Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật

Ứng dụng lớn nhất của liposome hiện này là làm chất mang thuốc điều trị ung thư và đã có một vài chế phẩm thương mại được bán trên thị trường với các dược chất như doxorubicin oxil, dau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUY N V N

NGHI N C U BÀO CHẾ THU C TI LIPOSOME DOXORUBICIN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TR N H I U ĐỘNG V T

U N V N THẠC S DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUY N V N

NGHI N C U BÀO CHẾ THU C TI

LIPOSOME DOXORUBICIN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC

ThS.NCS hánh Thị Nhi

Xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Vũ Mạnh Hùng-Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y và ThS Khánh Thị Nhi đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi khi tiến

hành đề tài đặc biệt là khi đánh giá tác dụng của thuốc trên động vật Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Bào chế- Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y, Phòng hiển vi điện tử - Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bè bạn đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài của mình

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1 21PC 1,2-Diheneicosanoyl-sn -Glycero-3-Phosphocholin

2 CHL Cholesterol

3 ĐVN ược điển Việt Nam

4 DLS Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động

ethanolamin-N-{Methoxy (Polyethylene glycol) }

9 EE Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa

10 EPR Enhanced Permeability and Retention effect - Hiệu ứng tăng

tính thấm và khả năng lưu giữ

11 EurP European Pharmacopoeia ( ược điển hâu Âu)

12 GUV Giant Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp khổng lồ

13 HEPES N-2- hydroxy ethyl piperazin-N‟-2-ethan sulfonic acid

14 HPLC High Performance Liquid hromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao)

15 ITG Inhibition Tumor Growth - hỉ số ức chế sự phát triển khối u

16 KTTB Kích thước trung bình

17 LTSL Low Temperature Sensitive Liposome – Liposome nhạy cảm

nhiệt độ thấp

18 LUV Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn

19 MLVs Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp

20 MUV Medium Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp trung bình

21 MVVs Multi Vesicular Vesicle – Liposome đa lớp

22 MWCO Molecular Weight Cut Off - Giới hạn khối lượng phân tử

23 NTSL Non Temperature Sensitive Liposome – Liposome không nhạy

cảm nhiệt độ

24 OLVs Oligo Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp

25 PB KTTP Phân bố kích thước tiểu phân

26 PDI Polydispersity Index – hỉ số đa phân tán

27 PEG Polyethylen glycol

25 PS Polysulfone

26 RES Reticuloendothelia System - Hệ lưới nội mô

27 SPC Soy phosphatidyl cholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành

28 SUV Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ

29 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

30 TKHH Tinh khiết hóa học

31 TTSL Traditional Temperature Sensitive Liposome – Liposome nhạy

cảm nhiệt độ cao

32 USP United State Pharmacopoeia ( ược điển Mỹ)

ỤC ỤC

DANH ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 4

DANH ỤC BẢNG 10

DANH ỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 11

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯ NG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Doxorubicin 2

1.2 Đại cương về liposome 5

1.2.1 Khái niệm và phân loại 5

1.2.2 Các phương pháp bào chế liposome 10

1.2.3 Đưa thuốc vào liposome 10

1.2.4 Đánh giá liposome tạo ra 12

1.3 Liposome doxorubicin 13

1.4 Sơ lược về mô hình đánh giá tác dụng chống ung thư 21

1.4.1 Các dòng tế bào 21

1.4.2 Động vật thực nghiệm 21

1.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng 22

1.4.4 Các chỉ tiêu đánh giá hiệu quả điều trị khối u 22

CHƯ NG 2 Đ I TƯỢNG VÀ PHƯ NG PHÁP NGHI N C U 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Nguyên vật liệu 24

2.3 Phương tiện nghiên cứu 25

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 26

2.4.2 Phương pháp đánh giá liposome tạo ra 29

2.4.3 Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin 32

2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin trên chuột thực nghiệm 32

2.5 Phương pháp l số liệu 34

2.6 Điều kiện thí nghiệm 34

CHƯ NG 3 ẾT QUẢ THỰC NGHIỆ 35

3.1 ết quả ây dựng đường chuẩn DOX 35

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kĩ thuật của quá trình bào chế đến các đặc tính của liposome do orubicin 36

3.2.1 Quá trình chế tạo liposome chưa mang dược chất 36

3.2.2 Quá trình làm giảm và đồng nhất kích thước của liposome 36

3.2.3 Quá trình đưa doxorubicin vào liposome 40

3.3 Bào chế thuốc tiêm liposome do orubicin 46

3.3.1 Lựa chọn quy trình bào chế 46

3.3.2 Đề xuất tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome doxorubicin 52

3.3.3 Sơ bộ đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin 53

3.4 Sơ bộ đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome do orubicin trên khối u chuột thực nghiệm 55

3.4.1 Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với thời gian sống trung bình của chuột nhắt mang khối u dưới da 55

3.4.2 Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với tỷ lệ sống sót của chuột nhắt mang khối u dưới da 56

3.4.3 Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với khối lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày 57

3.4.4 Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày 58

3.4.5 Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với khối lượng khối u cơ của chuột sau 30 ngày 59

3.4.6 Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với thể tích khối u cơ sau 30 ngày 60

CHƯ NG 4 BÀN U N 62

4.1 Về quy trình bào chế thuốc tiêm liposome do orubicin 2 mg/ml 62

4.2 Về đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome trên khối u chuột 70

ẾT U N VÀ ĐỀ XUẤT 73

DANH ỤC BẢNG

Bảng 3.10 Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin của mẻ 1 trong thời

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Các cách mang dược chất của liposome ……… 5

Hình 1.2 Kích thước của một số loại liposome……… 6

Hình 1.3 Các loại liposome……… 8

Hình 1.4 Minh họa hiệu ứng EPR……… 9

Hình 1.5 Phương pháp đưa DOX vào liposome bằng chênh lệch amoni……… 15

Hình 1.6 Các phương pháp DOX qua màng liposome……… 16

Hình 2.1 Mô hình thí nghiệm đổi đệm bằng phương pháp thẩm tích 27

Hình 2.2 Cơ chế đổi đệm bằng lọc tiếp tuyến……… 27

Hình 2.3 Mô hình lọc tiếp tuyến thao tác bằng tay 28

Hình 2.4 Sơ đồ hệ thống lọc tiếp tuyến tự động……… 28

Hình 2.5 Sơ đồ bào chế liposome doxorubicin……… 29

Hình 2.6 Sơ đồ chia nhóm đánh giá tác dụng chống ung thư……… 34

Hình 3.1 Mối tương quan giữa diện tich pic với nồng độ DOX……… 35

Hình 3.2 Ảnh chụp TEM liposome……… 39

Hình 3.3 Hàm lượng của DOX theo thời gian khi ủ DOX với liposome ở 50 o C 42

Hình 3.4 Đồ thị so sánh hiệu suất liposome hóa M1 và M2 45

Hình 3.5 Sơ đồ Bào chế các lọ chứa bột DOX đông khô……… 48

Hình 3.6 Sơ đồ bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml……… 51

Hình 3.7 Thời gian sống trung bình của các nhóm chuột ……… 56

Hình 3.8 Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày ……… 57

Hình 3.9 Khả năng ức chế sự phát triển khối u dưới da……… 58

Hình 3.10 Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày……… 59

Hình 3.11 Khả năng ức chế sự phát triển khối u cơ sau 30 ngày……… 60

Hình 3.12 Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày……… 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Liposome là một trong những hệ mang thuốc mới đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới nhờ có nhiều ưu điểm về khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng đưa thuốc tới đích Ứng dụng lớn nhất của liposome hiện này là làm chất mang thuốc điều trị ung thư và đã có một vài chế phẩm thương mại được bán trên thị trường với các dược chất như doxorubicin ( oxil), daunorubicin ( aunoxome),…

Nhằm bắt kịp các tiến bộ khoa học công nghệ trong lĩnh vược y dược trên thế giới, trong những năm gần đây, trường đại học ược Hà Nội đã tiến hành nhiều đề tài khoa học để đánh giá khả năng sử dụng liposome làm chất mang thuốc Trong đó liposome doxorubicin được nghiên cứu nhiều nhất và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ ác kết quả nghiên cứu cho thấy chúng ta đã từng bước nắm được các kỹ thuật chế tạo liposome và cũng đã cho thấy tiềm năng của việc sử dụng liposome doxorubicin trong điều trị ung thư

Đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin và đánh giá tác

dụng trên khối u động vật” được tiến hành để phát triển dạng thuốc tiêm liposome

doxorubicin trên cơ sở các kết quả nghiên cứu bào chế liposome đã thu được Đề tài được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm và đưa ra tiêu chuẩn của thuốc tiêm liposome doxorubicin

2 Sơ bộ đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u chuột thực nghiệm

Tên khoa học: (8S,10S)-10-{(3-Amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexo

pyranosyl) oxy}-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-tri hydroxy-8-(2-hydroxy methoxy-5,12-naphthacenedion [39]

acetyl)-1-Tính chất: Tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi Dung

dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5 Tan trong nước, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran Không tan trong cloroform, aceton, ethyl ethe, benzen [39]

Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp Tuy nhiên, ở

nồng độ điều trị thì doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng và không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ doxorubicin khỏi ánh sáng Thực tế thì dung dịch doxorubicin trong Na l 0,9% có thể ổn định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PV ở 25o và lâu hơn nếu bảo quản trong xylanh làm bằng polypropylen ở 4o

C [39]

Dược động học

Sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến cách mô phổi, gan, tim, lách, thận Doxorubicin bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol

Khoảng 40 - 50% lượng doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 - 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa; 5% bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày Doxorubicin không qua được hàng rào máu não nhưng qua được nhau thai và bài tiết được qua tuyến sữa [39]

ược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng

tự do Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn ác liposome doxorubicin phân

bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch máu không bình thường ạng liposome doxorubicin không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần trong huyết tương cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [39]

Chỉ định

Doxorubicin có khả năng tiêu diệt nhiều loại tế bào ung thư và thường được sử dụng cùng các hóa trị liệu khác để điều trị: u lympho dạng Hodgkin và không Hodgkin, sacroma xương và mô mềm, bạch cầu cấp, u nguyên bào thần kinh, ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng [39]

Liều dùng

Dạng thuốc tiêm dung dịch: Pha loãng với dung dịch glucose 5% hoặc dung

dịch nước muối sinh lý 0,9% rồi truyền nhanh tĩnh mạch trong 3 phút hoặc lâu hơn Nếu chỉ điều trị bằng doxorubicin thì liều sử dụng là 60-75 mg/m2

tương đương 1,2 – 2,4 mg/kg thể trọng, 3 tuần/lần Hoặc truyền 1 lần/ngày liều 20 mg/m2

, truyền trong 3 ngày cách nhau 3 tuần

Nếu sử dụng cùng với thuốc chống ung thư khác thì giảm liều xuống từ 30 -

60 mg/m2, truyền 1 lần trong 3 tuần

Tổng liều không quá 450-550 mg/m2

Dạng liposome PEG hóa: Pha loãng bằng dung dịch glucose 5% để truyền

tĩnh mạch Với liều dưới 90 mg pha trong 250 ml dung dịch glucose 5%, liều trên

90 mg pha loãng với 500 ml dung dịch glucose 5%

Truyền tĩnh mạch liều 20 mg/m2

trong 30 phút, 2-3 tuần truyền 1 lần Với điều trị ung thư vú và ung thư buống trứng, liều điều trị là 50 mg/m2, truyền trong 1 h, 1 lần trong 4 tuần Điều trị đa u tủy xương: truyền tĩnh mạch liều 30 mg/m2

vào ngày thứ 4 sau khi sử dụng liệu pháp bortezoomid [39]

Dạng liposome không PEG hóa được sử dụng trong ung thư vú di căn với liều

tương tự như dạng doxorubicin tự do Pha loãng chế phẩm bằng dung dịch Na l 0,9% hoặc dung dịch glucose 5% tới nồng độ 0,4-1,2 mg/ml, truyền tĩnh mạch trong

1 h cách nhau 3 tuần [39]

Doxorubicin có thể nhỏ trực tiếp vào bàng quang trong điều trị ung thư ác tính Nhỏ 50ml dung dịch doxorubicin 1 mg/ml trong 1h cách nhau 1 tuần hoặc 1 tháng [39]

Bảng 1.1: Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường

Thuốc tiêm

dung dịch

Adorucin lọ 5 ml, 25 ml, 2 mg/ml Korea United

Pharma Adriamycin lọ 5 ml, 100 ml 2 mg/ml Pfizer Doxorubicin Ebewe lọ 5 ml/25 ml, 2 mg/ml Ebewe Pharma

Doxorubicina servycal, lọ 10 mg, 50 mg Laboratorios IMA

1.2 Đại cương về liposome

1.2.1 hái niệm và phân loại

Liposome có cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một hay nhiểu lớp phospholipid kép, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn

nanomet [1] ấu tạo của liposome được minh họa ở hình 1.1 và hình 1.3 Thành

phần chính của liposome là phospholipid, cholesterol Đây là những chất tương hợp sinh học với cơ thể, và có thể phân giải được trong cơ thể nên có rất nhiều ưu điểm khi sử dụng làm chất mang thuốc trong cơ thể

Hình 1.1: Các cách mang dược chất của liposome: 1- Dược chất trong khoang nước 2- Dược chất nằm giữa lớp lipid kép 3- Dược chất gắn vào đầu phân cực của phospholipid 4- Dược chất liên kết với lớp lipid kép 5- Dược chất liên kết với đầu không phân cực của phân tử phospholipid 6- Dược chất hấp phụ trên bề mặ lớp lipid kép

Trong dược học, liposome được ứng dụng làm hệ mang thuốc và mô hình tế bào nhân tạo Khi sử dụng liposome làm chất mang thuốc, dược chất có thể phân bố trong khoang nước của liposome, phân bố giữa lớp phospholipid kép, tương tác và gắn với đầu không phân cực của phân tử phospholipid hoặc hấp phụ trên bề mặt của lớp phospholidpid kép tùy thuộc vào đặc tính thân dầu nước của dược chất và tương

tác hóa lí giữa dược chất với lớp phospholipid kép (hình 1.1) [33],[45] Một số dược

chất chỉ ổn định trong một số điều kiện nhất định, tuy nhiên môi trường ổn định nhất cho dược chất đôi khi lại không thích hợp với cơ thể do đó làm giảm khả năng điều trị của dược chất Những vấn đề này được giải quyết dễ dàng khi sử dụng

liposome làm chất mang thuốc do liposome có thể bao gói bên trong lớp lipid kép môi trường tối ưu cho sự ổn định của dược chất nhưng lại được phân tán trong một môi trường có điều kiện tương tự điều kiện sinh lý của cơ thể Vì thế có thể coi liposome là 1 hệ mang thuốc lý tưởng

Bảng 1.2: Phân loại liposome theo kích thước và cấu trúc

hiệu

ích thước

Liposome đơn lớp nhỏ SUV 20 – 100 1

Liposome đơn lớp trung bình MUV > 100 1

Liposome đơn lớp lớn LUV > 500 1

Liposome đơn lớp khổng lồ GUV > 1000 1

Liposome đa lớp nhỏ OLV 100-1000 < 5

Liposome đa lớp lớn MLVs > 500 5-25

Hình 1.2: Kích thước của một số loại liposome

Với ưu điểm trên, liposome nhanh chóng thu hút được sự quan tâm của các nhà bào chế trong nghiên cứu phát triển hệ mang thuốc mới trong cơ thể

Xét theo kích thước và số lớp, liposome được chia làm 3 loại chính: liposome

đơn lớp, liposome đa lớp (MLVs) và liposome nhiều túi (MVVs) (bảng 1.2) [34]

Xét theo cấu trúc lớp vỏ lại chia thành:

Liposome quy ước: là liposome có cấu tạo lớp vỏ chủ yếu là phospholipid và

cholesterol Đây là dạng liposome đầu tiên được nghiên cứu Liposome quy ước có nhược điểm là rất dễ bị bắt và phá hủy bởi các đại thực bào trong máu và bởi hệ thống lưới nội mô (RES - reticuloendothelial system) ở gan và lách; khả năng hướng đích còn kém và thụ động, chủ yếu phụ thuộc vào kích thước của liposome

và khả năng đi qua khe hở thành mạch ở các mô ung thư, chưa kiểm soát được khả năng giải phóng dược chất Mặc dù vậy, nếu tế bào bị bệnh thuộc hệ thống thực bào đơn nhân thì chính việc bị bắt giữ khi di chuyển trong hệ tuần hoàn lại là ưu điểm của các liposome quy ước [36]

Liposome hiện đại: là các liposome đã thay đổi cấu trúc lớp vỏ nhằm khắc

phục nhược điểm của liposome quy ước ác liposome hiện đại được phân loại rất khác nhau và cũng không rõ ràng giữa các nhà nghiên cứu Việc phân loại phụ thuộc nhà nghiên cứu muốn nhấn mạnh tính chất nào của liposome như khả năng tuần hoàn lâu trong cơ thể, khả năng hướng đích thụ động hay chủ động, khả năng kiểm soát giải phóng thuốc, …

Liposome tuần hoàn dài (Long circulation liposome): Để có thể tồn tại lâu

trong hệ tuần hoàn, bề mặt vỏ của các liposome thường được đưa thêm các nhóm phân tử thân nước có kích thước lớn như PEG, poly{N-(2-hydroxypropyl)} methacrylamid, poly-N-vinylpyrrolidon, polyvinyl alcol, phức hợp của L-amino acid với các polime phân hủy sinh học Nhờ đó liposome thoát khỏi sự tấn công của đại thực bào và hệ thống lưới nội mô tại gan, lách o khả năng tồn tại lâu trong vòng tuần hoàn nên khả năng tập trung thuốc của liposome tại mô đích tăng Khả năng tập trung tại mô đích của các liposome loại này được gọi là hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu (EPR – Enhanced permeability and retention effect) [36], [ 41], [ 42] Các liposome hướng đích nhờ hiệu ứng này được xếp vào nhóm hướng đích thụ động

Liposome miễn dịch (Immunoliposome): Tên gọi này chỉ các liposome được

gắn lên bề mặt các phân tử có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích (các nhóm nhận đích - target ligand) ác chất hướng đích đầu tiên được sử dụng là các kháng thể IgG nên liposome này được gọi là liposome miễn dịch Hiện nay đã phát triển thêm nhiều nhóm nhận đích khác mà không phải là các kháng thể, nên các liposome về sau đều gọi tên theo nhóm hướng đích được gắn, tuy nhiên chúng vẫn xếp vào loại liposome miễn dịch (immunoliposome) Một số nhóm hướng đích khác được nghiên cứu là: các kháng thể đơn dòng 53, 531, 19; kháng thể HER-2; kháng thể kháng receptor folat (anti-FR); kháng thể kháng receptor tranferin (anti- TfR)…[36], [ 42] Các liposome nhóm này có khả năng hướng đích chủ động

Hình 1.3: Các loại liposome:

A Liposome quy ước: a- thuốc tan trong nước; b-thuốc tan trong dầu

B Liposome miễn dịch: c,d- kháng thể gắn trên bề mặt liposome C: Liposome tồn tại lâu: e- các phân tử PEG

D: Liposome miễn dịch tồn tại lâu E: Các dạng liposome với các chất hướng đích khác

Liposome miễn dịch tuần hoàn dài (Long-circualating Immunoliposome): Đây

là loại liposome kết hợp các ưu điểm của liposome tồn tại lâu và liposome miễn

dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome Đặc điểm

cấu tạo của liposome này s có lớp áo polyme bảo vệ ở bên ngoài và các chất hướng đích s được gắn vào đuôi các phân tử polyme bảo vệ hoặc gắn lên vỏ liposome [42]

Hình 1.4: Minh họa hiệu ứng EPR

ác nghiên cứu hiện nay tập trung vào kiểm soát giải phóng thuốc khỏi liposome và đã chế tạo ra các liposome thông minh chỉ giải phóng thuốc khi nhận được những kích thích đặc hiệu tại mô đích ác liposome này được gọi là liposome cảm ứng (Stimuli – sensitive liposome hay Trigger liposome) Trong thành phần cấu tạo vỏ của các liposome cảm ứng có chứa một tỉ lệ nhất định các chất cảm ứng,

đó có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polime có khả năng bị phân giải cấu trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu kích thích tại mô đích Tác nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô bị bệnh như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường mô bệnh (tác nhân nội - internal trigger) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm và năng lượng điện từ trường, nhiệt độ, (tác nhân ngoại - external trigger) [4], [ 10], [ 13], [ 23], [ 25], [ 30], [ 36], [ 37], [ 38]

Các liposome thông minh có thể được PEG hóa bề mặt, trên các phân tử PEG

có thể được gắn thêm các nhiều nhóm phân tử khác nhau để thực hiện nhiều nhiệm

vụ khác nhau cùng lúc khi liposome di chuyển trong hệ tuần hoàn Khi đó ta s có các liposome thông minh đa chức năng [36]

1.2.2 Các phương pháp bào chế liposome

Liposome được chế tạo theo nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp hydrat hóa film lipid (phương pháp angham), phương pháp loại chất diện hoạt, phương pháp pha loãng alcol, phương pháp bốc hơi pha đảo, phương pháp nhũ hóa, phương pháp đông khô, phương pháp sử dụng hệ thống kênh vi lỏng…[45], [29] Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào:

 Thuộc tính hóa lý của dược chất và của hợp chất dùng chế tạo liposome

 Đặc tính của môi trường phân tán liposome

 Nồng độ tác dụng của dược chất và độc tính tiềm tàng của nó

 Các kỹ thuật bổ trợ trong quá trình phân phối liposome vào cơ thể

 Sự phù hợp của kích thước, mức độ đa phân tán và thời gian tồn tại của liposome với vị trí sử dụng hay với mô bệnh

 Độ lặp lại giữa các lô trong sản xuất và khả năng sản xuât của quy

mô lớn các liposome có độ an toàn và hiệu quả cao [33]

Tất cả các phương pháp bào chế liposome trên thường tạo ra hỗn hợp các loại liposome khác nhau với các kích thước khác nhau (trừ phương pháp sử dụng hệ thống kênh vi lỏng) o đó liposome sau khi tạo ra thường được giảm kích thước và đồng nhất kích thước bằng các phương pháp thích hợp ó 4 biện pháp thường sử dụng để đạt được mục đích này: Siêu âm, nén qua màng, đồng nhất hóa ở áp suất cao, đông chảy nhiểu lần Thường có sự kết hợp các phương pháp làm đồng nhất và làm giảm kích thước tiểu phân để đạt được hiệu quả mong muốn [45]

1.2.3 Đưa thuốc vào liposome

ược chất có thể đưa vào trong liposome theo cơ chế thụ động hoặc chủ động

Theo c ch th động: ược chất được đưa vào liposome trong quá trình bào

chế liposome Theo đó, dược chất thân nước s thêm vào pha nước, dược chất thân

dầu s thêm vào pha dung môi hữu cơ, sau đó s tiến hành bào chế liposome bằng các phương pháp thích hợp Đưa dược chất theo cơ chế thụ động có nhược điểm là hiệu suất gắn dược chất thấp, dược chất có thể bị tách khỏi liposome trong quá trình làm giảm kích thước và làm đồng nhất kích thước Theo Xiaoming Xu [46], nếu dược chất được chứa trong khoang nước, hiệu suất liposome hóa có thể dự đoán được bằng công thức:

Theo c ch ch động: s có 3 bước chính theo thứ tự sau:

 ào chế liposome bằng các phương pháp thích hợp

 Làm giảm kích thước liposome đến kích thước yêu cầu và đồng nhất hóa về kích thước

 Đưa dược chất vào liposome

ược chất được đưa vào liposome theo cơ chế chủ động bằng cách tạo ra chênh lệch năng lượng hai bên màng liposome, sự chênh lệch này s tạo động lực

để kéo dược chất từ môi trường bên ngoài vào liposome ách đơn giản nhất để tạo chênh lệch năng lượng là tạo ra chênh lệch nồng độ vật chất hai bên màng liposome Hiện nay hay sử dụng chênh lệch amoni, chênh lệch ion hay chênh lệch pH để tạo động lực đưa dược chất vào liposome Một số dược chất đã được đưa vào liposome với hiệu suất cao bằng phương pháp này như: doxorubicin, mitoxantron,

nêu chi tiết đối với liposome doxorubicin ở mục 1.3

Bảng 1.3: Ưu nhược điểm của các phương pháp tinh chế liposome

Hiệu suất cao ( >90%)

Lọc tiếp tuyến Hiệu suất cao (>99%)

Sắc ký lọc gel Hiệu suất cao (90-99,99%) Tiết kiệm thời gian

Mẫu bị pha loãng nên cần phải chỉnh hàm lượng lại bằng lọc tiếp tuyến

Liposome sau khi bào chế luôn chứa cả dược chất tự do và dược chất liposome hóa Trong một số trường hợp, dược chất tự do có thể gây ra các vấn đề về ổn định của chế phẩm hoặc dược chất tự do có thể giảm hiệu quả điều trị, khi đó cần thiết phải tinh chế để loại bỏ dược chất tự do ó 5 kỹ thuật có thể sử dụng cho mục đích này là thẩm tích (dialysis), ly tâm, ly tâm kết hợp siêu lọc (ultra-centrifugation), lọc thẩm tích ( diafiltration) hay lọc tiếp tuyến (tangential flow filtration / cross flow filtration), sắc ký lọc gel u nhược điểm của mỗi phương pháp tinh chế được trình

bày trong bảng 1.3 [45]

1.2.4 Đánh giá liposome tạo ra

Bảng 1.4 liệt kê các tiêu chí đánh giá và phương pháp đánh giá chất lượng của

liposome [6], [ 34] Ngoài các chỉ tiêu được đưa ra ở bảng 1.4, liposome vẫn phải

đáp ứng các chỉ tiêu chất lượng khác tùy thuộc vào việc liposome được sử dụng cho dạng bào chế nào Ví dụ, với thuốc tiêm liposome thì ngoài phải đáp ứng các chỉ

tiêu nêu ở bảng 1.4 thì còn phải đáp ứng thêm các chỉ tiêu về an toàn sinh học như

độ vô khuẩn, nội độc tố vi khuẩn

Bảng 1.4: Các tiêu chí đánh giá liposome

ung môi tồn dư

Chỉ tiêu

vật l

Hình dạng và cấu trúc bề mặt hụp TEM, SEM Kích thước và phân bố kích thước LS; chụp TEM, SEM Điện tích bề mặt Phương pháp điện di

tạo ra liposome quy ước và đưa doxorubicin vào liposome hiện nay đã là những vấn

đề khoa học rất cơ bản trên thế giới, cho nên hầu hết các nghiên cứu hiện nay khi nghiên cứu cải thiện và phát hiện thêm các đặc tính mới của liposome đều lựa chọn doxorubicin làm mô hình để nghiên cứu

Liposome doxorubicin thường được bào chế qua các bước sau: chế tạo liposome bằng phương pháp hydrat hóa film lipid, sau đó giảm kích thước liposome bằng phương pháp nén hỗn dịch liposome qua màng polycarbonat 100 nm uối cùng là đưa DOX vào trong liposome bằng một trong các phương pháp dưới đây [15]:

Tạo chênh lêch ion H+ trực ti p:

ngoài có pH từ 7 - 7,5 Khi hòa tan DOX vào hỗn dịch liposome, s xuất hiện

thể khuếch tán ngược ra ngoài liposome được Trong khi đó, ở bên ngoài

trình này s tiếp tục cho đến khi đạt được cân bằng pH ở hai bên màng liposome

hai bên màng liposome Theo các nghiên cứu, sự chênh lệch pH phải ít nhất là 3 đơn

vị

Tạo chênh lệch pH gián ti p qua chênh lệch :

 Liposome có môi trường ngoài là dung dịch đệm pH 7,5 ( Ví dụ đệm HEPES), môi trường bên trong là 300 mM amoni sulfat Hệ liposome ban đầu

khả năng thấm tốt qua màng lipid kép nên s khuếch tán ra bên ngoài liposome

do chênh lệch nồng độ amoniac hai bên màng Ở ngoài màng lại có cân bằng:

bị kết tủa lại trong liposome Do bị kết tủa lại nên chênh lệch nồng độ DOX 2

động lực cho 1 phân tử OX đi vào trong tế bào Quá trình cứ tiếp tục cho đến khi tất cả các quá trình đạt tới trạng thái cân bằng

Hình 1.5: Phương pháp đưa DOX vào liposome bằng chênh lệch amoni

Tạo chênh lệch ion H + gián ti p qua tạo chênh lệch ion:

sinh vật, có vai trò vận chuyển ion qua màng sinh học

với ion kim loại được dùng; môi trường bên ngoài không có các ion kim loại trên và có chứa các chất tạo phức với ion trong màng (Ví dụ EDTA)

lệch nồng độ, tại đây Mg2+ bị giữ lại do tạo phức với E TA Để đảm bảo cân

ionophore làm cho môi trường trong màng được acid hóa, tạo chênh lệch pH qua màng Sau khi tạo được chênh lệch pH hai bên màng thì tiến hành phối hợp DOX vào hỗn dịch, khi đó OX s khuếch tán qua màng để đảm bảo cân bằng pH hai bên màng theo cơ chế như đã mô tả trên

Hình 1.6: Các phương pháp DOX qua màng liposome:

Bằng chênh lệch ion(A) và chênh lệch pH (B)

ngoài cần có pH > 7 nhưng không nên quá kiềm vì OX không bền ở môi trường

pH cao (tốt nhất pH < 8); ngoài ra, môi trường bên ngoài liposome không nên có

làm

để khóa

Vì vậy, thường môi trường bên trong liposome hay chứa các anion đa hóa trị

này Do quá trình bào chế liposome, thường các ion này luôn có mặt với lượng lớn

ở bên ngoài liposome nên trước khi tiến hành liposome hóa OX, thường phải có quá trình loại bỏ các ion trên

ột số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới hiện nay:

Amey Bandekar và cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế và so sánh tác dụng chống ung thư của liposome giải phóng thuốc trong tế bào (liposome nhạy cảm pH) với liposome giải phóng thuốc qua khe tế bào (liposome tuần hoàn dài – PEG liposome) và của liposome hướng đích với liposome không hướng đích trên khối u dưới da chuột (được tạo ra bằng cách cấy tế bào ung thư vú T474) Liposome nhạy cảm pH có cấu tạo lớp vỏ gồm SPA, 21P , HL (tỉ lệ mol 6,8:2,3:0,9), ngoài ra còn phối hợp thêm 13% mol SPE-PEG để kéo dài thời gian tuần hoàn Liposome tuần hoàn dài sử dụng SP và HL (tỉ lệ mol 7:3) làm thành phần chính tạo lên vỏ liposome và phối hợp thêm 4,9% mol SPE-PEG Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film lipid, sau đó làm giảm kích thước bằng cách nén qua màng polycarbonat 100 nm ở 80o OX được liposome hóa bằng phương pháp chênh lệch amoni Liposome doxorubicin được gắn kháng thể HER2/neu bằng cách ủ hỗn hợp liposome và kháng thể theo tỉ lệ 1:30 trong 30 ph

ác liposome tạo ra có mật độ kháng thể từ 25 - 30 kháng thể/liposome, hiệu suất liposome hóa của liposome nhạy cảm pH và liposome tuần hoàn dài tương ứng là 29,41 ± 1,15% và 40,34 ± 1,46% Sự có mặt kháng thể trên bề mặt không ảnh hưởng đến kích thước và hiệu suất gắn OX của liposome Kết quả đánh giá khả năng ức chế sự phát triển khối u cho thấy liposome có gắn HER2/neu có khả năng làm giảm thể tích khối u (liposome nhạy cảm pH gắn HER2/neu giảm 35%, liposome tuần hoàn lâu gắn HER2/neu giảm 19% thể tích khối u) trong khi liposome không gắn HER2/neu có khả năng kìm hãm sự phát triển của khối u Sự tăng thể tích khối u của nhóm điều trị bằng liposome nhạy cảm pH, liposome tuần hoàn lâu và nhóm chứng lần lượt là 41%, 34% và 100% [5]

Lisa M Kaminskas và cộng sự (2012) đã nghiên cứu so sánh dược động học, hoạt tính chống ung thư và độc tính của Caelyx (liposome doxorubicin PEG hóa) –L-DOX so với dung dịch doxorubicin - DOX và dendrime doxorubicin được PEG hóa – D-DOX trên chuột đực 5 - 6 tuần tuổi (được tiêm 6x106 tế bào ung thư biểu

mô Walker và để phát triển cho đến khi tạo được khối u kích thước 1 cm3 ) Về dược động học, sau khi tiêm OX, nồng độ doxorubicin trong huyết tương giảm mạnh và ở dưới giới hạn định lượng dưới sau 1 h chứng tỏ doxorubicin phân bố nhanh và rộng vào các mô (Clr = 760 ± 163 mL/h) Trong khi đó -DOX và L-

OX cho thấy nồng độ doxorubicin toàn phần trong huyết tương giảm rất chậm và

hệ số thanh thải thấp hơn khoảng 1000 lần so với tiêm OX Mức doxorubicin tự

do ở 2 chế phẩm nano trên cũng rất thấp chứng tỏ trong vòng tuần hoàn, doxorubicin vẫn được gắn vào trong hệ nano Tuy nhiên kết quả đánh giá khả năng làm giảm khối u lại không khác nhau giữa cả 3 chế phẩm, cả 3 chế phẩm đều làm giảm 68-78% kích thước của khối u [20]

Antonella Accardo và cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin quy ước ( SP - OX) với liposome doxorubicin gắn nhóm peptid có đặc tính hướng đích tới các thụ thể ombesin tại các tế bảo ung

thư (DSPC-MonY-BN-DOX) Liposome được bào chế bằng phương pháp bốc hơi

pha đảo với lớp màng lipid gồm SP hoặc SP và MonY- N (tổng hợp từ chuỗi acid amin 7 - 14 của peptid obesin) (tỷ lệ mol 1:0,03) Làm giảm kích thước liposome bằng cách nén qua màng polycarbonat 100 nm Kết quả thu được các liposome có kích thước 145 – 165 nm và chỉ số đa phân tán < 0,20; DOX được đưa vào liposome bằng cách tạo chênh lệch pH (bên trong liposome là đệm citrat pH4) hoặc chênh lệch amoni Trước khi phối hợp OX thì sử dụng kĩ thuật siêu ly tâm để thay môi trường bên ngoài liposome bằng đệm HEPES pH 7,4 Hiệu suất gắn doxorubicin với phương pháp tạo chênh lệch pH là 95,0 ± 2,7% cao hơn phương pháp chênh lệch amoni sulfat (58,0 ± 1,9%) Kích thước của liposome sau khi gắn

OX và trước khi gắn OX không bị thay đổi nhiều Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung thư trên dòng tế bào PC-3 xenograft cấy trên chuột cho thấy DSPC-

MonY-BN- OX ức chế hơn 60% sự phát triển của tế bào so với SP - OX chỉ ức

chế được 30% sự phát triển của tế bào ung thư [3]

Kim Jong-Oh và cộng sự (2009) đã bào chế và đánh giá dạng bào chế

liposome doxorubicin trong thành phần có chứa các polyme mang điện tích (polyanion) như polyethylen oxid -b- polymethacrilic acid (PEO-b-PMA) mang điện tích Tính chất ion của tiểu phân cho phép đạt được nồng độ doxorubicin bên trong tiểu phân khá cao (50%) ác tiểu phân chứa các polyme mang điện chứa doxorubicin này biểu thị tính chất giải phóng thuốc nhạy cảm với pH: sự nhận proton của các các phân tử mang điện ở môi trường acid dẫn đến tăng giải phóng doxorubicin Đặc biệt, bằng cách thay đổi các thành phần của các phân tử mang điện s làm thay đổi hiệu quả chứa thuốc và đặc tính giải phóng thuốc o đó, nhóm nghiên cứu tin rằng các phân tử mang điện polyme với hạt nhân polyanion có nhiều triển vọng là các chất mang siêu phân tử cho phép kiểm soát sự phân bố sinh học và dược động học của thuốc để cải thiện kết quả trị liệu [21]

Evjen Tove J và cộng sự (2010) đã nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin

bằng phương pháp cất quay có sử dụng một số biện pháp kỹ thuật cải tiến ác tá dược lipid sử dụng là distearoyl phosphatidylethanolamin (DSPE), distearoyl phosphatidylcholin (DSPC), cholesterol (CHL) ác lipid được hòa tan trong hỗn hợp dung môi cloroform : methanol tỷ lệ 9 : 1 ở 60o , đem cất quay 6 h được film lipid Hydrat hóa film lipid bằng dung dịch ammoni sulphat trong 2 h Hỗn dịch thu được đem lọc ép nhiều lần qua màng polycarbonat với kích thước lỗ giảm dần (800

nm, 400 nm, 200 nm, 100 nm, 80 nm) Thêm dung dịch doxorubcin hydroclorid được pha trong dung dịch ammoni sulphat, khuấy, ủ Sử dụng sóng siêu âm với tấn

số thích hợp trong 6 phút Kết quả thu được liposome có kích thước tiểu phân khoảng 84 ± 1 nm [13]

Wafa T Al-Jamal và cộng sự (2012) nghiên cứu dược động học và phân bố của doxorubicin trên chuột 57 L6 (được gây u hắc tố (melanoma) bằng tế bào B16F10) khi điều trị bằng 3 loại liposome doxorubicin: liposome nhạy cảm nhiệt độ thấp - LTSL (DPPC:MSPC:DSPE-PEG2000 = 86:10:4), liposome nhạy cảm nhiệt độ

cao - TTSL (DPPC:HSPC:CHL:DSPE-PEG2000 = 50:25:15:3) và liposome quy ước

- NTSL (HSPC:CHL:DSPE-PEG2000 = 70:50:3) Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film lipid, giảm kích thước bằng cách nén qua màng polycarbonat 800, 200, 100, 80nm và sử dụng phương pháp chênh lệch amoni gắn

OX vào liposome (môi trường trong liposome là 240 mM amoni sulfat, môi trường ngoài là đệm 20 mM HEPES pH 7,4) ả 3 loại liposome bào chế ra có kích thước từ 90 - 120 nm, P I dưới 0,1, bề mặt tích điện âm (-9 ÷ -15 mV) và hiệu suất

liposome hóa trên 90% Đánh giá giải phóng in vitro trong môi trường chứa 50%

huyết tương chuột -1 cho thấy, ở 37o , LTSL giải phóng 30% OX trong 30 ph

và giải phóng 100% OX sau 2 h; TTSL giải phóng 10% OX sau 30 ph và giải phóng 60% DOX sau 24 h; NTSL không giải phóng OX ở 37o Ở 42o

C, LTSL giải phóng 100% OX sau 1 ph, TTSL giải phóng 70% OX ở 5 ph đầu và 100% DOX sau 15 ph, NTSL không giải phóng thuốc sau 24 h Sử dụng phương pháp đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 3

H-CHE (3H-cholesteryl hexa decyl ethe) và 14DOX (14C- doxorubicin) để đánh giá phân bố của các liposome cho thấy LTSL ổn định trong gan hơn so với NTSL và TTSL nhưng lại dễ bị bắt bởi lách hơn Tác động nhiệt lên lên mô ung thư của chuột không làm thay đổi đặc điểm tuần hoàn và khả năng phân bố thuốc tại mô bình thường của các liposome nhưng lại rất nhanh ảnh hưởng đến mô ung thư ụ thể là khi gây nhiệt tại mô ung thư, nồng độ OX tại mô ung thư trong 1 h đầu đã tăng từ 1,5 - 3 lần so với bình thường [4]

C-Benjakul Ruthairat và cộng sự (2011) đã nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin bằng phương pháp đông khô dưới áp suất thấp ở nhiệt độ thường ác tác giả đã sử dụng các tá dược chất mang trơ dễ bay hơi là clorobutanol hemihydrat ( N) ác tá dược lipid là phosphatidylcholin, cholesterol ác tá dược đường tạo khung là mannitol và sucrose ác tá dược lipid được hòa tan trong dung môi tert-butanol, các đường mannitol, sucrose hòa tan trong pha nước Doxorubicin hydroclorid được hòa tan trong pha nước Phối hợp các dung dịch, thêm tá dược dễ bay hơi là N Đem đông khô ở nhiệt độ phòng (25 - 30o ) dưới áp suất thấp (1,5

- 2,0 m ar) trong 8h thu được bột đông khô Khi hydrat hóa lại bột đông khô thu được liposome có kích thước khoảng 400 – 1000 nm [7]

Đào Thanh Tùng (2011) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá các đặc tính của liposome doxorubicin Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm SPC và cholesterol, dược chất được đưa vào liposome bằng hai phương pháp thụ động và chủ động chênh lệch pH qua màng, sau

đó sử dụng siêu âm để làm giảm kích thước Kết quả đã khảo sát được công thức tỷ

lệ mol lipid SPC : CHL (7 : 3), tỷ lệ mol dược chất : lipid (5 : 1) và xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin với kích thước < 300 nm, hiệu suất liposome hóa > 80%, hàm lượng dược chất trong hệ phân tán liposome ~ 1 mg/ml [2]

1.4 Sơ lược về mô hình đánh giá tác dụng chống ung thư

1.4.1 Các dòng tế bào

- Ung thư tuyến thượng thận (adrenocortical) : NCIh295 [16]

- Ung thư phổi: Lewis lung carcinoma, Colo-699-N, H460 [8], [ 31]

- Ung thư buồng trứng: Ovacar-3 [31]

- U nguyên bào thần kinh: GI-LI-N, Kelly [17], [ 31]

- Ung thư vú: T474, BT483, SKBR3, NCI/ADR-RES, 4T1, MCF-7, ADR [5], [ 8], [ 12], [ 17], [ 22]

MCF-7 Ung thư ruột già: CMCF-7 26, HCTMCF-7 116 [8], [ 12]

- Ung thư vòm họng có vảy nhỏ: SAS [8]

- Ung thư tế bào gan: Mahlavu, W256, QGY [19]

- Ung thư tuyến tụy: Panc-1, MIA, Paca-2, DSL6A [40], [8]

- Ung thư tuyến tiền liệt: PC-3, PU145 [3], [ 8], [ 12], [ 17]

- Ung thư hắc tố (melanoma): B16F10 [4]

1.4.2 Động vật thực nghiệm

Động vật thí nghiệm dùng để đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin rất

đa dạng hủ yếu trên các chủng chuột như: C57BL6 ,BALB/c, C3H/HeJ, NCR homozygous nude, Swiss, Fischer 344, SCID nude, NMRI, C57BL6, Sprague–Dawley, BDF-1, SLC Wistar/ST [3], [ 4], [ 8], [ 10], [ 11], [ 16], [ 32], [19]

ác chuột có thể bị cắt bỏ tuyến ức, dẫn đến giảm số lượng tế bào miễn dịch lympho T, làm giảm khả năng đào thải khối u và các mảnh ghép [16], [ 20]

1.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng

Trước hết, chọn dòng tế bào và động vật thực nghiệm Động vật thực nghiệm

là chuột thường chọn những con từ 6 - 8 tuần tuổi, nặng từ 20 – 26 g với chuột nhắt

và 250 – 300 g với chuột cống ác tế bào được nuôi cấy trong môi trường, nhiệt

độ, thời gian thích hợp Sau đó đem cấy truyền vào cơ thể động vật thực nghiệm Vị trí cấy tế bào rất khác nhau tùy vào loại tế bào ung thư: hông bên phải và hông bên trái, lưng, màng bụng, phổi, gan bàn chân, dưới da vùng cổ, dưới da đùi, thùy trái gan Sự cấy truyền u vào cơ thể chuột nhắt có thể tiến hành bằng cách ghép khối u,

có thể tiêm hỗn dịch của tế bào u của các loại u khác nhau từ cơ thể chuột đã mang

u sẵn ác khối u rắn (solid tumor) có thể được cấy truyền theo đường dưới da hoặc tiêm vào bắp, cơ của động vật ác khối u báng (ascites tumors) có thể được tiêm vào ổ bụng Số lượng tế bào đem cấy khoảng 105

– 107 /động vật

Sau đó chuột được chia thành các nhóm để tiến hành điều trị bằng các công thức khác nhau Liều doxorubicin tiêm vào chuột rất khác nhau tùy vào từng thí nghiệm: 1,5 mg/kg [5], 2 mg/kg [12], [ 20], 5 mg/kg [32],8 mg/kg [8], 10 mg/kg [3], [ 16], [ 17], 15 mg/kg [26] Thời điểm bắt đầu tiến hành rất khác nhau tùy theo từng thí nghiệm ó thể điều trị ngay sau khi cấy truyền tế bào thành công, cũng có thể

để khối u phát triển một cách chắc chắn Thường để các tế bào phát triển từ 1 – 2 tuần, cũng có khi tới 4 tuần hoặc đến khi thể tích u đạt đến một mức nào đó (khoảng

100 – 400 mm3)

1.4.4 Các chỉ tiêu đánh giá hiệu quả đi ều trị khối u

Thể tích khối u: Có nhiều công thức tính khác nhau tùy theo từng nghiên cứu:

⁄

a và b là đường kính lớn nhất và đường kính nhỏ nhất của khối u [5]

Tỉ lệ ức ch khối u - ITG ( Inhibition of Tumor Growth):

ITG =

W c , W t : Khối lượng trung bình khối u nhóm chứng và nhóm điều trị [19]

Ngoài ra còn có thể đánh giá thêm thời gian sống sót của chuột, sự thay đổi khối lượng cơ thể chuột, sự thay đổi về đặc điểm dược động học của thuốc

CHƯ NG 2 Đ I TƯỢNG VÀ PHƯ NG PHÁP NGHI N C U 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Liposome doxorubicin

- Thuốc tiêm liposome doxorubicin

2.2 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu

chuẩn

Doxorubicin hydroclorid chuẩn LGC Standards -

Phosphatidyl cholin đậu nành Avanti polar

lipids-Mỹ TCCS

Triton X 100 (OMyl phenol

poly(ethylen glycol ether))

Amresco Ohio-

HEPES (acid

Methanol Merck- Đức Dùng cho

HPLC

HPLC

- Chuột nhắt trắng dòng Swiss, BAL C57/6, giống đực, khỏe mạnh, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng trung bình 20,0 ± 1,0 g do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi bằng thức ăn tổng hợp, uống nước sạch,

tự do (ad libitum), nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm dược lý chuyên dụng

- Dòng tế bào ung thư Sarcoma TG180, do phòng thí nghiệm thực nghiệm trên chuột bạch của Bộ môn mô phôi – tế bào, khoa Sinh học, đại học Khoa học

tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội cung cấp

- Thuốc đối chiếu: Hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml Lipo-DOX của hãng TTY iopharm, Đài Loan ( EE >90%, KTTB: 60-120nm Số lô: SVN 1122; hạn dùng: 28-07-2013) Dung dịch tiêm doxorubicin 2 mg/ml “Ebewe” của nhà sản xuất Ebewe, Áo (Số lô: 12154206; hạn dùng: 01 - 2013)

2.3 Phương tiện nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 1200 infinity của hãng Agilent

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R

- Máy đo kích thước tiểu phân và đo thế zeta ZETASIZER ZS90

- Thiết bị siêu âm cầm tay Labsonic

- Bể siêu âm Wiseclean WUC

- Máy cất quay ROTAVAPOR R-210 của U HI

- Túi thẩm tích Spectrumlab/Por 4, MWCO: 12-14 kD (Spectrum Labs- Mỹ)

- Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone, kích thước lỗ lọc 10 kD; 50 kD, diện tích lọc 20 cm2

; 28 cm2 (Spectrum Labs- Mỹ)

- Máy đông khô Triad của hãng Labconco

- Máy đo thể tích khối u Plethysmometer-7140 của UGO BASIL (Italy)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin

ựa theo các kết quả của các nghiên cứu về liposome OX đã đạt được [2], liposome doxorubicin được bào chế qua các giai đoạn sau:

2.4.1.1 Ch tạo liposome chưa mang dược chất

Tạo lớp film lipid: hòa tan soy phosphatidyl cholin, cholesterol trong

cloroform rồi bốc hơi hết dung môi trên thiết bị cất quay với các thông số: tốc độ quay 50 vòng/phút, nhiệt độ 40o Thời gian bốc hơi dung môi là 12 h

Hydrat hóa: hòa tan acid citric trong nước, điều chỉnh pH bằng dung dịch

NaOH 2M tới pH4, lọc qua màng lọc 0,2 µm Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/ph và tăng nhiệt độ lên 50o , mở van của thiết bị cất quay để hút hết dung dịch đệm citrat vào Sau 2 h hydrat hóa s thu được hỗn dịch liposome có màu trắng, đục

2.4.1.2 Làm giảm kích thước tiểu phân

ho vào lọ thủy tinh hỗn dịch liposome ở trên, nhúng đầu siêu âm của thiết bị Labsonic ngập 1/3 hỗn dịch, siêu âm với các thông số: tần số 30 kHz, biên độ 100% Làm mát bằng nước lạnh để đảm bảo nhiệt độ siêu âm không vượt quá 60oC Sau khi siêu âm, lọc hỗn dịch qua màng 0,45 µm rồi 0,2 µm để loại các tiểu phân to

2.4.1.3 Ti n hành đổi hệ đệm

Sử dụng 2 phương pháp đổi hệ đệm là thẩm tích và lọc tiếp tuyến

Phư ng pháp thẩm tích: Hỗn dịch liposome được cho vào trong màng thẩm

tích và được đặt trong bình chứa đệm Hepes pH 7,4 (tỷ lệ thể tích hệ phân tán liposome: đệm Hepes là 1:100) ình chứa được để ở 2-8⁰ trong 24 giờ và được thay đệm Hepes tại các thời điểm 0 giờ, 5 giờ và 19 giờ Đệm citrat s khuếch tán ra bên ngoài môi trường đồng thời HEPES s từ môi trường ngoài túi đi vào trong cho tới khi đạt cân bằng nồng độ các chất tan giữa hai bên màng Kết quả là sau khi

thẩm tích, s thu được hỗn dịch liposome có môi trường bên trong là đệm citrat pH

4, môi trường bên ngoài là đệm HEPES pH 7,4 (hình 2.1)

Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm đổi đệm bằng phương pháp thẩm tích

Phư ng pháp lọc ti p tuy n: Hệ thống lọc tiếp tuyến có thể thao tác bằng tay

(hình 2.3) hoặc được thao tác tự động nhờ bơm nhu động (hình 2.4)

Hình 2.2: Cơ chế đổi đệm bằng lọc tiếp tuyến Với thao tác bằng tay: đệm Hepes pH 7,4 được bơm đồng thể tích với hệ phân

tán liposome trong đệm citrat pH 4 qua màng lọc của lọc tiếp tuyến, tại đây liposome được giữ lại, phần dung dịch đệm bị loại ra ngoài ơm tới khi hệ phân tán trở về thể tích ban đầu s loại được một phần đệm citrat Lặp đi lặp lại quy trình cho tới khi hệ phân tán có pH 7,2-7,4

Hình 2.3: Mô hình lọc tiếp tuyến thao tác bằng tay

Với thao tác tự động: bơm tuần hoàn hỗn dịch liposome qua cột lọc, nước s

kéo các chất tan thấm qua màng lọc theo chiều vuông góc so với dòng chảy, liposome không đi qua màng được s liên tục được chạy qua cột o nước bị loại bớt nên s làm giảm áp suất trong bình chứa nên s tạo lực hút đệm HEPES sang để

bù vào lượng nước bị loại mất Kết quả là cứ bao nhiêu ml dung dịch cũ bị loại qua màng lọc thì s được bù vào bằng bấy nhiêu dung dịch đệm HEPES Theo hướng dẫn của nhà sản xuất thì với thể tích dung dịch đổi gấp 8 lần thể tích liposome thì s loại được hoàn toàn môi trường cũ Khi pH dịch lọc đạt 7,4 thì ngừng bổ sung đệm HEPES nhưng vẫn chạy bơm đến khi thể tích hỗn dịch liposome trong bình chứa mẫu bằng 70% so với ban đầu thì ngừng hút liposome và tiếp tục bơm hút dung dịch đệm HEPES qua cột để thu hồi các liposome còn bám ở màng lọc về Khi thể tích bình chứa mẫu đạt được thể tích ban đầu thì dừng bơm để kết thúc

Hình 2.4: Sơ đồ hệ thống lọc tiếp tuyến tự động