phân lập và định danh vi khuẩn acetic từ giấm nuôi

TRƯỜNG KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC - CÔNG NGHỆ SINH HỌC1 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN ACETIC TỪ GIẤM NUÔI.. - Có khả năng sinh acid acetic tan CaCO3- Sinh trưởng hiếu khí bắt buộc

TRƯỜNG KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC - CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN

ACETIC TỪ GIẤM NUÔI.

Thực tập chuyên ngành vi sinh

NỘI DUNG CHÍNH

I VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

II KẾT QUẢ

III BIỆN LUẬN KẾT QUẢ

2

- Có khả năng sinh acid acetic (tan CaCO3)

- Sinh trưởng hiếu khí bắt buộc (catalase)

- Gram âm, trực khuẩn, tồn tại độc lập, kết chuỗi…

- Dựa trên vùng trình tự 16S RNA

- So sánh với ngân hàng dữ liệu gen

Mục tiêu: Thu nhận

được các vi khuẩn

Acetic

Mục tiêu: Định danh đến cấp

độ giống (genus) vi khuẩn

Acetic thu nhận được

Phương pháp

4

Tăng sinh chọn lọc

Tăng sinh chọn lọc

Phân lập, làm thuần

Phân lập, làm thuần

Test sinh hóa

Test sinh hóa

PCR

Chạy điện di

Giải trình tự

Gi gi ng ữ giống ống

Gi gi ng ữ giống ống

Định danh

Thu mẫu ->Tăng sinh

• Môi trường GE pH = 3,5 (K Matsushita (2016))

• Thêm 200µL mẫu giấm trong 5ml môi trường pH 3,5.

• Nuôi cho đến khi môi trường xuất hiện đục, có sinh khối trong ống

Phân lập

Dùng cối nghiền sinh khối Vi

khuẩn, dùng que cấy vòng vi

khuẩn trên môi trường GECA =>

ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày

Phân lập

 Chọn khuẩn lạc nào làm tan CaCO3

trong môi trường (môi trường từ đục

trở nên trong suốt).

 cấy ria làm thuần trên môi trường

 Giữ giống trong môi trường GECA

thạch nghiêng Ủ ở nhiệt độ

phòng cho lên sinh khối (Dương

Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng, 2007)

 Cứ khoảng 10 ngày thì ta cấy

chuyền giữ giống lại một lần.

8

Giữ giống

Phương pháp nhuộm Gram ( Tài liệu Thực tập Vi Sinh cơ sở )

Nhuộm thêm lugol

1 phút, rửa nước

Rửa cồn

90 độ, trong 30 giây, rửa nước

Nhuộm Safranin 1 phút, rửa nước, để khô

Thấm nhẹ cho khô mẫu và quan sát

Nhuộm gram

10

 Nhỏ một giọt H2O2 lên lame, sau đó dùng que cấy lấy một ít

sinh khối từ khuẩn lạc thuần hòa vào giọt H2O2.

2H2O2 + catalase → 2H2O + O2

 Hiện tượng:

 Dương tính: sủi bọt khí

 Âm tính: không sủi bọt khí

Thử nghiệm catalase

11

Định danh

12

13000 v/p – 15 phút

400µl

400µl

Chlo:Phe

Lắc cho dung dịch sang màu trắng đục ổn định

40µl Sodium acetat

ở đầu đũa vào dd ầu đũa vào dd

Đi đi n di xem k t ện di xem kết ết

nhiên.

180µl N ước cất c c t ất

2 l n ầu đũa vào dd

Hút 20µl dd mẫu cho vào nước cất 2 lần,

lần lượt pha loãng nồng độ

Nạp mẫu vào giếng agarose 0.8 %

10 -1 , 10 -2

 Sử dụng hai cặp mồi: ( Y Yamada, 2000)

Phản ứng PCR

15

 Mục đích: kiểm tra kích thước sản phẩm PCR

 Quy trình:

Chuẩn bị mẫu điện di: 5µl mẫu PCR + 2µl dung dịch nạp mẫu

‐ Thông số điện di: 90V trong 10 phút

‐ Nạp mẫu theo sơ đồ:

(-) (+) M 1 2 3 4 5 6 7 8

‐ Thu gel và quan sát kết quả dưới tia UV

 Gửi mẫu đến các viện nghiên cứu để giải trình tự So sánh độ tương đồng

của đoạn DNA của vi khuẩn với dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI

Điện di – giải trình tự

16

Kí hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu

NGUỒN MẪU

17

➢ Tăng sinh mẫu giấm trong môi trường pH 3,5

nghiệm

=> Có sự hiện diện của vi khuẩn acetic

KẾT QUẢ PHÂN LẬP

18

KẾT QUẢ PHÂN LẬP

Ống nghiệm tăng sinh vi khuẩn

acetic

• Lấy sinh khối của mẫu giấm, dùng cối nghiền nhỏ

• Dùng que cấy vòng cấy trực tiếp lên đĩa môi trường GECA

Mẫu C4B4 sau 2 ngày nuôi

KẾT QUẢ PHÂN LẬP

Mẫu C4B5 sau 2 ngày nuôi

KẾT QUẢ PHÂN LẬP

• Dùng que cấy vòng lấy sinh khối của các khuẩn lạc nghi ngờ ở đĩa

phân lập, cấy lên đĩa môi trường GECA

• Sau 4 ngày quan sát và mô tả hình thái của khuẩn lạc

Kết quả: Thu được các chủng

Các mẫu C4B4.3, C4B4.5, C4B4.6 Bị nhiễm, có khuẩn lạc

C4B5.1, C4B5.2, C4B5.4, C4B5.5 giống các mẫu còn lại

KẾT QUẢ LÀM THUẦN

C4B4.1:

Khuẩn lạc khoảng 1mm, tâm cam,

có vòng tan CaCO3, bìa nguyên màu trắng đục

KẾT QUẢ LÀM THUẦN

24

Khuẩn lạc nhỏ hơn 1mm, tâm cam , có vòng tan, bìa nguyên, trắng đục

KẾT QUẢ LÀM THUẦN

25

Khuẩn lạc khoảng 1mm, tâm cam, có vòng tan, bìa nguyên màu trắng đục

KẾT QUẢ LÀM THUẦN

27

Khuẩn lạc to, ánh tím có vòng tan

KẾT QUẢ LÀM THUẦN

29

Sau khi thực hiện giữ giống chủng trong ống thạch nghiêng môi

trường GEA

KẾT QUẢ TEST CATALASE

31

KẾT QUẢ NHUỘM GRAM

32

KẾT QUẢ NHUỘM GRAM

35

KẾT QUẢ NHUỘM GRAM

36

Khuẩn lạc đống cục, tròn, gram âm

=> Có khả năng đây không phải chủng

acetic.

KẾT QUẢ NHUỘM GRAM

Kết quả điện

di trên gel AGAROSE 0.8%

ĐLM24a ĐLM26a

0 -1 -2 0 -1 -2

ĐỊNH DANH BẰNG PP SINH HỌC PHÂN TỬ

39

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ

➢Mở file LG1TN01-27F.ab1 vào phần mềm BioEdit

➢Chỉ lấy các nucleotide từ vị trí 40 – 670

➢Copy các nucleotide từ vị trí 40 - 670 qua Text Document

➢So sánh đoạn gen có kích thước khoảng 630 bp của vùng 16S rDNA với trang web NCBI (Mỹ) để tìm vùng trình tự tương đồng

KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ

KẾT QUẢ GIÃI TRÌNH TỰ

KẾT QUẢ DÒ TÌM NCBI

• Khuẩn lạc có vòng tan CaCO3 → Vi khuẩn có khả năng sinh acid

• Nhuộm gram bắt màu hồng → gram âm

• Test catalase dương tính → có ezyme catalase (hiếu khí)

• Sinh trưởng phát triển trong môi trường pH 3.5

• Quan sát hình dạng → hình que

=> Đã phân lập và thu nhận được 6 mẫu nghi ngờ là vi khuẩn sinh acid

acetic từ giấm ăn, thuộc họ Acetobacteraceae

KẾT LUẬN

1 Lương Đức Phẩm Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, 1998 Giáo trình Vi

sinh vật học đại cương Trường ĐH Công nghiệp Tp.HCM 2008

2 Food Microbiology Martin R Adams and Maurice O Moss; University of Surrey, Guildford, UK Vi

sinh thực phẩm Trường DDH Công Nghiệp Tp.HCM Tháng 4 năm 2004

3 Trần Linh Thước, 2005 Phân lập Acetobacter có khả năng sinh acid acetic hiệu suất cao từ giấm

nuôi Đề tài nghiên cứu cấp trường, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên.

4 Nguyễn Hữu Hiệp, 2012 Khảo sát vùng gen 16S rDNA của một số dòng vi khuẩn có khả năng cố

định đạm ở đất vùng rễ lúa tỉnh Đồng Tháp Tạp chí khoa học Trường Đại học cần Thơ số 23A, trang 184- 192.

5 Ilkin Yucel Sengun Seniz Karabiyikli (2010) Importance of acetic acid bacteria in food industry,

Food Control 22 (2011) 647-656.

6 Yuzo Yamada, Pattaraporn Yukphan (2007) Genera and species in acetic acid bacteria,

International Journal of Food Microbiology 125 (2008) 15–24.

7 Nguyễn Thị Thùy Dương (2014) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái

cây có múi, Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành vi sinh vật học, Trường đại học Cần Thơ Viện

Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học.

Tài liệu tham khảo

45

Tài liệu tham khảo

Williams & Wilkins, Baltimore, MD.

10 Cleenwerck, I and De Vos, P (2008), “Polyphasic taxonomy of acetic acid bacteria: An

125(1), 2–14.

11 Gullo, M and Giudici, P (2008), “Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar:

12 Tài liệu thực tập vi sinh cơ sở

47