Đánh giá sự tương đồng trình tự ADN ribosom ITS giữa loài bạc căn với loài hà thủ ô trắng và sàng lọc tác dụng ức chế tế bào ung thư của bạc căn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRÌNH TỰ ADN RIBOSOM ITS GIỮA LOÀI BẠC CĂN VỚI LOÀI HÀ THỦ Ô TRẮNG VÀ SÀNG LỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRÌNH TỰ

ADN RIBOSOM ITS GIỮA LOÀI

BẠC CĂN VỚI LOÀI HÀ THỦ Ô TRẮNG

VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ

TẾ BÀO UNG THƯ CỦA BẠC CĂN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG TRÌNH TỰ

ADN RIBOSOM ITS GIỮA LOÀI

BẠC CĂN VỚI LOÀI HÀ THỦ Ô TRẮNG

VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ

TẾ BÀO UNG THƯ CỦA BẠC CĂN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH : HÓA SINH DƯỢC

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin phép được gửi lời cảm

ơn chân thành nhất tới :

TS Phùng Thanh Hương Ths Hà Thu

Những người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt và giúp đỡ

em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin nói lời cảm ơn chân thành tập thể các Thầy, các Cô trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp em trang bị kiến thức cần thiết để hoàn thành khóa học Thạc sĩ Cảm ơn các phòng ban, đặc biệt là Phòng sau đại học, đã giúp đỡ em nhiệt tình trong quá trình học tập

Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các chị kỹ thuật viên - bộ môn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp

em hoàn thành luận văn

Xin cảm ơn các anh, chị, em đang công tác tại Phòng Vi sinh phân tử Viện Công nghệ sinh học và Phòng Thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa Học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

-Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn luôn là động lực, là nguồn cổ vũ giúp em hoàn thành khóa học và luận văn tốt nghiệp

MỤC LỤC Trang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về ADN Ribosom ITS (ITS – rADN) 3

1.1.1 Cấu trúc của ADN Ribosom ITS 3

1.1.2 Vai trò của ADN Ribosom ITS 6

1.1.3 Ứng dụng của ADN Ribosom ITS trong nghiên cứu cây thuốc 7

1.2 Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 9

1.2.1 Vài nét về họ Thiên lí (Asclepiadaceae) 9

1.2.2 Vài nét về chi Streptocaulon 10

1.2.3 Loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 13

1.2.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng một số cây thuốc cùng thuộc phân họ Chu đằng, họ Thiên lý 13

1.2.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 126 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 16

2.1.1 Hóa chất, sinh phẩm 16

2.1.2 Trang thiết bị 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Thu mẫu và giám định tên khoa học 19

2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 20

2.2.3 Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR 21

2.2.4 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 22

2.2.5 Phương pháp tách dòng 22

2.2.6 Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli chủng TOP10F’ 24

2.2.7 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn 26

2.2.8 Phương pháp cắt ADN bằng enzym giới hạn 27

2.2.9 Phương pháp tinh sạch ADN plasmid 27

2.2.10 Phương pháp giải trình tự ADN 28

2.2.11 Phương pháp so sánh trình tự ADN 30

2.2.12 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Trình tự ADN ribosom vùng ITS của loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 34

3.1.1 Kết quả chiết tách ADN tổng số từ mẫu lá Bạc căn 34

3.1.2 Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR 34

3.1.3 Kết quả tạo dòng gen ITS-rADN 35

3.1.4 Kết quả tinh sạch plasmid tái tổ hợp 37

3.1.5 Kết quả xác định trình tự ADN ribosom vùng ITS của loài Bạc Căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 38

3.1.6 Kết quả so sánh trình tự ITS-rADN của loài Bạc căn với trình tự của loài Hà thủ ô trắng 39

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của loài Bạc Căn

(Streptocaulon kleinii Wight &Arn) 40

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin

ADN Acid deoxyribonucleic

ADNr ADN mã hóa cho ARN ribosom

ATCC American Type Culture Collection

bp Base pair

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s

medium DMSO Dimethylsulfoxid

dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylen diamin tetra acetic acid

EtBr Ethidium Bromid

FBS Foetal Bovine serum Huyết thanh bào thai bò HepG2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người ITS Internal Transcribed Spacer Vùng phiên mã nội

ITS- rADN Trình tự ADN ribosom

đoạn ITS IPTG Isopropyl β-D-1-

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid PCR Polymerase Chain Reaction

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SDS Sodium Dodecyl Sulphat

TAE Tris - Acetic acid - EDTA

Taq Thermus aquaticus

X-gal

5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2

của một số loài thực vật hạt kín 4 Bảng 2.1 Cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 16 Bảng 3.1 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn ở

nồng độ 5µg/mL trên dòng tế bào KB 41 Bảng 3.2 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn ở

nồng độ 5µg/mL trên dòng tế bào HepG2 41 Bảng 3.3 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn ở

nồng độ 5µg/mL trên dòng tế bào Lu 41 Bảng 3.4 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn ở

nồng độ 5µg/mL trên dòng tế bào MCF7 41 Bảng 3.5 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn

Bảng 3.6 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn

Bảng 3.7 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn

Bảng 3.8 Tỉ lệ % tế bào bị ức chế bởi cao chiết rễ cây Bạc căn

Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả thử độc tính tế bào của cao chiết rễ

cây Bạc căn trên 4 dòng tế bào ung thư khác nhau 47

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS 3

Hình 1.2 Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight & Arn) và Hà thủ ô

trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr)

12

Hình 2.1 Vector tách dòng PCR 2.1 23

Hình 2.2 Phản ứng chuyển MTT thành formazan 31

Hình 2.3 Các giếng tế bào sau khi xử lí với MTT 31

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số 34

Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR 35

Hình 3.3 Ảnh điện di thể hiện plasmid tách từ các dòng tế bào E.coli

sau khi biến nạp

Hình 3.8 Khả năng ức chế sự phát triển của cao chiết rễ cây Bạc căn

ở nồng độ 5µg/mL trên 4 dòng tế bào ung thư

42

Hình 3.9 Tác dụng của cao chiết rễ cây Bạc căn trên dòng tế bào KB 43 Hình 3.10 Tác dụng của cao chiết rễ cây Bạc căn trên dòng tế bào

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện quan hệ tiến hóa giữa một số loài thuộc

phân họ Chu đằng (Periplocoideae) ở Việt Nam

50

Sơ đồ 2.1 Các phương pháp nghiên cứu 19

ĐẶT VẤN ĐỀ

Một quy luật thường gặp trong nghiên cứu cây thuốc là: các loài thuộc cùng một bậc phân loại (loài, chi, họ) thường có đặc điểm chung về hình thái, thành phần hóa học và tác dụng sinh học Cơ sở khoa học của quy luật này chính là sự tương đồng về di truyền giữa các loài cùng bậc phân loại (taxon), đặc điểm di truyền tương tự nhau là yếu tố quan trọng dẫn tới sự giống nhau

về các tính trạng biểu hiện bên ngoài Mức độ tương đồng về trình tự ADN càng cao, thể hiện sự gần gũi về mức độ tiến hóa thì càng có sự tương đồng về hình thái, thành phần hóa học và tác dụng sinh học Do vậy, các chỉ thị phân

tử đã được sử dụng như một công cụ bổ sung hiệu quả cho các đặc điểm hình thái để phân loại thực vật cũng như xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Để đánh giá sự tương đồng về di truyền giữa các loài thực vật, một trong những chỉ thị phân tử thường được dùng để so sánh là trình tự ADN ribosom đoạn ITS (ITS-rADN), do tính chất vừa bảo thủ, vừa siêu biến giữa các loài [14], [18], [44]

Phân họ Chu Đằng là một trong hai phân họ chính của họ Thiên lí [2] Một số loài thuộc phân họ Chu đằng đã được nghiên cứu và sử dụng làm

thuốc ở nhiều nước trên thế giới như: Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas

Merr.) với tác dụng bồi bổ sức khỏe, chống ung thư, chữa sốt rét, lợi sữa [4], [11] và ức chế sự nhân lên của một số dòng tế bào ung thư [42], [43] Một

loài khác thuộc phân họ Chu đằng là Ẩn lân (Cryptolepis buchananii) cũng

được biết đến với tác dụng kháng khuẩn, chống ung thư [29] Trình tự một số đoạn ADN điển hình của hai loài này đã được công bố trên ngân hàng gen thế

giới Trong khi đó, loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight & Arn), mặc dù

cũng thuộc phân họ Chu đằng nhưng hầu như chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và trình tự ADN Đáng chú ý là có sự giống nhau về hình thái giữa Bạc căn và Hà thủ ô trắng Do đó, theo kinh nghiệm

dân gian, khi thu hái Hà thủ ô trắng để làm thuốc, người dân thường thu hái lẫn với Bạc căn Liệu sự tương đồng về hình thái giữa Bạc căn và Hà thủ ô trắng có liên quan đến sự tương đồng cao về trình tự ADN giữa hai loài này

và các loài cây thuốc khác cùng phân họ? Mặt khác, nếu trình tự đoạn rADN của loài Bạc căn được xác định sẽ giúp cung cấp thêm dữ liệu về mối quan hệ di truyền cũng như đánh giá đa dạng di truyền của các loài cây thuộc phân họ Chu đằng nói riêng và họ Thiên lý nói chung

ITS-Hơn nữa, bên cạnh sự giống nhau về hình thái, liệu Bạc căn có tác dụng chữa bệnh giống như Hà thủ ô trắng hay không?

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Đánh giá sự tương đồng trình tự đoạn ADN ribosom ITS giữa loài

Bạc căn với loài Hà thủ ô trắng và sàng lọc tác dụng ức chế tế bào ung thư của Bạc căn”

Nhằm các mục tiêu sau:

- Xác định trình tự nucleotid đoạn ADN ribosom ITS của loài Bạc căn

(Streptocaulon kleinii Wight & Arn) thu hái ở tỉnh Hòa Bình

- So sánh trình tự đoạn ADN ribosom ITS của loài Bạc căn

(Streptocaulon kleinii Wight & Arn) với trình tự đoạn ADN ribosom ITS đã công bố của loài Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas)

- Sơ bộ sàng lọc tác dụng ức chế tế bào ung thư của rễ cây Bạc căn

(Streptocaulon kleinii Wight & Arn)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về ADN Ribosom ITS (ITS – rADN)

1.1.1 Cấu trúc của ADN Ribosom ITS

Để nghiên cứu về ADN thực vật, có ba loại ADN thường được chọn làm đối tượng nghiên cứu, đó là: ADN nhân, ADN lạp thể và ADN ty thể Trong số đó, ADN nhân tỏ ra có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phân loại thực vật bởi ADN nhân có mức độ tiến hóa nhanh hơn, cho phép phân tích được sự khác biệt về di truyền ngay cả giữa các loài trong cùng một chi hay giữa các

cá thể của cùng một loài Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và hai vùng phiên mã nội (internal transcribed spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp về trình tự nucleotid [14]

Vùng phiên mã nội ITS của ADN ribosom được sử dụng phổ biến cho nghiên cứu phân loại loài của thực vật hạt kín Vùng ITS có ba phần: ITS1, 5,8S và ITS2 (hình 1.1.), trong đó tiểu đơn vị 5,8S là vùng có trình tự bảo tồn tiến hóa cao

Vùng ITS Hình 1.1 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [16]

Ở một số loài thực vật có hoa, kích thước của vùng ITS1 và ITS2 thường nhỏ hơn 300bp (ITS1: 187-298bp; ITS2 : 187-252bp), với các loài động vật có xương sống thì ngược lại Vùng tiểu phân 5,8S có kích thước không đổi là 163-164bp Ở thực vật, kích thước của toàn bộ vùng ITS xấp xỉ 500-700bp ở thực vật hạt kín và khoảng xấp xỉ 1500-3700bp ở thực vật hạt trần [14]

Vùng ITS1 thường có kích thước lớn hơn vùng ITS2, ví dụ như ở một

số loài sau: Adoxaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Canellaceae, Malvaceae, Onagraceae, Polemoniaceae, Ranunculaceae, Salicaceae, Saxifragaceae, Styracaceae và Winteraceae Ngược lại, ở một số loài vùng ITS2 có kích thước lớn hơn vùng ITS1 như: Betulaceae, Cucurbitaceae, Scrophulariaceae

và Viscaceae Ở loài Solanaceae, hai vùng này có kích thước bằng nhau Đối với những họ lớn như: Fabaceae, Poaceae và Rosaceae, vùng ITS1 có kích

thước dài hơn hoặc ngắn hơn vùng ITS2 Vùng ITS1 và ITS2 khác nhau cả về kích thuớc và % GC, mặt khác trình tự nucleotid của vùng ITS2 tiến hoá nhanh hơn vùng ITS1 [21]

Bảng 1.1 Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2

của một số loài thực vật hạt kín [16]

Loài

Kích thước (bp)

% G+C Kích thước

(bp)

% G+C

Adoxaceae, Viburnum, 28 loài 224-231 59-69 215-227 59-69

Apiaceae, Daucus, 1 loài 215 49 224 52

Apioideae 204-221 49-58 215-226 43-61

Asteraceae, Madiina, 42 loài 254-261 48-51 216-223 50-53

Asteraceae, Lactucea, 45 loài 246-253 52-54 220-222 53-58

Betulaceae, Alnu, 11 loài 215-216 58-64 228-229 53-65

Betulaceae, Betula, 3 loài 214-219 62-63 226-231 63-65

Betulaceae, Ostrya,1 loài 215 61 227 62

Brassicaceae, Arabidopsis,1

loài

268 57 187 55

Brassicaceae, Sinapis, 1 loài 265 51 188 54

Canellaceae, Canella, 1 loài 272 63 209 63

Fabaceae, Galegeae, 31 loài 221-231 55-60 207-217 50-54

Fabaceae, Vicia, 1 loài 235 52 208 50

Fabaceae, Vigna, 1 loài 205 60 220 59

Poaceae, Pooideae,10 loài 217-223 55-64 213-221 59-67

Poaceae, Sorghum, 1 loài 207 56 217 67

Poaceae, Oryza, 1 loài 194 73 233 77

Polemoniace, 38 loài 242-262 42-65 187-195 48-62

Ranunculace, 27 loài 214-246 198-216

Rosaceae, Fragaria, 1 loài 249 68 207 65

Rosaceae, Maloideae, 20 loài 208-221 65-72 211-224 67-72

Rosaceae, Prunus, 1 loài 242 62 209 69

Rosaceae, Rosa, 1 loài 249 60 207 57

Rosaceae, Spiraea, 1 loài 251 65 230 70

Salicaceae, Populus, 1 loài 214 67 207 70

Solanaceae, Nicotiana, 1 loài 216 69 217 65

Styracaceae, Styrax, 19 loài 255-264 208-221

Viscaceae, Arceuthobiu, 22

loài

208 31-36 226 30-37

Winteraceae, 11 loài 235-252 213-226

1.1.2 Vai trò của ADN Ribosom ITS

Trình tự nucleotid của vùng ITS vừa mang tính bảo thủ (ở đoạn 5,8S) vừa mang tính siêu biến (ở đoạn ITS1 và ITS2) nên cho phép phân biệt được

giữa các đơn vị ở bậc phân loại thấp (dưới giống - genus) Vùng ITS – rADN

là vùng gen mang nhiều biến dị có khả năng phản ánh quan hệ giữa những loài có nguồn gốc tiến hóa gần gũi trong khi đó trình tự nucleotid của vùng 18S có mức độ bảo thủ quá cao nên không đủ chi tiết để phân định giữa các

loài lân cận trong cùng chi [44]

Trình tự nucleotid vùng ITS đã được nghiên cứu nhiều và số lượng các trình tự nucleotid của vùng này đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới khá phong phú, thuận lợi cho phân tích so sánh

Một số ưu điểm khác của vùng ITS trong nghiên cứu phát sinh loài của thực vật hạt kín: thứ nhất là vùng ITS có độ lặp lại cao trong ADN nhân của thực vật, mỗi đoạn ADN được sắp xếp lặp lại hàng nghìn bản copy ở nhiễm sắc thể, số lượng trình tự lặp lại này thuận lợi cho việc phát hiện, khuếch đại, xác định trình tự ADN nhân Ưu điểm thứ hai và quan trọng nhất là xét từ quan điểm tái hiện cấu trúc phát sinh loài, sản phẩm PCR của ADN nhân có thể sử dụng cho thông tin nghiên cứu phát sinh loài của nhiều loài, thứ ba là vùng ITS có kích thước nhỏ (< 700bp ở thực vật hạt kín) nên dễ dàng khuếch đại [26]

Vùng ITS có một số ứng dụng như: tính toán các đột biến điểm trong quá trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự ADN, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài Trong thực tế, trình

tự ITS được coi là một công cụ hữu ích để thiết lập mối quan hệ di truyền giữa các loài và đánh giá sự đa dạng di truyền trong một bậc phân loại [21]

1.1.3 Ứng dụng của ADN Ribosom ITS trong nghiên cứu cây thuốc

Việc sử dụng các thảo dược và các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu làm thuốc là một xu hướng ngày càng phát triển Theo khảo sát của Trung Quốc, các dược liệu có tác dụng chữa bệnh bao gồm khoảng 11146 loài thuộc

2309 chi của 383 họ [46] Vì vậy cần có một công cụ hỗ trợ cho việc xác định các loài dược liệu để tránh nhầm lẫn, đảm bảo an toàn khi sử dụng Thuật ngữ

“mã ADN” được Hebert định nghĩa đầu tiên vào năm 2003, sau đó dành được

sự chú ý của giới khoa học Các nghiên cứu thường tập trung vào các đối tượng là các gen ở nhân Trong đó, vùng ITS là vùng thường được lựa chọn

nghiên cứu Kress và cộng sự đã nghiên cứu mối quan hệ chặt chẽ của 7 họ thực vật và 88 loài thuộc 88 chi trong 53 họ thực vật dựa vào trình tự ITS [18]

Sau đây là một số ví dụ ứng dụng đoạn ADN Ribosom ITS trong nghiên cứu cây thuốc:

* Chi Zanthoxylum có hơn 200 loài như Zanthoxylum piperitum, Zanthoxylum schinifolium và Zanthoxylum bungeanum Trong nền y học cổ

truyền của Trung Quốc, quả của các loài trong chi này được dùng làm thuốc

để điều trị đau thượng vị và thuốc bổ máu Zanthoxylum là một chi phức tạp

có nhiều điểm khác biệt giữa các loài, vì vậy phương pháp dựa vào các đặc tính hình thái bên ngoài và các đặc tính sinh lí không thể phân biệt một cách chính xác quan hệ của các loài Để giải quyết khó khăn này, ngày nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng trình tự gen để xác định hệ thống phát sinh loài Trong nghiên cứu của Sun Yan-Lin đã lựa chọn vùng ITS để phân biệt các loài trong

chi Zanthoxylum Kết quả nghiên cứu không những cung cấp trình tự ITS của loài Zanthoxylum piperitum mà còn giúp phân biệt được Zanthoxylum piperitum với loài Zanthoxylum schinifolium để giải thích quan hệ giữa các

loài trong chi Zanthoxylum [45]

* Một nghiên cứu khác trên chi Phyllanthus, với các dược liệu được dùng phổ biến trong điều trị viêm gan là P amarus, P niruri, P urinaria Tuy nhiên các loài trong chi Phyllanthus rất giống nhau về mặt hình thái vì

vậy rất khó phân biệt giữa các loài dược liệu này Vì vậy một nghiên cứu đã

xác định và so sánh trình tự ITS của các dược liệu P amarus, P niruri, P urinaria Kết luận khẳng định được P amarus và P niruri là hai loài độc lập,

đồng thời đưa ra những chỉ thị ADN đặc hiệu để nhận biết từng loài [31]

* Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu đã chứng minh cây

Trinh nữ hoàng cung (Crinum Latifolium), một loài thuộc họ Náng có chứa

các hợp chất alcaloid có tác dụng hỗ trợ trong việc điều trị một số bệnh như u

xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung rất hiệu quả Tuy nhiên, trên thực tế có rất nhiều loại cây cùng họ với Trinh nữ hoàng cung như cây Náng hoa trắng và cây Huệ biển do vậy rất dễ gây nhầm lẫn Để xác định chính xác cây Trinh nữ hoàng cung nhằm cung cấp nguyên liệu cho sản xuất các loại dược phẩm, thực phẩm chức năng, các nhà khoa học đã sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử

để định tên các loài thực vật Kết quả cho thấy khi sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen ITS, có thể xác định chính xác được đến cấp độ loài Trình tự nucleotid vùng ADN ribosom ITS của loài Trinh nữ hoàng cung

đã được đăng kí trên ngân hàng gen thế giới với mã hiệu AY139137 [13]

1.2 Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn)

1.2.1 Vài nét về họ Thiên lí (Asclepiadaceae)

Phân loại, vị trí họ Thiên lí

• Về phân loại:

Họ Thiên lí (Asclepiadaceae) là một trong những họ lớn và đa dạng trong

hệ thực vật Việt Nam cũng như trên thế giới Hệ thống phân loại của nhiều tác

giả đều xếp họ Thiên lí nằm trong bộ Long đởm [3], [4], [5]

Theo hệ thống phân loại phổ biến nhất hiện nay là hệ thống phân loại về

ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) của A Takhtajan thì họ Thiên lí thuộc lớp

Ngọc lan, phân lớp Hoa môi, bộ Long đởm [3]

Theo trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, trên thế giới có 290 chi và 2000 loài thuộc họ Thiên lí, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, một số ít ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới Ở Việt Nam có khoảng 50 chi và 110 loài Họ Thiên lý

gồm hai phân họ là: Periplocoideae và Cynanchoideae

• Về vị trí, họ Thiên lí được sắp xếp như sau:

C ụm hoa: thường là xim, có khi là chùm hoặc trông như tán Hoa đều,

lưỡng tính, mẫu 5 Đài 5, dính nhau ở gốc thành ống ngắn Tràng 5, dính liền thành ống, tiền khai hoa vặn, thường có phần phụ ở mặt trong và có tuyến mật Nhị 5, bao phấn dính với núm nhụy khối 5 mặt; hạt phấn dính nhau tạo thành khối 4 hạt phấn hoặc thành khối phấn có chuôi và gót dính để dính vào sâu bọ, chúng đưa khối phấn này vào sang hoa khác để thụ phấn cho hoa sau

Bộ nhụy gồm 2 lá noãn, bầu trên, rời nhau ở bầu và vòi, chỉ dính nhau ở núm ngụy, nhiều noãn

Quả: quả gồm 2 đại Hạt thường có mào lông ở một đầu [3]

1.2.2 Vài nét về chi Streptocaulon

Trên thế giới, phân họ Chu đằng (Periplocoideae) có 33 chi với 195 loài [20], ở Việt Nam gồm 11 chi với 16 loài Chi Streptocaulon thuộc phân họ Chu đằng (Periplocoideae), họ Thiên lí (Asclepiadaceae) [3]

Đặc điểm thực vật chi Streptocaulon

Chi Streptocaulon thường dưới dạng cây cỏ hay cây bụi leo Lá mọc đối

Cụm hoa xim các chùy, tam phân, không cuống hay có cuống theo trật tự khác nhau, thường có lông mềm, ở nách những lá mọc đối và ở ngọn; cuống hoa thường có lông nhung; nụ rất nhỏ, hoa rất nhỏ Đài nhỏ, chia 5 với 5 vảy

ở gốc phía trong Tràng hình bánh xe; ống rất ngắn, thùy hình trái xoan, hơi phủ sang bên phải Tràng phụ gồm có 5 sợi đính trên lưng của các chỉ nhị, Nhị đính ở gốc của tràng; chỉ nhị ngắn, xen kẽ với các tuyến nhỏ; bao phấn thuôn, dính ở đỉnh của vòi nhụy lõm ở giữa; phần phụ trung đới nhỏ, dính ở đỉnh của vòi; chuôi gồm những tuyến dính gắn gần đỉnh của vòi nhụy; khối phấn 2 trong mỗi ô, gồm những hạt lớn chứa mỗi cái 3-4 hạt phấn xếp thành hàng hay tứ tử Nhụy gồm 2 lá noãn, rời, vòi nhụy ngắn; đầu nhụy có 5 góc Quả gồm 2 quả đại Có lông mềm; hạt dẹp, mang một mào lông mềm, vỏ

mỏng, phôi nhũ hẹp; lá mầm xoan - thuôn [5]

Phân bố và vị trí của chi Streptocaulon

• Phân bố

Có khoảng 5 loài phân bố ở Châu Á Ở Việt Nam có 3 loài:

Streptocaulon juventas (Lour.) Merr - Hà thủ ô nam, Streptocaulon kleinii Wight & Arn - Bạc căn, Streptocaulon wallichii Wight - Bạc căn wallich

[2]

Theo Trần Thế Bách, khi so sánh hình thái - một phương pháp truyền thống trong phân loại thực vật đã xác định khóa định loại các loài của chi

Streptocaulon ở Việt Nam như sau [2]:

1A Cuống hoa có lông

2A Gân bên 14-20 cặp Cơ quan truyền phấn dài khoảng

350µm 1 S Juventas

2B Gân bên ít hơn 13 cặp Cơ quan truyền phấn dài khoảng

540µm 2 S Kleinii 1B Cuống hoa nhẵn 3 S Wallichii

Như vậy, có thể thấy hai loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight & Arn) và Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr) có nhiều đặc

điểm hình thái tương tự nhau (Hình 1.2)

Hình 1.2 Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight & Arn) và Hà thủ ô

trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) Merr)

1.2.3 Loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn)

• Đặc điểm thực vật

Dây leo, thân có lông, dày ở ngọn, lúc già có mủ trắng Lá có phiến bầu dục thon ngược, rộng ở phần trên, mặt dưới đầy lông trắng, mặt trên có lông thưa, cuống 4-5 mm Tụ tán kép, nụ cao 3,5 mm, vành hình thúng, không có lông ở trong, màu hoe Mang nang cụng đầu, dày 10-11 cm, hột dài 3-4 mm, lông mào dài 2 cm [8]

• Phân bố

Ninh Thuận (Phan Rang), Bình Thuận (Phan Thiết), Bình Dương, Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu (Vũng Tàu) Còn có ở Campuchia, Thái Lan [1]

 Vị trí phân loại (dựa trên đặc điểm hình thái)

1.2.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng một số cây thuốc cùng thuộc

phân họ Chu đằng, họ Thiên lý

Trong số các loài thuộc phân họ Chu đằng (Periplocoideae), dược liệu

Trong y học cổ truyền, dịch chiết nước rễ cây Hà thủ ô trắng dùng giải độc, chữa cảm sốt, trị vết sưng đau, vết thương do rắn cắn [4], [11].Mặt khác, dịch chiết Hà thủ ô trắng có khả năng ức chế sự phát triển của kí sinh trùng sốt rét

Plasmodium falciparum chủng FCR-3 kháng chloroquin [41] Các thử nghiệm

về hoạt tính kháng ung thư cho thấy dịch chiết methanol rễ cây Hà thủ ô trắng

có độc tính chọn lọc đối với năm dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư cổ tử cung người Hela, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào ung thư chuột colon 26-L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC và tế bào ung thư ruột kết chuột B16-BL6 [42], [43] Nghiên cứu của Bùi Xuân Hào và cộng sự đã xác định và phân lập được các thành phần hóa học của rễ cây Hà thủ ô trắng [7] Một loài

khác thuộc phân họ Chu đằng là Ẩn lân (Cryptolepis buchananii) cũng được

biết đến với tác dụng chống viêm, kháng khuẩn [28], [29], điều hòa miễn dịch, ức chế tế bào ung thư [27] Các loài này được liệt kê trong danh mục cây thuốc ở nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc, Mỹ, Philipin Trên ngân hàng gen quốc tế đã công bố trình tự ADN Ribosom ITS của cây Hà thủ ô trắng với mã hiệu DQ916865 và Ẩn lân với mã hiệu DQ916838 [24] Điều này gợi ý cho việc tiếp tục nghiên cứu các loài khác

thuộc phân họ Chu đằng (Periplocoideae), họ Thiên lí (Asclepiadaceae) để

xem xét sự tương đồng, từ đó mở ra triển vọng nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng chống ung thư, sốt rét, của các loài thực vật vốn rất phổ biến ở Việt Nam

1.2.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn)

Hiện nay trên thế giới và Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về loài Bạc

căn (Streptocaulon kleinii Wight &Arn) Một điều đáng chú ý là khi thu hái

Hà thủ ô trắng để làm thuốc ở nhiều vùng của nước ta, người dân vẫn thu hái

cả loài Bạc căn là một loài cùng chi Streptocaulon với nhiều đặc điểm hình

thái tương tự như Hà thủ ô trắng Trình tự ADN của Bạc căn cũng chưa hề được công bố trên thế giới Vì vậy, tiến hành xác định trình tự ADN Ribosom

ITS và đánh giá tác dụng sinh học của loài Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight&Arn) là bước đầu quan trọng để có thể mở ra triển vọng nghiên cứu và

khai thác đối với một loài thực vật sẵn có ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1 Hóa chất, sinh phẩm

Mẫu tách ADN tổng số: cây Bạc căn (Streptocaulon kleinii Wight

&Arn) thu hái tại Hòa Bình vào tháng 8 năm 2010, được giám định tên khoa học dựa trên các đặc điểm hình thái bởi phòng Tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật Mẫu lá tươi của cây Bạc căn được làm sạch và làm khô bằng silicagel

Mồi dùng cho phản ứng PCR: cặp mồi ITS4 và ITS5 được đặt mua của Bioneer (bảng 2.1.)

+ Dung dịch tách plasmid:

- Sol I: Tris HCL, pH 8:25mM, EDTA, pH 8: 10mM, glucose:50mM

- Sol II: NaOH:0,2M, SDS: 1%

- Sol III: đệm acetat kali 3M, pH 5,5

- Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1)

- Dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA)

+ Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB, g/L):

- LB lỏng (g/L): Cao nấm men:5g, trypton:10g, NaCl:5g, pH 7,4 (chỉnh bằng NaOH 5N)

- LB đặc (g/L): Cao nấm men:5g, trypton:10g, NaCl:5g, agar:15g

+ Hóa chất dùng cho điện di ADN:

- Dung dịch đệm điện di TAE 1X: lấy từ dung dịch gốc TAE 50X có thành phần như sau: Tris base:121g, acid acetic băng: 28,6mL, 0,5M EDTA pH 8,0:50mL, nước khử ion vừa đủ: 500mL

- Gel Agarose 1%: 1 gam agarose, bổ sung 100mL đệm TAE 1X, làm tan agarose trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút Để nhiệt độ hạ xuống khoảng

500C rồi đổ ra khay điện di đã có lược tạo giếng tra mẫu

- Ethidum bromid (EtBr) dung dịch mẹ: 10mg/mL Hòa 1 gam EtBr vào 100mL H20 Khuấy từ từ cho tan đều Giữ trong lọ màu ở nhiệt độ phòng Khi dùng pha 20µL dung dịch mẹ trong 100mL đệm TAE 1X

- Đệm tra mẫu ADN 5X: Tris-HCl 1M pH 8,0 : 1mL EDTA 0,5 M pH 8,0: 0,2mL, glycerol: 2mL, xanh bromophenol 1%: 2mL

+ Bộ kit chiết tách ADN thực vật Plant Tissue (Solution Type) của hãng Solgen Co.Ltd

+ Để tách dòng gen, sử dụng bộ kit TA cloning kit (Invitrogen) Trong bộ kit này gồm các thành phần : vector PCR 2.1 (đã mở vòng có đầu dính T), enzym

T4-ligase, đệm ligase 10X, tế bào E.coli chủng TOP10F’

+ Bộ kit tinh sạch vector tái tổ hợp phục vụ cho mục đích giải trình tự gen (Fermentas)

+ C¸c dßng tÕ bµo ung th− ë ng−êi ®−îc cung cÊp bëi ATCC gåm: KB (Human epidermic carcinoma) - ung th− biÓu m«; Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) -

ung th− gan; Lu (Human lung carcinoma) – ung th− phæi vµ MCF7 (Human breast carcinoma) - ung th− vó

+ Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM, RPMI-1640, huyết thanh FBS,

+ Dung môi chiết xuất dược liệu: methanol

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1 Các phương pháp nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu

Giải trình tự gen ITS- rADN

Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư

Cao chiết methanol

Đun hồi lưu, lọc nóng, cất quay ở áp suất giảm

Biến nạp ADN plasmid vào

E.coli

Cắt plasmid bằng enzym EcoRI

Tách chiết ADN plasmid

Gắn ITS-rADN vào PCR 2.1

Điện di agarose

Điện di agarose

2.2.1 Thu mẫu và giám định tên khoa học

Việc giám định tên khoa học được tiến hành theo phương pháp hình thái truyền thống, so sánh với mẫu tiêu bản của phòng Tiêu bản thực vật, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Khoa học công nghệ Việt Nam

2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

Quy trình tách chiết ADN sử dụng bộ kit chiết tách ADN thực vật Plant Tissue (Solution Type) của hãng Solgen Co Ltd gồm các bước sau:

- Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng dụng cụ nghiền Tissue Lyser II

- Chuyển mẫu đã nghiền vào ống 1,5mL

- Thêm 300µL dung dịch ly giải tế bào vào mẫu

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút

- Chuyển dịch trong sang ống 1,5 mL chứa 300µL isopropanol 100%

- Lắc đảo 50 lần nữa

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút (các vi hạt ADN sẽ tạo thành và lắng xuống)

- Loại bỏ dịch nổi, làm khô ống bằng giấy thấm sạch

- Thêm 500µL ethanol 80% và lắc đảo vài lần để rửa sạch hạt ADN

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút Đổ từ từ dịch ethanol

- Làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Thêm 40µL ADN Hydration Solution vào hạt ADN

- Hydrat hóa ADN bằng cách ủ mẫu ở 650C trong 1h

- Bảo quản ADN ở -200C đến -800C [37]

2.2.3 Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR

+ Nguyên tắc: Sử dụng kĩ thuật PCR Một đoạn gen có trình tự xác

định được khuếch đại từ một khuôn ADN dựa trên sự lai đặc hiệu của cặp mồi

và ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung và phản ứng kéo dài chuỗi nhờ enzym ADN polymerase Kết quả là tạo thành một số lượng lớn bản sao ADN sau một số chu kì nhiệt trong thời gian ngắn

ADN khuôn (50ng) 2,0 Tổng thể tích 25

- Chu trình nhiệt của phản ứng:

2.2.4 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose

+ Nguyên tắc: Các đoạn ADN mang điện tích âm nên di chuyển trong

điện trường từ cực âm sang cực dương Trên bản gel agarose, các đoạn ADN

có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường Nhuộm ADN bằng ethidium bromid để quan sát ADN dưới đèn tử ngoại

254nm

+ Tiến hành: Đặt bản gel agarose vào trong máy điện di có dung dịch

đệm TAE 1X, tra mẫu ADN cùng với chất chỉ thị xanh bromophenol vào giếng trên bản gel Chạy điện di ở điện thế 110V Sau đó nhuộm bản gel bằng ethidium bromid, rửa sạch bằng nước cất rồi quan sát dưới đèn tử ngoại 254nm

2.2.5 Phương pháp tách dòng

Sản phẩm PCR có đầu dính A do hoạt tính Terminal transferase của Taq ADN polymerase Dựa vào đặc tính đó, hãng Invitrogen đã thiết kế vector tách dòng PCR2.1 đã mở vòng, có đầu dính T Do đó, sản phẩm PCR

và vector có khả năng liên kiết với nhau theo nguyên tắc bổ sung giữa A và T Vector này có sơ đồ cấu trúc như sau:

Hình 2.1 Vectơ tách dòng PCR 2.1

Để sàng lọc các thể biến nạp, vector được thiết kế mang các gen như gen kháng kháng sinh và gen chứa một operon phân giải đường, nhờ vậy có thể dễ dàng nhận ra trong môi trường có chứa kháng sinh và cơ chất đặc hiệu (X-gal)

Tách dòng đoạn ADN ribosom ITS được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR 2.1, sử dụng bộ sinh phẩm tách dòng của hãng Invitrogen

Sau đó sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E.coli chủng TOP10F’

để cấy trải trên môi trường LB có bổ sung ampicillin và X-gal, sau đó ủ 370C

qua đêm Các khuẩn lạc E.coli chứa vector tách dòng PCR 2.1 tái tổ hợp

mang sản phẩm PCR sẽ có màu trắng

2.2.6 Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli

chủng TOP10F’

Nguyên lý: Tế bào vi khuẩn được hoạt hóa nhờ nuôi cấy trong môi trường

đến đầu pha log Khi nhiệt độ thay đổi đột ngột, làm tính thấm màng tế bào thay đổi cho phép tế bào nhận ADN ngoại lai Sau đó, cấu trúc màng tế bào hồi phục lại và giữ ADN ngoại lai trong tế bào Các tế bào mang ADN tái tổ hợp được phát hiện trên môi trường chọn lọc có kháng sinh thích hợp và chất chỉ thị màu X-gal

Ở thí nghiệm này chúng tôi sử dụng phương pháp sốc nhiệt với sự có mặt CaCl2

Quá trình này bao gồm hai giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp

a) Tạo tế bào khả biến

- Lấy chủng tế bào được cất giữ ở -750C

- Cấy vạch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc, ủ đĩa cấy qua đêm ở 370C

để thu lấy khuẩn lạc riêng rẽ Tách một khuẩn lạc nuôi cấy trong 2mL môi trường LB lỏng

- Cấy chuyển 2% dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 2mL môi trường LB lỏng Nuôi lắc ở 370C, 200 vòng/phút trong 90 phút

- Kiểm tra mật độ tế bào sao cho OD600 đạt 0,6-1,0

- Chuyển dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút

- Ly tâm thu sinh khối (5000 vòng/phút, 40C trong 10 phút)

- Loại dịch nổi, đặt ống chứa tế bào trên đá 10 phút

- Hòa tan cặn tế bào trong 1mL CaCl2 100mM

- Đặt lại ống tế bào trên đá 30 phút

- Ly tâm thu tế bào 3000 vòng/phút trong 10 phút

- Hòa lại tế bào trong 60µL CaCl2 100mM

- Để ống tế bào trên đá trước khi sử dụng khoảng 2-3 giờ

- Nếu muốn bảo quản lâu ngày, bổ sung glycerol đến nồng độ 30%

- Bảo quản ở -750C [37]

b) Biến nạp

Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp vào tế bào thể nhận Cơ chế biến nạp bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để ADN plasmid dễ dàng chui vào tế bào thể nhận Quá trình biến nạp ADN plasmid

vào tế bào E.coli chủng TOP10F’như sau:

- Lấy ống tế bào khả biến đặt trên đá 30 phút

- Trộn 4µL vector tái tổ hợp vào ống tế bào khả biến, sau đó để trên

đá 30 phút

- Sốc nhiệt ở 420C trong 45 giây, sau đó đặt ống tế bào trên đá và để 2 phút

- Bổ sung 250µL môi trường LB lỏng, sau đó nuôi cấy với tốc độ 200 vòng/phút ở 370C trong 1 giờ

- Cấy trải 150µL trên môi trường thạch LB đặc có ampicillin và gal

X Ủ đĩa ở tủ ấm 370C qua đêm

2.2.7 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn

- Chọn 4 khuẩn lạc trắng và 2 khuẩn lạc xanh, cấy mỗi khuẩn lạc vào 2mL môi trường LB lỏng có chứa ampicillin (nồng độ 100µg/mL) Nuôi lắc qua đêm ở 370C, 200 vòng/phút

- Thu 1,5mL dịch nuôi cho vào ống eppendorf 1,5mL Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào

- Bổ sung 150µL Sol I (Tris-HCl 50mM, pH 8.0; EDTA 10mM, pH 8.0), vortex

- Bổ sung tiếp 150µL Sol II (200mM NaOH; SDS 1%), đảo nhẹ

- Bổ sung tiếp 150µL Sol III (kac-potasium acetat 3M, pH 5,5), đảo nhẹ

- Thêm 450µL chloroform:isoamylalcohol (24:1), đảo nhẹ

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút

- Hút 400µL dịch nổi ở pha trên cùng sang 1 ống eppendorf loại 1,5mL Bổ sung 40µL NaOAC 3M, pH 5,2 và 1mL ethanol 100%

- Tủa DNA ở - 200C trong thời gian 2 giờ

- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, thu cặn

- Rửa cặn bằng 500µL ethanol 70%

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút, thu cặn