Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155 16

Qua những nghiên cứu ban đầu cho thấy chủng Streptomyces 155.16 do bộ môn Vi sinh- Sinh học cung cấp có hoạt tính kháng sinh mạnh và ổn định, phổ rộng và có nhiều tiềm năng trong thực t

- 3 -

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu, người

đã trực tiếp hướng dẫn, ân cần chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, cán bộ kĩ thuật viên bộ

môn Vi sinh và Sinh học, bộ môn Công nghiệp dƣợc trường Đại Học Dược Hà Nội

đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin cảm ơn đến ban giám hiệu cùng các thầy cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tạp và hoàn thành đề tài cao học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong suốt thời gian qua

Do thời gian có hạn, nên trong bài luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và bạn bè để đề tài được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2011 Học viên

Nguyễn Thị Cẩm Vân

- 4 -

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của KS 2

1.1.4 Ứng dụng của chất kháng sinh 3

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 4

1.2.1 Một số đặc điểm 4

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 5

1.2.3 Phân loại chi Streptomyces 6

1.3 Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh 6

1.3.1 Chọn lọc ngẫu nhiên 6

1.3.2 Đột biến nhân tạo 6

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 7

1.4.1 Lên men bề mặt 7

1.4.2 Lên men chìm 7

1.5 Chiết tách, tinh chế 9

1.5.1 Chiết xuất 9

1.5.2 Tách và tinh chế 9

1.6 Nghiên cứu cấu trúc KS bằng đo phổ 10

1.6.1 Phổ hồng ngoại 10

1.6.2 Phổ tử ngoại 11

1.6.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 11

1.6.4 Khối phổ 12

1.7 Phân loại, xác định tên xạ khuẩn bằng kỹ thuật gen 12

- 5 -

1.7.1 Kỹ thuật nhân gen PCR 13

1.7.2 Phương pháp giải trình tự gen 14

1.8 Một số nghiên cứu liên quan 16

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên liệu 19

2.1.1 Chủng xạ khuẩn 19

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 19

2.1.3 Các công thức môi trường 19

2.1.4 Vật liệu dùng trong sắc ký 20

2.1.5 Một số dụng cụ, máy móc 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp nuôi và giữ giống trong ống nghiệm 21

2.2.2 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên 21

2.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 22

2.2.4 Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 23

2.2.5 Phương pháp lên men gián đoạn 23

2.2.6 Phương pháp chiết xuất kháng sinh 24

2.2.7 Xác định cấu trúc phân tử kháng sinh bằng phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối 25

Chương 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 26

3.1 Nghiên cứu cải tạo giống và lên men sinh tổng hợp kháng sinh 26

3.1.1 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 26

3.1.2 Đột biến lần 1 27

3.1.3 Đột biến lần 2 28

3.2 Kết quả lên men chìm 29

3.2.1 Chọn môi trường lên men chìm 29

3.2.2 Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trong môi trường MT1dd 29

3.3 Chiết tách, tinh chế và nghiên cứu thành phần KS 30

- 6 -

3.3.1 Chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 30

3.3.2 Sắc ký lớp mỏng thăm dò các thành phần kháng sinh từ dịch lọc 33

3.3.3 Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột 33

3.4 Sơ bộ xác định cấu trúc phân tử KS 40

3.4.1 Kết quả phổ hồng ngoại 40

3.4.2 Kết quả phổ hồng ngoại 40

Chương 4- BÀN LUẬN 42

4.1 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 155.16 42

4.2 Chiết xuất và tinh chế kháng sinh 43

4.3 Biện giải phổ của thành phần kháng sinh chính 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 PHỤ LỤC

- 7 -

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

ATCC American Type Culture Collection

NMR Nuclear magnetic resonance

PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)

- 8 -

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 2

Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định 20

Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn [g/100ml] 21

Bảng 3.5: Kết quả chọn lọc tự nhiên chủng Streptomyces 155.16 26

Bảng 3.6: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần 1 27

Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần 2 28

Bảng 3.8: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng sinh trong các môi trường

Bảng 3.10: Kết quả chọn dung môi và pH chiết kháng sinh 31

Bảng 3.11:Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng sắc ký lớp

mỏng

33

Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký cột lần 1 34

Bảng 3.13: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký cột lần 2 36

Bảng 3.14: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký cột lần 3 37

Bảng 3.15: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký với hệ dung

trong đó chủ yếu do chi Streptomyces sản xuất Đây là chi xạ khuẩn lớn, gồm nhiều vi

sinh vật có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, một số loài có khả năng sinh tổng hợp các chất chữa ung thư, điều trị HIV Do đó, chi xạ khuẩn này đang được nước ta tập trung nghiên cứu

Qua những nghiên cứu ban đầu cho thấy chủng Streptomyces 155.16 do bộ môn

Vi sinh- Sinh học cung cấp có hoạt tính kháng sinh mạnh và ổn định, phổ rộng và có

nhiều tiềm năng trong thực tế nên chúng tôi chọn đề tài: ”Nghiên cứu quá trình sinh

tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.16” với các mục tiêu:

1 Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh của

chủng Streptomyces 155.16

2 Chiết tách, tinh chế, nghiên cứu và sơ bộ xác định cấu trúc của thành phần

kháng sinh của chủng Streptomyces 155.16

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

- lactam Penicillin, Cephalexin

Phenicol Chloramphenicol

Aminosid Streptomycin, Tobramycin

Macrolid Erythromycin, Clarithromycin

Lincosamid Lincomycin, Lindamycin

Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin

Quinolon Floxacin, Levofloxacin

Cotrimoxazol Cotrimoxazol

1.1.3 Cơ chế tác dụng của KS

Các KS tác động đến các quá trình sinh tổng hợp của tế bào [4]:

 Ức chế quá trình tổng hợp vách của VK (penicillin, bacitracin, vancomycin )

 Ức chế chức năng của màng tế bào (colistin, polymycin, amphotericin )

 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein (Aminoglycosid, Macrolid, tetracyclin )

 Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic (Actinomycin, rifamicin, )

- 11 -

 Ức chế trao đổi chất hô hấp (Antimycin, Oligomycin )

 Ức chế trao đổi chất trung gian (Sulfamid )

1.1.4 Ứng dụng của chất kháng sinh

 Ứng dụng trong y học:

Có rất nhiều KS đã được phát hiện và ứng dụng trong y học, nhờ có KS mà con người đã khống chế và loại bỏ được nhiều bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, thương hàn,…

Một số kháng sinh còn được chỉ định trong điều trị các bệnh nấm trên da, tóc, niêm mạc như: nystatin, amphotericin, natamicin,… KS điều trị ung thư là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và phát triển trong y học như Actinomycin D, Doxorubicin

một kháng sinh chiết xuất từ S peucetius, Bleomycin CKS từ S verticillius… [25]

 Ứng dụng trong nông nghiệp [24]

Trong nông nghiệp, KS được sử dụng làm thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ (cycloheximide) hoặc thuốc điều hòa sinh trưởng cho cây trồng

Các KS có nhiều ưu điểm so với thuốc hóa học như: có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao chỉ tiêu diệt một hoặc một số loài sâu nhất định nên không ảnh hưởng đến các VSV có ích khác Sử dụng KS trong bảo vệ thực vật đang ứng dụng nhiều trên thế giới và dần thay thế các chất hóa học độc hại

Nhật Bản đã sản xuất trên quy mô công nghiệp hơn 10 chất KS dùng trong bảo

vệ cây trồng như: Blasticidins (KS chiết từ S griseochromogenes), Kasugamycin (do

S kasugaensis tạo ra) để tiêu diệt Piricularia oryzae gây ra bệnh vàng lùn [5]

 Ứng dụng trong chăn nuôi

KS được dùng để phòng và trị bệnh cho động vật, như griseoviridin chữa viêm phổi cấp ở trâu bò Một số KS được sử dụng như những bổ sung thức ăn trong chăn nuôi (Monenzin, thiopeptin )

 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Thực phẩm đóng hộp sử dụng KS để tăng thời gian bảo quản (Tylosin, nizin, pimaricin )

cả trong cơ chất mà VK và nấm mốc không phát triển được [14]

* Khuẩn lạc

Xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: KS, enzym, vitamin, acid hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra

trong MT [7], [13], [15], [23]

* Khuẩn ty

Trên MT đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại:

- Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất - substrate mycelium) với chức năng dinh dưỡng

- Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng sinh sản

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ

có hệ sợi khí sinh Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng

* Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là VK Gram dương Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm các lớp: peptidoglycan bao gồm các gốc N - acetyl glucozamin liên kết với N - acetyl muramic acid bởi các tetrapeptid, ngoài ra có thể có thêm L- DAP, meso-DAP, Glycin…[7], [13], [15], [23]

- 13 -

Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudani II và các hạt polysaccharid bắt màu với dung dịch lugol)

Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở VK tỷ lệ này chỉ là 25- 45% [7]

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces

Streptomyces làm một chi thuộc bộ Actinomycetales, với hệ sợi sinh dưỡng phân

nhánh, ít khi đứt đoạn, đường kính từ 0,5-2,0 m

Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Sợi cơ chất mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi HSKS dạng phấn, đôi khi

có tính kỵ nước

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử theo hai phương pháp

phân đoạn và cắt khúc Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử với hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng Màu sắc của khuẩn lạc

và hệ sợi khí sinh khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces và môi trường nuôi cấy

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces là VK Gram dương, hiếu khí, dị

dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25- 30C, pH tối ưu 6,5 - 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh)

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các KS ức chế VK, vi

nấm, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật [7], [8]

1.2.3 Phân loại chi Streptomyces

Có nhiều khóa phân loại chi Streptomyces như khóa phân loại của Waksman,

Gauze Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế (ISP)

do Shirling và Gottlieb đề xuất năm 1970 đã được sử dụng rộng rãi để phân loại xạ khuẩn thuộc chị này Khóa phân loại này dựa trên các đặc điểm :

- Màu sắc khuẩn lạc

- Màu của khuẩn ty cơ chất

- 14 -

- Sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan

- Hình dạng chuỗi bào tử

- Bề mặt bào tử

- Khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon

Ngoài ra, kĩ thuật xác định trình tự gen đã và đang được áp dụng để phân loại

Streptomyces [13], [28]

1.3 Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh

Cải tạo giống để thu được các chủng có hoạt tính cao và ổn định đưa vào sản

xuất Có 2 phương pháp cải tạo giống: [5], [19]

1.3.1 Chọn lọc ngẫu nhiên

Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo các tần số khác nhau trong đó có các cá thể

có hoạt tính KS mạnh hơn 10-20% so với các cá thể khác

Chọn lọc những biến chủng ngẫu nhiên do tác động của những điều kiện ngoại cảnh nhằm lấy những chủng phát triển và STH tốt nhất trên cơ sở kế thừa thế hệ trước

1.3.2 Đột biến nhân tạo

Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến nhân tạo:

- Tác nhân hóa học: hydroxylamin, ethylenimin, nitroso – guanidine, HNO2

- Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia nơtron hay electron

- Tác nhân sinh học: đột biến do hiện tượng thiếu các base nitơ hay các tác nhân sinh học biến đổi gen

Sau khi bị xử lý với tác nhân đột biến, phần lớn các VSV chết Các cá thể sống sót sẽ có sự biến đổi nhiễm sắc thể, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến mất (giảm) khả năng tạo KS (đột biến âm tính) hoặc tăng khả năng sinh KS (đột biến dương tính) Tiến

hành sàng lọc ngẫu nhiên để chọn biến chủng tốt nhất để nghiên cứu [33]

1.4 Lên men sinh tổng hợp KS

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động sống của VSV nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp

chất trung gian cần thiết cho chúng [5], [7], [9], [18]

- 15 -

Trong công nghệ KS sử dụng hai phương pháp lên men chính:

1.4.1 Lên men bề mặt

hấp thu các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng O2 của không khí để hô hấp trên bề mặt MT Như vậy yêu cầu bề mặt MT phải đủ rộng và không quá sâu (5-10 cm)

 Nhược điểm: mặt bằng lớn, hiệu suất thấp, khó tự động, cơ giới hóa, chi phí cho một

đơn vị sản phẩm cao

Do đó, lên men bề mặt không ứng dụng trong công nghiệp sản xuất KS mà chỉ áp dụng trong nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm

1.4.2 Lên men chìm

trong lên men là tế bào dinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao Vì vậy, trước khi lên men phải tiến hành chế tạo giống Tỷ lệ giống so với MT lên men thường dùng 1-10%

Quá trình lên men làm thay đổi các điều kiện ban đầu của MT như pH, nồng độ các thành phần trong MT, các sản phẩm trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt Để đảm bảo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta đưa ra một

số biện pháp: dùng dung dịch đệm để ổn định pH, thêm các chất phá bọt

- Lên men gián đoạn (lên men mẻ, lên men chu kỳ): Lên men dịch thể, VSV trưởng thành trong một hệ thống đóng với đường cong sinh trưởng thường gồm 4 pha (pha lag-pha tiềm phát, pha log-pha lũy thừa, pha cân bằng, pha suy tàn) KS là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp và thường được bắt đầu tổng hợp từ cuối pha log kéo dài sang pha cân bằng, hoặc muộn hơn Trong suốt thời gian lên men không tác động hay

bổ sung gì vào MT, trừ việc cung cấp oxy (dưới dạng khí nén), chất phá bọt (nếu cần), chất điều chỉnh pH.[27]

- 16 -

- Lên men có bổ sung: Lên men có bổ sung là biến tướng của lên men gián đoạn Khi bắt đầu lên men, các thành phần ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi thứ cấp (glucose, các hợp chất nitơ ) được đưa vào với nồng độ thấp và được bổ sung vào hệ thống trong suốt quá trình lên men

- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc rút bớt dịch lên men và bổ sung thêm MT dinh dưỡng không xẩy ra liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian xác định

- Lên men liên tục: Quá trình lên men MT dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men Quá trình này được xem như một hệ mở

mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, chi phí cho một đơn vị sản xuất thấp,

có thể triển khai trên quy mô lớn

- 17 -

- Chiết đơn (chiết một lần)

- Chiết lặp (chiết nhiều lần)

chuyển một chất từ pha này sang pha khác Phương pháp gồm: chiết, thẩm thấu, sắc ký

[1], [5], [20]

Quá trình tách sắc ký dùng để tách từng thành phần khỏi một hỗn hợp Dựa vào

sự phân chia các thành phần khác nhau vào hai pha tĩnh và pha động Quá trình tách sắc ký qua ba giai đoạn: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động qua pha tĩnh và phát hiện chất cần tách

Ưu điểm: Nhanh (15-30 phút), trang thiết bị tương đối đơn giản, dễ kết hợp định tính

với định lượng và bán định lượng Tách nhiều hỗn hợp tương đối phức tạp SKLM thường được dùng để thăm dò số lượng các thành phần có trong KS

 Sắc ký lỏng trên cột

Chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha tĩnh được nhồi trong ống cột hình trụ, nhờ vậy mà có thể khai triển nhiều hệ DM khác nhau liên tục Thường dùng để tinh chế thu được KS tinh khiết

Hóa chất nhồi cột: cellulose, oxid nhôm, silicagel

- 18 -

Dung môi: các hệ DM dùng cho sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy đều có thể sử dụng

Dựa vào kết quả thăm dò tách các thành phần KS bằng SKLM để lựa chọn DM chạy SK lỏng trên cột thích hợp Ngoài ra, các yếu tố như kích thước cột, kích thước hạt nhồi, dung tích phân đoạn cần thu lấy cũng ảnh hưởng đến quá trình

Phương pháp điện di mao quản cũng được sử dụng để tinh sạch KS

1.6 Nghiên cứu cấu trúc KS bằng đo phổ

Trong nghiên cứu STH KS, người ta thường sử dụng các phương pháp đo phổ sau để nghiên cứu cấu trúc KS

1.6.1 Phổ hồng ngoại

Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và

thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ

để nhận biết một nhóm chức nào đó [1]

1.6.2 Phổ tử ngoại

Nguyên tắc: Dựa trên sự hấp thụ năng lượng các bức xạ ánh sáng vùng UV - VIS

bởi các phân tử của chất nghiên cứu làm thay đổi mức năng lượng điện tử (E0,E1,E2 ) Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có những phân tử nào có điện tử dễ bị kích thích mới hấp thu năng lượng ánh sáng để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái bị kích thích (phân tử có nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị

- 19 -

- Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi từ trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của từ trường biến thiên, và xuất hiện phổ NMR

- Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối lượng là

số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có moment từ và cho tín hiệu cộng hưởng hạt nhân

- Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự là số chẵn thì không có moment từ và không cho tín hiệu NMR

- Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện

tử ở vùng lân cận quanh proton đó

 Biện giải phổ NMR: thông qua việc phân tích các yếu tố sau:

- Độ chuyển dịch hóa học (vị trí của tín hiệu cộng hưởng): của phổ 1H-NMR nằm trong khoảng từ 0-12ppm

- Tương tác spin-spin: cho biết số lượng H ở nguyên tử C bên cạnh và mối tương quan lập thể của các nguyên tử H với nhau Trong đó người ta quan tâm tới: Đội bội của tín hiệu cộng hưởng; Tỷ lệ cường độ của các vạch tín hiệu; Hằng số tương tác spin-spin

- Diện tích dưới tín hiệu: cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu [2]

Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của

ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10-6mmHg) Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ

Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất

- 20 -

1.7 Phân loại, xác định tên xạ khuẩn bằng kỹ thuật gen

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu

hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Một trong những cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử hiệu quả nhất hiện nay đó là kỹ thuật phân tích acid nucleic [37]

Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN

và lai ADN Việc nghiên cứu phát sinh loài dựa trên phân tích chuỗi 16S rADN đã và đang đem lại những kết quả quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn Đó

là vì trình tự nucleotid của gen 16S rADN hầu như không có sự trao đổi giữa các loài,

do đó trình tự của gen này có ý nghĩa đặc trưng cho loài [38], [40] Để có thể phân tích chuỗi 16S rADN cần phải tiến hành hai kỹ thuật quan trọng nhất đó là kỹ thuật nhân

gen PCR và giải trình tự ADN [31] Việc nhân gen cho phép làm tăng số lượng gấp

hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối với đoạn ADN hay ARN nghiên cứu Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích nguồn ADN khuyếch đại theo cách này Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự ADN và ARN của sản phẩm PCR Việc xác định được sai khác của chuỗi ADN sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu Kết quả xác định trình tự ADN còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật [29], [32]

1.7.1 Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo một số lượng rất lớn bản sao của gen trong thời gian ngắn Nguyên tắc dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của ADN và nguyên lý tổng hợp ADN Trên cơ sở trình tự của đoạn ADN khuôn, đoạn mồi, các nucleotid tự do và enzyme ADN polymerase có thể tổng hợp được các đoạn ADN giới hạn bởi các đoạn mồi Lặp lại nhiều lần các chu kì nhân gen [17]

- 21 -

PCR gồm một chuỗi các phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép

- Giai đoạn gắn mồi: bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn

- Giai đoạn tổng hợp: là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp

gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung Kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ

Các yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR:

a ADN khuôn: kích thước đoạn khuôn nhỏ hơn 3 kb cho kết quả nhân gen tốt nhất

b Các nucleotid tự do (dNTP): Các nucleotid tự do cần thiết cho phản ứng gồm dATP,

dTTP, dGTP và dCTP Trong mỗi phản ứng cần chú ý đến tỉ lệ G-C trong đoạn khuôn

để xác định hàm lượng mỗi loại dNTP phù hợp

c Mồi: là các đoạn oligonucleotid ngắn khoảng khoảng 14-35 nucleotid, có vai trò

quan trọng quyết định thành công của phản ứng

Điều kiện chủ yếu để đảm bảo hiệu quả của mồi:

- Mồi không quá ngắn (<8 nu) hoặc quá dài (> 50 nu)

- Trình tự của mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ có thể bắt cặp ở đầu 3’ của mạch khuôn

- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi không chênh lệch nhau quá lớn

d Enzym ADN Polymerase: sử dụng các loại khác nhau sẽ thu được các sản phẩm PCR

có tính đặc hiệu khác nhau: Taq ADN polymerase, Tth ADN polymerase

e Dung dịch đệm cho PCR: cần đảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt động

của enzyme ADN polymerase như MgCl2, KCl…

f Thiết bị thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi các chu kì tuần hoàn

nhiệt, do đó có thể thực hiện phản ứng trong các thiết bị chuyên dụng là các máy PCR

1.7.2 Phương pháp giải trình tự gen

Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định

typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên

- 22 -

nhiễm sắc thể Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh

sự tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu Các gen bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ

sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau [17] Giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân

tử ADN Có 3 nhóm giải trình tự gen chủ yếu:

 Phương pháp Maxam và Gilbert

Đây là phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Tạo mạch khuôn ADN trên cơ sở đánh dấu đồng vị phóng xạ P32

đầu 5’ và biến tính phân tử ADN thành các mạch đơn không tự xoắn lại với nhau Các mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ được phân vào các ống nghiệm khác nhau, thực hiện kỹ thuật xử lý hóa học đặc hiệu để phân cắt các mạch đơn thành các đoạn ngắn hơn kém nhau một nucleotid,

từ đó xác định trình tự ADN bằng phương pháp điện di [17]

 Phương pháp Dideoxy

Chuẩn bị các điều kiện cần thiết đảm bảo thực hiện tổng hợp ADN Trong quá trình tổng hợp mạch đơn ADN, bổ sung một hàm lượng nhỏ Dideoxynucleotid (ddNTP) mỗi loại Do ddNTP bị mất cả 2 nhóm OH (ở C số 2 và 3), nên trong quá trình tổng hợp mạch đơn ADN, gặp ngẫu nhiên một dideoxynucleotid làm cho phản ứng tổng hợp ADN ngừng lại Kết quả tổng hợp ADN tạo nên các chuỗi mạch đơn mới hơn kém nhau một nucleotid, từ đó xác định trình tự của mạch khuôn ADN

 Giải trình tự gen bằng máy tự động (Sequencer)

Dựa trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh Trong quá trình tổng hợp ADN có sử dụng các mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang thay cho đánh dấu phóng xạ, mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn ADN mới trên cả 2 mạch khuôn ADN, đồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính để xử lý kết quả

- 23 -

Trong phạm vi đề tài chúng tôi phân loại xạ khuẩn theo trình tự rADN Ribosom trong xạ khuẩn gồm 2 tiểu đơn vị 50S và 30S kết hợp với nhau Các tiểu đơn vị gồm 2 thành phần: rADN 16S và protein trong đó rADN 16S là thành phần bền vững, ít biến đổi nhất trong xạ khuẩn Xác định trình tự các nucleotid trong rADN 16S giúp chúng ta xác định được tên của xạ khuẩn Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niện hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN Keswani và cộng sự đã chứng minh nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%

1.8 Một số nghiên cứu liên quan

Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng kháng sinh đạt được những thành tựu rực rỡ Các nhà khoa học không chỉ tìm kiếm những chủng vi sinh vật sinh kháng sinh từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền, công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp

Ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã phân lập được chủng vi khuẩn M4 (ckm7) được

từ mẫu đất thu thập từ đất nông nghiệp của Đông Uttar Pradesh (UP), Ấn Độ Chủng này sản xuất kháng sinh kháng khuẩn và kháng nấm Tác giả đã phân loại chủng này dựa trên phân tích trình tự gene và hoạt tính sinh học Nghiên cứu so sánh trình tự của

ckm7 cho thấy giống tới 98% so với trình tự gene 16S rRNA của Streptomyces spinichromogenes, S triostinicus và S capoamus Trên cơ sở nghiên cứu hoạt tính sinh

học và phân tích phát sinh loài của ckm7, tác giả đã kết luận rằng các dòng phân lập là

một biến thể mới của S triostinicus [39]

Tại Brzin, một nghiên cứu được thực hiện với mục đích sản xuất được lượng lớn

nhất Actinomycin D từ 3 chủng Streptomyces: S parvulus, S felleus, S regenesis S

- 24 -

parvulus sinh ra Actinomycin, có hoạt tính sinh học lớn nhất (152mg/l) và chỉ cung cấp

Actinomycin D Nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng sản xuất kháng sinh trong các bình lắc bằng việc thay thế glucose bằng fructose nồng độ 20, 30 và 40g/l Sự thay thế này làm gia tăng khả năng sản xuất kháng sinh, đạt nồng độ cao nhất 635mg/l với nồng

độ fructose 30g/l Tác giả thực hiện thí nghiệm trong bình lên men với các mức cấp khí khác nhau (0,5; 1 và 1,5vvm), tốc độ khuấy khác nhau (300 và 500 rpm) cho kết quả lượng kháng sinh được sản xuất lớn nhất (1530mg/l) với lượng khí CO2 1,5vvm và tốc

độ khuấy 500rpm Môi trường lên men cho thấy hoạt động lưu biến của dung dịch dạng chất dẻo Kết quả cho thấy: phần lớn sản phẩm thu được từ 3 chủng

thích hợp nhất cho việc sử dụng các chủng thu được và đặc tính lưu biến của môi trường lên men [35]

Ở Việt Nam, nhóm tác giả đã sử dụng chủng Streptomyces 15.29 được nuôi cấy trên môi trường ISP để phân loại Các đặc trưng phân loại của Streptomyces 15.29 so sánh với các đặc điểm phân loại của Streptomyces sinensis thấy chúng về có bản giống nhau (92,86% trùng khớp) Tác giả giải trình tự gen 16s rADN của Streptomyces 15.29 cho thấy chủng có tính di truyền độc lập Hệ gen của Streptomyces 15.29 hoàn toàn trùng với gen của Streptomyces microflavus. Tác giả tiến hành tạo giống qua sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến ánh sáng UV kết hợp sàng lọc sau đột biến đã làm tăng trưởng

được hiệu suất sinh tổng hợp KS của chủng Biến chủng Streptomyces 15.29.21.23 là

biến chủng hiện tại mà tavs giả tạo được Lên men chìm trên máy lắc và trong bình lên men 5 lít và 500 lít được thực hiện và kết quả là lên men trên máy lắc cho kết quả tốt nhất, còn lên men trong bình 5 lít và 500 lít cho kết quả tương đương tuy nhiên kém hơn lên men trên máy lắc nhiều Từ dịch lọc lên men KS chiết được tốt nhất bằng ethylacetat ở pH 5,0 SKLM và SK cột cho thấy hỗn hợp KS có ít nhất 4 thành phần Trong đó thành phần chính được tinh chế bằng sắc ký cột Silica gel, cột oxyt nhôm, YMC và cột Shephadex có hiệu suất 66% Bước đầu tác giả đã xác định giá trị MIC

- 25 -

của KS này khá thấp: từ 0,11-0,30 µg/ml đối với S aureus, P mirabilis, S flexneri, S typhi [22]

Tác giả sử dụng dịch chiết ethyl acetat của dịch lên men kháng sinh

Streptomyces microflavus được loại dung môi (5,0 gam cặn chiết) và phân lập bằng các

phương pháp sắc ký kết hợp sử dụng chất hấp phụ là silica gel pha thường, pha đảo,

YMC với các hệ dung môi thích hợp thu được chất KS chính 1 (1,0 g) [21]

Tác giả tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ, tác giả xác

định được hợp chất 1 là actinomycin X2, một hợp chất cũng được phân lập từ chủng

Streptomyces spp và có hoạt tính chống ung thư cũng như hoạt tính kháng sinh rất

mạnh.[21]

- 26 -

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủng xạ khuẩn

Chủng Streptomyces 155.16 đã qua phân lập và tuyển chọn có khả năng STH KS

cao, phổ tác dụng rộng, do bộ môn Vi sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định

Chủng Gr (-): Shigella flexneri (Shi) DT 112

Chủng Gr (+): Bacillus pumillus (BP) ATTC 10241

2.1.3 Các công thức môi trường

 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định

Thành phần

MT

NaCl (%)

Cao thịt (%)

Chú ý: MT được tiệt trùng bằng hơi nước ở 118-120C/20 phút

 DM sử dụng: Aceton, Butylacetat, Cloroform, Dichloroform, Dimethylformamid,

Ethanol, Ethylacetat, N-butanol, NH4OH 25%, Methanol, Propanol, Triethylamin

 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: Các MT được ký hiệu từ MT1 đến MT7

(bảng 2.3)

6,8-7,2

7,2

7,2

7,2

7,0-7,6

7,4- Môi trường lên men

MT lên men trên máy lắc có thành phần tương ứng như MT nuôi cấy xạ khuẩn,

chỉ khác là bỏ thạch và được ký hiệu tương ứng là MT1dd đến MT7dd

- 28 -

Bảng 2.4: Các dung môi chiết được khảo sát

[g/cm3]

Nhiệt độ sôi [0C]

 Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030

 Máy cất quay Buchi Waterbath B480

 Cân kỹ thuật, cân phân tích Sartorius

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi và giữ giống trong ống nghiệm

Pha MT1 phân lập, chỉnh pH, đun sôi 3 phút, phân đều vào ống nghiệm mỗi ống 5-6ml, tiệt trùng ở 1 atm/30 phút rồi đặt thạch nghiêng, khi MT đã nguội dùng que cấy

vô trùng cấy zigzac các bào tử Streptomyces 155.16 đã chọn và không bị lây nhiễm lên

bề mặt thạch nghiêng, ủ ở 28-29C trong 6-14 ngày, sau đó đem cất giữ trong tủ lạnh ở 2-4C, định kỳ 3-6 tháng cấy truyền một lần

2.2.2 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên

Lấy 1 vòng que cấy bào tử cho vào 10ml nước vô trùng ta có nồng độ quy ước

10-1 Pha loãng hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-2 - 10-6, cấy 0,1ml lên đĩa Petri, để ở tủ

- 29 -

ấm ở 30°C trong 6 ngày để xuất hiện khuẩn lạc, chọn ngẫu nhiên các khuẩn phát triển tốt đem cấy sang MT1, ủ 6 ngày ở 28-29C rồi thử hoạt tính KS

2.2.3 Đánh giá hoạt tính KS bằng phương pháp khuếch tán

a Nguyên tắc: Đưa mẫu thử lên trên bề mặt lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm

định KS từ mẫu khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định

và tạo vòng vô khuẩn

b Tiến hành:

Bước 1: Tạo hỗn dịch VSV kiểm định

Bước 2: Cấy hỗn dịch VSV kiểm định vào MT thạch thường đã tiệt trùng để nguội tới

45-50°C với tỷ lệ 5:200, lắc đều và đổ ra các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa

Bước 3: Đưa mẫu thử vào hộp Petri có chứa MT VSV kiểm định

- Phương pháp giếng thạch: Nhỏ dịch nước chứa mẫu thử vào các giếng đường kính 6mm đã được trên lên bề mặt MT đã cấy VK kiểm định với thể tích 0,05ml

Chú ý: làm thí nghiệm song song với mẫu thử

Bước 4: Nuôi cấy Sau khi đặt mẫu thử, các đĩa Petri được để ở tủ ấm ở 37°C trong

18-24 giờ

Bước 5: Đánh giá kết quả: Sau thời gian ủ trên tiến hành đánh giá kết quả dựa vào

đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức:

n

D D

n

i i

n

i i

D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn

Di (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i

- 30 -

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: Số thực nghiệm làm song song

2.2.4 Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV

Lấy 1 vòng que cấy bào tử cho vào 10ml nước vô trùng ta có nồng độ quy ước

10-1 Lấy 1 ml để pha loãng tiếp ở nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9 ml còn lại cho vào đĩa Petri vô trùng, chiếu tia UV với khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút, để tối trong 2 giờ sau đó pha loãng đến nồng độ 10-5 Cấy bào tử chứng ở nồng độ 10-6

vàbào tử đột biến ở nồng độ 10-4

, 10-5 , ủ ấm ở 28-29°C trong 6 ngày đêm

Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc đột biến tương tự phép sàng lọc ngẫu nhiên Làm song song với mẫu chứng, sau 6 ngày đêm ủ ở 28-29°C, đem thử hoạt tính KS bằng phương pháp khối thạch

Xác định % biến đổi hoạt tính theo công thức:

% biến đổi hoạt tính =

0

i

D D

i

D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biên chủng thứ i đột biến

0

D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng

Các biến chủng nào có % biến đổi hoạt tính KS cao nhất sẽ được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.5 Phương pháp lên men gián đoạn

Tạo giống cấp 1: Nuôi cấy chủng nghiên cứu trên MT1 thạch nghiêng ở

28-29°C sau 6-10 ngày, cấy vô trùng sang bình nón 500 ml chứa 100ml MT1dd bằng 10

ml nước cất vô trùng, sau đó đem lắc trên máy ở nhiệt độ 28-29°C, tốc độ quay 140 vòng/ phút trong 48 giờ

Lên men: 10ml giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500 ml chứa 100

ml MTdd với tỷ lệ giống Vgiống : VMT = 1:10 Các bình lên men được lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 28-29°C, tốc độ quay 140 vòng/ phút trong 120 giờ

- 31 -

Sau 120 giờ lấy ra lọc dịch lên men và tiến hành thử hoạt tính KS bằng phương pháp giếng thạch sau đó đánh giá hoạt tính KS

2.2.6 Phương pháp chiết xuất kháng sinh

♦ Chiết bằng DM hữu cơ: Dịch lên men sau khi loại bỏ sinh khối, dịch lọc được chỉnh

về pH trung tính rồi chiết bằng DM với tỷ lệ Vdịch lọc : VDM = 5:1 Kiểm tra hoạt tính KS bằng phương pháp giếng thạch và phương pháp khoanh giấy lọc

♦ Tách các thành phần KS bằng SKLM: bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 110°C trong

30 phút, chuẩn bị DM theo tỷ lệ định sẵn Chấm dịch chiết lên bản mỏng bằng mao quản, đường kính vết chấm 0,5mm cách mép dưới 1,5 cm

Sấy khô bản mỏng ở 44-45°C, cho vào bình chạy sắc ký, DM cách mép bản mỏng 1 cm Có thể phát hiện sự có mặt của KS bằng tia UV hay phương pháp hiện màu hóa học, phương pháp hiện hình VSV

Rf được tính theo công thức:

D

v f

dm

D

Dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết

Ddm; Khoảng cách từ vạch xuất phát đến DM đánh dấu

♦ Tinh chế KS thô bằng phương pháp cất quay: Dịch chiết được đem cất chân không

bằng máy cất quay Buchi Waterbath B480 ở nhiệt độ 70-80°C thu được bột KS thô Cân một lượng xác định bột KS thô, đem hòa tan trong methanol theo đúng tỷ lệ với dịch chiết đem cất Thử hoạt tính KS và SKLM để kiểm tra sự biến đổi của KS sau khi cất, đồng thời tìm ra điều kiện tối ưu cho sắc ký cột

♦ Tinh chế KS thô bằng phương pháp sắc ký cột:

- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký đường kính 1 cm, dài 50 cm Chất nhồi được dùng là hạt Silicagel 60 F254, Merck cỡ hạt 0,06 - 0,2 mm Cân khoảng 8g, hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với DM và đưa lên cột Ổn định trong 2 giờ

- 32 -

- Chuẩn bị mẫu chạy SK: Bột KS thô được hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa, sấy khô ở 50°C cho bay hơi hết methanol rồi đưa lên cột

- Chạy sắc ký: Cho DM đã pha chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút Lấy khoảng 20-25 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5 ml

- Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa KS cần tách bằng phương pháp khoanh giấy lọc Các phân đoạn có hoạt tính KS tiến hành SKLM với hệ DM tốt nhất đã nghiên cứu Phân đoạn chính được xác định từ khi bắt đầu xuất hiện vết đến khi không còn vết Rf tương đương và vẫn có hoạt tính KS mạnh

2.2.7 Xác định cấu trúc phân tử KS bằng phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại và phổ khối

Bột KS đã tinh chế tinh khiết về mặt sắc ký, đem đo phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối Dựa trên các phổ thu được ta dự đoán các nhóm chức

và cấu trúc phân tử KS thu được

- Phổ hồng ngoại (Phổ IR): mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó

- Phổ tử ngoại (Phổ UV): Sự hấp thu trong vùng UV-Vis làm thay đổi năng lượng (E) điện tử của phân tử, liên quan với kích thích điện tử, chuyển các điện tử từ các orbital bền vững (có E thấp hơn) lên các orbital không bền (có E cao hơn) Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ vì chỉ những phân tử nào có điện tử

dễ bị kích thích mới hấp thụ năng lượng để chuyển trạng thái Đó là các nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N,S,O, halogen

- Phổ khối: Dựa trên phổ thu được ta biết số ion phân tử M+ và các mảnh vỡ m1

+,

m2 +

Từ đó ước đoán được khối lượng phân tử và cấu tạo hóa học của hợp chất