Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 5 phenyl 1,3,4 thia diazol 2 YL hướng ức chế enzym histon deacetylase

Sự giảm acetyl hóa các histon có liên quan đến cấu trúc của NST ở trạng thái đóng xoắn dẫn đến ức chế quá trình phiên mã gen, ngược lại những histon được acetyl hóa có liên hệ với một cấ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DEACETYLASE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DEACETYLASE

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM

VÀ BÀO CHẾ

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn người thầy đáng kính của tôi,

trưởng bộ môn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội PGS.TS Nguyễn Hải

Nam Thầy đã không chỉ tạo những điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn mà luôn có những hướng dẫn chính xác và kịp thời những lúc tôi gặp khó khăn, luôn ở bên động viên tôi, cho tôi niềm động lực tinh thần, niềm tin lớn Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội trong suốt thời gian qua đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại bộ môn, đến những cô chú anh chị cán bộ giúp đỡ tôi trong quá trình kiểm tra, đo đạc các loại phổ tại viện Hóa Học Việt Nam, viện Hóa Học các hợp chất tự nhiên và bộ môn Hóa vật liệu trường Đại học Khoa học tự nhiên

Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị, các bạn và các em trong nhóm thực nghiệm tại bộ môn Hóa Dược, những người

đã chia sẻ vui buồn, đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội ngày tháng năm 2012

Người viết

Đỗ Thị Ánh Tuyết

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ……….1

PHẦN I - TỔNG QUAN……… 2

1.1 Histon deacetylas……… 2

1.1.1 Cấu trúc nhiễm sắc thể……… 2

1.1.2 Histon deacetylase……… 3

1.1.3 Cơ chế hoạt động của histon deacetylase ……… 4

1.1.4 Mối quan hệ giữa HDAC và ung thư……… 5

1.2 Các chất ức chế HDAC……… 7

1.2.1 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC……… 7

1.2.2 Phân loại chất ức chế HDAC……… …10

1.2.3 Tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC 15

1.2.4 Liên quan cấu trúc-tác dụng của các chất ức chế HDAC……… 16

1.3 Phản ứng hóa học……… 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên liệu 25

2.1.1 Hóa chất chính 26

2.1.1 Dung môi và hóa chất khác 26

2.2 Thiết bị, dụng cụ 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 27

2.4.2 Xác định cấu trúc 27

2.4.3 Thử tác dụng ức chế enzym HDAC 27

2.4.4 Thử độc tính tế bào invitro 27

2.4.5 Nghiên cứu docking của các chất………28

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 29

3.1 Tổng hợp hóa học 31

3.1.1 Tổng hợp ”N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid” (5a)……… 32

3.1.2 Tổng hợp ”N1-hydroxy-N8 -(5-(2clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid” (5b) 33

3.1.3 Tổng hợp “N1-hydroxy-N8 -(5-(3clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid(5c) 35

3.1.4 Tổng hợp “N1-hydroxy-N8 -(5-(4clorophenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid(5d) 37

3.1.5 Tổng hợp “N1-hydroxy-N8-(5-(methoxyphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid(5e) 39

3.1.6 Kiểm tra độ tinh khiết 40

3.2 Xác định cấu trúc 42

3.2.1 Phổ hồng ngoại (IR) 42

3.2.2 Phổ khối lượng (MS) 45

3.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 46

3.3 Hoạt tính sinh học 49

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 51

4.1 Hóa học 51

4.2 Hoạt tính sinh học 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ALL : Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính

AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính

APL : Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính

Receptor gây chết nội tại Bệnh ung thư bạch cầu mãn tính

U lympho tế bào T dưới da Hội chứng loạn sản tuỷ DMF : Dimethyl formamid

DMSO : Dimethyl sulfoxid

EtOH : Ethanol

HAT : Histon acetyltranferase

HDAC : Enzym histon deacetylase

HDACi : Chất ức chế enzym histon deacetylase

IC50 : Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào xuống một nửa

RAR : Receptor của acid retonic

SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic

TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng

TSA : Trichostatin A

Stt Tên bảng Trang

Bảng 1.2 Tác dụng ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC 15 Bảng 3.1 Giá trị Rf và T0nc của các chất 5a-e 39 Bảng 3.2 Số liệu phân tích phổ IR của các chất 3a-d 40 Bảng 3.3 Số liệu phân tích phổ IR của các chất 4a-d 40 Bảng 3.4 Số liệu phân tích phổ IR của các chất 5a-e 41 Bảng 3.5 Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất 42 Bảng 3.6 Số liệu phân tích phổ 1H-NMR của các chất 5a-e 43 Bảng 3.7 Số liệu phân tích phổ 13C-NMR của các chất 5a-e 45 Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính của chất 5a-e và SAHA 46

Bảng 4.1 Kết quả thử độc tính tế bào in vitro của một số dẫn chất

Bảng 4.2

Kết quả thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất benzothiazol trong luận văn thạc sỹ của Trần Văn Nam

STT Tên hình Trang

Hình 1.1 Cấu trúc histon trong nucleosom 2 Hình 1.2 Cấu trúc 3D của một HDAC gắn với một chất ức chế HDAC 5 Hình 1.3 Tác động của các HDAC với tế bào ung thư 6

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của các chất ức chế HDAC 7

Hình 1.5. Công thức của một số chất ức chế enzyme HDAC 14

Hình 1.6 Phần mang dược tính của các chất ức chế HDAC 17

Hình 1.7 Liên quan cấu trúc – tác dụng của các chất ức chế

HDAC dẫn chất acid hydroxamic

18

STT Tên sơ đồ Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cho đến nay, ung thư vẫn được coi là căn bệnh khó chữa nhất Trong khoảng năm thập kỷ trở lại đây, trong cuộc chiến chống lại căn bệnh ung thư, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát triển nhiều loại thuốc mới để điều trị ung thư Cho đến nay, có khoảng 200 thuốc đã được cấp phép sử dụng trong lâm sàng và hàng trăm thuốc vẫn đang được nghiên cứu Những thuốc này đã đạt được một số thành tựu như cải thiện được tình trạng bệnh và kéo dài tuổi thọ bệnh nhân tuy nhiên việc sử dụng chúng có nhiều hạn chế do độc tính cao, thiếu tính chọn lọc trên các khối u và hiệu lực điều trị thấp Ngày nay nhờ các tiến bộ

về sinh học phân tử, di truyền học, người ta đã có những hiểu biết ngày càng sâu sắc về các tiến trình sinh học trong ung thư: sự tăng trưởng tế bào, các gen điều hòa chu trình tế bào, sự chết tế bào theo chương trình, sự tạo mạch… Điều này

đã tạo điều kiện thuận lợi để các nhà khoa học phát triển một liệu pháp mới: liệu pháp nhắm trúng đích (targeted therapy) nhờ vào các hiểu biết về ung thư ở mức

độ phân tử

Một trong những mục tiêu phân tử đang được chú ý hiện nay là các enzym histon deacetylase (HDAC) [1] Nghiên cứu về các HDAC, người ta đã chứng minh được rằng hoạt động bất thường của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư Trong những năm gần đây, các chất ức chế HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng Acid suberoylanilid hydroxamic (Vorinostat, Zolinza®) là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T da [13] Vorinostat là một chất ức chế HDAC có chứa nhóm hydroxamic trong phân tử Đây là một trong những chất được nghiên cứu phát triển từ TSA - là một chất ức chế HDAC tự nhiên có chứa nhóm hydroxamic trong phân tử Điều này cho thấy các chất ức chế HDAC có chứa nhóm chức hydroxamic rất có triển vọng trong điều trị ung thư Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung thiadiazol-2-yl hướng ức chế enzyme histon deacetylase” với 2 mục tiêu chính:

5-phenyl-1,3,4-1, Tổng hợp N 1 -hydroxy-N 8 yl)octandiamid” và một số dẫn chất

-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-2, Thử tác dụng ức chế enzyme HDAC và độc tính tế bào ung thư (in vitro của các chất tổng hợp được

\

và được bảo tồn cao qua quá trình tiến hóa Tất cả 4 lõi của histon đều có một đuôi tận cùng là nhóm amino [1,18] Việc kéo dài nucleosom là do những đuôi amino mang điện của các histon Đuôi của histon H4 dường như kéo dài đến sát ngay nucleosom kế tiếp để kết hợp với phức hợp H2A-H2B, cho thấy phần đuôi của các histon có thể quyết định cấu trúc bậc cao hơn của sợi nhiễm sắc [1] Thực tế là, những đuôi histon đặc biệt là H3 và H4 là đích đến cho nhiều sự biến đổi khác nhau sau phiên mã bao gồm: sự acetyl hóa, sự methyl hóa và sự phosphoryl hóa Những thay đổi cộng hóa trị của những đuôi histon được tạo thành bởi những enzym như histon acetyltransferase (HAT), methyltransferase, kinase và đặc biệt là những histon deacetylase (HDAC) đã được biết đến là quyết định sự biểu hiện gen [1,15]

Hình 1.1: Cấu trúc histon trong nucleosom

a/ Các lõi protein của nucleosom gồm H2A (histon 2A), H2B (histon 2B), H3 (histon 3) và H4 (histon 4) ADN (màu đen) quấn quanh một octamer của các histon b/ Các đuôi amino của các lõi histon Các lysin (K) trong các đuôi amino

của các histon H2A, H2B, H3 và H4 là những vị trí có khả năng bị

acetyl/decacetyl hóa bởi các histon acetyltransferase (HAT) và histon

deacetylase (HDAC) Sự acetyl hóa làm trung hòa điện tích trên các lysin A, acetyl; C, nhóm carboxyl; E, acid glutamic; M, methyl; N, nhóm amino; P, phosphat; S, serin; Ub, ubiquitin

1.1.2 Histon deacetylase

HDAC là enzym xúc tác cho sự di chuyển làm giảm bớt nhóm acetyl trên phần đuôi lysin của những protein histon H2A, H2B, H3 và H4 trong lõi nucleosom [26] Sự giảm acetyl hóa các histon có liên quan đến cấu trúc của NST ở trạng thái đóng xoắn dẫn đến ức chế quá trình phiên mã gen, ngược lại những histon được acetyl hóa có liên hệ với một cấu trúc NST ở trạng thái giãn rộng hơn và sự hoạt hóa quá trình phiên mã Ngoài ra, các HDAC còn có chức năng quan trọng khác là kiểm soát trạng thái acetyl hóa và chức năng của nhiều protein trong tế bào chất và những nhân tố phiên mã Hiện nay người ta đã biết đến 18 HDAC, chia làm 4 nhóm [14,24]:

- Nhóm I gồm: HDAC1, 2, 3 và 8, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào

- Nhóm II gồm: HDAC4, 5, 7, 9, 6 và 10 Các enzyme này biểu thị mô đặc trưng, có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân

- Nhóm III gồm những sirtuin, có ở bào tương, ty thể và nhân

- Nhóm IV gồm HDAC11, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào

Nhóm I, II và IV gồm 11 thành viên và được coi là những HDAC “kinh điển” Những HDAC “kinh điển” và sirtuin có cơ chế xúc tác khác nhau Những HDAC “kinh điển” là những enzym phụ thuộc Zn2+, vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy của túi Những enzym này có thể bị

ức chế bởi các hợp chất tạo chelate với Zn2+ như các acid hydroxamic Ngược lại, những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất này vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ như một cofactor cơ bản [29] Thuật ngữ “các chất ức chế HDAC” thường được sử dụng cho những hợp chất nhằm

mục tiêu vào những HDAC “cổ điển” thuộc nhóm I, II và IV và những hợp chất này hiện nay đang được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng

1.1.3 Cơ chế hoạt động của các HDAC

Cơ chế hoạt động của các enzym HDAC liên quan đến sự loại bỏ nhóm acetyl từ các histon trong nucleosom Sự giảm acetyl hóa gây ra sự giảm khoảng trống giữa nucleosom và ADN quấn quanh nó ADN quấn chặt hơn làm các nhân tố phiên mã khó tiếp cận hơn, dẫn đến ức chế quá trình phiên

mã Vùng xúc tác của HDAC được tạo thành bởi gần 390 aminoacid được bảo tồn Vị trí hoạt động này có một túi hình ống hơi cong với phần đáy rộng hơn

Sự di chuyển của một nhóm acetyl xảy ra thông qua một hệ thống rơ-le điện (a charge-relay system) bao gồm hai đuôi histidin, hai đuôi aspartic (cách những histidin khoảng gần 30 aminoacid), và một đuôi tyrosin (ở cùng phía

và cách những đuôi aspartic khoảng 123 aminoacid) ở gần kề nhau Ion Zn2+

là cần thiết cho hoạt động của hệ thống này Nguyên tử này được liên kết với

vị trí liên kết với kẽm ở đáy của túi Các chất ức chế HDAC thực hiện chức năng bằng cách chiếm chỗ ion kẽm và do đó làm cho hệ thống rơ-le điện hoạt động bất thường [25] Trichosanthin A với nhóm hydroxamic của nó và dây nối 5 nguyên tử Cacbon tới nhóm phenyl là cấu trúc tối ưu để lắp vừa vào vị trí hoạt động Việc xác định cấu trúc của HDAC là rất cần thiết để xác định cơ chế tác dụng của HDAC, đồng thời dựa vào cấu trúc HDAC để thiết kế công thức cho các chất ức chế HDAC Bằng các kỹ thuật kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X người ta đã xác định được cấu trúc 3D của nhiều HDAC khác nhau (Hình 1.2), đồng thời nghiên cứu được các trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl hóa của các enzym này, qua đó ứng dụng trong nghiên cứu liên kết giữa HDAC và một số chất ức chế Các kết quả này được sử dụng trong thiết

kế cấu trúc của nhiều dãy dẫn chất ức chế HDAC mới

Hình 1.2 Cấu trúc 3D của một HDAC gắn với một chất ức chế HDAC (A)

Chi tiết các đặc điểm cấu tạo tại trung tâm liên kết (B) và mô hình tối

giản trung tâm liên kết (C)

1.1.4 Mối quan hệ giữa HDAC và ung thư

Mặc dù đã có sự ứng dụng rộng rãi các chất ức chế HDAC trong nuôi cấy tế bào, các mô hình động vật, hay các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn đầu, tuy nhiên chúng ta vẫn còn biết một cách mơ hồ về các mục tiêu của chúng trong các mô ung thư Điều này là do hiểu biết của chúng ta về các chức năng của các HDAC trong một mô hình khối u nhất định còn chưa được đầy đủ HDAC có thể liên quan tới việc trung gian điều hòa chức năng của các sản phẩm hoán vị gây ung thư trong một số loại bệnh bạch cầu và u lympho nhất định Mối liên quan giữa hoạt động của HDAC và sự hình thành khối u được thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp tính (APL) RARα, receptor của acid retonic (RA), là một chất điều hòa phiên mã quan trọng trong sự biệt hóa của tế bào tủy RARα và RXR (chất đồng trùng hợp ngoại lai của RARα) liên kết với các yếu tố đáp ứng RA (RAREs) và trong điều kiện vắng mặt yếu tố dạng lưới, có thể ức chế sự phiên mã bằng cách thu nạp SIN3/HDAC thông qua N-CoR và SMRT [19] Một ví dụ khác,

các protein liên hợp AML1-ETO và TEL-AML1 xuất hiện trong bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính (AML) và ung thư nguyên bào lympho cấp tính (ALL) Các protein này có thể làm cho yếu tố phiên mã AML1, từ chỗ là một chất hoạt hóa trở thành một chất ức chế, bằng cách thu nạp HDAC thông qua ETO và TEL [31]

Tuy nhiên, những thay đổi trong biểu hiện gen được mô tả ở trên không cho thấy một cách rõ ràng sự thay đổi các loại HDAC cụ thể Do đó chưa thể

có dữ liệu kết luận chung của sự thay đổi các HDAC biểu hiện trong các loại ung thư ở người Gần đây một số nghiên cứu về sự thay đổi của một số loại HDAC trong các mô hình khối u đã được công bố Ví dụ, có một sự gia tăng của HDAC1 biểu hiện trong bệnh ung thư dạ dày, ung thư tuyến tiền liệt [13], ung thư đại tràng [32], ung thư vú [33] hay ung thư da Một ví dụ khác, sự gia tăng quá mức của HDAC2 được tìm thấy trong ung thư cổ tử cung [15] và ung thư dạ dày [27] Một số nghiên cứu khác cũng đã có báo cáo về sự gia tăng không kiểm soát của HDAC3 và HDAC6 trong các mẫu xét nghiệm ở ung thư đại tràng và ung thư vú [36]

Hình 1.3: Tác động của các HDAC với tế bào ung thư

Những nghiên cứu được nhắc tới ở trên cho thấy rằng sự ức chế phiên

mã do HDAC là một cơ chế phân tử phổ biến của nhiều loại ung thư trong cả giai đoạn khởi phát và tiến triển Trong các ví dụ này, sự ức chế phiên mã dường như được điều hòa bởi sự thu nạp HDAC và cung cấp một cơ sở hợp lý cho phương pháp điều trị bệnh bạch cầu với các chất ức chế HDAC Sự mất cân bằng trong quá trình acetyl hóa histone có thể dẫn tới những thay đổi trong cấu trúc của NST và sự rối loạn điều hòa phiên mã các gen tham gia vào điều khiển chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bào

1.2 Các chất ức chế HDAC

1.2.1 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Khi HDAC bị ức chế bởi các chất ức chế HDAC (butyrat, TSA, depsipeptid, oxamflatin, MS-275 và SAHA), những histon sẽ bị acetyl hóa, ADN đang quấn quanh histon đó sẽ giãn ra Một vị trí đặc biệt trong vùng hoạt hóa của một nhóm nhỏ gen (ví dụ các vị trí SP1) được cho là gắn phức hợp yếu tố phiên mã (TFC) với HDAC và sự tích tụ những histon bị acetyl hóa trong nucleosom dẫn đến sự phiên mã của nhóm nhỏ gen này tăng lên (ví

dụ, CDKN1A (còn gọi là p21), gen này mã hóa chất ức chế phụ thuộc cyclin (CDK) là WAF1), và dẫn đến tác dụng hiệp đồng là gây ra sự ngừng phát triển, sự biệt hóa và/hoặc sự chết tế bào theo chương trình, kết quả là ức chế

sự phát triển khối u [18]

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC tác động lên tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ yếu [15]:

* Sự biệt hóa gây ra bởi các chất ức chế HDAC: Các chất ức chế

HDAC tác động lên các tế bào ung thư gây ra sự ngừng tế bào ở pha G1, kết

quả là gây ra sự biệt hóa tế bào ung thư

* Các chất ức chế HDAC gián tiếp gây ra sự chết tế bào theo chương

trình: Các chất ức chế HDAC tác động lên những tế bào bình thường và tế bào ung thư với cùng mức độ gây ra G2 checkpoint (vị trí mà tại đó chu trình

tế bào tạm thời dừng lại, chờ đến khi các điều kiện trở nên phù hợp thì chu trình lại tiếp tục) Những tế bào bình thường trải qua G2 checkpoint và tiếp tục phát triển, trong khi đó những tế bào ung thư tái tạo ADN tạo thành dạng 4nADN và chuyển sang giai đoạn gây chết tế bào theo chương trình

* Các chất ức chế HDAC còn có những tác dụng gián tiếp đến sự phát triển khối u Bằng cách làm tăng các phản ứng miễn dịch chủ thể và ức chế sự tạo mạch của khối u để có thể ngăn cản rõ rệt sự phát triển khối u ban đầu và

sự di căn

1.2.1.1 Các chất HDACi gây ra sự biệt hóa

Khi là 1 tác nhân riêng lẻ, các HDACi có thể khiến cho nhiều loại tế bào ung thư bạch cầu và u rắn khác nhau phải thể hiện đặc tính biệt hóa và ngừng tăng sinh Sự ức chế chu trình tế bào là cần thiết cho sự biệt hóa của tế bào, và tác dụng kìm tế bào của HDACi là rất quan trọng cho hoạt động chống ung thư của chúng Phân tích các số liệu về chu trình tế bào của các tế bào ung thư đã được điều trị với HDACi cho thấy các tế bào thường dừng ở

pha G1, nhưng đôi khi tích tụ đến pha G2 của chu trình

Sự biệt hóa của tế bào tủy phụ thuộc vào sự hoạt hóa phiên mã của RARα và protein gây ung thư PLZF-RARα làm ngắt quãng chương trình biệt hóa bình thường HDACi có thể kết hợp với RA để tạo ra sự biệt hóa tế bào

APL kháng hóa trị liệu PLZF-RARα cả in vivo và in vitro [19].Trường hợp

tương tự cũng có thể xảy ra ở AML, trong đó chức năng ức chế của các protein AML1-ETO và TEL-AML1 bị kìm hãm bởi các HDACi, và sự nhạy cảm của tế bào ác tính với RA vẫn được bảo toàn Trong hai trường hợp này, mục tiêu phân tử của HDACi đã được xác định rõ, và chu trình dẫn đến sự biệt hoá cũng đã được nghiên cứu tỉ mỉ Tuy nhiên HDACi có thể gây ra sự biệt hóa ở rất nhiều loại tế bào khác, và các hiện tượng phân tử có liên quan tới sự biệt hóa của các loại tế bào khác đó vẫn chưa được sáng tỏ [7]

1.2.1.2 Các chất HDACi điều hòa sự gây chết tế bào theo chương trình

Quá trình điều trị các tế bào ung thư với HDACi có thể dẫn đến sự gây chết tế bào theo chương trình Sự gây chết tế bào theo chương trình là một chương trình gây chết tế bào sinh lý với mục đích là kiểm soát số lượng tế bào bình thường trong quá trình phát triển hoặc trong các loại bệnh Người ta đã xác định hai con đường chết nội bào với chức năng riêng biệt nhưng có mối liên hệ phân tử với nhau Cả hai con đường này đều đòi hỏi sự có mặt của Caspases- một họ cystein protease Con đường thứ nhất được hoạt hóa bởi các yếu tố nội là “death-receptor” như CD95, TNF, TRAIL Các yếu tố này sau khi liên kết với phối tử của chúng sẽ hoạt hóa các capase cạnh màng tế bào như caspase-8 và -10 Các caspase này sau đó sẽ tiếp tục hoạt hóa các capases kích thích như caspase-3 và -7 Con đường thứ hai lại cần thiết phải có sự

rách màng ty thể nhằm điều hòa sự giải phóng của cytochrome c và các

protein hỗ trợ sự chết tế bào theo chu trình (như SMAC, AIF) và sự hoạt hóa của capaes-9 thông qua yếu tố APAF1 Sự toàn vẹn của màng tế bào ty thể được quyết định bởi các protein trong họ protein BCL2 (bao gồm các protein pro-apoptic (BAX, BAK) và các protein anti-apoptic (BCL2, BCL-XL) HDACi đã được ghi nhận là hoạt hóa cả chu trình gây chết receptor và chết tế bào nội sinh [22] Ví dụ apicidin và CBHA có thể kích thích sự biểu hiện của CD95 và phối tử CD95 (CD95L), và sự ức chế sự phát tín hiệu của CD95 sẽ kháng lại sự gây chết tế bào do apidicin gây ra Tuy nhiên, việc điều trị với

butyrat sẽ làm cho các tế bào nhạy cảm với sự gây chết tế bào được điều hòa bởi CD95 mà không cần sự mã hóa của phối tử hay receptor Sự biểu hiện quá mức của BCL2 có thể ngăn chặn chu trình chết tế bào nội sinh nhưng không ảnh hưởng tới con đường gây chết receptor, ức chế gây chết tế bào theo chu trình do HDACi, chỉ ra tầm quan trọng của chu trình nội sinh đối với chức năng của các HDACi Các dữ liệu này được củng cố bởi các phát hiện rằng sự gây chết tế bào theo chu trình do HDACi trùng hợp với sự tăng cường điều chỉnh các protein BCL2 pro-apoptic và sự giảm điều chỉnh các BCL2 anti-

apoptic [18]

1.2.1.3 Các tác dụng khác lên ung thư của các chất HDACi

Ngoài việc trực tiếp tác động lên sự tồn tại và phát triển của khối u, HDACi còn có thể có các hoạt động khác gián tiếp ảnh hưởng lên sự phát triển của khối u HDACi có thể hoạt hóa phiên mã các protein MHC (major histo-compatibility complex) nhóm I và II, các phân tử đồng kích thích CD40, CD80, và CD86, phân tử kết dính gian bào ICAM1 và interferon loại I và II, nhằm làm tăng mạnh sự nhận biết và hoạt hóa các tế bào miễn dịch Thêm vào

đó, sự tồn tại và phát triển của các khối u rắn phát triển rộng và nhanh cần cung cấp oxy và chất dinh dưỡng một cách liên tục để duy trì hệ mạch của khối u TSA có thể ức chế sự gây giảm oxy huyết của yếu tố gây phát triển

màng trong mao mạch (VEGF) và triệt tiêu sự hình thành mạch cả in vivo và

in vitro Do đó, sự kích thích đáp ứng miễn dịch chính và sự ức chế hình thành mạch khối u có thể ngăn chặn sự phát triển của các khối u lớn và ngăn cản sự di căn [11]

1.2.2 Phân loại chất ức chế HDAC:

Các chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng để sử dụng

trong điều trị ung thư có thể được chia làm 4 nhóm dựa trên cấu trúc [18]:

Các acid hydroxamic: SAHA, pyroxamid, TSA, oxamflatin và các CHAP

Các acid béo chuỗi ngắn: 4-phenylbutyrat, acid valproic

Các tetrapeptid vòng: trapoxin, apicidin và depsipeptid (cũng được gọi là FK-228 hay FR901228)

Các benzamid: MS-275, CI-994

1.2.2.1 Các hydroxamat

Trichostatin A (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên được phát hiện có tác dụng ức chế HDAC TSA là một sản phẩm lên men của

Streptomyces Ban đầu, TSA được sử dụng làm chất chống nấm, nhưng sau

đó người ta đã phát hiện ra khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh các tế bào ung

thư của nó TSA có tác dụng in vitro ngay ở mức nồng độ nanomol Do việc

sản xuất TSA rất tốn kém và hiệu suất thấp (20 giai đoạn, với hiệu suất chỉ là 2%) nên việc tìm kiếm một HDACi thay thế nó đang được tiến hành và rất quan trọng Ngày nay, TSA được dùng chủ yếu làm chất đối chiếu trong việc tìm kiếm các các HDACi mới Rất nhiều hợp chất tương tự TSA thuộc nhóm hydroxamat đã được tìm ra, nhưng trong đó chỉ có oxamflatin là có tác dụng

in vitro tương tự TSA [22]

Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) có cấu trúc tương tự TSA và

là chất ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol Cả SAHA và TSA đều không ức chế HDAC nhóm III M-carboxycinnamic acid bishydroxamid (CBHA) là một chất ức chế HDAC mạnh khác, nó là cơ sở cấu trúc của nhiều dẫn chất khác bao gồm LAQ824 và 1 dẫn chất sulfonamid PXD-101, cả hai chất này đều ức chế HDAC nhóm I và II ở nồng độ nanomol

Các HDACi có chứa nhóm hydroxamat đã được xác nhận là chúng tương tác với vị trí xúc tác của HDAC, do đó chúng ngăn không cho cơ chất tiếp xúc với ion Zn2+ tại vị trí của nó Nhược điểm của các hydroxamat là bị chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC [30]

1.2.2.2 Các acid béo mạch ngắn

Nhóm các acid béo mạch ngắn như phenylbutyrat và các dẫn chất và acid valproic có tác dụng ức chế HDAC tương đối yếu, có tác dụng ở khoảng nồng độ micromol và ảnh hưởng đến sự biểu hiện của nhiều gen với các chức năng tế bào khác nhau Những tác nhân này đã được đánh giá trong lâm sàng, nhưng có chu kỳ bán hủy ngắn trong huyết tương và cần phải có nồng độ tương đối cao (cỡ milimol) cho các hoạt động của chúng Gần đây, một hợp chất có cấu trúc ghép giữa phenyl butyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận

là có tác dụng ức chế ở nồng độ micromol thấp Cả valproic acid và phenylbutyrat đều đã được sử dụng làm thuốc trên thị trường từ lâu, không phải với tác dụng chống ung thư Cho đến gần đây chúng mới được phát hiện

là có khả năng ức chế HDAC [32]

1.2.2.3 Các peptid vòng

Nhóm các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất trong số các HDACi, bao gồm: depsipeptid tự nhiên (FK228), apicidin và các phần tử khác thuộc nhóm các CHAP (các dẫn xuất của acid tetrapeptid hydroxamic vòng) Trong khi hầu hết các hợp chất này là sản phẩm của vi khuẩn hoặc nấm, thì apicidin và depsipeptide là sản phẩm kết hợp giữa acid hydroxamic và peptid vòng Tất cả các chất này đều có tác dụng ức chế HDAC mạnh ở mức nồng

độ nanomol [22]

Apicidin là chất được chiết xuất từ các thử nghiệm với ký sinh trùng, chất này gây ra sự acetyl hóa quá mức histon trong ký sinh trùng sốt rét

Plasmodium falciparum và ức chế histon deacetylase của nhiều loại ký sinh

trùng như Eimeria tenella (IC50 = 0,7 nM) đồng thời cũng có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư bạch cầu Trong khi đó, các chất dẫn xuất như 9-hydroxy- hoặc 9-acyloxyapicidin đã được cấp bằng sáng chế nhưng chưa có báo cáo về hoạt tính sinh học nào

Depsipeptid là một tiền chất của 1 tác nhân hoạt động: red FK Depsipeptid (FR901228) có hoạt tính chống ung thư có hiệu quả với các loại

ung thư phổi và ung thư tuyến vú, những kiểu ghép dị chủng u melanin, ngoài

ra có tác dụng với ung thư bạch cầu cùng loại ở chuột và u melanin Depsipeptide được đưa vào các thử nghiệm lâm sàng vì hoạt tính chống ung thư của nó có khởi đầu ấn tượng khi nó được phát hiện là một tác nhân ức chế HDAC ở mức nMol Kết quả đầu tiên cho thấy tác dụng điều trị trong bệnh giảm tiểu cầu đột ngột có hồi phục như một tác dụng phụ ở mức liều tới hạn Các tetrapeptid vòng có chứa các nhóm chức năng trifluoroethyl và pentafluoroethyl ceton, liên kết với kẽm đã được tổng hợp và là những chất

ức chế HDAC mạnh [12]

1.2.2.4 Các benzamid

Nhóm HDACi thứ tư bao gồm tập hợp các tác nhân trong cấu trúc có chứa nhóm chức benzamid Nhóm này ức chế các HDAC bằng cách xâm nhập vào vị trí xúc tác và liên kết với ion kẽm hoạt động Các chất thuộc nhóm này gồm: MS-275 (có khả năng ức chế HDAC ở mức nồng độ micromol) và CI-994 (N-acetyldinalin) có tác dụng ức chế HDAC theo cơ chế chưa được xác định

Một nhóm các benzamid được phát hiện có hoạt tính ức chế HDAC ở mức micromol thấp Một chức 2’- hydroxy hoặc amino được chỉ ra là cần thiết cho hoạt tính của chúng và giá trị IC50 của những chất này là từ 2 đến 10

µM Hợp chất 2’-amino MS-275 (thường được gọi là MS-27-275 trong những báo cáo đầu tiên) là tác nhân ức chế HDAC đầu tiên được chứng minh có hoạt tính chống ung thư ở miệng trong các loại động vật Thêm vào đó, người ta chưa nhận thấy tác dụng bất lợi nào của chất này

Bảng 1.1 Một số chất ức chế HDAC đang được thử lâm sàng

Acid carboxylic Phenyl butyrat I AML/MDS

acid valproic I, II AML, MDS, u trung biểu mô

hydroxamic LAQ824 I ung thư máu

LBH589 II, III ung thư máu CRA 024781 I u lympho Hodgkin

Các benzamid MS275 I, II

u lympho, AML, u hắc sắc tố

ác tính di căn tiến triển

MGCD0103 II ung thư bạch cầu, MDS peptid vòng Depsipeptid I, II AML, CTCL, u đa tuỷ xương

N NH H

HN

O NHOH O

O

O

O

DÉn chÊt cña tetrapeptid vßng (CHAP)

H

N

NHOH O

O

Pyroxamid

H N

NHOH O

NHOH O

O

H S O

O

H

NHOH O

Nghiên cứu về tính chọn lọc của các chất ức chế enzym histon deacetylase (HDACi) đối với từng loại HDAC là bước rất quan trọng giúp lựa chọn chính xác các phác đồ điều trị bằng liệu pháp dùng HDACi (cả đơn trị liệu và kết hợp) trong mỗi loại bệnh cụ thể có liên quan đến HDAC Vì vậy đi đôi với các công trình nghiên cứu ra thuốc mới, thì việc nghiên cứu về đích tác dụng của thuốc trong mỗi loại ung thư cụ thể cũng rất được chú trọng Ở đây chúng tôi tổng kết một số nghiên cứu về một số loại thuốc ức chế HDAC đang được dùng phổ biến hiện nay (bảng 1.2)

1.2.4 Liên quan c ấu trúc-tác dụng của các chất ức chế HDAC

Phần mang dược tính của các chất ức chế HDAC thông thường bao gồm [8,9,16, 17]:

- Nhóm gắn với kẽm (ZBG): tương tác với Zn2+ ở vị trí hoạt động của các enzym HDAC: acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton Với các chất ức chế HDAC có nhóm hydroxamic, in Zn2+ tạo 2 liên kết phối trí với 2 nguyên tử oxy của nhóm hydroxamic

- Vùng cầu nối sơ nước: là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hay vòng, có thể no hoặc không no, nằm trong lòng mạch enzyme

- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt: thường là vòng thơm hoặc peptid vòng, sẽ tạo tương tác với 1 vành nhỏ trên

miệng túi trong cấu tạo của kênh enzyme HDAC được tạo nên từ vài vòng xoắn protein

Hình 1.6 Phần mang dược tính của các chất ức chế HDAC

Khi phân tích cấu trúc tia X của một đồng đẳng của HDAC, protein giống HDAC (HDLP), kết hợp được với SAHA hay TSA, và gần đây khi nghiên cứu HDAC8 ở người, người ta đã xác định được ZBG tương tác với một ion Zn2+ của vị trí hoạt động có dạng túi (Zn2+ ở đáy của túi) [9] Dây nối

sơ nước đưa ZBG đến vị trí hoạt động một cách có hiệu quả bằng cách lấp kín túi Trong khi đó, nhóm khóa hoạt động ở phía bên kia của dây nối liên kết với những đuôi amino acid ở mép túi Cấu trúc ZBG thông thường của những chất ức chế HDAC là một nửa hydroxamat Sự thay đổi cấu trúc của ZBG hydroxamat đạt được một số thành công; sinh ra những đẳng vị như benzamid, những α-ketoester, những keton ái điện tử, mercaptoamid và những phosphonat [9]

Trong một chất ức chế HDAC nguyên mẫu, nhóm khóa hoạt động có thể được nối với dây nối sơ nước thông qua những nhóm cho hay những nhóm nhận liên kết hydro khác như những nhóm keto- và amid- Sự thiếu hụt những nhóm cho hay những nhóm nhận liên kết hydro trong một nửa dây nối đưa đến một cơ hội liên kết với những nhóm khác mà dễ tổng hợp hơn và có dược động học thuận lợi hơn từ đó có thể giúp đơn giản hóa việc thiết kế và tổng hợp những chất ức chế HDAC mới Trong khi cả TSA và SAHA có cầu nối chứa các nhóm carbonyl (tương ứng với keto và amid), các nghiên cứu đã cho thấy các chất ức chế HDAC tiềm năng có thể có đơn vị cầu nối là sulfoxid hoặc đơn thuần là một nhóm thioete loại 1 Các hợp chất có chứa các

nhóm này thể hiện tác dụng ức chế trung bình trong các thử nghiệm với enzym Từ đó ta có thể thấy rằng nguyên tử oxy xen giữa vòng thơm và dây nối alkyl là một yếu tố có thể phát triển và tạo ra nhiều chất ức chế HDAC tiềm năng hơn so với các dẫn xuất thioete

Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl- acid hydroxamic

đã được biết đến nhiều, ví dụ như SAHA Cấu trúc của chúng bao giờ cũng bao gồm 3 phần chính A-B-C [29]

- phần A liên quan đến hiệu lực và tính đặc hiệu ( thường là aryl)

- Phần B là cầu nối như amid-alkyl

- Phần C là nhóm gắn kết với Zn: acid hydroxamic

Cho đến nay phần lớn các nghiên cứu liên quan cấu trúc –tác dụng đều tập trung tìm hiểu vai trò của nhóm gắn kết Zn, cố gắng ngiên cứu thay thế acid hydroxamic và một vài cầu nối Sau đây là tổng kết liên quan cấu trúc-tác dụng của một dãy các dẫn chất của acid hydroxamic đã được nghiên cứu [29]

Nh©n th¬m tèt h¬n NÕu

cã cÇu nèi víi amid, cÇu nèi kh«ng no tèt h¬n

N

hãm

amid

Các nghiên cứu thiết kế công thức cho các HDACi mới đều dựa trên việc thay đổi cấu trúc của 3 phần: cầu nối, nhóm gắn kẽm, nhóm nhận diện bề mặt.

1.2.4.1 Thay đổi nhóm tạo chelat với kẽm

Khả năng tạo phức với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của HDAC quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của các HDACi Hiện nay, 1 số nhóm có thể có liên kết với Zn2+ bao gồm hydroxamic acid, sulfanamid, nhóm chức aminoanilin, thiol, acid carboxylic… Nhóm acid hydroxamic tạo chelat bền vũng với Zn2+ nhất và vẫn là một nhóm chức quan trọng trong nghiên cứu HDACi Hầu hết các dẫn chất acid hydroxamic đều ức chế HDAC ở nồng độ

nM Mặt khác, việc thay đổi nhóm A cũng làm thay đổi tính chọn lọc của HDACi: các hợp chất benzamid (BZG là o-aminoanilin) chủ yếu ức chế chọn lọc HDAC nhóm I, còn sulfamid lại chủ yếu ức chế HDAC6 [21]

1.2.4.2 Thay đổi phần cầu nối

TSA và SAHA là 2 điển hình cho phần cầu nối có 5-6 carbon, chúng thể hiện tác dụng ức chế HDAC mạnh Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng khoảng cách tốt nhất giữa nhóm hydroxamic aicd và phần (C) là 5, 6, 7 nguyên tử carbon, với khả năng ức chế theo thứ tự số nguyên tử carbon là 6>5~7>>4, 3 Trong phần cầu nối, liên kết amid có vai trò khá quan trọng Phần cầu nối chứa vòng thơm, có thể ảnh hưởng đến tác dụng ức chế chọn lọc HDAC, cũng như đến hiệu lực của HDACi Nếu cầu nối là mạch carbon béo

mà thiếu nhóm nhận diện bề mặt như các acid béo mạch ngắn thì hầu như khó tương tác với túi enzym của HDAC nhóm IIb Việc đảo chiều liên kết amid cũng làm thay đổi tác dụng HDACi

1.2.4.3 Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt:

Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt nhằm khai thác sự khác biệt ở phần miệng kênh enzym giữa các HDAC, từ đó có thể thiết kế công thức làm tăng hoạt tính hoặc tăng khả năng ức chế chọn lọc Nhóm nhận diện bề mặt chủ

yếu là các vòng, có thể là vòng thơm hoặc peptid vòng Các nghiên cứu cho thấy nhóm nhận diện bề mặt là vòng thơm thì tác dụng tốt hơn vòng no Mặt khác vòng lớn thường tốt hơn vòng nhỏ Ví dụ khi thay thế nhóm phenyl của SAHA bằng vòng indol thì IC50 của dẫn chất indol nhỏ hơn SAHA nhiều lần Việc thay đổi phần (C) còn ảnh hưởng đến khả năng ức chế chọn lọc của các HDACi, nhóm nhận diện bề mặt nhỏ thường tạo ra các HDACi không chọn lọc, còn các vòng lớn như peptid vòng thì làm tăng khả năng ức chế chọn lọc: SAHA và các acid hydroxamic có phần (C) nhỏ ức chế không chọn lọc HDAC I và II, trong khi CHAP (các hydroxamic tổng hợp chứa peptid vòng) chỉ ức chế chọn lọc một số HDAC nhóm I Điều này có thể do HDAC nhóm II có phần vành trên bề mặt miệng túi enzym được tạo thành từ 2 vòng xoắn có thể ngăn cản liên kết với phần peptid vòng của HDACi Cấu trúc càng cồng kềnh thì càng khó tương thích với các HDAC khác nhau mặc dù chúng vẫn thể hiện tác dụng ức mạnh HDAC Tuy nhiên nhóm nhận diện bề mặt quá lớn cũng làm giảm tác dụng do làm cho HDAC khó thâm nhập vào vị trí xúc tác của HDAC Nếu là vòng thơm nhỏ, muốn thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc thì phải tăng số lượng vòng thơm trong nhóm nhận diện bề mặt, tạo liên kết amid giữa các vòng thơm với nhau sẽ tăng tác dụng ức chế chọn lọc Khi vòng thơm có thêm nhóm halogen cũng có thể làm tăng hoạt tính [21, 28]

Khi phân tích cấu tạo trung tấm hoat động của dạng túi của HDAC, nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm Sigma-Tau (Ý) đặc biệt chú trọng phần miệng túi với các vòng aminoacid có thể tham gia tương tác quan trọng với các nhóm nhận diện bề mặt hoặc các nhóm lân cận Phần nhận diện bề mặt tại trung tâm hoạt động của HDAC chấp nhận một hệ vòng khá đa dạng, từ indol, bemzofuran, quinolin, benzodioxol…Nhóm Nitơ trong cấu trúc của phần nhân thơm R có thể tạo liên kết Hydro với các nhóm aminoacid trong cấu trúc túi, tăng tuơng tác với mép túi tại trung tâm hoạt động của enzyme HDAC, do

đó tăng hoạt tính của các chất ức chế HDAC Vì vậy, các nghiên cứu khảo sát dẫn chất ức chế HDAC bằng cách thay đổi nhóm khoá hoạt tính (thay thế vị trí phenyl bằng các nhân thơm như benzothiazol, phenylthiazol, isoxazol ) trong SAHA có tính khả quan cao

R1CNHRCl

- Phương pháp 2: tác nhân acyl hóa là anhydrid acid, , xúc tác pyridine hoặc triethylamin TEA, dung môi dicloromethan hoặc dimethylformamid DMF

R1

R1CNHRO

CO

Để hạn chế phản ứng phụ, thường chọn dung môi có hằng số điện môi thấp như chloroform, dicloromethan…Các carbodiimid hay dùng là N,N-

dicyclohexylcarbodiimid (DDC), N,N-diisopropylcarbodiimid (DIC),

DIC

N C N

RCOOMe + NH2OH NaOH

Tùy trường hợp cụ thể, đối với các chất khác nhau, điều kiện tiến hành phản ứng (dung môi, nhiệt độ, thời gian) cũng có sự thay đổi

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.2 Dung môi và các hóa chất khác

2.2 Thiết bị, dụng cụ

- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)

- TLC tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh

- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap MS của viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR, 13C-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-500, dùng DMSO làm dung môi Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) [3]

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

 Nghiên cứu tổng hợp 5 chất trong mục tiêu bằng phương pháp hóa học

- Phản ứng amid hoá dùng dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hoặc ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (CDI)

- Một số phản ứng khác

Các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol (với mạch chứa nhóm acid hydroxamic găn vào vị trí số 2) dự kiến được tồng hợp như sau:

HNO

OOH

S

thiosemicarbazid ethanol, acetic

Trong đó Ar = Phenyl Ar = 4-Cl-Phenyl

Ar = 2-Cl-Phenyl Ar = 4-methoxy-Phenyl

Ar = 3-Cl-Ph

 Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng

 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy

2.4.2 Xác định cấu trúc: Sử dụng các phương pháp phổ bao gồm:

- Phổ hồng ngoại (IR)

- Phổ khối (MS)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR và 13C NMR)

2.4.3.Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase:

Tác dụng ức chế hoạt tính HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3 trong rVSMCs Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3 khi so sánh với mẫu trắng Chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây [10,34]

2.4.4 Thử độc tính tế bào in vitro:

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được

thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Chungbuk, Chonju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm GraphPad Prism

Dòng tế bào thử nghiệm:

• SW620: tế bào ung thư đại tràng

• MCF-7: tế bào ung thư vú

• AsPC-1: tế bào ung thư tụy

• PC-3: tế bào ung thư tiền liệt tuyến

• NCI-H460: tế bào ung thư phổi

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50%

so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm dung môi pha chất thử): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa trên phần mềm

GraphPad Prism Trong phương pháp thử này, IC50 ≤ 20 µg/ml được coi là có hoạt tính

2.4.5 Nghiên cứu docking của các chất:

Việc nghiên cứu sơ bộ tính tương tác của 1 số chất với HDAC (docking) được thực hiện tại phòng nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc Để tìm hiểu sơ bộ tương tác liên kết của các chất với HDAC, chúng tôi đánh giá tương tác với HDAC8 cho các chất tổng hợp được Chúng tôi sử sụng mạng lưới cấu trúc HDAC8 tương tác với SAHA đã

có sẵn Sử dụng HDAC8 do cấu trúc này có sự tương đồng lớn với HDAC4 với điểm DALI Z (Z-score, điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và r.m.s.d (root-mean-square-deviation, độ lệch) =2,1 Å, thứ tự acid amin giống đến 46% và

là HDAC của động vật có vú đầu tiên được nghiên cứu kỹ nhất Chúng tôi thực hiện kiểm soát thử nghiệm lắp ghép của các chất vào HDAC8 bằng phương trình Auto Dock Vina Tiếp theo, dự đoán năng lượng của sự tương tác liên kết của các chất tổng hợp được với HDAC8 từ lắp ráp trên

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ

NH2

R

S

N N

Tác nhân và điều kiện: i) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, hồi

lưu, 4h; ii) FeCl 3 12H 2 O, ethanol, 100 0 C, 1/4h; iii) acid monomethyl suberic, CDI, DMF, hồi lưu, 24h; iv) hydroxylamine.HCl, NaOH, DMF, methanol,

0 0 C, 1-2h

3.1.1 Tổng hợp ”N 1 -hydroxy-N 8 yl)octandiamid” (5a)

-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-Quy trình tổng hợp chất 5a tiến hành qua 4 giai đoạn tương tự trong sơ

đồ phương pháp chung Quy trình tổng hợp như sau:

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất 5a

Tác nhân và điều kiện i) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, hồi

lưu, 4h; ii) FeCl 3 12H 2 O, ethanol, 100 0 C, 1/4h; iii) acid monomethyl suberic, CDI, DMF, hồi lưu, 24h; iv) hydroxylamine.HCl, NaOH, DMF, methanol,

0 0 C, 1-2h

a Tổng hợp chất 2a

Để tổng hợp chất 5a cần tổng hợp 2-phenylidenhydrazincarbothioamid

(2a) Tổng hợp chất 2a từ benzaldehyd (1a) được chúng tôi thực hiện bằng

phản ứng ngưng tụ với xúc tác là acid hữu cơ, tiến hành phản ứng như sau:

(trong khoảng 48h)

 Kết quả:

• Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng có ánh vàng