PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỒN VỚI CƠ CHẤT BÃ MÍA Ở CẦN THƠ, HẬU GIANG, BẾN TRE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG do Nghiên cứu sinh thực hiện PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

(do Nghiên cứu sinh thực hiện)

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỒN VỚI

CƠ CHẤT BÃ MÍA Ở CẦN THƠ, HẬU GIANG,

BẾN TRE

Mã số: TNCS2013-13

Chủ nhiệm đề tài: Ths VÕ VĂN SONG TOÀN

Cần Thơ, 3/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

(do Nghiên cứu sinh thực hiện)

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG NẤM MEN

CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN CỒN VỚI CƠ CHẤT BÃ

MÍA Ở CẦN THƠ, HẬU GIANG, BẾN TRE

Mã số: TNCS2013-13

Xác nhận của trường Đại học Cần Thơ Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

Cần Thơ, 3/2014

Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài và đơn vị phối hợp chính

khóa: 2010 - 2014, chuyên ngành:

Vi Sinh Vật

Viện NC & PTCNSH

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

TÓM LƯỢC vii

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU viii

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS ix

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Giới thiệu về bã mía, cellulose, cellulase 3

1.2.1 Tổng quan bã mía 3

1.2.2 Tổng quan cellulose 3

1.2.3 Tổng quan cellulase 4

1.3 Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy tĩnh 6

1.4 Giới thiệu chung về men rượu 8

1.4.1 Giới thiệu chung về nấm men 9

1.4.2 Hình dạng và kích thước của nấm men 9

1.4.3 Cấu tạo của nấm men 10

1.4.4 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men 11

1.4.5 Vai trò và ứng dụng của nấm men 12

1.5 Sự lên men ethanlol 13

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men 17

1.7 Ethanol sinh học 19

1.7.1 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học trong nước 19

1.7.2 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học ngoài nước 20

1.8 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 23

1.8.1 Địa điểm, thời gian, thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu 23

1.8.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 24

1.8.3 Phương pháp nghiên cứu 25

1.8.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng nâm men từ men rượu 25

1.8.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men 26

1.8.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men 26

1.8.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng lên men một số loại đường 27

1.8.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với các dòng vi khuẩn 27

1.8.4 Phương pháp xử lý số liệu 29

PHẦN 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

CHƯƠNG 1 Kết quả phân lập dòng nấm men 30

CHƯƠNG 2 Kết quả hoạt tính exoglucanase và endoglucanase của nấm men 32

CHƯƠNG 3 Kết quả lên men 33

3.1 Kết quả lên men trong ống Durham 33

3.2 Kết quả phối hợp lên men có sự phối hợp giữa nấm men với vi khuẩn 37

3.2.1 Thể tích cột khí 37

3.2.2 Đo pH trước và sau lên men 38

3.2.3 Hàm lượng đường khử trong dịch lên men sau168 giờ 39

3.2.4 Định tính độ cồn bằng cồn kế 40

3.2.5 Chuẩn độ cồn dung dịch sau chưng cất 42

3.2.6 Kết quả phân tích DM 43

3.2.7 Kết quả phân tích CF 44

PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

3.1 Kết luận 46

3.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 3: PHỤ LỤC THỐNG KÊ

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần hóa học bã mía 3

Bảng 2 Thành phần hóa học của nấm men 10

Bảng 3 Thành phần môi trường Potato Glucose Agar (PGA) 24

Bảng 4 Thành phần môi trường Potato Glucose (PG) 24

Bảng 5 Thành phần môi trường cải tiến nuôi vi khuẩn dạ cỏ bò 24

Bảng 6 Thành phần môi trường cải tiến nuôi sinh khối vi khuẩn dạ cỏ bò 25

Bảng 7 Bảng phân bố NT 28

Bảng 8 Đặc điểm của các dòng nấm men phân lập 31

Bảng 9 Chiều cao cột khí CO2 (mm) trong ống Durham 34

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Cấu trúc cellulose 4

Hình 2 Cơ chế tác động của enzyme cellulase 5

Hình 3 Đường tăng trưởng của tập đoàn vi khuẩn 6

Hình 4 Tế bào nấm men 9

Hình 5 Các dạng tế bào nấm men khác nhau quan sát dưới kính hiển vi điện tử 10

Hình 6 Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO2 16

Hình 7 Đường kính vòng halo trên cơ chất bã mía của các dòng nấm men 32

Hình 8 Thể tích khí trong bình lên men sau 168 giờ 38

Hình 9 Hàm lượng đường khử trong dịch lên men sau 168 giờ 39

Hình 10 Độ cồn được tạo ra sau 168 giờ lên men 40

Hình 11 Hàm lượng ethanol được tạo ra sau 168 giờ lên men (g/l) 42

Hình 12 Hàm lượng DM giảm sau 168 giờ lên men 43

Hình 13 Hàm lượng CF giảm sau 168 giờ lên men 44

TÓM LƯỢC

- Đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để lên men cồn trên cơ

chất bã mía” được thực hiện nhằm mục đích tuyển chọn các dòng nấm men có khả

năng lên men cồn trên cơ chất bã mía Kết quả đã phân lập được 18 dòng nấm men từ các viên men khác nhau ở 3 tỷnh (thành phố) Bến Tre, Cần Thơ, Hậu Giang Các dòng nấm men được khảo sát hoạt tính exoglucanase và endoglucanase: có 10 dòng (H5, H6, H7, H9, H10, H12, H13, H15, H16, H18) có hoạt tính exoglucanase, hoạt tính endoglucanase chưa thể hiện ở 18 dòng nấm men được phân lập Kết quả lên men trong ống Durham của 18 dòng nấm men cho thấy bốn dòng nấm men H6, H9, H10, H13 có khả năng lên men một số loại đường D-Glucose, D-Mannose và D-Galactose lần lượt là 30 cm, 30 cm, 30 cm, 30 cm (D-Glucose), 30 cm, 25,67 cm, 17, 33 cm, 17,67 cm (D-Mannose) và 25 cm, 21,33 cm, 28,33 cm, 30 cm (D-Galactose) Bốn dòng nấm men này được chọn để đánh giá khả năng sử dụng bã mía cho quá trình lên men cồn, thông qua một số chỉ tiêu như thể tích khí, độ cồn, hàm lượng ethanol, đường khử, hàm lượng DM và CF giảm đi Kết quả cho thấy rằng dòng nấm men H13 phối hợp với tổ hợp vi khuẩn BM13, BM21 và BM49 (lần lượt tương đồng với Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20 và Bacillus subtilis FS32 ở mức 91, 94 và 94%) có khả năng lên men trên cơ chất bã mía tốt nhất với lượng khí

CO, sinh ra, nồng độ cồn, hàm lượng ethanol, đường khử, lượng DM và CF giảm lần lượt là 44 ml, 4,33, 2,23 g/ls, 0,483 g/l, 9,62% và 27,57%.

Từ khóa:, Achromobacter xylosoxidans, Bacillus subtilis, bã mía, ethanol, nấm men H13

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Đơn vị: VIỆN NC & PT CNSH

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Phân lập, tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng lên men cồn với cơ chất bã mía ở Cần Thơ, Hậu Giang, Bến Tre

- Mã số: TNCS2013-13

- Chủ nhiệm: Ths VÕ VĂN SONG TOÀN

- Cơ quan: Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

- Thời gian thực hiện: 8/2013 - 3/2014

2 Mục tiêu: Tuyển chọn nấm men có khả năng lên men cồn với cơ chất bã mía

3 Tính mới và sáng tạo:

- Tuyển chọn được10 dòng nấm men có hoạt tính exoglucanase

- Tổ hợp nấm men H13 và 3 dòng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BL6,

Bacillus subtilis S20 và Bacillus subtilis FS32 có thể phối hợp để lên men cồn.

4 Kết quả nghiên cứu:

- Phân lập được 18 dòng nấm men trong đó 10 dòng nấm men có hoạt tính

exoglucanase, nhưng chỉ có 4 dòng nấm men (H6, H9, H10, H13) có khả năng lên menDurham mạnh với 3 loại đường D-Glucose, D-Mannose và D-Galactose

- Dòng nấm men H13 có khả năng kết hợp tốt nhất với tổ hợp vi khuẩn

Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20, Bacillus subtilis FS32 để lên

men cồn từ cơ chất bã mía

5 Sản phẩm:

- Góp phần đào tạo một (01) cử nhân Vi Sinh Vật học khóa 36

6 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:

- Tiếp tục hoàn thiện qui trình lên men cồn từ nguyên liệu bã mía đối với tổ hợp

nấm men H13, Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20, Bacillus

1 General information:

Project title: Isolation and selection yeasts for alcohol fermentaion from

sugarcane baggase

Code number: TNCS2013-13

Coordinator: MSc VÕ VĂN SONG TOÀN

Implementing institution: Biotechnology research and Development Institute,Can Tho University

Duration: from 8/2013 to 3/2014

2 Objective(s): Selection of yeast for alcohol fermention from sugarcane baggase

3 Creativeness and innovativeness:

- Ten strains of yeast showed exoglucanase activity

- Strain of a yeast H13 and three strain of bacteria including of Achromobacter

xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20 và Bacillus subtilis FS32 showed to be able

mix together for alcohol fermentation

4 Research results:

- Ten of eighteen strains of yeasts showed exoglucanase activity; However, only four strains including of H6, H9, H10, H13 were able to fermen alcohol with D-Glucose, D-Mannose và D-Galactose in Durham bottle

- Strain of yeast H13 was able to mix with Achromobacter xylosoxidans BL6, Bacillus subtilis S20 and Bacillus subtilis FS32 for alcohol fermentation

5 Products:

- Supporting one bachelor in Microbiology of course 36th

6 Effects, technology transfer means and applicability:

- Improving a process of alcohol fermentation by using sugarcane bagasse as a

substrate

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luôn là vấn đềnan giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới Mỹ và Brazil đã thành công trong việcsản xuất ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía Điều này đã khích lệ các nước khácđầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học

Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thểđược sản xuất từ lignocellulose Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thếgiới Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giảipháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nông nghiệp như Việt Nam

Nền nông nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nôngnghiệp Trong đó, bã mía là loại phụ phẩm có chứa đáng kể hàm lượng cellulose vàcác loại lignocellulose khác Theo kết quả của Tổng cục thống kê, năm 2012 cả nước

có khoảng 297,9 nghìn ha trồng mía với sản lượng cả nước đạt khoảng 19040,8 nghìntấn Vì thế lượng bã mía thải ra hàng năm rất lớn, gây nguy cơ ô nhiễm môi trườngcao Để tận dụng nguồn bã mía thải ra hằng năm và góp phần giảm thiểu tác động đếnmôi trường cũng như giải quyết vấn đề năng lượng, sử dụng bã mía như nguồn nguyênliệu đầu vào để sản xuất ethanol là hướng đi mới đầy tiềm năng và triển vọng ở vùngĐồng bằng sông Cửu Long hiện nay

Việc nghiên cứu sử dụng phụ phẩm nông nghiệp giàu hợp chất carbonhydrat làmnguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu có sử dụng sự trợ giúp của các vi sinh vật đang

là một trong những giải pháp đầy hứa hẹn cho việc thay thế cho nguồn nguyên liệu hóathạch dần cạn kiệt, giảm thiểu sự tác động của môi trường là một trong những hướngnghiên cứu đang dần thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước.Trong lên men ethanol sinh học, giai đoan lên men là một giai đoạn quan trọng.Trong đó nấm men giữ vai trò quyết định trong quá trình lên men Chúng phân bố rộngrãi khắp nơi, đặc biệt hiện diện nhiều trong đất trồng hoa quả và các nhà máy chế biếnđường Ngoài ra, chúng còn xuất hiện trong trái cây chín, trong nhụy hoa, trong khôngkhí và cả nơi sản xuất rượu vang Nấm men lên men ethanol thường được phân lập từquá trình lên men rượu, bã quả, mật rỉ của củ cải đường hay mía đường, Trên bánh

nấm men thường gặp là Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Pichia

anomada,… và một số nấm men dại khác Đây là nguồn phân lập nấm men cho quá

trình lên men ethanol Do đó đề tài “Phân lập và tuyển chọn nấm men từ men rượu để

lên men cồn trên cơ chất bã mía” được tiến hành nhằm để tuyển chọn một số dòng

nấm men có khả năng sử dụng cơ chất bã mía để lên men cồn

1.2 Giới thiệu về bã mía, cellulose, cellulase

1.2.1 Tổng quan bã mía

Bã mía là một lại thức ăn khó tiêu do hàm lượng xơ rất cao trong đó hàmlượng lignin (khoảng hơn 20%) rất lớn và rất nghèo protein là một trong những trởngại cho sự tiêu hóa của gia súc nhai lại (Lê Đức Ngoan, 2005) Theo Kamstra et al.(1958) sự tăng lignin cùng với sự sinh trưởng của thực vật làm giảm tỷ lệ tiêu hóacellulose xuống 30 – 50% do lignin rất bền vững đối với acid mạnh và enzyme của vikhuẩn Lớp ngoài thành tế bào được tạo thành chủ yếu từ các phức chất ligno-hemicellulose mà các enzyme vi sinh vật dạ cỏ thủy phân vô cùng chậm (Lê ĐứcNgoan, 2005) Thực vật càng trưởng thành số lượng lignin càng tăng nên mức độ tiêuhóa cellulose cũng giảm (Trần Cừ, 1979)

Bảng 1 Thành phần hóa học của bã mía

(*Nguồn : Lê Đức Ngoan, 2005)

1.2.2 Tổng quan về cellulose

Cellulose là một hợp chất bền vững Đó là một loại polysaccharide cao phân tử,chúng được cấu tạo bởi nhiều gốc β-glucose liên kết với nhau nhờ cầu nối β-1,4glucosid Mỗi phân tử cellulose thường có chứa từ 1400 – 10000 gốc glucose (NguyễnLân Dũng, 2007)

Cellulose có cấu trúc và tính chất rất đặc biệt Gốc glucose trong công thức cấutạo của cellulose thường tồn tại dưới dạng ghế bành, không phân bố theo mặt phẳng cốđịnh Chính vì thế chúng tạo ra sự vững chắc cho cellulose Cellulose chỉ bị phá hủybởi vi sinh vật trong những điều kiện thích hợp (Nguyễn Lân Dũng, 2007)

Cellulose là một trong những thành phần chủ yếu của tổ chức tế bào thực vật.Trong xác bả thực vật thành phần hữu cơ chiếm tỉ lệ cao nhất bao giờ cũng là cellulose

Hình 1: Cấu trúc cellulose

(*Nguồn : http://community.h2vn.com/index.php?topic=6652.0, ngày 26/05/2008)

1.2.3 Tổng quan cellulase

- Enzyme tham gia phân hủy cellulose được phân làm 3 nhóm:

+ Exocellulase (1,4 β - D- glucan cellobiohydrolase) (EC.3.2.1.91) cắt đầu khôngkhử của chuỗi polyme để tạo thành cellobiose, không có khả năng phân hủy polymedạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzymeendocellulase phân hủy chúng tốt hơn Enzyme này còn có tên khác như:cellobiohydrolase, exocellulase, cellobiosidase và avicecellase (Nguyễn Đức Lượng,2004)

+ Endoglucanase (1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase) (EC.3.2.1.4): thủy phânliên kết β-1,4 glucosid trong vùng vô định hình của cellulose và β-D-glucan thànhcellodextrin, cellobiose và glucose và tác đông yếu đến cellulose kết tinh Enzyme nàycòn có tên khác như: endo 1,4- β-glucanase, C- cellulase Một số nghiên cứu tìm thấy

enzyme này ở Clostridium thermocellum, cellulomonas fimi và các VSV khác

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

+ β-D glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21) : phân hủy các gốc đường đôicellobiose thành glucose, không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Các têngọi khác như : β- glucosidase (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

- Cơ chế tác động của cellulase

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả 3 loại enzymecellulase như: endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Từ những nghiên cứucủa nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các enzyme cellulase sẽ thay phiên nhauphân hủy cellulose để tạo sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách trình bày khác

nhau, cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa ra được nhiều ngườicông nhận hơn cả

Hình 2 Cơ chế tác động của enzyme cellulase

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiênthường bị ảnh hưởng bởi yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loàiphát triển yếu Vì vậy, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên tiến hành không đồng

bộ, xảy ra rất chậm

Sự phân cắt của vi khuẩn trải qua 4 giai đoạn, giai đoạn chậm, giai đoạn log, giaiđoạn quân bình và giai đoạn chết

* Đường tăng trưởng của vi khuẩn

Đường tăng trưởng của vi khuẩn là đường biểu diễn sự gia tăng mật số của vikhuẩn trong mẻ cấy theo thời gian

Hình 3 Đường tăng trưởng của tập đoàn vi khuẩn

(a) Giai đoạn chậm, (b) giai đoạn log, (c) giai đoạn quân bình, (d) giai đoạn chết

(*Nguồn: Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)

 Giai đoạn chậm.

Giai đoạn chậm được giải thích là khi chuyển vi khuẩn sang môi trường nuôi cấymới vi khuẩn thiếu các enzyme cần thiết để có thể sử dụng các hợp chất mới trong môitrường nên chúng cần có thời gian để tổng hợp các enzyme thích hợp để có thể sửdụng các hợp chất mới Độ dốc của đường biểu diễn sự tăng trưởng của vi khuẩn tronggiai đoạn chậm rất nhỏ Giai đoạn chậm không xảy ra khi ta chuyển vi khuẩn sang môitrường mới có thành phần thức ăn giống môi trường cũ (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)

 Giai đoạn log

Khi vi khuẩn đã thích nghi được với môi trường nuôi mới chúng sẽ tăng trưởng

và phân cắt nhanh chóng Đường biểu diễn có độ dốc lớn Đây là giai đoạn tăng trưởngmạnh nhất của của tế bào trong mẻ cấy vi khuẩn Cường độ tăng trưởng của giai đoạnnày tùy thuộc vào điều kiện môi trường như nhiệt độ, thành phần cấu tạo môi trườngcũng như đặc tính di truyền của tế bào vi khuẩn (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)

 Giai đoạn quân bình

Tế bào vi sinh vật không thể tiếp tục phát triển mãi do các chất dinh dưỡng chủyếu trong môi trường ngày càng cạn kiệt và lượng chất bài tiết do hoạt động sống của

tế bào tiết ra càng nhiều Trong giai đoạn này số lượng tế bào không tăng cũng khônggiảm (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)

 Giai đoạn chết

Nếu tiếp tục nuôi cấy sau khi mẽ cấy đạt đến giai đoạn quân bình, tế bào vẫn cóthể tiếp tục sống sót và tiếp tục biến dưỡng nhưng đa số chúng sẽ chết đi Vì vậy, mẽcấy sẽ dần dần đi vào giai đoạn chết Giai đoạn này xảy ra do chất dinh dưỡng ngàycàng cạn kiệt và nồng độ chất bài tiết tích lũy trong môi trường ngày càng cao trở nênđộc đã giết chết các tế bào tiết ra chúng (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007)

1.4 Giới thiệu chung về men rượu

Thực chất men rượu là môi trường không thuần khiết của hệ sinh vật có khả năngsinh trưởng, tổng hợp hệ enzyme đường hóa và lên men rượu Nói cách khác, hệ visinh vật trong men rượu rất đa dạng Trong đó, có ba loài phổ biến nhất, có số lượngđông đảo nhất và có vai trò quan trọng nhất: nấm men, nấm mốc và vi khuẩn.

Các kết quả nghiên cứu khoa học cho thấy các giá trị pH bánh men rượu ở ViệtNam trong khoảng 5,76, độ ẩm khoảng 13,6, hàm lượng vi sinh vật trong nấm mentương ứng là vi khuẩn 2,6 × 106, nấm mốc 3,4 × 106, nấm men 5,8 × 107 CFU/grambánh men rượu Trong tổng số 119 vi sinh vật phân lập được thì có 53 tế bào nấm mốc,

51 tế bào nấm men và 15 tế bào vi khuẩn

Nấm mốc thường có mặt trong bánh men chủ yếu là các chủng Rhizopus, Mucor,

Aspergilluls, Amylomyces Chúng giữ vai trò đường hóa( Trần Thị Thanh,2001) Loài Mucor, đặc biệt là Mucor rouxii có khả năng chịu nhiệt cao (32-35oC), chúng vừa cókhả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa

Nấm men gồm hai chi khác nhau là Endomycopsis fibuligenes là loài nấm men

rất giàu enzyme amylase, glucoamilase, do đó chúng vừa có khả năng đường hóa, vừa

có khả năng rượu hóa; và Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men rất nhiều

loại đường khác nhau như glucose, saccarose, maltose, fructose, raffinose, galactose.Chúng có khả năng lên men ở nhiệt độ cao (khoảng 36-40oC) và có khả năng chịuđược acid Đặc biệt có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02-0,025% và có khả năng lên men các loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai,sắn với lượng đường trong dung dịch từ 12-14% có khi đến 16-18% Nồng độ rượutrong dịch lên men là 10-12% Nhiệt độ lên men thích hợp là 28-32oC

Ngoài hai chi nấm men kể trên, trong men thuốc bắc còn thấy nhiều loài nấmmen hoang dại khác nhau Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năngchuyển hóa đường thành cồn, tuy rằng sự chuyển hóa này còn rất thấp Điều đặc biệt làcác loài nấm men dại này chịu nhiệt rất cao có khi tới 60-65oC và chịu được chất sáttrùng ở nồng độ 0,05-1% (Nguyễn Đức Lượng, 1998)

Ngoài ra trong bánh men thuốc bắc còn có sự hiện diện của một số loài vi khuẩnphát triển, trong đó chủ yếu là các loài vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic Các loài vi khuẩn thường làm chua môi trường Thời gian đầu của quá trình lên men, quá trìnhnày xảy ra có lợi vì pH môi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấmmốc phát triển, tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men

Mặt khác nếu trong dịch lên men có mặt oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thànhacid acetic Quá trình này làm tổn hao lượng cồn tạo thành (Nguyễn Thị Hiền, 2004)

1.4.1 Giới thiệu chung về nấm men

Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có những đặc điểm như cấu tạo đơnbào, đa số sinh sôi nảy nở bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, nhiều loại có khảnăng lên men đường Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong cácmôi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉđường, mật ong, trong đất ruộng trồng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất cónhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng, 1999) Nấm men có nhiều ứng dụng rộng rãi tronglĩnh vực thực phẩm, con người từ lâu đã biết ứng dụng nấm men vào sản xuất các loạithực phẩm truyền thống như rượu, bia, bánh mì…

Hình 4 Tế bào nấm men

(* Nguồn: http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/8485043/1/, ngày 20.7.2013)

1.4.2 Hình dạng và kích thước của nấm men

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: do cấu tạo đơn bào nên chúng tạo ra các khuẩn

lạc có những đặc trưng như: hình dạng khuẩn lạc thường tròn, không đều hoặc hìnhthoi, bìa của khuẩn lạc thường là bìa nguyên, chia thùy, gợn sóng hoặc răng cưa(Huỳnh Xuân Phong, 2010)

Hình dạng tế bào: Nấm men thường có hình cầu, hình elip, hình ovan và có cả

dạng hình dài Chúng hầu hết tồn tại dưới dạng đơn bào, một số loài như Candida

albicans không chỉ nảy chồi mà các tế bào nối lại với nhau tạo thành khuẩn ty giả và Eremothecium gossypii hình thành khuẩn ty thật (Kurtzman và Piškur, 2006)

Kích thước tế bào: Nấm men là loài vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thực.

Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn Kích thước của nấm

men khác nhau tùy theo loài và thời kỳ sinh trưởng của nấm men Saccharomyces

cerevisiae là nấm men thường được sử dụng trong lên men rượu, bia có kích thước

chiều rộng khoảng 2,5 – 10µm và chiều dài 4,5 – 21µm, có thể thấy rõ dưới kính hiển

vi quang học (Nguyễn Lân Dũng, 1999).

Hình 5 Các dạng tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi điện tử

(*Nguồn: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/nammen01.htm , ngày 20/07/2013)

1.4.3 Cấu tạo của nấm men

Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) nấm men có thành phần hóa học như sau:

Bảng 2: Thành phần hóa học của nấm men

(*Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Thành tế bào: Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm, chiếm 15 – 30%

trọng lượng khô của tế bào nấm men, được cấu tạo chủ yếu từ glucan (60% khối lượngthành tế bào), mannoprotein, chitin và một lượng nhỏ lipid

Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất có 3 tầng kết cấu khác nhau,

được cấu tạo chủ yếu từ protein (50% khối lượng khô), phần còn lại là lipid và một ítpolysaccharide (Nguyễn Lân Dũng, 1999)

Chất nguyên sinh: Chất nguyên sinh của nấm men cũng tương tự như chất

nguyên sinh của vi khuẩn, thành phần chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid, enzyme

Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên

trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân Nhân tế bào nấm men Saccharomyces

cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể.

Các bào quan và thành phần khác: ty thể, không bào, ribosome,…

1.4.4 Sự sinh sản và phát triển của nấm men

Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh sản

vô tính và sinh sản hữu tính

- Sinh sản vô tính: chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi

nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi

Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans).

- Sinh sản hữu tính: nấm men hình thành bào tử túi ở các chi Saccharomyces,

Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales.

Nấm men là các vi sinh vật hóa dị dưỡng vì chúng sử dụng các hợp chất hữu cơlàm nguồn cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển Nguồn carbon đượcnấm men sử dụng hầu hết là đường sáu carbon như glucose và fructose hoặc cácđường đôi như sucrose hoặc maltose Một số loài có thể sử dụng đường năm carbon(đường ribose) Nguồn nitrogen cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitrogen của tếbào là các hợp chất hữu cơ hay vô cơ có sẵn trong môi trường Nấm men có khả năngtổng hợp tất cả acid amin Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat Song, giống

Hansenula và giống Pichia lại đồng hóa được chất này Một số loài thuộc giống Brettanomyces cũng đồng hóa được nitrat Về nhu cầu dinh dưỡng các nguyên tố vô

cơ, phospho là nguyên tố được quan tâm nhiều nhất, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh, Nấm men có thể tồn tại được trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí với khoảng nhệt độtương đối rộng và pH acid thích hợp cho sự phát triển của nấm men

1.4.5 Vai trò và ứng dụng của nấm men

Nấm men có nhiều ứng dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm như dùngtrong sản xuất ethanol, bánh mì, rượu vang, bia, tạo sinh khối protein và vitamin, sảnxuất enzyme, acid citrid… Trong đó việc ứng dụng nấm men vào việc lên men các sảnphẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol rất đáng được quan tâm, nguồn ethanol giáthành rẻ sẽ đóng góp đáng kể vào việc giải quyết vấn đề về nhiên liệu và ô nhiễm môitrường.

1.5 Sự lên men ethanol

Lên men ethanol là quá trình chuyển hóa đường thành ethanol được thực hiện bởinhiều nhóm vi sinh vật khác nhau nhưng chủ yếu là nấm men Trong công nghiệp cồn,

bia, rượu, các loại nước uống có cồn, người ta thường sử dụng nấm men

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces trong quá

trình lên men tạo ethanol

Ethanol được sản xuất chủ yếu từ các loại nguyên liệu từ thực vật có chứa đường,hoặc tinh bột và cellulose thông qua phản ứng trung gian thủy phân tạo đường

- Các cơ chất có hàm lượng đường cao thường được dùng để lên men ethanolthường là: rỉ đường, nước mía, củ cải đường, nước trái cây chín; sự lên men từ cácnguyên liệu này được thực hiện trực tiếp mà không thông qua quá trình thủy phân tạođường

- Những cơ chất giàu tinh bột như: gạo, lúa mì, ngô, khoai mì, khoai tây, khoailang…, đối với các loại nguyên liệu này cần phải có quá trình thủy phân tinh bột tạođường cho nấm men sử dụng để lên men tạo ethanol

- 25%) không thể lên men vì khó phân hủy sinh học

Việc chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh học ethanol có ba bước cụ thể làtiền xử lý, thủy phân và lên men Các nguyên liệu trở nên dễ tiếp cận hơn với cácenzyme sau khi tiền xử lý Cellulose phân cắt tạo thành đường khử mà đó là cơ chất

phương pháp hóa học hoặc thủy phân bằng enzyme để tạo thành glucose làm chất nềnchính trong quá trình lên men ethanol Hemicellulose có cấu trúc nhỏ gọn hơn so vớicellulose và có thể bị phân hủy đáng kể hoặc hòa tan trong tiền xử lý.

- Tiền xử lý cellulose

Nhằm tạo ra một dạng cellulose đơn giản hơn để cho quá trình thủy phân dễ dànghơn, các enzyme có thể tiếp xúc tối đa với cơ chất tương thích Phương thức và hiệuquả của quá trình tiền xử lý thay đổi nhiều tùy thuộc vào đặc tính cấu trúc của nguồnnguyên liệu được lựa chọn Các phương pháp xử lý được áp dụng gồm có xử lý cơhọc, hóa học và sinh học (dùng vi sinh vật)

Xử lý cơ học làm giảm kích thước nguyên liệu, các phương pháp thuộc nhómnày không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý Gồm các phương pháp như: nghiềnnát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi Trong đóphương pháp xử lý bằng hơi nước được xem là hiệu quả hơn hết

Sử dụng tác động của hóa chất Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acidloãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid Trong đó, acid sulfuric đã được nghiêncứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên vì nó rẻ và hiệu quả Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong

xử lý acid là thiết bị phải chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung hòa acid với CaOH Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liênquan, chủ yếu là về xút hoặc xút cùng các hóa chất khác Tuy nhiên, nhiều nhà khoahọc cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp Detroy et al(1992) cho thấy rằng amonia lỏng có phần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủyphân bã rắn, nhưng ethylenediamine có thể còn hiệu quả hơn Ngoài ra còn có nhữngphương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol,acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2, NH3 … Các quy trình này hiệnnay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm Tuy nhiên xử lý bằng phương pháphóa học gây nhiều tốn kém và ảnh hưởng nặng đến môi trường, do đó hiện nay phươngpháp sinh học đang dần được được hoàn thiện để thay thế toàn phần hay sử dụng kếthợp với các phương pháp hóa học

Phương pháp xử lý sinh học sử dụng loại nấm như Cyathus sp., Streptomyces

viridosporus, Phelebia tremellosus, Pleurotus florida và Peurotus cornucopiae có khả

năng thủy phân lignin và hỗ trợ một phần thủy phân nguồn nguyên liệu cellulose

- Thủy phân bằng enzyme:

Quá trình tạo hỗn hợp đường từ cellulose bắt đầu bằng giai đoạn vi khuẩn phângiải cellulose tổng hợp enzyme nhằm phân cắt mạch polymer của cellulose thành cáccấu trúc đơn giản hơn và theo sau đó là quá trình thuỷ phân các cellulose đơn giảnthành hỗn hợp đường.

Quá trình này gây tiêu tốn nhiều chi phí trong giai đoạn sản xuất cồn Bằng kỹthuật di truyền, các nhà nghiên cứu đang hướng đến tạo ra một tổ hợp enzyme có thểthủy phân nguồn nguyên liệu lignocellulose hiệu quả nhất Thủy phân hoàn toàn nguồnlignocellulose cần có những sự chuyển đổi các nhóm polysaccharide sau:

Chuyển hóa cellulose: Cellulose là loại polysaccharide đồng hình được cấu tạo từ

-D-glucose thông qua liên kết -(1-4) glycoside thành từ các đơn phân Quá trìnhthủy phân bằng tổ hợp enzyme cellulase bao gồm exoglucanase (-cellobiohydrolase),endoglucase, –glucosidase và sản phẩm cuối cùng là glucose

Chuyển hóa hemicellulose: hemicellulose là thành phần dồi dào nhất thứ 2trong nguồn nguyên liệu lignocellulose (25-30%) Hemicellulose là một loại polymer

dị hình được tạo bằng các đơn phân pentose (D-xylose, D-arabinose), đơn phân hexose(D-mannose, D-glucose, D-galactose) và các acid đường Xylan là thành phần thường thấy trong các thân gỗ cứng, tuy nhiên glucomanan lại là thành phần chính trong cácloại thực vật thân mềm Tổ hợp enzyme để thủy phân hemicellulose cũng rất phức tạp

Ví dụ -xylanse để thủy phân xylan thì tổ hợp enzyme cần thiết là arabinofuranosidase, -glucuronidase và -xylosidase

endo-1,4-L-Nguồn enzyme được sử dụng phổ biến hiện nay là từ Trichoderma reesei và

Aspergillus niger Đa số vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose cũng có khả năng

tổng hợp xynalase để phân hủy xylan Khả năng này thường thấy ở vi sinh vật sống

trong dạ cỏ động vật nhai lại như: Bacillus, Bacteriodes, Butyvibrio, Ruminococus và các vi khuẩn chi Clostridium Hiện nay, người ta đang thay thế dần các hệ enzyme

chịu nhiệt, chịu các điều kiện hóa học quá hạn Hơn hết là các nghiên cứu về phức hợpcellulosome của các vi khuẩn kỵ khí đang dần mở ra một con đường mới nhằm tănghiệu quả thủy phân của tổ hợp trên các loại nguyên liệu lignocellulose

- Cơ chế của quá trình lên men ethanol từ glucose

Lên men ethanol là quá trình trao chuyển hóa dưới tác dụng của chất xúc tác làenzyme Đây là quá trình lên men kỵ khí dưới sự có mặt của nấm men tạo thành

Quá trình lên men rượu của nấm men gồm hai giai đoạn chính:

- Tăng sinh khối nấm men: tế bào nấm men phát triển và tăng sinh khối, giaiđoạn này cần sự hiện diện của oxy

- Lên men chuyển hóa đường thành rượu: quá trình này xảy ra dưới điều kiện

kỵ khí theo sơ đồ sau:`

Hình 6 Cơ chế lên men glucose của nấm men tạo ethanol và CO 2

(*Nguồn: Norr et al, 2003)

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol của nấm men

- Dinh dưỡng

Nitơ và nguồn carbon là yếu tố dinh dưỡng chính trong môi trường lên men Sựtương tác lẫn nhau của các chất dinh dưỡng có thể đóng vai trò quan trọng trong traođổi chất của nấm men Các chất bổ sung vào môi trường sinh trưởng có chứa maltosehoặc glucose cùng với nguồn nitơ như peptone sẽ làm tăng sinh khối và sự sản sinhethanol (Helena de Cruz et al, 2003)

- Nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố cần thiết ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men Thôngthường nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28 – 30°C Nhiệt độ khoảng hơn 50°C và dưới0°C thì sự lên men hầu như bị đình trệ Thông thường quá trình lên men ở nhiệt độthấp sẽ kéo dài hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất sản phẩm, cũngnhư ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm Trong công nghiệp lên men thực phẩm, nhiệt độtối ưu của quá trình lên men có thể không trùng khớp với nhiệt độ tối ưu cho sự sinhtrưởng của vi sinh vật

- pH

Nồng độ của ion H+ có ảnh hưởng đáng kể đến sự lên men trong công nghiệp do

pH đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi khuẩn có thể bị nhiễm và ảnhhưởng lên sự phát triển của nấm men Năng suất lên men ethanol cao nhất thường daođộng ở pH 4,5 – 4,7 Khi pH được điều chỉnh lên 7 hoặc cao hơn thì acid acetic đượctạo thành từ acetaldehyde dựa vào sự gia tăng hoạt động của enzyme aldehydedehydrogenase, glycerol được sản sinh và ức chế sự lên men (Wang et al, 2001)

- Khí oxy và carbonic

Nấm men là vi sinh vật vừa kỵ khí vừa hiếu khí Trong điều kiện kỵ khí, chúnglên men đường tạo thành rượu và khí carbonic (CO2) Còn trong điều kiện đầy đủ oxy,chúng có khả năng oxy hóa đường thành CO2 và nước, đồng thời sinh sản và phát triểnmạnh Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sựsinh sản của nấm men Trong điều kiện nhiệt độ cao, lượng khí hòa tan trong dungdịch lên men sẽ giảm xuống, tạo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men của nấm men

- Nồng độ ethanol

Nồng độ ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, nồng độethanol cao có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men Việc chọn lọc dòng nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao sẽ mang lạilợi ích đáng kể cho quá trình lên men vì các dòng nấm men này có thể nâng cao hiệusuất của quá trình lên men

Ngô Thị Phương Dung (2009) đã phân lập được 50 dòng nấm men từ viên menrượu, 9 dòng được chọn để khảo sát khả năng chịu độ cồn Kết quả thử khả năng chịu

đựng độ cồn cho thấy 7 dòng có khả năng chịu độ cồn trong khoảng 5 – 6% (w/v)ethanol và 2 dòng có khả năng chịu độ cồn thấp hơn từ 2,4 – 3% (w/v) ethanol

- Nồng độ dịch lên men

Nồng độ dịch lên men được xác định bằng khối lượng đường sucrose trong dungdịch (độ Brix) Nồng độ dịch đường quá cao sẽ làm thay đổi độ nhớt của môi trườngtăng áp suất dẫn đến mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Nồng độ ethanolđược sản sinh tăng cao cũng gây ức chế nấm men Tuy nhiên nếu nồng độ dịch đườngquá thấp thì sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất lên men, hao phí trong quá trìnhchưng cất

1.7 Ethanol sinh học

Ethanol sinh học (bio-ethanol) là một loại nhiên liệu sinh học dạng lên men vàchưng cất các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn, thườngđược sản xuất từ các loại cây nông nghiệp hàm lượng đường cao như bắp, lúa mì, lúamạch, mía Ngoài ra, ethanol sinh học còn được sản xuất từ cây có chứa cellulose.Cellulose đã được sản xuất thành công và đưa vào sử dụng làm nhiên liệu nhiều nướctrên thế giới Hiện nay, việc sản xuất ethanol từ các loại cây nông nghiệp có thể ăn

được đang gây lo lắng về vấn đề an ninh lương thực Chính vì vậy, thế giới đang đitheo hướng sản xuất ethanol từ nguyên liệu chứa hợp chất cellulose.

1.7.1 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học trong nước.

Trần Diệu Lý (2008) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ bằng

phương pháp nổ hơi, thủy phân bằng cellulase và lên men với Saccharomyces

cerevisiae Kết quả cho thấy từ 1 kg rơm thô sẽ thu được 204,16g glucose, qua đó thu

được 113,72 g ethanol tương đương 144 ml ethanol

Nguyễn Thị Hằng Nga (2009) nghiên cứu khả năng sản xuất ethanol sinh học từphụ phẩm nông nghiệp Đề tài đã xác định được điều kiện cho quá trình thủy phânbằng acid: H2SO4 2%, 121°C trong 1h, tỷ lệ nguyên liệu: acid là 1: 10 (w/v) thu đượcdịch sau thủy phân có hàm lượng đường khử là 4 g/l Đề tài đã chọn chủng xạ khuẩnACT 06 làm tác nhân cho quá trình thủy phân bằng vi sinh vật và chủng SA.03 làchủng nấm men có khả năng lên men cao làm tác nhân cho quá trình lên men Kết quảcho thấy cần 7.787 kg thân cây ngô sau thu hoạch để sản xuất được dịch giấm chínchứa 1 lít ethanol

Nguyễn Xuân Cự (2010) nghiên cứu khả năng thủy phân bằng axít loãng và bướcđầu đánh giá hiệu quả sản xuất ethanol sinh học từ thân cây ngô Quá trình thủy phânthân cây ngô bằng H2SO4 2 % ở 121°C trong 60 phút có hàm lượng đường khử hìnhthành khá cao (4,2 g/l) khi tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10 (w/v) Đây được xem làđiều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân thân cây ngô bằng acid loãng Sử dụng

Saccharomyces cerevisiae lên men có thể chuyển hóa khoảng 70% lượng đường khử

trong dung dịch và lượng ethanol tạo thành có nồng độ 2,5% thể tích Dựa trên các kếtquả nghiên cứu này, có thể tính sơ bộ để sản xuất 1 lít etanol sinh học cần khoảng 3,24

kg nguyên liệu từ thân cây ngô

Đoàn Thị Ngọc Hân (2010) báo cáo đề tài luận văn “Bước đầu sản xuất ethanolnhiên liệu từ rơm” đã khảo sát các điều kiện để tối ưu các quá trình lên men ethanol từrơm Qua đó kết luận bổ sung 2% H2O2 (v/v) trong 5% (w/v) cơ chất và xử lý mẫu ở37°C trong 23 giờ, sau khi tiền xử lý, rơm được thủy phân ở điều kiện 3% (v/v)enzyme, 50°C, pH % trong 72 giờ sẽ thu được lượng đường khử là 0,455g/g rơm Để

thu được ethanol, bổ sung 0,3% (v/v) nấm men Saccharomyces cerevisiae vào dịch

đường khử, sau 3 ngày lên men, lượng ethanol thu được là 3% (v/v)

Tại Việt Nam, mẻ sản phẩm cồn sinh học ethanol đầu tiên được sản xuất dùng để

pha vào xăng đã xuất xưởng ngày 5.8.2010 Đây là sản phẩm của nhà máy sản xuất

nhiên liệu sinh học ethanol đầu tiên của Việt Nam, hoàn thành và đưa vào sản xuất tạiCông ty cổ phần Đồng Xanh, huyện Đại Lộc, tỷnh Quảng Nam

Từ năm 2011, Việt Nam có chính sách sử dụng xăng sinh học E5 (hàmlượng ethanol 5%) làm nguyên liệu thay thế cho xăng A92 truyền thống Năm 2011,Việt Nam, đã sản xuất ethanol khoảng 0,3 triệu tấn/ năm Mục tiêu của chính phủ tới năm 2015 là 1,5 triệu tấn Quy trình công nghệ sinh học sản xuất ethanol từ phế thảinông nghiệp của giáo sư Trần Đình Toại (2012) được xem là một sáng chế tiêu biểucủa khoa học Việt Nam Theo nghiên cứu thử nghiệm, cứ 1 kg rơm rạ sẽ thu đượckhoảng 0,4 kg cellulose, nếu chọn được các chủng vi sinh có hệ enzyme với hoạt tínhcao thì hiệu suất của giai đoạn thủy phân có thể đạt 80-90%, có nghĩa là từ 0,4 kgcellulose sẽ thu được trung bình là 0,34 kg glucose, từ đó sản xuất ra ethanol Bằngphương pháp trên, với lượng lớn phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) hiện nay của nước ta,nếu sử dụng 30% để sản xuất ethanol với hiệu suất 15%, chúng ta đã có thể thu được

từ 3,6 đến 4,5 triệu tấn ethanol, vượt mục tiêu mà Chính phủ đặt ra tới năm 2015

1.7.2 Tình hình nghiên cứu ethanol sinh học ngoài nước.

Keikhosro Karimi et al (2006) nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạbằng phương pháp tiền xử lý với acid loãng, thủy phân và lên men đồng thời với

Mucor indicus, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae.

Một nghiên cứu của Rajee v Sukumaran và cộng sự (2009) nghiên cứu sản xuấtethanol sinh học từ nguồn sinh khối bã mía Cơ chất bã mía được đường hóa với chủng

vi sinh vật là Trichoderma reesei RUT C30 và Aspergillus niger MTCC 7956, sau đó được lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp lên men rắn.

Kết quả sản xuất được 0,093 g ethanol trên mỗi gram rơm

Năm 2010, Lever và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học thành

công từ rơm lúa mì bằng phương pháp lên men rắn với Saccharomyces cerevisiae, trước đó họ dùng dịch enzyme thô từ nấm mốc Trichoderma reesei để thủy phân vật

dùng phương pháp lên men rắn với Saccharomyces cerevisiae, kết quả có thể chuyển

hóa 81% cơ chất bã mía cho quá trình sản xuất ethanol

Công trình nghiên cứu của Firoz et al (2012) đã tiền xử lý bã mía bằng NaOH ở

pH 4, 50°C trong 24 giờ, sau đó trích dịch enzyme thô từ Trichoderma viride cho quá trình thủy phân bã mía, nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng để lên men

sau đó Quy trình này đã sản xuất ra ethanol với nồng độ 0,579 % và

1,15% Đây là báo cáo đầu tiên ở Bangladesh về sản xuất cellulose ethanol sử dụngcác chủng vi sinh vật địa phương Mặc dù nồng độ sản xuất ethanol là rất thấp, nhưngđây là một động lực lớn trong lĩnh vực này có thể tối đa hóa sản xuất, qua đó đáp ứngnhu cầu nhiên liệu trong tương lai

Hiện nay, tình hình sản xuất và sử dụng ethanol trên thế giới phát triển rất mạnh

mẽ, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất nhiên liệu sinh học là sản phẩm nôngnghiệp, các loại hạt có dầu, rong tảo, cellulose và một phần nhỏ từ các loại mỡ cá, mỡđộng vật nói chung

Tại Đông Nam Á, Thái Lan là nước đứng đầu về sản xuất và sử dụng ethanol làmnhiên liệu, khoảng 1,5-1,6 triệu tấn/năm

Brazil: sản lượng tiêu thụ ethanol đạt tới 14-15 triệu tấn/năm đứng đầu thế giới Mỹ: Hình thành vành đai nông nghiệp gồm nhiều ban chuyên sản xuất ngô, làmnhiêu liệu cho hơn 50 nhà máy sản xuất ethanol sinh học với sản lượng tiêu thụ 13triệu tấn/năm

Các nước Canada, Mexico, Pháp, Thụy Điển, Úc, Nam Phi, Trung Quốc đều đãtùng bước phát triển công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học, chủ yếu là nhiên liệu hóathạch pha ethanol sinh học

1.8 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.8.1 Địa điểm, thời gian, thiết bị, dụng cụ, hóa chất, nguyên vật liệu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, Viện Nghiên cứu và Phát triển

Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: từ tháng 8.2013 đến tháng 12.2013.

Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật , tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), kính hiển vi

Olympus CHT (Nhật), quang phổ kế, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủsấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tửSatorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm, tủ lạnh -4°C Akira (ViệtNam), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

Dụng cụ: Eppendorf centrifuge 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10,

P20, P200, P1000 (Đức), đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 500 ml, đĩa petriđường kính 10cm (Đức), ống nghiệm 10ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: ốngDurham, que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh,bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…

Hóa chất: Ethanol 95%, agar, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, D-Xylose,

CaSO4, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol(C8H18O) octilic alcohol, acetone, sodium hidroxide (NaOH), K2Cr2O7 , Na2S2O3,

H2SO4, KI,

Nguyên vật liệu:

- Thu bã mía từ nhà máy đường Vị Thanh, tỷnh Hậu Giang sẽ được sấy ở 70oCtrong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle vớikích thước lỗ lưới là 0,1 mm Bột bã mía sau khi nghiền được rửa với nước lọc nhiềulần để loại đường

- Nguồn vi khuẩn: 3 dòng vi khuẩn BM13, BM21, BM49 được phân lập từ dạ

cỏ bò; đã được định danh bằng kỹ thuật sinh học phận tử và lần lượt tương đồng với

Achromobacter xylosoxidans BL6 (91%), Bacillus subtilis S20 (94%) và Bacillus subtilis FS321 (94%) (Võ Văn Song Toàn, et al., 2013).

- Nguồn men rượu: men rượu được mua tại 3 tỉnh (thành phố) Cần Thơ (71/2,phường An Bình, quận Ninh Kiều, TP.Cần Thơ), Hậu Giang (ấp Tân Phú, xã TânBình, huyện Phụng Hiệp, tỷnh Hậu Giang), Bến Tre (209, xã Phú Lễ, huyện Ba Tri,tỷnh Bến Tre) Viên men được nghiền mịn thành bột trước khi chủng vào môi trường

1.8.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường Potatose Glucose Agar (PGA) (M1)

Bảng 3 Thành phần môi trường PGA

Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)

(*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2003).

Môi trường Potato Glucose (PG) (M2)

Bảng 4 Thành phần môi trường Potato Glucose (PG)

Hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích

(ml)

(*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2003)

Bảng 5 Thành phần môi trường cải tiến nuôi vi khuẩn dạ cỏ bò (M3)

Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)

(* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh., 2010)

Bảng 6 Thành phần môi trường cải tiến nuôi sinh khối vi khuẩn dạ cỏ bò (M4)

Tên hóa chất Khối lượng/ Thể tích

Bột bã mía (NH 4 ) 2 SO 4

KH 2 PO 4

K 2 HPO 4

MgSO 4 7H 2 O NaCl Nước

10 (g)

1 (g)

1 (g)

1 (g) 0,5 (g) 0,001 (g)

1000 (ml)

(* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010)

1.8.3 Phương pháp nghiên cứu

1.8.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập các dòng nấm men từ men rượu

Mục đích: Phân lập các dòng nấm men từ nguồn men

Vật liệu: Bột viên men rượu thu về từ một số tỷnh (thành phố): Cần Thơ, Bến

Tre, Hậu Giang

+ Hình dạng: dạng tròn có kích thước nhỏ (punctiform) và lớn (circular);dạng không đều (irregular), dạng thoi (spindle), rễ cây dạng sợi (filamentous) và rễ(rhizoid).

+ Độ nổi: dạng phẳng (flat) thường thấp và ngang với mặt môi trường; dạnglài (raised) có chiều cao khuẩn lạc khá hơn dạng phẳng nhưng có 2 dốc (phía vànhkhuẩn lạc lài xuống); dạng mô (convex) thường mổi mô cao lên trên môi trường đặc;dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có dạngnhư nổi mô (pulvinat) nổi bướu (unbonate) nổi hố (umbilicate)

+Dạng bìa: có 5 dạng phổ biến là bìa nguyên (entire), bìa gợn sóng (curled),bìa chia thùy (lobate), bìa răng cưa (erose), bìa sợi (filamentous)

+ Màu sắc: khuẩn lạc thường có màu trắng trong, trắng đục, trắng sữa, …

(*Nguồn: Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp 2008).

- Quan sát tế bào nấm men bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 40X

Chỉ tiêu theo dõi

- Quan sát hình dạng, màu sắc, kích thước, dạng bìa,… của khuẩn lạc nấm men

- Quan sát hình dạng, kích thước của tế bào nấm men

1.8.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo hoạt tính exoglucanase của nấm men.

Mục đích: Khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sinh tổng

hợp exoglucanase để có thể sử dụng cơ chất cellulose

Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (dòng nấm men), 3 lần lặp

lại, mẫu đối chứng không chủng nấm men

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng tròn phân giải bã mía

Đường kính vòng tròn phân giải bã mía = đường kính vòng halo – đường kính lỗ đục

1.8.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo hoạt tính endoglucanase của nấm men.

Mục đích: khảo sát và tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng sinh tổng

hợp endoglucanase để có thể sử dụng cơ chất cellulose

Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (dòng nấm men), 3 lần lặp

lại, mẫu đối chứng không chủng nấm men

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng tròn phân giải bã mía

Đường kính vòng tròn phân giải bã mía = đường kính vòng halo – đường kính lỗ đục

1.8.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng lên men một số loại đường.

Mục đích: tuyển chọn một số dòng nấm men có khả năng lên men tốt nhất 4 loại

đường  tìm nguồn carbon nào là phù hợp nhất cho các dòng nấm men

Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố (nấm men:), 3 lần lặp lại Tiến hành thí nghiệm:

Chủng 10% v/v dịch huyền phù nấm men (mật số 106 tế bào/ml) vào 9 ml dungdịch các loại đường (D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, D-Xylose) (2% w/v) vàoống nghiệm Ủ ở nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao (mm) cột khí trong ống Durham sau 12 giờ, 24 giờ,

36 giờ, 48 giờ, 60 giờ

1.8.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng phối hợp lên men của các dòng nấm men đã tuyển chọn với vi khuẩn