Ứng dụng kỹ thuật realtime RT PCR trong giảm sát dịch cúm AH1N1 tại một số đơn vị quân đội phía bắc việt nam

Kết qu so sánh ph n t ch trình tự th nh phần acid a in của các oạn gen H1 của ẫu nghi n cứu với các chủng quốc tế ư c ựa chọn so sánh ..... Các vị tr acid a in sai khác trong trình tự pr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH TÂM

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG GIÁM SÁT DỊCH CÚM A/H1N1 TẠI MỘT

SỐ ĐƠN VỊ QUÂN ĐỘI PHÍA BẮC, VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH TÂM

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG GIÁM SÁT DỊCH CÚM A/H1N1 TẠI MỘT

SỐ ĐƠN VỊ QUÂN ĐỘI PHÍA BẮC, VIỆT NAM

trong suốt quá trình ề t i

TS Nguyễn Văn Rư – Trưởng Bộ môn Hóa Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội người ã hết ng giúp ỡ t i trong quá trình học tập v ho n

th nh uận văn n y

T i cũng xin c n các anh chị ang c ng tác tại Khoa Vi sinh Y học – Vi n v sinh Ph ng dịch Qu n ội Khoa Sinh học Ph n t B nh vi n Trung

ng Qu n ội 108 nh ng người u n tận tình gi i áp nh ng th c c v hết ng giúp ỡ t i trong quá trình thực hi n ề t i

T i xin g i ời c n tới an ãnh ạo Trường Đại học Dư c H Nội

v các thầy c giáo trực tiếp tha gia gi ng dạy v giúp ỡ e trong suốt quá trình học tập tại trường

V cuối cùng t i xin y tỏ ng iết n ối với người th n ạn è

nh ng người u n sát cánh cùng t i chia s ộng vi n giúp t i ho n th nh

kh a học v uận văn tốt nghi p

Đề t i ư c thực hi n tại ph ng Vi sinh Y học ph n t Vi n V sinh ph ng dịch Qu n ội v Khoa Sinh học ph n t B nh vi n 108

H Nội ng y 14 tháng 11 nă 2012 Học vi n

Nguyễn Thị Thanh T

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình dịch nh cú A 3

1.1.1 Tình hình nhiễ cú A/H1N1 tr n thế giới 3

1.1.2 Tình hình nhiễ cú A/H1N1 tại Vi t Na 4

1.1.3 Đặc iể s ng nh cú A/H1N1 6

1.2 Đặc iể của virus cúm A 7

1.2.1 Ph n oại Virus cú 7

1.2.2 Cấu trúc virus cú A 8

1.3 Kh năng g y nh v c chế x nhiễ 12

1.3.1 Kh năng g y nh 12

1.3.2 C chế x nhiễ 13

1.4 Các phư ng thức iến ổi kháng nguy n 14

1.4.1 Hi n tư ng « ch kháng nguy n» 14

1.4.2 Hi n tư ng «trộn kháng nguy n» 15

1.4.3 Hi n tư ng g ycosy hoá 16

1.5 Các kỹ thuật s dụng trong nghi n cứu virus cú A/H1N1 17

1.5.1 Kỹ thuật rRT-PCR phát hi n cú A/H1N1 từ nh phẩ nh y họng 17

1.5.2 Kỹ thuật gi i trình tự gen 20

1.5.3 Một số phư ng pháp tạo c y chủng oại phát sinh (Phy ogenetic tree) 21

1.6 Một số nghi n cứu i n quan virus cú A/H1N1 ã thực hi n 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tư ng nghi n cứu 24

2.2 Nguyên vật i u 25

2.2.1 Sinh phẩ 25

2.2.2 Trang thiết ị 25

2.2.3 Vật tư ti u hao 25

2.3 Thiết kế nghi n cứu 26

2.4 Ứng dụng rRT-PCR phát hi n cúm A/H1N1 26

2.4.1 Qui trình x nh phẩ 26

2.4.2 Quy trình tách chiết ARN tổng số 27

2.4.3 Phư ng pháp rRT-PCR 28

2.4.4 Phư ng pháp i n di kiể tra v tinh sạch s n phẩ rRT-PCR 29

2.5 Các ước tiến h nh gi i trình tự 31

2.5.1 Real time PCR cho Sequencing 32

2.5.2 Tinh sạch ại s n phẩ PCR cho Sequencing 32

2.5.3 Gi i trình tự tr n áy Sequencing CEQ 8800 33

2.6 Phư ng pháp x ý số i u 34

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Kết qu giá sát dịch tễ cú A/H1N1 tại ột số n vị qu n ội ph a B c 35

3.1.1 Đặc iể tình hình dịch tễ tại các n vị qu n ội giai oạn tháng 8-12/2009 35

3.1.2 Kết qu giá sát diễn iến dịch cú tại các n vị qu n ội 36

3.1.3 Kết qu x t nghi cú A tại ột số n vị qu n ội ph a B c 37 3.1.4 Kết qu x t nghi cú A/H1N1 tại ột số n vị qu n ội ph a B c 38

3.1.5 Tỉ nhiễ virus cú A/H1N1 tại các n vị qu n ội nă 2009 40

3.1.6 Ph n ố tỉ nhiễ virus cú A/H1N1 theo các tháng trong nă

2009 – 2010 40

3.2 Kết qu thu nhận Rea ti e –PCR Gi i trình tự xác ịnh gen H1 42

3.2.1 Kết qu thực hi n rRT-PCR 42

3.2.2 Kết qu gi i trình tự v thu nhận chuỗi gen 44

3.3 Phân tích so sánh trình tự gen ã h a kháng nguy n H của các ẫu gi i trình tự 47

3.3.1 Truy cập ng n h ng gen v ựa chọn các chủng virus cú A/H1N1 so sánh ph n t ch với chủng thu thập 47

3.3.2 Kết qu ph n t ch sai khác về nuc eotid ở các chủng so sánh 52

3.2.3 Kết qu so sánh ph n t ch trình tự th nh phần acid a in của các oạn gen H1 của ẫu nghi n cứu với các chủng quốc tế ư c ựa chọn so sánh 56

3.3 Kết qu ph n t ch xác ịnh quan h ph h của các ẫu virus cúm A/H1N1 thu ư c với các chủng tr n thế giới dựa trên gen H1 58

Chương 4 BÀN LUẬN 65

4.1 Kết qu giá sát dịch nh cúm A/H1N1 tại các n vị qu n ội khu vực iền B c từ 2009-2011 65

4.2 Kết qu kh o sát ặc iể sinh học ph n t virus cú A/H1N1 tại các n vị qu n ội khu vực iền B c từ 2009-2011 68

KẾT LUẬN 71

ĐỀ XUẤT 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool - C ng cụ tì kiế sự

tư ng ồng

CDC Centers for Disease Control and prevention- Trung t kiể

soát v ph ng chống nh tật

RT-PCR Reverse transcriptase PCR - Ph n ứng sao ch p ngư c

VSDT TW Vi n V sinh dịch tễ trung ư ng

DANH MỤC BẢNG

B ng 1.1 Các nh RNA v chức năng của virus cú A 11

B ng 2.1 Th nh phần v nồng ộ các chất tha gia ph n ứng 29

B ng 2.2 Chu kì nhi t của ph n ứng 29

B ng 3.1 Đặc iể dịch tễ các n vị c nhiễ cú trong vụ dịch 35

B ng 3.2 Diễn iến tình hình dịch cú trước v sau c ng ố dịch 36

B ng 3.3 Kết qu x t nghi cú A ằng kĩ thuật rRT-PCR TaqMan Probe nă 2009 37

B ng 3.4 Kết qu x t nghi cú A/H1N1 tại ột số n vị qu n ội ằng kĩ thuật rRT-PCR TaqMan Pro e nă 2009 39

B ng 3.5 Ph n ố tỉ nhiễ virus cú A/H1N1 theo các tháng trong 2 nă 41 B ng 3.6 Danh sách các chủng virus cú A/H1N1 của Vi t Na v thế giới s dụng gen H1 trong ph n t ch so sánh th nh phần gen v ối quan h nguồn gốc ph h 49

B ng 3.7 Các vị tr nuc eotid sai khác trong gen H1 gi a các chủng so sánh 55 B ng 3.8 Các vị tr acid a in sai khác trong trình tự protein H1 của các oạn gen nghi n cứu với các nh chủng virus A/H1N1 so sánh 58

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc kh ng gian virus cú A 9

Hình 1.2 Cấu trúc virus cú A [27] 10

Hình 1.3 C chế x nhiễ của virus cú A/H1N1 v o tế o vật chủ 14

Hình 2.1 Thiết kế nghi n cứu dịch tễ học ph n t virus cú A/H1N1 26

Hình 2.2 Qui trình tinh sạch DNA 30

Hình 3.1 Tỷ nhiễ cú A tại các n vị qu n ội 38

Hình 3.2 X t nghi dư ng t nh với cú A/H1N1 tại các n vị qu n ội 39 Hình 3.3 Tỷ nhiễ cú A/H1N1 tại các n vị qu n ội 40

Hình 3.4 Ph n ố tỷ nhiễ virus cú A/H1N1 theo tháng 41

Hình 3.5 Đi n di s n phẩ rRT-PCR của virus cú A/H1N1 tr n thạch agarose 1% 43

Hình 3.6 Gi n ồ Chro atogra ột phần trình tự gen virus cúm A/H1N1 45

Hình 3.7 Một phần trình tự gen ã h a kháng nguy n H của virus A/H1N1(hai ẫu số 5 v số 7) 46

Hình 3.8 Kết qu BLAST oạn gen gi i trình tự n NCBI ( ẫu số4) 48

Hình 3.9 Kết qu so sánh th nh phần nuc eotid của gen H1 của các chủng nghi n cứu với các iến chủng A/H1N1 ư c ựa chọn so sánh 53

Hình 3.10 Kết qu so sánh th nh phần acid a in của gen H1 của các chủng nghi n cứu với các iến chủng A/H1N1 ư c ựa chọn so sánh 57

Hình 3.11 Mối quan h nguồn gốc ph h gi a các chủng cú A/H1N1 xác ập dựa tr n th nh phần nuc eotid gen H1 ằng chư ng trình MEGA5.1 (phư ng pháp kết nối iền kề NJ - Neighbour Joining, với h số kiể ịnh tin cậy ã th 1000 ootstrap) 61

Hình 3.12 Mối quan h nguồn gốc ph h gi a các chủng cú A/H1N1 xác ập dựa tr n th nh phần acid a in gen H1 ằng chư ng trình MEGA5.1 (phư ng pháp kết nối iền kề NJ - Neighbour Joining, với h số kiể ịnh tin cậy ã th 1000 bootstrap) 63

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đầu nă 2009 tr n to n cầu xuất hi n ột chủng virus cúm A/H1N1

ới với ầy ủ t nh chất ể c thể g y th nh ại dịch Ng y 11/06/2009 ần

ầu ti n sau 41 nă Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ã ch nh thức c ng ố ại dịch cú ầu ti n trong thế kỷ XXI với t n gọi cú A/H1N1/09 ại dịch Sáu tuần sau dịch ã an rộng ra 168 nước v vùng ãnh thổ ở c 5 ch u ục với kho ng 162.380 ca nh v 1153 ca t vong [3], [48]

Ng y 31/05/2009 với vi c ghi nhận ca nh cú A/H1N1/09 ại dịch

ầu ti n tại th nh phố Hồ Ch Minh Vi t Na ã trở th nh quốc gia thứ 54

tr n to n cầu th ng áo xuất hi n dịch cú ới n y Ca nh cú A/H1N1/09 ại dịch ầu ti n tại khu vực iền B c khởi phát ng y 08/06/2009 Đại dịch ã nhanh ch ng an ra các tỉnh th nh phố [3] [48] Cho ến nay theo ánh giá của H thống giá sát cú to n cầu của Tổ

chức Y tế thế giới kĩ thuật Real time Reverse transcription-PCR (rRT-PCR)

ư c xe ti u chuẩn v ng cho phát hi n ở ức ộ ph n t học virus cú nhờ ộ nhạy v ộ ặc hi u cao của ph n ứng

Hi n nay tại ột số ph ng th nghi của tuyến trung ư ng ã triển khai kĩ thuật rRT-PCR phát hi n ư c các su type cú nhưng y u cầu trang thiết ị hi n ại con người c trình ộ chuy n n cao v giá th nh c n t Tuy nhi n y vẫn kĩ thuật ư c ựa chọn s dụng rộng rãi nhất cho c ục

ch chẩn oán cũng như nghi n cứu vì phư ng pháp rRT-PCR cho kết qu nhanh sớ ch nh xác giúp cho các nh qu n ý xác ịnh sớ ư c tác nh n

g y dịch khoanh vùng dịch v sớ ựa chọn nh ng i n pháp ph ng nh

hi u qu Trong các n vị qu n ội ặc i t các n vị huấn uy n v các trường o tạo do iều ki n sống v sinh hoạt tập trung ng úc nhiều người cùng ột thời iể n n dễ dẫn tới tình trạng nhiễ các nh truyền nhiễ

y an qua ường h hấp trong c virus cú A/H1N1 n i ri ng Vi c phát

hi n nhanh ch nh xác tác nh n g y nh ể kịp thời ối ph dập t t dịch u n nhi vụ h ng ầu của ng nh dự ph ng qu n ội

Virus cúm A/H1N1có các kháng nguy n g ycoprotein ề ặt ặc hi u virus c các chức năng quan trọng Ch nh ởi tầ quan trọng của hai kháng nguy n n y n n vi c phân tích gi i trình tự hai gen ã h a chúng ể c nh ng ánh giá s u h n về ặt di truyền học kh năng g y nh v t nh kháng thuốc rất quan trọng [9] Nghi n cứu ặc iể ph n t của gen cúm A/H1N1,

kh ng chỉ cho ph p tì hiểu ặc iể iến ổi th nh phần nucleotid và acid

a in của virus v nh hưởng của nh ng virus ến ộc ực kh năng x nhiễ tr n vật chủ cũng như tư ng quan trong áp ứng iễn dịch c n cho ph p ph n t ch ối quan h tiến h a xác ịnh ph n type xác ịnh tư ng ồng kháng nguy n- iễn dịch của virus Qua cho ph p dự áo dịch tễ học virus cúm A/H1N1 ở ức ộ sinh học ph n t giúp ịnh hướng s dụng vacxin phù h p Xuất phát từ nh ng c sở tr n chúng t i tiến h nh ề t i:

―Ứng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR trong giám sát dịch cúm

A/H1N1 tại một số đơn vị quân đội phía Bắc, Việt Nam” với các ục ti u:

- Xác ịnh tỉ nhiễ cú A/H1N1 ở ột số n vị qu n ội ph a B c trong vụ dịch 2009-2010 ằng kỹ thuật rRT-PCR

- Xác ịnh ặc iể kiểu gen ã h a kháng nguyên H của chủng virus

cúm A/H1N1 ph n ập ư c

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình dịch bệnh cúm A

B nh cú ã ư c Hippocrates t r nh ạch kho ng 2.400 nă trước Virus cú ư c cho ã g y ra các vụ dịch tr i suốt ịch s o i người [48],[51] Từ thế kỷ XVI nh ng ại dịch cú xuất hi n 10 - 50 nă 1 ần với ức ộ v nh hưởng khác nhau cùng với các dịch cú ùa x y ra

h ng nă [51] Theo WHO, t nh tr n to n thế giới hậu qu của nh ng dịch

cú n y h ng nă c kho ng 1 tỷ ca c cú 3 ến 5 tri u ca c cú nặng v kho ng 250.000 ến 500.000 ca t vong hầu hết nh ng ca t vong ở

nh ng nước c ng nghi p phát triển nh ng người từ 65 tuổi trở n [9],[51]

1.1.1 Tình hình nhiễm cúm A/H1N1 trên thế giới

Đại dịch cú ầu ti n ư c ghi nhận trong ịch s x y ra v o nă 1580 Dịch t nguồn từ Nga an sang ch u Phi rồi v o ch u Âu Trận dịch ã khiến

ột số th nh phố của T y Ban Nha v Ita y thi t hại nặng [9],[48]

Thế kỷ XX chứng kiến 3 ại dịch cú Từ 1918 ến 1919 thời kỳ x y

ra ại dịch cú T y Ban Nha Số người chết v o kho ng 20 ến 50 tri u tỷ

t vong 2 - 3% [48] N ư c g y ra ởi virus H1N1 v t ầu y an từ

n sang con người ến ùa hè nă 1918 dịch cú ã an ra kh p thế giới Một phần a d n số thế giới ã ị nhiễ cú v phần ớn do tiếp xúc với các o i vật hoang dã trung gian y an ầ nh [9], [36]

Nă 2009 ánh dấu ại dịch cú ầu ti n của thế kỷ XXI do ột virus

cú A/H1N1 ới g y ra Theo WHO dịch cú A/H1N1 t ầu ư c ghi nhận tại Mexico v o ng y 18/3/2009 sau an sang Mỹ v các nước tr n thế giới ột cách nhanh ch ng [9],[49] Đến ng y 11/6/2009 WHO phát i th ng

áo tới tất c các quốc gia tr n thế giới cú A/H1N1 ã trở th nh ại dịch

to n cầu T nh ến ng y 25/10/2009 tr n to n thế giới ã xác ịnh h n

440.000 ca c cú A/H1N1 sau WHO ngừng cập nhật số ca ư c chẩn oán xác ịnh nh do tăng quá nhanh [48],[51] Tuy vậy số ca ư c xác ịnh c nh kh ng ph n ánh ầy ủ tác ộng của ại dịch T nh ến ng y 25/4/2010 ã c h n 214 quốc gia v vùng ãnh thổ xác ịnh c cú A/H1N1 trong tr n 17.919 ca t vong [3],[49] Hầu hết các nh nh n nhiễ virus cú H1N1 2009 ều diễn iến cấp t nh v tự khỏi gặp nhiều ở

tr e v người tr tuổi Tỷ c nh thay ổi theo từng vùng tỷ t vong nhìn chung dưới 0 5% ước t nh thay ổi từ 0 0004% ến 1 47% [36],[22] Vaccin ph ng oại virus n y ã ư c chế tạo th nh c ng chỉ 5 tháng sau thời iể phát hi n nh ng ca nh ầu ti n vaccin ầu ti n ã

ư c tung ra thị trường hồi tháng 11/2009 [2],[49]

Kết qu các iể giá sát cú tr n to n cầu trong tuần thứ 5 6/2011 (30/01-12/02/2011) trong số các ẫu x t nghi dư ng t nh với cú virus cúm A/H1N1 chiế tỷ 63 6% Tại Trung Quốc virus cú ưu h nh chủ yếu virus cúm A/H1N1 trong khi tại Ch u Âu ao gồ c hai oại virus cúm A/H1N1 cú B tại Mỹ ao gồ a oại virus cúm A/H1N1, cúm A/H3N2 và cúm B [5],[36],[51] Theo th ng áo của Tổ chức Y tế Thế giới trong tháng 06/2011 các trường h p c cú tr n to n thế giới gi ạnh so với các tháng trước trong c virus cúm A/H1N1 tại khu vực B c án cầu Châu Âu B c Á v B c Mỹ ặc dù vẫn tiếp tục ghi nhận các trường h p c cúm A/H1N1 tuy nhi n hầu như ã kết thúc ùa cú Theo kết qu các iể giá sát cú tr n to n cầu từ ng y 05-18/6/2011 tại 71 quốc gia v vùng ãnh thổ ã ghi nhận 485 ẫu x t nghi dư ng t nh với virus cúm A/H1N1 chiế tỷ 57 9% các ẫu x t nghi dư ng t nh với virus cúm [25],[29]

1.1.2 Tình hình nhiễm cúm A/H1N1 tại Việt Nam

Ở Vi t Na cú cũng ột nh ý rất hay gặp trong cộng ồng Virus cú căn nguy n virus ứng h ng thứ 2 g y nhiễ khuẩn h hấp cấp

t nh ở tr e (sau virus h p o h hấp) [11] Nă 2001 tần suất c hội chứng cú tại H Nội 535 25/100.000 d n iền B c (trừ H Nội)

c ca n o t vong) cao nhất trong số các nh truyền nhiễ [5],[48]

Vi t Na cũng chịu nh hưởng của các ại dịch cú tr n thế giới ới nhất ại dịch cú A/H1N1 2009 Tại Vi t Na 34 ng y sau khi WHO

th ng áo dịch cú A/H1N1 tại Mexico v Mỹ ã ghi nhận trường h p cú A/H1N1 ầu ti n v o ng y 31/5/2009 [5],[48] Nh ng ca nh ầu ti n ều

nh ng người i từ nh ng nước c dịch về v nh ng trường h p tiếp xúc trực tiếp với nh ng người Dịch dần an rộng ùng phát th nh các ổ dịch ở

nh ng n i tập trung ng người như các trường học c ng sở ến ng y 25/7/2009 dịch ư c xác ịnh ã chuyển sang giai oạn y an trong cộng ồng [5],[10] Từ dịch tiếp tục an rộng ra hầu hết các tỉnh th nh ỉnh

iể v o tháng 8 9 v gi dần từ tháng 11 12 [11],[48] T ch ũy từ ầu

vụ dịch ến 3/2010 c nước ã ghi nhận 11.305 trường h p c x t nghi

dư ng t nh với virus cú A/H1N1 tại 63 tỉnh th nh phố trong 61 trường

h p ã t vong ph n ố ở c 4 khu vực trong c nước cụ thể: Miền Na :

41 0% T y Nguy n: 13 1% iền Trung: 13 1% iền B c: 32 8% [11] Các trường h p t vong chủ yếu ở nh nh nh n c nguy c cao như phụ n

c thai tr nhỏ tiền s nh ý như nhiễ HIV nh phổi nh ti ạch

nh áu [48]

Hai tháng ầu nă 2011 Virus cúm A/H1N1 ã ư c ghi nhận tại 30

tỉnh th nh phố a số các trường h p c ều ở thể nhẹ C 07 trường h p

t vong tại 06 ịa phư ng; các trường h p t vong chủ yếu c nh ạn t nh

kè theo cụ thể: 01 trường h p c tiền s ái tháo ường tăng huyết áp; 01 trường h p ị khối u trung thất; 01 trường h p ị nh phổi t c nghẽn ạn

t nh v 01 trường h p vi ruột hoại t Từ ầu nă 2011 ến nay theo kết

qu giá sát cú trọng iể Quốc gia nước ta ghi nhận sự xuất hi n của 03 phân týp virus cúm A/H1N1, cúm A/H3N2 và cúm B Virus cúm A/H1N1 ã

ư c ghi nhận tại 40 tỉnh th nh phố với 498 trường h p c c x t nghi

dư ng t nh trong ã c 13 trường h p t vong tại 10 ịa phư ng; các trường h p t vong chủ yếu c nh ạn t nh kè theo chiế 61 5% [9],[11]

1.1.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh cúm A/H1N1

B nh c thể x y ra ở ọi ứa tuổi với các iểu hi n s ng tùy theo sức ề kháng của ỗi cá thể từ nhẹ ến nặng [2]

+ Đau ầu au c t ỏi n n ti u ch y

+ Nhiều trường h p c iểu hi n vi phổi nặng thậ ch c suy h hấp cấp v suy a tạng

X t nghi chẩn oán căn nguy n [2]:

- Real time RT-PCR x t nghi xác ịnh virus cúm A/H1N1 B nh

phẩ dịch ngoáy họng dịch tỵ hầu dịch phế qu n ( ấy c ng sớ c ng tốt)

- Nu i cấy virus: thực hi n ở nh ng n i c iều ki n

- C ng thức áu: số ư ng ạch cầu ình thường hoặc gi nhẹ

- X quang phổi: c thể c iểu hi n của vi phổi kh ng iển hình 1.2 Đặc điểm của virus cúm A

1.2.1 Phân loại Virus cúm

Virus cúm chủ yếu g y nh ường h hấp ở người v ộng vật thuộc họ

Orthomyxoviridae, có gen RNA n s i (-) gồ 8 ph n oạn Họ Orthomyxoviridae gồ 4 chi: Influenzavirus A (virus cúm A), Influenzavirus B

(virus cúm B), Influenzavirus C (virus cúm C) và Thogotovirus Các nhóm virus

n y khác nhau chủ yếu ở kháng nguy n ề ặt v tác nh n chủ yếu g y nh ường h hấp tr n ở người ộng vật gia cầ v chi [9],[16],[39]

Nhóm virus cúm A (Influenza A virus): Ph n type nguy hiể nhất vì n

c thể g y nh cú ở ộng vật ở người v c thể ùng phát th nh nh ng vụ dịch hoặc nh ng trận ại dịch to n cầu

Nhóm virus cúm B (Influenza B virus): Thường chỉ phát hi n thấy ở

người v kh ng ao gồ các ph n nh Virus cú B cũng c thể g y nh nặng cho người nhưng t g y th nh dịch như virus cú A [9]

Nhóm virus cúm C (Influenza C virus): Tồn tại tr n người v n Người

ị nhiễ virus cú C c thể iểu hi n các tri u chứng ở dạng nhẹ Virus cú

C kh ng g y th nh dịch

Ba nh virus cú A B C ư c nhận di n ởi sự khác nhau trong cấu trúc kháng nguy n ề ặt phức h p protein cũng như vai tr g y nh khác nhau tr n ộng vật c xư ng sống Virus cú A v B c kháng nguy n ề

ặt protein he agg utinin (HA) c n ở cú C HEF (he agg utinin esterase fusion)

Nh Thogotovirus g y nh cho ộng vật người v ộng vật kh ng

xư ng sống ( uỗi rận iển) Kháng nguy n ề ặt của Thogotovirus GP (glycoprotein)

Virus cú A ư c ịnh type phụ dựa v o ph n ứng huyết thanh học của các g ycoprotein ề ặt HA v NA Hi n nay người ta ã xác ịnh ư c 16 phân type HA (H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9) Từ nă 1980 vi c xác ịnh ph n type HA ã ư c ti u chuẩn h a cho tất c các virus cú type

A từ gia cầ chi ngựa v người Huyết thanh từ gia cầ v chồn sư ng phục hồi sau khi c nh v kháng thể n d ng ư c dùng ể xác ịnh sự

c ặt kháng nguy n của virus cú trong từng ph n type [18], [32], [43] Đối với các virus ư c ph n ập tr n người nh: Danh pháp ư c Tổ chức Y tế thế giới (WHO) quy ịnh thống nhất danh pháp virus cú theo thứ

tự ký hi u: Tuýp huyết thanh/n i ph n ập/số hi u chủng/thời gian ph n ập/ oại hình ph n tuýp theo kháng nguy n HA v NA [25]

V dụ: A/Singapore/13032057/2009 (H1N1) Chủng virus ph n ập từ người tại Singapore k hi u chủng 13032057 nă ph n ập 2009 c kháng nguyên HA là H1 và NA là N1 [12]

1.2.2 Cấu trúc virus cúm A

Cấu trúc của virus cú A gồ 3 phần: Trong cùng õi (gen) của virus tiếp ến ớp vỏ protein ao ọc õi gen ể o v gen gọi vỏ capsid Ngo i cùng ớp vỏ ipoprotein ao ọc xung quanh capsid gọi vỏ ngo i (envelope)

Hình 1.1 Cấu trúc không gian virus cúm A

Virus cú hình cầu ường k nh kho ng 100 – 120 n Các hạt virus cú

c cấu trúc c n gồ các protein capsid cùng với ARN tạo th nh nuc eocapsid Bao ngo i của virus cú 2 ớp ipid tr n ề ặt 2 ớp ipid

c các kháng nguy n he agg utinin v neura inidase ký hi u H v N Các kháng nguy n n y ặc hi u cho từng phân type virus v c chức năng giúp virus

x nhập v o tế o thúc ẩy sự p ráp v ch n uồi của virus trong tế o

Hi n nay c 16 cấu trúc kháng nguy n H v 9 cấu trúc kháng nguy n N khác nhau ký hi u kháng nguy n H1 ến H16 N1 ến N9 nhưng chỉ c H1 2, 3 và N1 2 hay gặp ở người.Virus cú A c 11 protein ư c ã hoá trong ARN

ao gồ : he agg utinin (HA) neura inidase (NA) nuc eoprotein (NP) M1 M2, NS1, NS2, PA, PB1, PB1-F2 và PB2 [18], [27], [43] (Hình 1)

Bảng 1.1 Các mảnh RNA và chức năng của virus cúm A

Protein (PB1-F2) ư c ã h a ởi ột khung ọc

ở khác của PB1 c vai tr g y ra hi n tư ng apoptosis (hi n tư ng tế o chết theo chư ng trình)

1497

(NA)

Tránh sự kết tụ virus v hỗ tr gi i ph ng phần t virus ới

Bao ọc RNA tạo n n phức h p RNP v tha gia

v o quá trình ―nảy chồi‖ của virus

Kiể soát RNA sau phi n ã trung h a interferon

Hỗ tr sự di chuyển ra ngo i nh n của RNA virus

ng g i virus B o v h gen của virus

890

1.3 Khả năng gây bệnh và cơ chế xâm nhiễm

1.3.1 Khả năng gây bệnh

Virus cú A c t nh th ch ứng v y nhiễ cao với tế o iểu ường h hấp g y nh chủ yếu ở ường h hấp v cũng c thể g y tổn thư ng cho nhiều c quan khác nhau trong c thể của các ộng vật c nhiễ do c n ư c gọi virus a phủ tạng Kh năng g y nh của virus cúm A phụ thuộc v o ộc ực v t nh th ch nghi vật chủ của từng chủng virus

Virus cúm A (Influenza A virus) ột oại virus ặc i t c ức ộ v

iều ki n tiến h a nhanh do kh năng thay ổi h gen tạo n n ph n type v iến chủng ới th ng qua c chế ột iến ― ch kháng nguy n‖ (antigenic drift) hoặc/v tái tổ h p ―trộn kháng nguy n‖ (antigenic shift) Trộn kháng nguy n hi n tư ng trao ổi các ph n oạn gen hay c n gọi tái tổ h p trao ổi (reassort ent) gi a các virus thuộc cùng ột ph n type hoặc gi a các ph n type khác nhau dẫn ến sự hình th nh ột oại virus ới c ặc

t nh g y nh v kháng nguy n ho n to n khác c kh năng g y ại dịch

nh ng chủng virus trước c thể sẽ kh ng hoặc c t áp ứng iễn dịch

o hộ th ch ứng với chủng virus ới Đ y nguy n nh n cho gia cầ

v con người thường c cú nhiều ần trong nă các t dịch cú về sau thường nặng nề v c thể g y n n ại dịch cú ới Kh năng g y nh của chủng virus cú ới gi hoặc iến ất khi c thể c ư c áp ứng iễn dịch ặc hi u với iến chủng v chúng trở n n th ch nghi y nhiễ ở o i

vật chủ ới [41]

1.3.2 Cơ chế xâm nhiễm

Cũng như tất c các oại virus khác virus cú A k sinh nội o t uộc Quá trình x nhiễ v nh n n của virus x y ra chủ yếu ở các tế o iểu ường h hấp ường ti u h a:

- Quá trình x nhiễ ư c t ầu khi HA kết h p với thụ thể ặc

hi u d nh cho n tr n ề ặt các tế o c nhiễ v gi i ph ng h gen của virus v o trong o tư ng của tế o nhiễ

- Trong o tư ng tế o nhiễ virus s dụng ộ áy sinh học của tế

o chủ tổng h p các protein của virus v các enzym RNA po y erase phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA polymerase - RdRp) oại enzym không

c ở tế o chủ xúc tác cho tổng h p gen RNA từ s i khu n cũng c n chất RNA Phức h p protein – RNA của virus ư c vận chuyển v o trong nhân

tế o

- Trong nh n tế o từ các RNA h gen của virus tổng h p n n các s i

dư ng từ khu n s i của h gen virus từ các s i dư ng n y chúng tổng

h p n n RNA h gen của virus ới nhờ RNA- po y erase Các s i n y

kh ng ư c Adenine h a ở ầu 3‘ v 5‘ chúng kết h p với nuc eoprotein (NP) tạo th nh phức h p ri onuc eoprotein (RNP) ho n chỉnh v ư c vận chuyển ra o tư ng tế o [27], [39] Đồng thời các RNA th ng tin của virus cũng sao ch p nhờ h thống enzym ở từng ph n oạn gen của virus v

ư c enzym PB2 g n th 10 - 12 nucleotid Adenin ở ầu 3‘ sau ư c vận chuyển ra o tư ng v dịch ã tại ưới nội o c hạt ể tổng h p n n các protein của virus

- Các ph n t NA v HA của virus sau khi tổng h p ư c vận chuyển

g n n ặt ngo i của ng tế o nhiễ nhờ ộ áy Go gi gọi vùng ―n y chồi‖ của virus Protein NP sau khi tổng h p ư c vận chuyển trở ại nh n tế

o ể kết h p với RNA th nh RNP của virus Sau cùng các RNP của virus

ư c h p nhất với vùng ―n y chồi‖ tạo th nh các ―chồi‖ virus g n chặt v o

ng tế o chủ ởi i n kết gi a gai HA với thụ thể của tế o chứa sia ic acid Các NA ph n c t các i n kết n y v gi i ph ng các hạt virus trưởng

th nh ra ngo i tế o ể tiếp tục chu trình x nhiễ của virus v o các tế o khác

Hình 1.3 Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/H1N1 vào tế bào vật chủ

1.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên

Đặc t nh c n của virus cú A h gen u n iến ổi sự thay ổi kháng nguy n theo thời gian tồn tại giúp cho virus ưu h nh rộng rãi trong tự nhi n ở nhiều loài vật chủ khác nhau [11], [43]

C a phư ng thức chủ yếu iến ổi kháng nguy n ở virus cú A

1.4.1 Hiện tượng «lệch kháng nguyên»

«L ch kháng nguy n» (antigenic drift) thực chất các ột iến iể

x y ra trong các ph n oạn gen/h gen của virus chủ yếu ở ph n oạn 4 của

Virus cúm A Virus xâm nhi tế

bào Thụ thể dành cho virus trên bề mặt tế bào

Màng tế bào

Virus ph ng th ch theo nối

n y chồi

Dung h p màng, cởi áo

Nhân tế bào

Glycoprotein HA và NA của virus ư c chèn lên màng tế bào

ph n oạn HA (Hình 1.6) Do virus cú A ký sinh nội o t uộc kh ng c

c chế "đọc và sửa bản sao" (proof-reading) trong quá trình phiên mã và sao

ch p ở nh n tế o ch cho n n sự thiếu hụt enzy s a ch a RNA dẫn ến

các enzy sao ch p phụ thuộc RNA sẽ c thể th nucleotid (đột biến thêm),

ất i (đột biến xoá) hoặc thay thế (đột biến điểm) [12] ột hay nhiều

nucleotid kh ng ư c s a ch a trong ph n t RNA chuỗi n ới trong quá trình nh n n của virus [43] [39]

Tuỳ thuộc vị tr x y ra các ột iến trong ộ a ã h a c thể trực tiếp thay ổi các acid amin trong trình tự của protein ư c ã h a iểu

hi n dẫn ến thay ổi ặc t nh sinh học của protein hoặc ư c t ch ũy trong

ph n oạn gen x y ra ột iến (đột biến điểm) Tần suất x y ra ột iến iể

(point- utation) rất cao cứ ỗi 10.000 nucleotid (tư ng ứng với ộ d i của RNA h gen của virus cú A) thì c 1 nucleotid sai khác [18],[21] Như vậy gần như ỗi hạt virus ới ư c sinh ra ều chứa ột hoặc hai ột iến iể trong h gen của n v như vậy các ột iến n y ư c t ch ũy qua nhiều thế

h virus sẽ xuất hi n ột ph n type virus ới c gen HA với nh ng ặc

t nh kháng nguy n ới c thể ị sai ch

Sự chuyển dịch ch kháng nguy n cũng c thể x y ra với gen NA NA c chứa nhiều phần dư acid amin quan trọng nh ng phần dư n y khi ột iến sẽ làm cho virus kháng ại các thuốc ức chế neura idase Các ột iến n y thường x y ra tại các vị tr acid amin R152K E119V H274Y R292K Đột iến tại vị tr H274K i n quan ến vấn ề kháng thuốc Ose ta ivir (Ta if u) [12],[33],[42] Lysine (K) thay thế cho arginine (R) ở vị tr 292 của NA sẽ ưa

ến sự kháng thuốc ho n to n Đột iến R th nh K g n iền với sự trao ổi nucleotid AGA thành AAA trong gen NA

1.4.2 Hiện tượng «trộn kháng nguyên»

Hi n tư ng «trộn kháng nguy n» (antigenic shift) (c n gọi trao đổi hay

tái tổ hợp) các gen kháng nguy n chỉ c ở virus cú v ở rất t ột số virus

RNA g y nh gia cầ khác cho ph p virus c kh năng iến chủng rất cao

Hi n tư ng n y x y ra như sau : H gen gồ 8 ph n oạn gen ri ng i t của virus cú A ư c hai chủng virus cú A khác nhau khi ồng nhiễ trong

ột tế o c thể trao ổi cho nhau ể c thể x y ra sự ho trộn (reassort) hoặc trao ổi (swap) các ph n oạn gen gi a hai chủng virus trong quá

trình kết h p ại th nh ột h gen ới tạo ra các dạng khác nhau của RNA h gen ở các hạt virus ới sinh ra hỗn h p từ th nh phần các ph n oạn của h gen từ nh ng virus an ầu Kết qu tạo ra thế h virus ới c các ph n oạn gen kết h p v i khi giúp cho chúng c kh năng y nhiễ ở o i vật chủ ới hoặc gia tăng ộc ực g y nh [33] [42] [18]

1.4.3 Hiện tượng glycosyl hoá

Th ng thường các virus cúm A nói chung và cúm A/H1N1 nói riêng có

ức ộ ột iến iể cao thay thế ột số nucleotid tại nh ng vị tr ở

c thể tạo n n các acid amin ới c kh năng tiếp nhận car onhydrate tạo

n n hi n tư ng glycosyl hoá (glycosylation) Hay nói cách khác ở virus cú A/H1N1, glycosyl hoá là sự g n kết của ột chuỗi car onhydrate

(oligosaccharide) v o với acid amin asparagine (N) ở ột số vị tr nhất ịnh

trong chuỗi po ypeptide HA hay NA hay ột số po ypeptide khác Th ng thường chuỗi o igosaccharide ư c g n tại vị tr NXS hoặc NXT (trong , N: asparagine, X: acid amin ất kỳ trừ pro ine S: serine hoặc T: threonine)

Đ y nh ng vị tr ư c cho g n kết với các kháng thể ư c c thể sinh ra

do k ch th ch của kháng nguy n nhằ o v c thể khỏi ị nhiễ virus

Hi n tư ng «lệch kháng nguyên» sinh ra do ột iến iể ở ột vị tr n o

hình thành nên ộ ã của asparagine tạo tiền ề cho hi n tư ng g ycosy hoá

x y ra khi tổng h p chuỗi po ypeptide HA hay NA thay ổi iểu hi n ặc

t nh kháng nguy n của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác ộng iễn dịch

o hộ của c thể chủ v iều ho sự nh n n của virus [24]

Hi n tư ng "lệch kháng nguyên" và "glycosyl hóa" x y ra i n tục theo thời gian c n hi n tư ng "trộn kháng nguyên" c thể x y ra với tất c các

chủng của virus cúm A, khi ồng nhiễ trong ột tế o ở tất c các o i vật chủ khác nhau Đ y cũng ch nh vấn ề áng o ngại của virus cú A/H1N1

hi n nay ặc dù virus n y chưa c sự th ch nghi y nhiễ dễ d ng ở người nhưng n c kh năng g y nh cho người v rất c thể virus cú A/H1N1 tái

tổ h p (vay mượn) gen HA hay NA hoặc c hai gen của các chủng virus cú

A ã th ch nghi ở người ể tạo ra ột iến chủng virus ới th ch ứng y nhiễ dễ d ng ở người g y ra nguy c của ột ại dịch cú ới v ặt ra ột ịnh hướng ới trong ph ng chống [18], [33], [51]

1.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu virus cúm A/H1N1

1.5.1 Kỹ thuật rRT-PCR phát hiện cúm A/H1N1 từ bệnh phẩm nhày họng

Qui trình kĩ thuật rRT-PCR phát hi n cú A/H1N1 ư c áp dụng qui trình ã ư c c ng ố của Tổ chức Y tế thế giới v Trung t kiể soát v

ph ng chống nh tật Hoa kì (CDC) phát hi n virus cú A/H1N1 ại dịch

ới

Ti u ch chọn qui trình dựa tr n c sở: sự ựa chọn các pri er trong qui trình phù h p với ặc iể dịch tễ học ph n t của virus cú A/H1N1 ưu

h nh ở Vi t Na

Kĩ thuật rRT-PCR (TaqMan Probe): L ột kĩ thuật PCR ịnh ư ng

thực hi n ột ước ao gồ giai oạn chuyển s i RNA th nh s i DNA ổ sung Số ư ng n gen gốc an ầu ư c t nh toán dựa tr n c sở số ư ng copy thu ư c từ ỗi chu kì ph n ứng [13], [23], [25] Ngo i các cặp ồi

xu i v ngư c ph n ứng rea ti e PCR c n ư c ổ sung các pro e c g n huỳnh quang v ư c phát hi n nhờ h thống ầu ọc của áy rea ti e PCR

C nhiều oại ph n ứng rea ti e PCR dựa v o cấu tạo của pro e: Sy re Green TaqMan pro e Nguy n kĩ thuật rea ti e PCR theo phư ng pháp TaqMan Probe:

Chu kì ph n ứng diễn ra gồ 3 giai oạn:

Giai oạn iến tính (denature): ở nhi t ộ 940C s i i DNA ư c tháo

xo n tạo th nh 2 s i n

Giai oạn t cặp (annea ing): ở nhi t ộ kho ng 45-680

C, các primer và pro e sẽ g n v o s i n DNA tại các vị tr ặc hi u ể chuẩn ị cho quá trình tổng h p s i DNA ới

Giai oạn k o d i (Extension): ở nhi t ộ 720C enzy po y erase t

ầu hoạt ộng g n các nuc eotid tự do trong i trường v o ầu 3/

của pri er ể tổng h p s i DNA ới Khi s i DNA ới k o ến oạn pro e

ứt gãy pro e ầu receptor của pro e gi i ph ng khỏi ầu quencher v phát

t n hi u huỳnh quang Đầu ọc huỳnh quang của áy rea ti e PCR sẽ t

ư c t n hi u n y

Kết thúc ph n ứng (qua nhiều chu kì) phần ề của áy sẽ t nh số

ư ng n gốc DNA trong ẫu th an ầu

Chuẩn ị ẫu th (RNA):

Tách chiết RNA ằng cột spin co u n: x dụng ộ kit tách chiết RNA Vira RNA Mini Kit của hãng QIAGEN Đức Qui trình tách chiết thực hi n theo hướng dẫn của nh s n xuất

S dụng ộ k t QIAGEN n y nhằ tách chiết v tinh sạch ARN từ các

ẫu nh phẩ s ng khác nhau ARN sau khi ã tách chiết ư c s dụng

te p ate cho các ph n ứng RT-PCR, Realtime PCR, sequencing

Nguyên lý: Bộ k t s dụng ng ọc c g n si ica Mẫu ầu ti n ư c y

gi i dưới iều ki n iến t nh ể ất hoạt ARNase v ồng thời ARN vẫn ư c

o to n Sau s dụng các dung dịch nhằ cung cấp các iều ki n tối

ưu cho kh năng g n v o ớp ng của ARN Mẫu sau ư c chuyển sang cột tách c chứa ớp ng si ica ARN g n tr n ớp ng các chất c kh năng ức chế ph n ứng sẽ ư c oại ỏ th ng qua hai ần y t ằng dung dịch r a Cuối cùng ARN ư c tách khỏi ớp ng si ica v sẵn s ng cho

ục ch tiếp theo v ưu gi

Đánh giá kết quả rRT-PCR:

- Â t nh: kh ng c t n hi u huỳnh quang

- Dư ng t nh: tất c các ẫu nh phẩ c t n hi u huỳnh quang ư c

thu nhận tại chu kì (Ct: thresho d cyc e) thứ 37-40 của ph n ứng

- Dựa v o chứng RP (Rnase P) ể ánh giá chất ư ng RNA (chỉ ánh

giá RNA tách chiết từ ẫu nh phẩ của người) Tất c các ẫu c t n hi u huỳnh quang ư c thu nhận trước hoặc tại chu kì thứ 37 của ph n ứng ư c coi ủ ư ng RNA cho ph n ứng

Đánh giá độ tin cậy của phản ứng rRT-PCR:

- H số tư ng quan r ≥ 0 99

- Hi u suất PCR E %: 90-105

Đánh giá độ đặc hiệu rRT-PCR:

Độ ặc hi u của phư ng pháp ư c ánh giá ằng cách thực hi n ph n ứng rRT-PCR với ẫu th RNA của virus cú A/H5N1 v virus cú B

Đánh giá độ nhạy của phương pháp:

Độ nhạy của phư ng pháp ư c ánh giá ằng cách pha oãng ẫu th RNA ở các ậ ộ khác nhau v cùng ư c khuếch ại ằng 2 qui trình rRT-PCR (qui trình 1 s dụng cặp ồi của CDC v qui trình 2 s dụng sinh phẩ

v cặp ồi của Vi n V sinh dịch tễ Trung ư ng Nga)

1.5.2 Kỹ thuật giải trình tự gen

Gi i trình tự (DNA sequencing) quá trình thu nhận v xác ập trình tự nuc eotid của ột ph n oạn DNA cần nghi n cứu Nguy n ý của phư ng pháp gi i trình tự dựa v o hoạt ộng của DNA-polymerase trong quá trình tổng h p DNA ạch n g n nuc eotid v o vị tr 3'-OH tự do nếu nuc eotid kh ng chứa nh 3'-OH (ddNTP) thì ph n ứng tổng h p ị dừng ại

Đặc trưng của phư ng pháp n y dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị

trí C 3 và 4) ể dừng ph n ứng ột cách ngẫu nhi n [13], [18], [25] Kết qu

tạo ra các oạn DNA s i n d i ng n khác nhau v chỉ sai khác nhau ột nucleotid, sau khi ph n t ch sẽ cho ột dãy c ộ d i v i tră nuc eotid

Mồi s dụng ồi n d i kho ng 20-24 nuc eotid v chuỗi n DNA

s n phẩ ư c xác ịnh trình tự theo chiều 5' 3' ư c dùng thuốc nhuộ huỳnh quang (f uorescent dye) ể ánh dấu Khi s dụng thạch polyacrylamide và

qu t tia azer dọc theo chuỗi ể ọc trình tự ph n t ch tự ộng ằng áy với các chư ng trình phần ề tin-sinh học thì thu nhận ư c chuỗi DNA cuối cùng

Phương pháp dideoxy của Sanger

Phư ng pháp n y do F Sanger S ith v Cou son phát hi n v o nă

1977 dựa tr n c chế tổng h p DNA trong c thể sinh vật

Trong quá trình tổng h p DNA ổ sung ột ư ng nhỏ ddNTP ị ất

2 nh OH ở car on số 2 v số 3 n n trong quá trình tổng h p ạch n DNA gặp ngẫu nhi n ột ddNTP cho ph n ứng tổng h p DNA dừng

ại Kết qu tổng h p DNA tạo n n các chuỗi ạch n ới h n k nhau ột nucleotid từ xác ịnh ư c trình tự ạch khu n

Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự tự động

Máy gi i trình tự gen án tự ộng hoặc tự ộng ư c thiết kế tr n

nguy n t c s dụng ddNTP do F.Sanger v cộng sự phát inh

S dụng các ồi v ddNTP ánh dấu thay cho ánh dấu ph ng xạ

ỗi oại ddNTP ư c ánh dấu huỳnh quang khác nhau iểu thị u s c khác nhau Máy thực hi n tổng h p các ạch n DNA ới tr n c 2 ạch khu n DNA ồng thời s dụng các phần ề t nh toán tr n áy

t nh ể x kết qu giúp kiể soát ư c các sai s t o ộ ch nh

xác cao

Trình tự nucleotid của gen ư c xác ịnh theo phư ng pháp của Sanger trên áy xác ịnh trình tự DNA tự ộng ABI pris 3100 Sequencer (App ied Biosyste s) với ộ Kit xác ịnh trình tự BigDye® Ter inater v3.1 Cyc e

Sequencing Kit của hãng App ied Biosyste s

1.5.3 Một số phương pháp tạo cây chủng loại phát sinh (Phylogenetic tree)

Nguy n ý c n của các phư ng pháp n y dựa tr n thuật toán thống

k ể x y dựng c y chủng oại phát sinh từ số i u ph n t Các phư ng pháp

ư c s dụng phổ iến c thể chia th nh 3 nh :

- Phư ng pháp kho ng cách (Distance)

- Phư ng pháp chi li (Maximum parsimony)

- Phư ng pháp ch c ch n (Maxi u ikehood)

Phư ng pháp kho ng cách hay c n gọi phư ng pháp a trận (Distance atrix ethod) Phư ng pháp thường ư c s dụng nhiều vì c ộ ch nh xác khá cao t nhất trong các trường h p tỉ tiến h a kh ng thực sự quá khác

i t (Do Saitow and Nei - 1987)

Phư ng pháp chi i tối a (Maxi u parsi ony ethod) phát triển s dụng cho trình tự nucleotid Đ y phư ng pháp cho ộ ch nh xác khá cao so với phư ng pháp kho ng cách khi c số ư ng nucleotid ớn (Do Fitch 1971

và Haitigan 1973)

Phư ng pháp ch c ch n tối a (Maxi u ikehood Method) ể phát

hi n tần số gen nhưng chưa ho n chỉnh Trong phư ng pháp n y ể phát hi n

ột số i u trình tự ị thay thế theo ột kiểu ặc hi u tối a cho ột hình v hình c ộ ch c ch n tối a cao nhất sẽ ư c chọn ể tạo c y (Do Felsenstein 1981)

(Nguồn: NeiM (2000), Molecular evolutility and phylogenesis, Oxford

University, New York)

1.6 Một số nghiên cứu liên quan virus cúm A/H1N1 đã thực hiện

Về dịch tễ học ã c nhiều nh nghi n cứu thực hi n ể ưa ra nh ng

ức tranh tổng quát về ặc iể dịch tễ học v các yếu tố nguy c của nh

cú A/H1N1/09 ại dịch tại từng khu vực khác nhau, [8],[13] Nghi n cứu ịnh type iến ổi di truyền v gen học tiến h a của virus cú (A/H1N1 v A/H5N1) ư c nhiều c sở tiến h nh trước y v ngay từ nh ng tháng ầu

ti n diễn ra ại dịch cú 2009 Nh ng chuỗi gen giúp xác ịnh ph n type H1

ph n type N1 v các gen cấu trúc ã ư c Vi n c ng ngh sinh học Vi n Pasteur th nh phố Hồ Ch Minh Vi n v sinh dịch tễ trung ư ng Vi n v sinh dịch tễ qu n ội gi i ã v c ng ố tr n ng n h ng gen [12] [17] [19]

[49]

Theo nghi n cứu của vi n VSDT Trung ư ng hầu hết các virus H1N1 lưu h nh tại Vi t Na từ 2001 ến 2006 có kháng nguyên tư ng tự như của chủng A / New Caledonia / 20/99 [12]

Nă 2009 Vi n Vaccin Sinh phẩ Y Tế Nha Trang ã ưa Chủng virus cúm NYMC X-179A s n xuất vaccin v trình tự gen ã h a kháng nguy n

NA của chủng n y ư c gi i trình tự v ph n t ch cho kết qu tư ng ồng 100% kh ng x y ra ột iến gen NA trong quá trình s dụng [6]

Nă 2011 trong ề t i của vi n V sinh dịch tễ Trung ư ng khi nghi n cứu ặc iể dịch tễ học v virus học của cú A/H1N1 ại dịch khu vực

B c-Trung-T y nguy n ã chỉ ra các quan h ph h của các chủng ph n ập tại Vi t Na so với các chủng tr n thế giới v tất c ư c phát triển từ chủng gốc A/Ca ifornia/04/09(H1N1 pd ) v ề xuất ựa chọn hai chủng ại di n A/VietNam/HN-NN/07/09, A/VietNam/HN-NN/100/10 ể phát triển vaccin

Từ nh ng kết qu nghi n cứu về cú A/H1N1 của Vi t Na ã v ang sáng tỏ th về ối quan h tiến triển nh học y nhiễ dịch tễ học

ph n t phát triển tiến hoá v genotype v kháng nguy n - iễn dịch - vaccin của cú tại Vi t Na Cho ến nay chưa c nghi n cứu n o về dịch tễ học v

ặc iể gen của virus cú A/H1N1 trong các n vị qu n ội Vi t Na thời kỳ ại dịch 2009-2010

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nh phẩ dịch nh y họng của người nh c tri u chứng s ng iển hình ở ột số n vị qu n ội ph a B c: Học vi n quốc ph ng Học vi n Hậu cần Trường sĩ quan ục qu n I Trung cấp th ng tin H a ình nh nh n tại các n vị thu dung iều trị tại Vi n 103

+ Chọn nh nh n:

Chọn các nh nh n nghi ngờ nhiễ virus cú c các tri u chứng của

nh giống cú theo hướng dẫn của Bộ Y tế như sau:

+ Cỡ ẫu nghi n cứu ư c t nh theo c ng thức:

Trong : n : Cỡ ẫu nghi n cứu

Z(1-  /2) : H số tin cậy = 1 96 (tư ng ứng với α= 0,05)

P : Tỷ nhiễ cú A/H1N1 (P= 0 3 ấy theo tỷ ước

t nh của WHO)

d : Sai số nghi n cứu ước t nh 10%

Vậy cỡ ẫu nghi n cứu của chúng t i tối thiểu : 81

Địa điểm nghiên cứu: Khoa vi sinh Y học Vi n VSPDQĐ

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 nă 2010 ến tháng 6 nă 2012

- Bộ kit tách chiết RNA của hãng QIAa p Vira RNA Mini Kit Đức

- Bộ sinh phẩ rRT-PCR SuperScrip TM III Platium One-Step

Quantitative RT-PCR Syste của hãng Invitrogen

- Bộ sinh phẩ rRT- PCR chẩn oán cú A/H1N1(A p isen) của Vi n

V sinh dịch tế Trung ư ng Nga

- M i trường DMEM vận chuyển v o qu n nh phẩ (Invitrogen)

- Các cặp pri er v pro e ặc hi u cho ph n type H1N1 ới

2.2.2 Trang thiết bị

- Máy c áy i t p ate (Eppendorf Centrifuge 5417C)

- H thống rea ti e PCR 7300 fast 7500 ABI

- Dụng cụ è ưỡi v trùng

2.3 Thiết kế nghiên cứu

- Phư ng pháp nghi n cứu thực nghi t hồi cứu và tiến cứu

- Thiết kế nghi n cứu ư c t như sau:

Hình 2.1 Thiết kế nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus cúm A/H1N1

2.4 Ứng dụng rRT-PCR phát hiện cúm A/H1N1

2.4.1 Qui trình xử lí bệnh phẩm

+ Lấy ẫu nh phẩ nh y họng: nh phẩ nh y họng ư c ấy ằng

que tă ng tẩ nước uối sinh v trùng

+ Nhúng que tă ng nh phẩ v o 2 nước uối sinh v trùng

hay i trường DMEM B o qu n ở iều ki n 2-80C trong quá trình vận

chuyển về ph ng th nghi

+ Vortex que tă ng trong i trường vận chuyển 15 gi y

+ Lấy 200 µ dung dịch nh y họng (kh ng i t ấy cặn) ể tách chiết RNA

2.4.2 Quy trình tách chiết ARN tổng số

+ Lấy 560 dung dịch AVL c chứa chất ang ARN v o ống PCR 1,5ml

+ Thêm 140 ẫu v o hỗn h p tr n sau trộn ều tr n áy c trong vòng 15s

+ Chuyển 630 hỗn h p từ ước 5 v o cột tách QIAa p v i t ở tốc

ộ 8000v/1 phút Chuyển cột tách chứa ng ọc sang ống PCR 2 ới v oại ống PCR chứa dung dịch ã i t

+ Mở cột tách v th 500  dung dịch AW1 Đ ng n p v i t

ở tốc ộ 8000v/1phút Chuyển cột tách sang ống PCR i t 2 ới v oại

ỏ ống PCR chứa dung dịch ã i t

+ Mở cột tách và thêm 500  dung dịch AW2 Đ ng n p v i t

ở tốc ộ 14.000/3 phút Chuyển cột tách sang ống PCR 2 ới v tiếp tục i

t ở tốc ộ 14.000/3 phút Chuyển cột tách sang ống PCR 1 5 ới v oại ỏ ống PCR chứa dung dịch ã i t

+ Chuyển cột tách sang ống PCR 1,5ml và thêm 60  dung dịch

+ Đ ng n p v ủ ở nhi t ộ ph ng (15-250C) trong 1 phút

+ Li t ở tốc ộ 8000v/1phút

+ Loại ỏ cột tách Dung dịch thu ư c chứa ARN ã ư c tách chiết

Gi ẫu ARN ở 40C nếu tiến h nh ngay

+ Nếu chưa tiến h nh ngay các ẫu ARN n y cần ph i o qu n ở

-800C

2.4.3 Phương pháp rRT-PCR

Kết quả lựa chọn primer

Tr n c sở tha kh o các t i i u ã c ng ố của H thống giá sát cú

to n cầu của Tổ chức Y tế thế giới (WHO-GISN) chúng t i ã chọn ư c h thống pri er v pro e cho ph n ứng rRT-PCR phát hi n virus cúm A/H1N1

ới

Các cặp ồi ư c thiết kế tr n oạn gen o thủ ã h a protein Hae agg utinin (HA) của virus cú A/H1N1 ới kh ng khuếch ại trình tự nuc eotide tư ng ư ng với các ph n type HA khác

Primer đặc hiệu cho cúm A:

- Inf A Forward: GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGAC

- Inf A Reverse: AGG GCA TTY TGG ACA AKC CGT CTA

- Inf A Probe: TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG

Primer và probe đặc hiệu cho phân type cúm A/H1N1 mới:

- SW H1 Forward: GTG CTA TAA ACA CCA GCC TYCCA

- SW H1 Reverse: CGG GAT ATT CCT TAA TCC TGT RGC

- SW H1 Pro e: CAG AAT ATA TAC A‖T‖CCG GTC ACA ATT

GGA GAA

Primer và probe đặc hiệu cho kiểm tra quá trình tách chiết:

- Rnase P Forward: AGA TTT GGA CCT RCG AGCG

- Rnase P Reverse: GAG CGG CTG TCT CCA CAAGT

- Rnase P Probe: TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCGCG

Bảng 2.1 Thành phần và nồng độ các chất tham gia phản ứng

Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng

SuperScrip TMIII RT/Platium Taq Mix 0,5

Bảng 2.2 Chu kì nhiệt của phản ứng

hi n các trình tự ặc hi u tr n gen HA của virus cú A/H1N1

2.4.4 Phương pháp điện di kiểm tra và tinh sạch sản phẩm rRT-PCR

Đi n di ư c thực hi n ằng cách ưa hỗn h p s n phẩ rRT-PCR vào

thạch agarose trong hộp i n di (e ectrophoretic apparatus) v ặt trong ột

i n trường S n phẩ rRT-PCR hiển thị ở dạng ăng u tr ng sau khi tra trực tiếp chất nhuộ ethidium bromide - EtBr) hoặc ư c nhuộ sau khi i n

di v ư c quan sát dưới èn tia t ngoại K ch thước các ăng DNA ư c so sánh với thang DNA chuẩn (DNA arker) Đi n di ư c thực hi n ở 100-120V 400 A trong kho ng 30 phút R a thạch ằng nước cất soi qua tia cực t ằng áy soi ge (Do phin Wa tec) v chụp nh S n phẩ PCR cần

ư c tinh sạch (purification) ể oại ỏ các th nh phần khác chỉ gi ại DNA tinh khiết Tinh sạch s n phẩ ằng ộ PCR purification kit Bioneer

Tinh sạch sản phẩm PCR (Theo k t tinh sạch DNA của hãng Bioneer)

Hình 2.2 Qui trình tinh sạch DNA

Tinh sạch DNA

Sản phẩm

PCR

Dung dịch đệm Hỗn hợp tủa DNA

Ly tâm

Làm khô loại cồn

Hòa tan tủa DNA Dung dịch DNA sạch

Ly tâm

Ly tâm Ly tâm

Rửa tủa, loại tạp

chuyển cột sang ống PCR 2 khác ục ch ể oại ỏ uối v tạp tan trong dịch trong cột DNA DNA ị ất trong ước n y kh ng áng kể Lặp

Nếu trong ẫu nh phẩ c virus cú A/H1N1 thì kết qu i n di sẽ

c các vạch DNA tư ng ứng c k ch thức 244 349 p Nếu trong ẫu nh phẩ c virus cú A nhưng kh ng c ph n type H1 sẽ chỉ c 1 vạch 244 p Nếu kết qu i n di kh ng xuất hi n các vạch DNA c k ch thước như tr n thì

ẫu nh phẩ kh ng có virus cúm A

2.5 Các bước tiến hành giải trình tự

Gi i trình tự gen tại khoa Sinh học Ph n t - B nh vi n Trung ng

Qu n ội 108 thực hi n tr n áy tự ộng CEQ 8800 Đư c tiến h nh theo t i

i u áy CEQ 8800 của hãng Beck an cou ter cung cấp