SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TINH DẦU TRONG THÂN RỄ CỦA CÂY NGHỆ ĐEN CURCUMA ZEDOARIA ROSC

T: Nghệ đen Curcuma zedoaria Rosc. (Zingiberaceae) là loài cây thân thảo lâu năm, có thân rễ được tìm thấy ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ và Thái Lan. Thân rễ của loại cây này tích lũy tinh dầu được dùng để làm gia vị, nước hoa và thuốc. Tăng trưởng của các thân rễ bắt nguồn từ hoạt động của mô phân sinh dày cấp một giúp tạo một lượng lớn nhu mô hướng vào trong. Các hạt tinh dầu ở các lát cắt ngang từ thân rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và mối quan hệ giữa tăng trưởng và tạo tinh dầu trong thân rễ Nghệ đen được thảo luận. Từ khóa: Curcuma zedoaria Rosc., tinh dầu, mô phân sinh dày cấp một, thân rễ. MỞ ĐẦU Trong y học cổ truyền, thân rễ (củ) Nghệ đen được dùng để trị bệnh xanh xao, thiếu máu, viêm loét dạ dày… Thành phần quan trọng củT: Nghệ đen Curcuma zedoaria Rosc. (Zingiberaceae) là loài cây thân thảo lâu năm, có thân rễ được tìm thấy ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ và Thái Lan. Thân rễ của loại cây này tích lũy tinh dầu được dùng để làm gia vị, nước hoa và thuốc. Tăng trưởng của các thân rễ bắt nguồn từ hoạt động của mô phân sinh dày cấp một giúp tạo một lượng lớn nhu mô hướng vào trong. Các hạt tinh dầu ở các lát cắt ngang từ thân rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và mối quan hệ giữa tăng trưởng và tạo tinh dầu trong thân rễ Nghệ đen được thảo luận. Từ khóa: Curcuma zedoaria Rosc., tinh dầu, mô phân sinh dày cấp một, thân rễ. MỞ ĐẦU Trong y học cổ truyền, thân rễ (củ) Nghệ đen được dùng để trị bệnh xanh xao, thiếu máu, viêm loét dạ dày… Thành phần quan trọng củT: Nghệ đen Curcuma zedoaria Rosc. (Zingiberaceae) là loài cây thân thảo lâu năm, có thân rễ được tìm thấy ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ và Thái Lan. Thân rễ của loại cây này tích lũy tinh dầu được dùng để làm gia vị, nước hoa và thuốc. Tăng trưởng của các thân rễ bắt nguồn từ hoạt động của mô phân sinh dày cấp một giúp tạo một lượng lớn nhu mô hướng vào trong. Các hạt tinh dầu ở các lát cắt ngang từ thân rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và mối quan hệ giữa tăng trưởng và tạo tinh dầu trong thân rễ Nghệ đen được thảo luận. Từ khóa: Curcuma zedoaria Rosc., tinh dầu, mô phân sinh dày cấp một, thân rễ. MỞ ĐẦU Trong y học cổ truyền, thân rễ (củ) Nghệ đen được dùng để trị bệnh xanh xao, thiếu máu, viêm loét dạ dày… Thành phần quan trọng củT: Nghệ đen Curcuma zedoaria Rosc. (Zingiberaceae) là loài cây thân thảo lâu năm, có thân rễ được tìm thấy ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ và Thái Lan. Thân rễ của loại cây này tích lũy tinh dầu được dùng để làm gia vị, nước hoa và thuốc. Tăng trưởng của các thân rễ bắt nguồn từ hoạt động của mô phân sinh dày cấp một giúp tạo một lượng lớn nhu mô hướng vào trong. Các hạt tinh dầu ở các lát cắt ngang từ thân rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và mối quan hệ giữa tăng trưởng và tạo tinh dầu trong thân rễ Nghệ đen được thảo luận. Từ khóa: Curcuma zedoaria Rosc., tinh dầu, mô phân sinh dày cấp một, thân rễ. MỞ ĐẦU Trong y học cổ truyền, thân rễ (củ) Nghệ đen được dùng để trị bệnh xanh xao, thiếu máu, viêm loét dạ dày… Thành phần quan trọng củ

Trang 5

SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TINH DẦU TRONG THÂN RỄ CỦA CÂY NGHỆ

ĐEN CURCUMA ZEDOARIA ROSC

Nguyễn Thị Duy Bình, Bùi Trang Việt

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG – HCM

(Bài nhận ngày 21 tháng 03 năm 2011, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 14 tháng 09 năm 2011)

TÓM TẮT: Nghệ đen Curcuma zedoaria Rosc (Zingiberaceae) là loài cây thân thảo lâu năm, có

thân rễ được tìm thấy ở nhiều nước thuộc vùng nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ và Thái Lan Thân rễ của loại cây này tích lũy tinh dầu được dùng để làm gia vị, nước hoa và thuốc Tăng trưởng của các thân rễ bắt nguồn từ hoạt động của mô phân sinh dày cấp một giúp tạo một lượng lớn nhu mô hướng vào trong Các hạt tinh dầu ở các lát cắt ngang từ thân rễ được quan sát dưới kính hiển vi quang học Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật và mối quan hệ giữa tăng trưởng và tạo tinh dầu trong thân rễ Nghệ đen được thảo luận

Từ khóa: Curcuma zedoaria Rosc., tinh dầu, mô phân sinh dày cấp một, thân rễ

MỞ ĐẦU

Trong y học cổ truyền, thân rễ (củ) Nghệ đen

được dùng để trị bệnh xanh xao, thiếu máu,

viêm loét dạ dày… Thành phần quan trọng của

củ Nghệ đen là tinh dầu có tính kháng khuẩn,

kháng nấm, kháng virus, diệt côn trùng và

chống oxi hóa (Đỗ Tất Lợi, 2009; Lobo và cs,

2008; Nguyễn Thị Phúc Lộc và cs, 2010)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tìm hiểu về sự

tăng trưởng và tích lũy tinh dầu trong củ của

cây Nghệ đen

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

- Củ Nghệ đen từ các cây được trồng trong

vườn, ở huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai, ở giai

đoạn cây 4 tháng tuổi (đang tăng trưởng) và 10

đến 12 tháng tuổi (khi thân khí sinh héo rủ, cây

không mang hoa, và người trồng thu hoạch củ)

- Cây Nghệ đen in vitro 3 tháng tuổi được

trồng với môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l và IBA 0,5 mg/l

Phương pháp

Quan sát hình thái giải phẫu

Các lát cắt ngang và dọc qua thân cây in

vitro 3 tháng tuổi được quan sát dưới kính hiển

vi quang học, sau khi nhuộm hai màu đỏ carmin và xanh iod

Theo dõi sự tích lũy tinh dầu ở cây trong vườn

Củ cấp một (từ củ mẹ đầu tiên được trồng) ở giai đoạn 4 tháng tuổi của cây Nghệ đen trong vườn được chia thành ba phần: ngọn, giữa và đáy Cắt ngang qua vùng giữa của mỗi phần (khi chia mỗi phần thành ba vùng có chiều dài bằng nhau) thành 15 lát cắt Đếm số hạt tinh dầu trong thị trường khi dùng vật kính x10, ở vùng vỏ và vùng lõi của các lát cắt

Kết quả là giá trị trung bình của các lần đếm

trên 15 lát cắt Lặp lại ba lần trên ba củ khác

nhau

Xác định tỉ lệ trọng lượng khô trên trọng

lượng tươi (TLK/TLT) bằng cách sấy khô 5 g

trọng lượng tươi từ vùng giữa được cắt ra từ

các phần của củ cấp một ở 1200C trong 1 giờ,

tiếp theo ở 800C cho đến khi trọng lượng không

đổi (khoảng 72 giờ) để xác định trọng lượng

khô

Đo cường độ hô hấp (lượng oxygen hấp

thu/g TLT/giờ) bằng máy Hansatech với điện

cực oxygen, ở 270C, trong tối Trong sự đo,

vùng giữa của mỗi phần củ (khi chia mỗi phần

thành ba vùng có chiều dài bằng nhau) được

cho vào buồng đo của máy

Xác định lượng tinh bột theo phương pháp

của Coombs và cộng sự (1987), bằng cách

nghiền vùng giữa của các phần của củ cấp một

(khi chia mỗi phần thành ba vùng có chiều dài

bằng nhau) trong ethanol nóng Phần bã được

sấy khô, đun cách thủy với nước và thủy giải

tinh bột với HClO4 9,2N Xác định lượng tinh

bột dựa vào đường cong chuẩn glucose

Lập đường chuẩn : Pha glucose theo các

nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 µg/l

Nhuộm dung dịch glucose bằng phenol 5% và

H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ glucose: phenol 5%:

H2SO4 đậm đặc (1: 1: 5 theo thể tích) Đo mật

độ quang ở bước sóng 490 nm với chuẩn là

nước cất: phenol 5%: H2SO4 đậm đặc (1: 1: 5

theo thể tích) Từ các giá trị thu được, vẽ

đường chuẩn để dùng cho việc xác định hàm

sự phân ly trên bản mỏng sắc kí Silicagel F254

với dung môi di chuyển là hỗn hợp chloroform: methanol: acid acetic (tỷ lệ 80: 15: 5 theo thể tích), ở nhiệt độ 300C Vị trí của IAA, ABA và zeatin trên bản sắc kí được phát hiện trực tiếp dưới tia UV 254 nm so với chuẩn là IAA, ABA

và zeatin Hoạt tính của IAA, zeatin, GA3 và ABA được xác định bằng sinh trắc nghiệm (Bùi Trang Việt, 1992; Meidner, 1984) Hoạt tính auxin và acid abscisic được đo

bằng sinh trắc nghiệm với diệp tiêu lúa (Oryza

sativa L.) Sự gia tăng về chiều dài diệp tiêu lúa

được đo sau 24 giờ, trong tối Hoạt tính auxin

tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với chuẩn (dung dịch IAA 1 mg/l) Hoạt tính acid abscisic tỷ lệ nghịch với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với chuẩn (dung dịch ABA 1 mg/l)

Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc

nghiệm với tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus

L.) Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với sự sai biệt trọng lượng tươi của các tử diệp so với chuẩn (dung dịch Zeatin 1 mg/l) sau 48 giờ chiếu sáng

Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc

nghiệm với cây mầm xà lách (Lactuca sativa

L.) Hoạt tính gibberellin tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với chuẩn (dung dịch GA 10 mg/l) sau 72 giờ chiếu sáng

Trang 7

KẾT QUẢ

Sự tăng trưởng của củ cây Nghệ đen trong

vườn

Từ củ mẹ đầu tiên được trồng (thường là củ

cấp hai có mang 1 – 3 củ cấp ba được chọn khi

thu hoạch, sau 12 tháng trồng), các củ cấp một,

hai và ba lần lượt phát triển từ chồi mầm trên

củ mẹ, củ cấp một và củ cấp hai Đôi khi, củ

cấp bốn xuất hiện từ chồi mầm của củ cấp ba

Thân Nghệ đen gia tăng đường kính từ vùng

mô với các tế bào phân chia mạnh, được gọi là

mô phân sinh dày cấp một Lát cắt dọc qua

vùng mô phân sinh ngọn của thân cây Nghệ

đen in vitro 3 tháng tuổi cho thấy mô phân sinh

dày cấp một phân bố ngay dưới mô phân sinh

ngọn và các sơ khởi lá (Hình 2A) Ở lát cắt ngang thân gần mô phân sinh ngọn, mô phân sinh dày cấp một sắp xếp thành một vòng tròn xung quanh bó mạch (Hình 2B) Mô phân sinh dày cấp một xuất hiện ở vùng trụ bì, ở giữa vùng vỏ có tương đối ít bó mạch và vùng trung tâm có sự tập trung nhiều bó mạch hơn, và bao gồm các tế bào dẹp, dài, xếp xuyên tâm Các tế bào này phân chia tiếp tuyến hình thành nhu

mô vỏ và nhu mô lõi (Hình 2B, C) Trong khi

đó, ở các lát cắt ngang qua thân tại vị trí xa mô phân sinh ngọn hơn, một số vùng mô phân sinh dày cấp một phân chia lộn xộn hình thành nên

bó mạch hướng vào trong (Hình 2D)

Sự tích lũy tinh dầu của củ Nghệ đen cấp một trong vườn

Ở vùng vỏ, số hạt tinh dầu của phần giữa củ cao hơn so với phần ngọn và đáy củ, trong khi

ở vùng lõi, số hạt tinh dầu tăng dần từ phần ngọn đến phần đáy củ Khi tính tổng cộng, số hạt tinh dầu tập trung nhiều hơn ở phần giữa và đáy, thấp hơn ở phần ngọn của củ (Bảng 1)

Bảng 1 Số hạt tinh dầu/thị trường kính có trong lát cắt ngang ở các phần của củ Nghệ đen cấp một

trong vườn

Vị trí Số hạt tinh dầu/thị trường kính

Vùng vỏ Vùng lõi Tổng cộng Ngọn 2,22 ± 0,23a 6,55 ± 0,20a 8,85 ± 0,12aGiữa 2,93 ± 0,19b 7,21 ± 0,17b 10,11 ± 0,23bĐáy 2,13 ± 0,22a 7,97 ± 0,19c 10,20 ± 0,15b

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05

Bảng 2 Tỉ lệ trọng lượng khô/trọng lượng tươi (TLK/TLT), cường độ hô hấp (CĐHH) và hàm lượng

tinh bột ở các phần của củ Nghệ đen cấp một trong vườn

Vị trí TLK/TLT CĐHH (µmolO2/gTLT/h) Hàm lượng tinh bột (mg/g TLK) Ngọn 0,10 ± 0,004a 12,49 ± 0,57c 78,23 ± 7,90a

Giữa 0,11 ± 0,004a 9,65 ± 0,41b 77,91 ± 5,11a

Đáy 0,24 ± 0,002b 6,88 ± 0,44a 169,05 ± 17,64b

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05

Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực

vật của củ Nghệ đen cấp một trong vườn

Hoạt tính auxin cao nhất ở phần ngọn nhưng

giảm ngay ở phần giữa và đáy củ, trong khi

hoạt tính cytokinin, gibberellin và acid abscisic

nói chung cao ở các phần ngọn và giữa củ và thấp hơn ở phần đáy củ (Bảng 3)

Bảng 3 Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở các phần của củ Nghệ đen cấp một trong vườn

Vị trí Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật (mg/g TLT)

Auxin Cytokinin Gibberellin Acid abscisic Ngọn 0,37 ± 0,03b 0,20 ± 0,04b 0,61 ± 0,04ab 0,73 ± 0,12bGiữa 0,28 ± 0,02a 0,28 ± 0,05b 0,70 ± 0,04b 0,61 ± 0,08b

Đáy 0,26 ± 0,03a 0,06 ± 0,01a 0,49 ± 0,02a 0,18 ± 0,05a

Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05

THẢO LUẬN

Ở Nghệ đen cũng như những cây đơn tử diệp

khác hầu như không xảy ra sự tăng trưởng hậu

lập từ tượng tầng Sự dày lên của thân Nghệ

đen (gia tăng đường kính), giống như ở đa số

cây đơn tử diệp, nhờ hoạt động của vùng mô

phân sinh dày cấp một, nơi tập trung các tế bào

phân chia mạnh (Hình 2A) Mô phân sinh dày

cấp một hình thành từ vài lớp tế bào có nguồn

gốc từ mô phân sinh ngọn, xếp thành hàng

xuyên tâm, nằm ngay dưới mô phân sinh ngọn

và các sơ khởi lá, và ở vùng ngoại vi của đỉnh

thân (Esau, 1967; Rodrigues và Estelita, 2009;

Rudall, 1991) Phân tích lát cắt ngang thân cây

Nghệ đen (vùng gần mô phân sinh ngọn) cho

thấy mô phân sinh dày cấp một tạo thành một vòng tròn xung quanh các bó tiền tượng tầng (Hình 2B), phù hợp với nhận xét về vị trí của

mô phân sinh dày cấp một của Rudall (1991)

và Rodrigues và Estelita (2009)

Cùng với mô phân sinh ngọn, mô phân sinh dày cấp một có chức năng hình thành các cơ quan cấp một Ở giai đoạn cây còn non, các bó mạch hình thành từ tiền tượng tầng có nguồn gốc từ mô phân sinh ngọn Về sau, sự gia tăng

số lượng bó mạch là do hoạt động của mô phân sinh dày cấp một Có điểm tương đồng giữa mô phân sinh dày cấp một ở cây đơn tử diệp và tượng tầng ở cây song tử diệp Đó là sự phân chia tiếp tuyến tạo lớp tế bào dẹp, dài, xếp

Trang 9

xuyên tâm Tuy nhiên, khác với tượng tầng, mô

phân sinh dày cấp một phân chia để tạo các bó

mạch (libe và mộc) hướng vào trong (Hình

2D), trong khi tượng tầng phân chia để tạo libe

hướng ra ngoài và gỗ hướng vào trong Mặt

khác, mô phân sinh dày cấp một hoạt động theo

cả hai chiều: hoạt động ly tâm cho các dãy nhu

mô, và hoạt động hướng tâm, cho nhu mô cùng

với các bó mạch (Esau, 1967; Oriani, 2007;

Rodrigues và Estelita, 2002; Rudall, 1991)

Mô phân sinh cấp một hoạt động theo cả hai

chiều ở củ Nghệ đen có kích thước tương đối

lớn (đường kính khoảng 7cm) Tuy nhiên, theo

Rodrigues và Estelita (2009), tùy vào từng loài

và cách tăng trưởng của cây mà mô phân sinh

dày có hoạt động chức năng khác nhau: chỉ tạo

ra các dãy nhu mô phân bố xuyên tâm ở củ

Cyperus esculentus (đường kính chỉ vài mm);

chỉ hoạt động hướng vào trong để cho các bó

mạch ở Bulbostylis paradoxia

Mô phân sinh dày hoạt động dọc theo thân

cây, tạo nhiều mạch dẫn trong một thời gian

giới hạn hay trong suốt đời sống của thực vật

(Rudall, 1991) Ở Nghệ đen, mô phân sinh dày

cấp một không còn giữ các đặc tính phân sinh

(bao gồm các tế bào dẹp, dài, xếp xuyên tâm và

phân chia tiếp tuyến) khi ở xa mô phân sinh

ngọn chồi, vì các tế bào đã biệt hóa hoàn toàn

thành nhu mô vỏ, nhu mô lõi và các bó mạch

(Hình 2D) Kết quả này cũng phù hợp với

nghiên cứu của Sherlija và cs (1998) Tuy

nhiên, ở Cọ, mô phân sinh dày cấp hai xuất

hiện nối tiếp và trực tiếp từ mô phân sinh dày

cấp một, và cả mô phân sinh dày cấp một và

mô phân sinh dày cấp hai được xem như hai

giai đoạn nối tiếp nhau của cùng một loại mô phân sinh dày (Dickson, 2000)

Tinh dầu tập trung ở phần giữa và đáy (Bảng 1), thấp hơn ở phần ngọn (non hơn) của củ trong khi hàm lượng auxin, gibberellin và cytokinin cao ở phần ngọn (Bảng 3) Như vậy, hoạt động của auxin, gibberellin và cytokinin

có vẻ tác động mạnh trên sự tăng trưởng của củ hơn sự tích lũy dầu Auxin kích thích sự phân chia của các tế bào tượng tầng (Bùi Trang Việt, 2000) Có lẽ sự hiện diện auxin cao ở phần ngọn củ đã giúp các tế bào vùng mô phân sinh dày cấp một của thân cây Nghệ đen phân chia mạnh để cung cấp một lượng lớn tế bào cho sự hình thành nhu mô vỏ, nhu mô lõi và các bó mạch về sau Hiệu ứng cản tăng trưởng của acid abscisic (với hàm lượng cao ở các phần ngọn và giữa) chắc chắn đã bị đẩy lùi bởi hiệu ứng đối nghịch của gibberellin Cùng với sự tập trung các hạt tinh dầu, trọng lượng khô và hàm lượng tinh bột tăng trong khi cường độ hô hấp giảm ở phần đáy củ (Bảng 2) Rõ ràng, phần đáy củ là phần dự trữ các chất cho cây, trong khi phần ngọn với mô phân sinh ngọn giúp sự kéo dài thân và mô phân sinh dày cấp một cho phép sự gia tăng đường kính

KẾT LUẬN

- Hoạt động của mô phân sinh dày có liên hệ

mật thiết với đường kính thân, chính hoạt động của mô phân sinh dày cấp một tạo lượng lớn nhu mô và các bó mạch ở phía trong mô phân sinh này giúp thân cây Nghệ đen gia tăng đường kính

- Tại phần ngọn và giữa củ, dưới tác động của auxin và cytokinin hoạt động phân chia tế

bào và gia tăng kích thước tế bào xảy ra mạnh

là cơ sở cho sự tích lũy tinh bột và tinh dầu ở

phần giữa và đáy củ Trong tương lai, chúng tôi

sẽ tiếp tục tìm hiểu hoạt động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự tăng trưởng

và tích lũy tinh dầu ở củ Nghệ đen

GROWTH AND ESSENTIAL OIL ACCUMULATION IN RHIZOMES OF CURCUMA

ZEDOARIA ROSC

Nguyen Thi Duy Binh, Bui Trang Viet

University of Science, VNU – HCM

ABSTRACT: Curcuma zedoaria Rosc (Zingiberaceae) is a herbaceous and rhizomatous

perennial species found in tropical countries, such as Viet Nam, India and Thailand Rhizomes of this plant accumulate essential oil which is used as a condiment, in perfumery, and as a medicine Growth of the rhizomes is derived from a primary thickening meristem which produces vast amounts of parenchyma to the inside Essential oil droplets in transverse thin sections from the rhizomes are observed under light microscope Roles of plant growth regulators on rhizome growth and relationship between growth and essential oil production were discussed

Keywords: Curcuma zedoaria Rosc, essential oil, primary thickening meristerm, rhizomes

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bùi Trang Việt, Sinh lý thực vật – phát

triển, NXB ĐH Quốc gia TP Hồ Chí

Minh.(2000)

[2] Bùi Trang Việt, Tìm hiểu hoạt động của

các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

thiên nhiên trong hiện tượng rụng

“bông” và “trái non” Tiêu (Piper nigrum

L.), Tập san khoa học Trường ĐH Tổng

hợp TP Hồ Chí Minh, số 1:

155-165.(1992)

[3] Combs J., Hind G., Leegood R C.,

Tieszen L L., Vonshak A Techniques in

bioproductivity and photosynthesis, In:

Measurement of starch and sucrose in

leaves, Edicted by J Combs, D O Hall,

S P Long, J M O Scurlock, Pergamon Press, pp 219 – 228 (1987)

[4] Dickison W C (2000), Intergrative

plant anatomy, Academic Press, Inc pp:

195-200

[5] Đỗ Tất Lợi (2009), Những cây thuốc và

vị thuốc Việt Nam, NXB Y học – Thời

đại, 377 – 378

[6] Esau K (1967), Plant anatomy, The

second edidtion, Wiley J & Sons, Inc pp: 338 – 408

[7] Lobo R., Prabhu K S., Shirwaikar A

and Shirwaikar A (2009), Curcuma

Trang 11

of its chemical, pharmacological and

ethnomedicinal properties, Journal of

Pharmacy and Pharmacology 61: 13 –

21

[8] Meidner H (1984), Class experiments in

Plant physiology, George Allen and

Uniwin, London

[9] Nguyễn Thị Phúc Lộc, Võ Châu Tuấn và

Nguyễn Hoàng Lộc (2010), Khảo sát

hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu chiết

xuất từ tế bào Nghệ đen (Curcuma

zedoaria Roscoe) trong hệ lên men 10

[12] Rodrigues A C., Estelita M E M

(2009), Morphoanatomy of the stem in

Cyperaceae, Acta Botannica Brasilica

23: 3

[13] Rudall P (1991), Lateral meristems and

monocotyledons, Botanical Review 57,

150 – 163

[14] Sherlija K K., Remashree A B., Unnikrishnan K and Ravindran P N (1998), Comparative rhizome anatomy

of four species of Curcuma, Journal of

Spices and Aromatic 7 (2): 103 – 109

A Chồi mầm tái lập tăng trưởng trên củ mẹ sau 2 tuần trồng; B Thân khí sinh phát triển và cho củ cấp một (mũi tên); C Củ cấp hai hình thành từ củ cấp một sau 3 – 4 tháng trồng; D Củ ở các cấp một, hai, ba và bốn khi thu

Trang 13

Hình 2 Mô phân sinh dày cấp một (PTM) ở thân Nghệ đen in vitro 3 tháng tuổi

A, Lát cắt dọc cho thấy mô phân sinh dày cấp một ngay dưới mô phân sinh ngọn

B, Lát cắt ngang ngay dưới mô phân sinh ngọn cho thấy mô phân sinh dày cấp một phân bố thành vòng tròn

C, Chi tiết vùng mô phân sinh dày cấp một ngay dưới mô phân sinh ngọn cho thấy các tế bào dài, dẹp và xếp xuyên

KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH PHÔI THỂ HỆ Ở KHOAI MÌ ( Manihot esculenta Crantz)

Vũ Văn Kiên, Nguyễn Du Sanh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

(Bài nhận ngày 21 tháng 03 năm 2011, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 23 tháng 09 năm 2011)

TÓM TẮT: Phôi thể hệ ở khoai mì dòng KM297 từ khúc cắt thùy lá non in vitro hay khúc cắt lá

mầm phôi thể hệ được cảm ứng trên môi trường MS bổ sung picloram 8mg/l, sau 13 ngày nuôi cấy trong tối Các giai đoạn phát triển phôi được ghi nhận sau 10 ngày nuôi cấy ở ngoài sáng trên môi trường MS bổ sung BA 0,1mg/l và NAA 0,01mg/l Hoạt tính AIA và Zeatin nội sinh của giai đoạn phôi hình cầu đã được phân tích

Từ khóa: khoai mì, Manihot esculenta, phôi thể hệ, picloram

Chữ viết tắt: 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, BA: benzyladenine, CĐHTTTV: chất điều hòa tăng

trưởng thực vật, MS: Murashige và Skoog, 1962, MT: môi trường, NAA: naphthalene acetic acid, picloram: amino-3,5,6-trichloropicolinic acid

4-MỞ ĐẦU

Khoai mì cung cấp củ như một nguồn lương

thực quan trọng cho cư dân các vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở châu Phi Hiện

nay ở Việt Nam, khoai mì đang trong quá trình

chuyển đổi nhanh chóng từ cây lương thực

truyền thống thành cây công nghiệp [3]

Việc cải tiến các giống hiện có cho mục đích

tăng năng suất, tăng hàm lượng protein và giảm

acid cyanhydric là vấn đề đang được quan tâm

trên toàn thế giới Điều kiện quan trọng cho

quy trình cải tiến giống thông qua các kỹ thuật

hiện đại như chuyển gen, dung hợp tế bào, đột

biến lý học cần một hệ thống tái sinh cây hoàn

chỉnh [11]

Trong những năm gần đây, bộ môn Sinh lý

Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành một số

nghiên cứu trên cây khoai mì như: ghép giữa

mì cao su và khoai mì, tạo mô sẹo và dịch treo

tế bào, phát sinh chồi, phát sinh hình thái phôi thể hệ từ mô sẹo có nguồn gốc lá khoai mì dòng Cuống Trầu Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục khảo sát các biến đổi hình thái, sinh lý trong quá trình phát sinh phôi thể

hệ trên đối tượng KM297 và tiến hành các thí nghiệm bước đầu nhằm nâng cao hệ số phát sinh phôi

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu

Cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz),

dòng KM297 được trồng tại vườn thực nghiệm,

bộ môn Sinh lý Thực vật, trường Đại học Khoa Học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở phường Linh Trung, quận Thủ Đức Khúc cắt

đốt thân mang một chồi ngủ được đưa vào in

vitro sau khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2

1,5‰ trong 20 phút Cây được giữ trong in

Trang 15

vitro bằng phương pháp cấy chuyền chồi ngọn

và chồi ngủ trên môi trường MS cơ bản,

sucrose 20g/l Thùy lá trên phiến lá non (dài từ

3- 8mm) của cây in vitro được cắt vuông góc

với gân chính thành các mảnh cách nhau 2mm

và đặt ngửa trên MT nuôi cấy

Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là môi trường MS bổ

sung thêm sucrose 20g/l, CuSO4 0,3 mg/l, agar

6g/l, bổ sung các CĐHTTTV (2,4-D, BA,

NAA, picloram) theo các thí nghiệm khác

nhau, pH được chỉnh ở 5,7 ± 0,1 Môi trường

được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC và áp suất

1 atm trong thời gian 18 phút

Điều kiện nuôi cấy: các thí nghiệm được

thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý

Thực vật, cơ sở phường Linh Trung, quận Thủ

Đức; quang kỳ 12 giờ/ngày, cường độ chiếu

sáng 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 27 ± 3oC, độ ẩm

75 ± 10% 6 mẫu cấy được đặt trong erlen 50ml

có chứa 15ml môi trường cảm ứng Các mẫu

cấy sau đó được chuyển sang erlen 100ml chứa

30ml môi trường cho sự phát triển của phôi

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Khảo sát loại, nồng độ auxin

lên hiệu quả cảm ứng phát sinh phôi từ vật

liệu khúc cắt thùy lá non in vitro

Khúc cắt thùy lá non được đặt trên các môi

trường cảm ứng khác nhau, là môi trường MS

bổ sung 2,4-D (2, 4, 8) mg/l hoặc picloram (2,

4, 8) mg/l trong tối 21 ngày Sau đó, mẫu cấy

được chuyển sang môi trường MS cơ bản, đặt

ngoài sáng

Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian cảm ứng

lên hiệu quả phát sinh phôi

Khúc cắt thùy lá non được đặt cảm ứng trên môi trường MS bổ sung picloram 8mg/l sau 6,

10, 13, 21 ngày rồi lần lượt chuyển mẫu cấy sang môi trường MS bổ sung NAA 1mg/l trong tối cho đủ 21 ngày Sau đó, tất cả các mẫu cấy

ở các nghiệm thức khác nhau được chuyển sang môi trường MS bổ sung BA 0,1mg/l + NAA 0,01mg/l

Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trường thích hợp cho sự phát triển của phôi

Khúc cắt thùy lá non được đặt cảm ứng trên môi trường MS bổ sung picloram 8mg/l trong tối sau 21 ngày Sau đó, mẫu cấy được chuyển sang các môi trường khác nhau gồm môi trường MS cơ bản (đối chứng) và MS bổ sung

BA (0,1; 0,5; 1) mg/l + NAA 0,01mg/l, đặt ngoài sáng theo dõi sự phát triển của phôi

Thí nghiệm 4: Khảo sát loại, nồng độ auxin lên hiệu quả cảm ứng phát sinh phôi từ vật liệu khúc cắt tử diệp phôi thể hệ

Phôi thể hệ thu được từ thí nghiệm 1 sau khi chuyển mẫu cấy sang môi trường MS cơ bản

21 ngày Các tử diệp phôi thể hệ được cắt vuông góc với gân chính thành các mảnh cách nhau 2mm và đặt ngửa trên MT cảm ứng khác nhau: MS bổ sung 2,4-D (4, 8) mg/l và picloram (4, 8) mg/l Sau 21 ngày trong tối mẫu cấy được chuyển sang MT MS bổ sung BA 0,1mg/l + NAA 0,01mg/l, đặt ngoài sáng cần cho sự phát triển của phôi

Thí nghiệm 5: Phân tích hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Khúc cắt thùy lá non đặt trên môi trường MS

bổ sung piloram 8mg/l ở ngày 0, 10, 13, 21

được đo hoạt tính CĐHTTTV bằng sinh trắc

nghiệm theo cải tiến của Bùi Trang Việt, 1992

KẾT QUẢ

Thí nghiệm 1: Khảo sát loại, nồng độ auxin

lên hiệu quả cảm ứng phát sinh phôi từ vật

liệu khúc cắt thùy lá non in vitro

Mẫu cấy sau 3 ngày cảm ứng có sự giãn nở

về kích thước và bắt đầu tạo sẹo ở vị trí các vết

cắt Sau 8 ngày, có sự xuất hiện của khối mô

sẹo có khả năng sinh phôi; sau 13 ngày, có sự

xuất hiện phôi hình cầu Sau 21 ngày trên các

môi trường cảm ứng, có sự xuất hiện của phôi

ở các giai đoạn khác nhau trên bề mặt khối mô sẹo (Hình 1.1)

Sau 10 ngày chuyển mẫu cấy sang môi trường MS cơ bản, tất cả các nghiệm thức đều

có sự xuất hiện phôi, trên môi trường cảm ứng

MS bổ sung picloram 8mg/l trước đó cho tỉ số mẫu cấy xuất hiện phôi cao nhất (Bảng 1) Cấu trúc giải phẫu phôi ở giai đoạn có hai tử diệp cũng được quan sát thấy được cực chồi và cực

rễ phát triển (Hình 1.2)

Bảng 1 Tỉ lệ mẫu cấy khúc cắt thùy lá non in vitro trên các môi trường cảm ứng khác nhau trước đó, có

xuất hiện phôi sau khi được chuyển sang môi trường MS cơ bản 10 ngày

Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05

Số phôi trung bình/mẫu cấy xuất hiện không

khác biệt nhiều ở các nghiệm thức khác nhau,

dao động trong khoảng từ 10- 20 phôi Trên

môi trường MS bổ sung picloram 8mg/l, cho

trên 30 phôi

Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian cảm ứng

lên hiệu quả phát sinh phôi

Ở nghiệm thức cảm ứng 6 ngày, sau khi

chuyển mẫu cấy sang môi trường MS bổ sung

NAA 1mg/l, có sự xuất hiện và kéo dài của rễ

từ mô sẹo sau 7 ngày trên môi trường này; đến

ngày thứ 10, rễ ngưng kéo dài, trên bề mặt rễ

bắt đầu tạo mô sẹo và sau khi chuyển sang môi trường MS bổ sung BA 0,1mg/l + NAA 0,01mg/l các rễ lại tiếp tục kéo dài và không có

sự xuất hiện phôi

Ở các nghiệm thức còn lại, sau 10 ngày chuyển mẫu cấy sang môi trường MS bổ sung

BA 0,1mg/l + NAA 0,01mg/l, đều có sự xuất hiện phôi và không có sự có mặt của rễ; nghiệm thức cảm ứng sau 13 ngày cho kết quả tốt nhất (Bảng 2) Số phôi trung bình/mẫu cấy xuất hiện phôi không có sự khác biệt nhiều: từ 20- 30 phôi

Các số trung bình bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05

Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trường thích

hợp cho sự phát triển của phôi

Sau 10 ngày chuyển mẫu cấy sang các môi

trường khác nhau cho sự phát triển của phôi, tỉ

lệ số mẫu cấy xuất hiện phôi ở các nghiệm thức

thử nghiệm không khác biệt so với đối chứng

(môi trường MS cơ bản), dao động trong

khoảng 20- 26,7% Tuy nhiên số phôi trung

bình/mẫu cấy xuất hiện phôi ở các nghiệm thức

thử nghiệm đều cao hơn (20- 30 phôi) so với

đối chứng (10- 20 phôi)

Thí nghiệm 4: Khảo sát loại, nồng độ auxin

lên hiệu quả cảm ứng phát sinh phôi từ vật

liệu khúc cắt tử diệp phôi thể hệ

Sau 3 ngày cảm ứng trên các môi trường

khác nhau, mẫu cấy bắt đầu tạo mô sẹo Sau 14

ngày, có sự xuất hiện phôi đạt đến giai đoạn hình cá đuối Sau 21 ngày trên môi trường cảm ứng, phôi ở các giai đoạn khác nhau xuất hiện với tần số cao trên bề mặt khối mô sẹo Cấu trúc giải phẫu phôi hình cầu được quan sát, phôi chưa phân hóa cực chồi và cực rễ nhưng

có dây treo ngắn gắn phôi vào mô sẹo (Hình 1.3)

Sau 10 ngày chuyển mẫu cấy sang môi trường MS bổ sung BA 0,1mg/l + NAA 0,01mg/l Tất cả các nghiệm thức đều xuất hiện phôi, môi trường MS bổ sung picloram 8mg/l trước đó cho 91,7% mẫu cấy xuất hiện phôi (Bảng 3) Số lượng phôi trung bình/mẫu cấy từ khúc cắt tử diệp phôi thể hệ cao hơn so với vật

liệu khúc cắt từ lá non in vitro (Hình 1.4, Bảng

4)

Bảng 3 Tỉ lệ mẫu cấy có xuất hiện phôi ở các nghiệm thức khác nhau với khúc cắt tử diệp phôi thể hệ

Bảng 4 Số lượng phôi trung bình/mẫu cấy khúc cắt tử diệp phôi thể hệ xuất hiện phôi ở các nghiệm

thức khác nhau sau khi mẫu cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung BA 0,1 mg/l + NAA 0,01mg/l 10

Quy ước: +, số lượng phôi ít (1-10); ++, số lượng phôi tương đối ít (11-20); +++, số lượng phôi trung bình

(21-30); ++++, số lượng phôi tương đối nhiều (31-40); +++++, số lượng phôi nhiều (41-50); ++++++, số lượng phôi rất nhiều (> 50)

Thí nghiệm 5: Phân tích hoạt tính chất điều

hòa tăng trưởng thực vật

Sự thay đổi hoạt tính auxin, cytokinin trong

mẫu cấy khúc cắt phiến lá non in vitro theo thời

gian đặt trên môi trường cảm ứng (MS bổ sung 8mg/l picloram) được ghi nhận theo hình 2

Hình 1 Sự thay đổi hoạt tính auxin, cytokinin trong mẫu cấy khúc cắt phiến lá non in vitro theo thời gian đặt trên

môi trường cảm ứng MS bổ sung picloram 8mg/l Hoạt tính auxin và cytokinin đều tăng trong

quá trình cảm ứng tạo phôi đạt cao nhất vào

ngày thứ 13

Số phôi bất thường ghi nhận được trong

nghiên cứu này cao (80%), chủ yếu là phôi có

hay nhiều phôi dính nhau, phôi hình tách (cup shape)

Sự thay đổi hoạt tính auxin, cytoknin trong mẫu cấy khúc cắt phiến lá

non in vitro theo thời gian nuôi cấy

Trang 19

Hình 1 1 Phôi ở các giai đoạn khác nhau từ khúc cắt thùy lá non in vitro sau 21 ngày đặt trên môi trường cảm ứng

MS bổ sung 2,4-D 4mg/l sau 21 ngày; 2.Phôi giai đoạn hai tử diệp với cực chồi và cực rễ sau 10 ngày chuyển sang môi trường MS cơ bản; 3 Phôi hình cầu vơi biểu bì sơ khởi từ vật liệu khúc cắt tử diệp phôi thể hệ sau khi đặt trên môi trường cảm ứng MS bổ sung picloram 4mg/l 21 ngày; 4 Một phần cụm phôi từ vật liệu khúc cắt tử diệp phôi

thể hệ sau khi chyển sang môi trường phát triển của phôi 10 ngày, trước đó đặt cảm ứng trên MT MS bổ sung

picloram 8mg/l

THẢO LUẬN

Trên đối tượng khoai mì, phôi đạt tới giai

đoạn có hai tử diệp sớm với hình thái bình

thường có thể thu nhận được ngay trên môi

trường có bổ sung auxin mạnh (2,4-D,

picloram) ở nồng độ cao trong môi trường nuôi

cấy (8mg/l) Kết quả này phù hợp với các

nghiên cứu khác [4], [5], [6], [8], [9], [10],

[11]

Theo nghiên cứu của Bùi Trang Việt và cs

(2004) [1], trên đối tượng cây lúa dòng Bằng

Ngọc, sau khi chuyển khối mô sẹo có khả năng

sinh phôi được tạo ra trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 2mg/l + NAA 1mg/l + BA 0,5mg/l sang môi trường MS cơ bản, auxin ngoại sinh (NAA, 2,4-D) giảm nhẹ trong mẫu cấy Tuy nhiên, diển tiến quá trình phát sinh phôi có sự liên quan chặt chẽ đến sự thay đổi auxin nội sinh; auxin nội sinh đạt đến đỉnh trong giai đoạn phôi hình cầu và sau đó giảm mạnh ở giai đoạn phôi hình chùy Trong nghiên cứu này, hoạt tính auxin và cytokinin nội sinh tăng ở ngày thứ 13 khi đặt mẫu cấy làkhúc cắt phiến

lá non in vitro trên môi trường cảm ứng bổ

sung picloram 8mg/l Ngày thứ 13 là thời điểm

xuất hiện phôi hình cầu Có lẽ chính sự tăng

hoạt tính auxin và cytokinin nội sinh ở giai

đoạn này đã giúp cho sự phát triển tiếp theo của

phôi tới các giai đoạn sau đó

Auxin nội sinh giảm mạnh trong quá trình

tạo cơ quan phôi [1] Tuy nhiên, sau 21 ngày

nuôi cấy, ứng với thời điểm xuất hiện phôi hình

cá đuối và phôi có hai tử diệp, hoạt tính auxin

nội sinh không giảm so với ngày thứ 13 Kết

quả này do sự xuất hiện không đồng thời của

phôi ở các giai đoạn khác nhau sau 21 ngày

trên môi trường nuôi cấy (Hình 1.1) Có thể

phôi hình cầu tiếp tục xuất hiện trong ngày thứ

21 giúp cho hoạt tính auxin nội sinh trong mẫu

cấy cao Mẫu cấy còn đặt nuôi trên môi trường

auxin cao có lẽ cũng kích thích gia tăng hoạt

tính auxin nội sinh trong mô sẹo

Tóm lại, có thể do sự thu hút auxin từ khối

mô sẹo vào các tế bào ở giai đoạn tiền phôi và

khả năng sản xuất auxin cao từ các tế bào phía

trên phôi hình cầu giúp hoạt tính auxin nội sinh

cao ở ngày thứ 13 Sau đó, sự định hướng của

các PIN protein (protein vận chuyển auxin đi

ra) giúp cho sự di chuyển hữu cực của auxin

nội sinh từ phôi qua dây treo để vào khối mô

sẹo; auxin nội sinh từ mô sẹo sẽ đi vào môi

trường theo cơ chế khuếch tán Chính dòng

auxin nội sinh di chuyển hữu cực theo hướng

từ phôi hình cầu qua mô sẹo rồi vào môi trường

nuôi cấy cùng với sự gia tăng hoạt tính của

cytokinin là nhân tố quan trọng giúp cho phôi hình cầu tiếp tục phát triển trên môi trường có

bổ sung auxin ngoại sinh cao

Trong nghiên cứu này, số lượng phôi bất thường là cao (80%) Tần số phôi thể hệ bất thường cao đã được ghi nhận trong báo cáo của Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Du Sanh, 2009

trên đối tượng cây cà tím (Solanum melongena

phôi từ vật liệu lá non in vitro ở các nồng độ

được nghiên cứu

Thời gian cảm ứng trên môi trường MS bổ sung picloram 8mg/l sau 13 ngày (sau đó chuyển sang MT MS bổ sung NAA 1mg/l) cho hiệu quả phát sinh phôi cao hơn khi cho cảm ứng sau 21 ngày, với vật liệu làkhúc cắt lá non

Trang 21

SOMATIC EMBRYOGENESIS OF CASSAVA (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ)

VAR KM297

Vu Van Kien, Nguyen Du Sanh

University of Sciences, VNU-HCM

ABSTRACT: Somatic embryos of cassava var KM297 received from pieces of in vitro immature

leaf lobes or cotyledon of somatic embryos, were induced on the MS medium supplemented with 8mg/l picloram after 13 days inoculation in the dark condition Different states of embryo were obtained after

10 days cultured on MS medium supplemented with 0.1 mg/l BA and 0.01mg/l NAA, in the light condition Role of endogenous AIA and Zeatin of the globular state of embryos was studied

Keywords: Callus, cassava, induction, picloram, somatic embryos

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bùi Trang Việt, Phan Ngô Hoang,

Nguyễn Thị Huệ, Trần Thanh Hương,

Trần Thị Bích Trinh, Đoàn Thị Phương

Thùy, Trịnh Cẩm Tú, Cao Minh Phương

Vai trò của auxin và cytokinin trong quá

trình sinh phôi thể hệ ở khoai tây, lúa,

chuối Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp,

số 2: 64- 67 (2004)

[2] Đoàn Thị Phương Thùy và Bùi Trang

Việt Tìm hiểu sự phát sinh phôi thể hệ

từ mô sẹo có nguồn gốc lá khoai mì

(Manihot esculenta Crantz.) dòng cuống

trầu Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp,

số 1: 19- 23 (2006)

[3] Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương,

Nguyễn Xích Liên Tinh bột sắn và các

sản phẩm từ tinh bột sắn Nhà xuất bản

Khoa học và Kỹ thuật (2005)

[4] Le, B.V., Anh, B.L., Soytong, K., Danh,

N.D and Anh Hong, L.T Plant

regeneration of cassava (Manihot

esculenta Crantz.) plants Journal of Agricultural Technology 3(1): 121- 127

(2007)

[5] Ma, G., and Xu, Q Induction of somatic embryogenesis and adventitious shoots

from immature leaves of cassava Plant

Cell, Tissue and Organ Culture 70: 281–

288 (2002)

[6] Raemakers, C.J.J.M., Amati, M., Staritsky, G., Jacobsen E., and Visser, R.G.F Cyclic Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration in Cassava

Annals of Botany 71: 289- 294 (1993)

[7] Stamp, J.A and Henshaw, G.G Somatic

embryogenesis in cassava Zeitschriff fur

(1982)

[8] Stamp, J.A and Henshaw, G.G

Secondary somatic embryogenesis and

plant regeneration in cassava Plant Cell,

Tissue and Organ Culture 10: 27- 33

(1987)

[9] Stamp, J.A and Henshaw, G.G Somatic

embryogenesis from clonal leaf material

of cassava Annals of Botany 59: 45- 50

(1987)

[10] Szabados, L., Hoyos, R., Roca, W In

vitro somatic embryogenesis and plant

regeneration in cassava Plant Cell

Reports 6: 248- 251 (1987)

[11] Taylor, N.J., Edwards, M., Kiernan, R.J.,

Davey, C.D.M., David Blakesley, D.,

and Henshaw, G.G Development of

friable embryogenic callus and

embryogenic suspension culture systems

in cassava (Manihot esculenta Crantz)

Natural Biotechnology, volume 14: 721-

230 (1996)

[12] Trịnh Ngọc Nam, Nguyễn Du Sanh Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự phát sinh

phôi thế hệ cà tím (Solanum melongena L.) Tạp chí Phát triển Khoa Học &

Công nghệ Đại Học Quốc Gia Tp.HCM,

Tập 12 (17): 71-80 (2009)

Trang 23

KHẢO SÁT SỰ TẠO MÔ SẸO CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CAPSAICINOID

TỪ CÂY MẦM ỚT CAPSICUM SP

Võ Thanh Phúc, Lê Thị Thuỷ Tiên

Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM

(Bài nhận ngày 21 tháng 03 năm 2011, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 20 tháng 11 năm 2011)

TÓM TẮT: Mô sẹo hình thành từ trụ hạ diệp và tử diệp của cây mầm ớt Capsicum sp in vitro

trên môi trường MS bổ sung kinetin 0,5 mg/l với 2,4-D hoặc NAA nồng độ thay đổi (1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 mg/l) Sự hình thành mô sẹo từ tử diệp trong điều kiện tối tốt hơn trong điều kiện chiếu sáng, ngược lại, mẫu cấy từ trụ hạ diệp tạo sẹo tốt trong điều kiện chiếu sáng Mô sẹo có dạng bở và tăng trưởng tốt hơn trên môi trường bổ sung 2,4-D và kinetin Mô sẹo từ tử diệp tăng trưởng tốt nhất trên môi trường

có D 3,0 mg/l và kinetin 0,5 mg/l Mô sẹo từ trụ hạ diệp tăng trưởng tốt nhất trên môi trường có

2,4-D 1,5 mg/l và kinetin 0,5 mg/l Capsaicinoid có mặt trong mô sẹo ở tất cả các nghiệm thức thí nghiệm,

được xác định bằng phương pháp sắc kí bản mỏng

Từ khóa: capsaicinoid, cây mầm ớt, mô sẹo

GIỚI THIỆU

Ớt là một trong những loại cây trồng phổ

biến trên thế giới Thành phần tạo nên vị cay và

nóng của các loài ớt là một nhóm hợp chất

alkaloid liên quan đến capsaicin (8-methyl

6-nonenoyl- vanillylamine) được gọi là

capsaicinoid Các hợp chất này giúp thực vật

chống lại sự xâm hại của động vật, một số vi

khuẩn và nấm, …

Capsaicinoid được sử dụng trong công

nghiệp thực phẩm (sản xuất các sốt cay,…),

dược phẩm (sản xuất thuốc giảm đau cơ,…),

quân sự (thành phần chính trong thuốc xịt

phòng vệ,) Capsaicin còn được nhận thấy có

khả năng chống ung thư và chống oxi hóa

mạnh [2]

Hiện nay, nhu cầu về hợp chất này trong thực

phẩm cũng như dược phẩm đang tăng cao

Trong khi đó, qui trình sản xuất capsaicin

thương mại từ ớt phải trải qua nhiều bước tinh sạch phức tạp Do đó, nhiều nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp capsaicin của tế bào ớt

Capsicum sp in vitro đã được tiến hành nhằm

mục đích tiến tới sản xuất capsaicin ở qui mô công nghiệp có điều khiển chặt chẽ

Thí nghiệm này được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên sự hình thành, tăng trưởng và tổng hợp capsaicinoid

của mô sẹo từ cây mầm ớt Capsicum sp như

nguồn gốc mẫu cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực vật và điều kiện chiếu sáng

THỰC NGHIỆM Vật liệu

Tử diệp và trụ hạ diệp từ cây mầm ớt trên môi trường MS bổ sung myo-inositol 100 mg/l, sucrose 20 g/l, agar 6 g/l Hột giống tạo cây

con là hột giống ớt cay Capsicum sp F1TN

139 (công ty TNHH - TM Trang Nông)

Phương pháp

Khảo sát ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu

cấy, chất điều hòa sinh trưởng và điều kiện

chiếu sáng lên sự hình thành và tăng trưởng

của mô sẹo

Môi trường tạo sẹo là môi trường MS có bổ

sung myo-inositol 100 mg/l, sucrose 30 g/l,

agar 6,5g/l, kinetin 0,5 mg/l và auxin (2,4-D,

NAA) với các nồng độ 1; 1,5; 2; 2,5 và 3 mg/l

Mẫu cấy được duy trì ở nhiệt độ 25 ± 2oC, ẩm

độ 70 ± 5% Thí nghiệm được tiến hành trong

điều kiện sáng (2800 lux, 16 giờ/ngày) và trong

tối Mô sẹo hình thành sẽ được cấy chuyền sau

mỗi 3 tuần

Thu nhận và xác định sự hiện diện của

capsaicinoid trong mô sẹo bằng phương pháp

sắc kí bản mỏng

Mô sẹo 9 tuần tuổi được sấy ở nhiệt độ

40-50oC cho đến khô, sau đó được nghiền nhuyễn

để thu bột nguyên liệu Dung môi sử dụng để ly

trích capsaicinoid là aceton khan Dung dịch sau trích ly được ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút để thu dịch chiết có chứa capsaicinoid [6] Bản mỏng sắc ký được sử dụng là bản silicagel tráng nhôm (Merck 60

F254) 10 x 10 cm Tiến hành chấm sắc ký dịch chiết từ mô sẹo song song với dịch chiết từ trái

ớt để so sánh Hệ dung môi di chuyển là benzene: methanol 16: 1 (theo thể tích) Phát hiện capsaicinoid bằng cách ngâm bản sắc ký

phosphomolybdic acid 3%, sau đó, lấy bản mỏng ra và để khô tự nhiên Sau 12 giờ, thu kết quả sắc kí Vệt capsaicin sẽ hiện màu xanh dương với giá trị Rf = 0.16 [2]

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sự hình thành mô sẹo từ mẫu cấy

Sự tạo mô sẹo trong nuôi cấy in vitro phụ

thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu gen, loại mô, cơ quan, chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh và ngoại sinh bao gồm loại, nồng độ và tỉ

lệ auxin/ cytokinin … (Pierik, 1987) [5]

Bảng 1 Sự hình thành mô sẹo từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm ớt trên môi trường bổ sung kinetin 0,5

mg/l với 2,4-D nồng độ thay đổi sau 7 ngày nuôi cấy

2,4-D (mg/l) Kinetin (mg/l) Mẫu cấy Tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo (%)

Trang 25

Bảng 2 Sự hình thành mô sẹo từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm ớt trên môi trường bổ sung kinetin 0,5

mg/l với NAA nồng độ thay đổi sau 7 ngày nuôi cấy

Mô sẹo hình thành từ vết thương trên mẫu

cấy tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm ớt Mô sẹo

mới hình thành có dạng bở, màu trắng đục,

chuyển dần sang màu vàng trong theo sự kéo

dài thời gian nuôi cấy (Hình 1a, 1b và 1c) Môi

trường có nồng độ auxin cao kích thích sự hình

thành mô sẹo nhanh hơn trên môi trường có

nồng độ auxin thấp (Bảng 1 và 2) Sự khởi tạo

mô sẹo chậm hơn trên các môi trường có nồng

độ auxin thấp có thể do sự giảm hoạt tính

enzyme RNA polymerase liên quan đến quá trình phiên mã cần thiết cho hoạt động phân chia tế bào [7]

Sự ảnh hưởng của điều kiện sáng tối lên quá trình hình thành mô sẹo không rõ ràng Tuy nhiên, nhìn chung điều kiện tối thuận lợi cho việc hình thành mô sẹo từ mẫu cấy tử diệp, điều kiện sáng thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ trụ hạ diệp

Hình 1 Sự tăng trưởng của mô sẹo có nguồn gốc từ tử diệp trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 3,0 mg/l và

kinetin 0,5 mg/l trong điều kiện sáng (a) mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy, (b) mô sẹo sau 6 tuần nuôi cấy, (c) mô sẹo sau 9 tuần nuôi cấy

Mô sẹo trên môi trường chứa NAA và

kinetin có dạng chắc và có sự hình thành rễ bất

định Trong khi đó, mô sẹo trên môi trường

chứa 2,4-D tăng trưởng tốt mà không có sự

phát sinh hình thái Rễ bất định hình thành

nhiều hơn trên môi trường có nồng độ NAA

thấp (1,0 và 1,5 mg/l) Trên các môi trường có

nồng độ NAA cao hơn, sự tăng trưởng của mô

sẹo chiếm ưu thế Sự cảm ứng rễ cần một nồng

độ auxin cao nhưng để kéo dài phác thể rễ thì

nồng độ auxin thấp là cần thiết [1] Cũng trên

môi trường có NAA, sự tạo rễ bất định từ mô

sẹo xảy ra mạnh trong điều kiện tối Sự phát

sinh rễ bất định trong điều kiện chiếu sáng ít

hơn trong tối có thể do auxin nội sinh bị phân

hủy [3]

Các yếu tố ảnh hưởng lên sự tăng trưởng

của mô sẹo

Auxin

Mô sẹo từ tử diệp tăng trưởng tốt trên môi

trường có 2,4-D 3,0 mg/l nhưng mô sẹo từ trụ

hạ diệp tăng sinh mạnh nhất trên môi trường có

2,4-D 1,5 mg/l (Hình 2, 3) Nhu cầu về nồng độ

auxin cho sự phân chia của tế bào khác nhau

tùy theo kiểu di truyền hay mức độ nhạy cảm

của tế bào trong mô hay cơ quan nào đó [1]

Với mẫu cấy là trụ hạ diệp, môi trường có

kinetin 0,5 mg/l phối hợp với 2,4-D 1,5 mg/l

hay NAA 1,5 mg/l thích hợp cho sự gia tăng

trọng lượng tươi của mô sẹo (Hình 2, 4) Nồng

độ auxin thấp hơn hoặc cao hơn đều hạn chế sự

gia tăng sinh khối Taiz và Zeiger (2002) cho

rằng nồng độ auxin tối ưu sẽ hoạt hóa một số

enzyme, dẫn đến tăng hàm lượng DNA, RNA

và protein giúp cho sự phân chia của tế bào mô

sẹo Nồng độ auxin ngoại sinh thấp hơn nồng

độ tối ưu sẽ làm giảm IAA nội sinh cần thiết cho sự hoạt hóa các enzyme liên quan đến sự phiên mã RNA [7] Trong khi đó, nồng độ auxin cao quá sẽ cảm ứng sinh tổng hợp ethylene Sự tích lũy ethylene dù chỉ một lượng nhỏ trong bình nuôi cấy có thể ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều mẫu cấy thực vật [3]

Sự phối hợp giữa 2,4-D và kinetin kích thích

sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo tốt hơn môi trường có sự phối hợp giữa NAA và kinetin Mô sẹo trên môi trường có 2,4-D và kinetin có màu trắng, dạng bở và tăng sinh nhanh, thích hợp để làm nguyên liệu tạo dịch treo tế bào Kết quả này phù hợp với kết luận của Phillips và Hubstenberger (1985) khi các ông cho rằng 2,4-D là chất điều hòa sinh trưởng tốt nhất trong sự tạo sẹo từ cây ớt

Capsicum [4]

Ánh sáng

Ánh sáng làm chậm sự tăng trưởng của mô sẹo (Hình 2 -5) Nguyên nhân có thể là do sự phân hủy của auxin tự nhiên trong mẫu cấy Bên cạnh đó, ánh sáng có thể kích thích sản xuất các hợp chất phenol trong mô sẹo ở một

số loài thực vật Các hợp chất phenol này có thể liên kết với các enzyme liên quan đến sự tăng trưởng của tế bào và ngăn cản sự hoạt động của các enzyme này [1]

Trang 27

1.989

2.269 2.303

2.896 1.882.0171.827

1.832 1.61 1.752

2.202 2.589 2.628 2.856 2.973

3.676 3.23 3.993

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

Hình 2 Sự biến thiên trọng lượng tươi của mô sẹo từ trụ hạ

diệp trên môi trường có kinetin 0,5 mg/l và 2,4-D sau 6 tuần

nuôi cấy

Hình 3 Sự biến thiên trọng lượng tươi của mô sẹo từ tử

diệp trên môi trường có kinetin 0,5 mg/l và 2,4-D sau 6

tuần nuôi cấy

1.593 1.715 1.6981.896

1.4121.5951.314 1.534

0.776 1.316

0.652 0.767 0.754

1.357 0.952 1.631 1.209 1.234 0.8861.078

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

Hình 4 Sự biến thiên trọng lượng tươi của mô sẹo từ trụ hạ

diệp trên môi trường có kinetin 0,5 mg/l và NAA sau 6 tuần

nuôi cấy

Hình 5 Sự biến thiên trọng lượng tươi của mô sẹo từ tử

diệp trên môi trường có kinetin 0,5 mg/l và NAA sau 6

tuần nuôi cấy

Xác định sự hiện diện của capsaicinoid trong mô sẹo

Hình 6 Kết quả xác định sự hiện diện của capsaicinoid trong mô sẹo từ trụ hạ diệp trên môi trường bổ sung 2,4-D

và kinetin ở điều kiện sáng trên bản mỏng sắc kí

M1: dịch chiết ớt

M2, M3, M4, M5, M6: dịch chiết mô sẹo trên môi trường có 2,4-D (1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l) và kinetin 0,5 mg/l

Kết quả từ bản mỏng sắc kí cho thấy có sự

hiện diện của capsaicinoid trong mô sẹo qua sự

xuất hiện của các chấm màu xanh dương ở vị

trí Rf = 0.16 (Hình 6) Ngoài chấm màu xanh

dương ở vị trí Rf = 0.16, còn có sự xuất hiện

của các chấm khác ở các vị trí có giá trị Rf cao

hơn, được tạo ra do các hợp chất có tính khử

trong mẫu tác dụng với phosphomolybdic acid

Các vệt này xuất hiện ở cả mẫu dịch chiết ớt và

mẫu dịch chiết mô sẹo Điều này chứng tỏ mẫu

sẹo có thể chứa các hợp chất tương tự như

trong quả ớt

Các mẫu mô sẹo từ tử diệp và trụ hạ diệp

trên các môi trường và điều kiện nuôi cấy còn

lại đều thu được kết quả tương tự Như vậy,

qua kết quả thu được trên bản mỏng sắc ký, ban

đầu có thể nhận định sự hiện diện của nhóm

hợp chất capsaicinoid trong mô sẹo có nguồn

gốc từ tử diệp và trụ hạ diệp cây mầm ớt Tuy

nhiên, mẫu cấy, nồng độ chất điều hòa sinh

trưởng cũng như điều kiện nuôi cấy nào là tối

ưu cho tích lũy capsaicinoid vẫn chưa xác định được Vì vậy, việc định lượng capsaicinoid cần được tiến hành để xác định được nghiệm thức tối ưu cho sự tích lũy capsaicinoid trong mô sẹo làm nguồn nguyên liệu tạo dịch treo tế bào

D 3,0 mg/l, mô sẹo từ trụ hạ diệp tăng trưởng tốt nhất trên môi trường có kinetin 0,5 mg/l và 2,4-D 1,5 mg/l trong điều kiện tối Capsaicinoid có mặt trong mô sẹo ở tất cả các nghiệm thức thí nghiệm, được xác định bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

STUDYING ON CALLUS FORMATION FROM CHILLI PLANTLET CAPSICUM SP

AND CAPSAICINOID ACCUMULATION IN VITRO

Vo Thanh Phuc, Le Thi Thuy Tien

University of Technology, VNU-HCM

ABSTRACT: Callus was initiated from hypocotyls and cotyledons explants of chilli Capsicum

sp in vitro on MS medium with 0,5 mg/l kinetin and 2,4-D /NAA (1,0; 1,5; 2,0; 2,5 and 3,0 mg/l) Callus from cotyledon explants was induced in the dark better than in the light, whereas callus from hypocotyl explants was initiated in the light better than in the dark Callus was more friable and grew faster on medium with 2,4-D and kinetin MS medium with 3,0 mg/l 2,4-D and 0,5 mg/l kinetin was optimal for the growth of callus from cotyledon explants Besides, callus from hypocotyl explants grew best on MS

Trang 29

medium with 1,5 mg/l 2,4-D and 0,5 mg/l kinetin Capsaicinoid from callus which was determined by

thin layer chromatography was recognized in all treatment experiments

Key words: capsaicinoid, chilli plantlet, callus

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên

Công nghệ tế bào Nhà xuất bản đại học

quốc gia TP Hồ Chí Minh (2006)

[2] De, A.K Capsicum – Medicinal and

aromatic plants- Industrial Profiles

Taylor and Francis Group (2003)

[3] George, E.F et al Plant Propagation by

Tissue Culture Springer (2008)

[4] Phillips, G.C., Hubstenberger

Organogenesis in pepper tissue cultures

Plant Cell Tissue Organ Culture 4,

261-269 (1985)

[5] Pierik In vitro culture of higher plants Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht,

Boston, Lancaster (1987)

[6] Sadasivam, S et al Biochemical

Publishers (1996)

[7] Taiz, L., Zeiger, E Auxin: Plant

Physiology Sinaver Associates Inc Pub

(2002)

SÀNG LỌC VÀ THU NHẬN HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA TỪ

DỊCH CHIẾT CÂY DROSERA INDICA L NUÔI CẤY IN VITRO

Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Lê Phi Yến, Nguyễn Kim Phi Phụng,

Bùi Văn Lệ

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

(Bài nhận ngày 21 tháng 03 năm 2011, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 01 tháng 06 năm 2011)

TÓM TẮT: Dịch chiết các loài Drosera đã từng được chứng minh về khả năng kháng oxy hóa từ

rất nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như từ khả năng trị liệu trong những bài thuốc dân gian Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sàng lọc và ly trích thành công một hợp chất flavonoid từ phân đoạn cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa từ sinh khối cây Drosera indica L nuôi cấy in vitro Hợp chất được tinh sạch bằng các phương pháp sắc ký và xác định cấu trúc là quercetin bằng các kỹ thuật 1 H-, 13 C- NMR, DEPT và COSY, HSQC, HMBC Hàm lượng hoạt chất này trong cây cũng đã được xác định bằng

phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC

Từ khóa: Drosera indica L., hợp chất kháng oxy hóa, quercetin

GIỚI THIỆU

Trong cơ thể con người có rất nhiều loại gốc

tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là

superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid

peroxide và hydroxyl radical Theo các nhà

khoa học, gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra

tới trên 100 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh

xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer,

Parkinson, đục thủy tinh thể, tiểu đường, cao

huyết áp không nguyên nhân, xơ gan Mặc dù

đã có hệ thống kháng oxy hóa nội sinh giúp cơ

thể chống lại những tác nhân oxy hóa gây hại,

nhưng hệ thống này tỏ ra không hiệu quả, nhất

là khi con người ở giai đoạn cuối cuộc đời Do

đó, phương pháp hiệu quả nhất chính là bổ

sung các chất có hoạt tính kháng oxy hóa vào

cơ thể qua con đường tiêu hóa

Drosera là họ cây thuốc quý được nghiên

cứu nhiều trên thế giới về giá trị dược tính và

khả năng ứng dụng Từ xa xưa, Drosera đã

được dùng trong y học cổ truyền để chữa các bệnh: kháng lao, chống ung thư, chữa phong, chống hen suyễn, kháng viêm, kháng oxy hóa

Ở Việt Nam, hiện nay có 3 loài Drosera được tìm thấy: D.burmanni Vahl, D.peltata J.E.Sm

và D.indica L., nhưng vẫn chưa được quan tâm

đúng mức với số lượng nghiên cứu rất hạn chế

Trong khi, nhiều loài Drosera đã trở thành loài

có nguy cơ tuyệt chủng cao trên thế giới, trong

đó có cả 2 loài D.burmanni và D indica Vì lí

do đó, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm sàng lọc và thu nhận hợp chất có hoạt tính

kháng oxy hóa từ cây D.indica L in vitro với

mục đích góp phần làm sáng tỏ giá trị dược tính của loài này và khả năng thu nhận hợp chất

thứ cấp từ nguyên liệu nuôi cấy in vitro

Trang 31

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Điều chế và sàng lọc cao

Nguồn nguyên liệu là cây D indica L in

vitro do phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học

Thực vật - trường Đại học Khoa học Tự nhiên

cung cấp

Toàn cây tươi đem sấy khô ở 500C, xay

nhuyễn được bột cây khô Bột cây khô lần lượt

đem ngâm dầm trong các loại dung môi có độ

phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl

acetate, aceton, ethanol ở nhiệt độ phòng, sau ít

nhất 24 giờ đem lọc Dịch lọc tổng cộng sau

nhiều lần ngâm chiết (thu lấy đến khi dịch lọc

gần như trong suốt) được cô quay chân không

thu được các loại cao

Các loại cao được thử nghiệm hoạt tính

kháng oxy hóa bằng phương pháp dựa trên tính

khử của Yen và Duh (1993) Lặp lại 2 lần cho

mỗi nghiệm thức

Phương pháp của Yen và Duh (1993)

Hút 1ml chất thử nghiệm; 2,5ml dung dịch

đệm sodium phosphate 0,2M pH 6,6; 2,5ml

dung dịch potassium ferricyanide 1%; ổn định

ở 200C sau 20 phút; thêm 2,5ml acid

tricloroacetic 10%; ly tâm 2000 vòng/phút

trong 10 phút; thu dịch nổi; hút 1ml dịch nổi

qua ống nghiệm khác; thêm 2ml nước cất và

0,5ml dung dịch FeCl3 1%; lắc đều rồi để yên

sau 5 phút; đo ở bước sóng 700nm Giá trị hấp

thu càng cao thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa

càng mạnh

Trích ly và cô lập hợp chất kháng oxy hóa

Từ cao có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh

nhất, tiến hành cô lập hợp chất có hoạt tính

kháng oxy hóa bằng các phương pháp: sắc ký

cột silicagel với hệ dung môi giải ly là (chloroform: ethyl acetate), sắc ký gel sephadex với hệ dung môi (chloroform: methanol) cho đến khi sản phẩm thu được chỉ

có 1 vệt tròn rõ khi kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa sau khi cô lập

Hợp chất được thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa theo 2 phương pháp: Thiobarbituric acid (TBA) và Ferric thyocynate (FTC) Lập lại

2 lần cho mỗi thí nghiệm

Phương pháp Thiobarbituric acid (TBA)

Phương pháp này dựa theo phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid của Ottolenghi (1959) và nhóm tác giả Kikuzaki (1993), với cơ sở: trong suốt quá trình oxy hóa, peroxide được phân hủy dần thành các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp hơn Một trong những hợp chất như vậy là malonaldehyde, có thể được đo lường bằng phương pháp TBA vào ngày cuối của chu kỳ ủ (1 ngày sau khi mẫu đối chứng đạt cực đại) Malonaldehyde là sản phẩm chính khi lipid bị oxy hóa, nó phản ứng với TBA cho phức chất có màu đỏ, hấp thu cực đại ở 532nm

Do đó, phương pháp tiến hành như sau: hòa tan 4mg mẫu thử trong 4ml ethanol 96%, thêm 4,1ml acid linoleic + 8ml đệm phosphate 0,05M với pH7 + 3,9ml nước cất; đem hỗn hợp

ủ trong tối ở 400C Cho vào một ống nghiệm: 1ml hỗn hợp + 2ml TCA 20% + 2ml TBA 20%, đặt ống nghiệm trong bể nước sôi trong

10 phút, sau đó làm lạnh, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 20 phút, dịch nổi sau ly tâm

được đo độ hấp thu ở 532nm sau mỗi 24 giờ

Đo đến sau khi mẫu chứng âm đạt cực đại một

ngày

Phương pháp Ferric thyocynate (FTC)

Cũng là một trong những phương pháp phổ

biến được sử dụng để đo mức độ per-oxy hóa

trong suốt giai đoạn đầu tiên của sự oxy hóa

chất béo: hòa tan 4mg mẫu thử trong 4ml

ethanol 96%, thêm 4,1ml acid linoleic + 8ml

đệm phosphate 0,05M với pH7 + 3,9ml nước

cất; đem hỗn hợp ủ trong tối ở 400

C Cho vào một ống nghiệm: 0,1ml hỗn hợp + 9,7ml

ethanol 75% + 0,1ml FeCl2 0,02M; để yên ống

nghiệm trong 3 phút, đo độ hấp thu ở 500nm

sau mỗi 24 giờ Đo đến sau khi mẫu chứng âm

đạt cực đại một ngày

Chỉ tiêu đánh giá của 2 phương pháp

- Giá trị hấp thu càng thấp thể hiện hoạt tính

kháng oxy hóa càng mạnh

- Phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa: AI (%)

= 100 X (A0 – A)/ A0

Trong đó, A0 là độ hấp thu của phản ứng đối

chứng (phản ứng không chứa chất kiểm tra) và

A là độ hấp thu của mẫu cần kiểm tra hoạt tính

chống oxy hóa

Xác định cấu trúc và đo hàm lƣợng hợp chất đã cô lập

Dùng phối hợp các phương pháp hóa lý hiện đại: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều 1H-NMR, 13C-NMR; phổ 2 chiều 1H-1H COSY, HSQC, HMBC,và kỹ thuật DEPT (thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.500 tần số cộng hưởng 500 MHz cho 1H và

125 MHz cho 13C-NMR) Hàm lượng hợp chất

cô lập được có trong cao ban đầu được xác định bằng phương pháp qui về 100% diện tích trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với chất chuẩn là hợp chất cô lập từ cây đã xác định cấu trúc, với cột Hypersil 5 ODS, pha động là chloroform: methanol (9:1), tốc độ chảy 1 ml/phút, nhiệt độ phòng, detector phát hiện ở bước sóng 336nm, thể tích bơm là 25l

KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN Điều chế và sàng lọc cao có hoạt tính kháng oxy hóa

Sau khi hút ẩm và sấy khô các loại cao đến khối lượng không đổi, so sánh với khối lượng khô ban đầu và thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa, kết quả cho thấy cao chloroform là cao có năng suất thu được cao nhất đồng thời có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất

Bảng 1 Năng suất các loại cao thu được từ Drosera indica L với khối lượng khô ban đầu là 503,58 g

Dung môi Khối lƣợng cao (g) Thu suất cao so với khối lƣợng khô (%)

Trang 33

Hình 1 Biểu đồ thể hiện tính khử của các loại cao

ĐC: đối chứng, VitE: vitamin E, I1-I5: các loại cao D.indica L theo thứ tự: n-hexan, chloroform, ethyl acetate,

aceton, ethanol

Trích ly và cô lập hợp chất kháng oxy hóa

Cao chloroform được sắc ký cột silicagel với

hệ dung môi chloroform và ethyl acetate với độ

phân cực tăng dần: ethyl acetate có nồng độ từ

0% - 100% trong chloroform, sắc ký gel

sephadex LH-20 với hệ dung môi chloroform: methanol (1:1) Hợp chất sau khi kết tinh lại trong chloroform: ethyl acetate (3:7) là tinh thể hình kim dài màu vàng (Hình 2), có điểm nóng chảy 3160C

Hình 2 Tinh thể hình kim dài của hợp chất cô lập và vệt chất khi giải ly bằng hệ dung môi chloroform: aceton (1:1)

+ 7 giọt acid acetic

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp

chất sau khi cô lập

Hợp chất thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa

mạnh ở cả hai phương pháp FTC và TBA (hoạt

tính kháng oxy hóa cao hơn chất chuẩn vitamin E) (Hình 3 -5)

Hình 3 Đồ thị thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp FTC

Hình 4 Đồ thị thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp TBA

Hình 5 Biểu đồ thể hiện phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất

biết hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa cô lập được chính là 2-(3,4-dihydrophenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one (quercetin,

C15H10O7, M=302.226) (Hình 7)

Ngày Ngày

Trang 35

Hình 6 Kết quả chạy phổ HSQC, HMBC (CDCl3)

O

OH HO

O

OH

OH

1 2

3 4 5

6

7 8 9

10

1' 2' 3'

4' 5' 6'

13 C-NMR (CDCl 3 ) ( ppm)

HMBC ( 1 H 13 C)

Xác định hàm lượng

Cây tươi D.indica L in vitro được khảo sát

bằng HPLC, qua so sánh với mẫu chuẩn, cho

thấy sự hiện diện của quercetin với hàm lượng

là 0,058 mg/g (FW) trong cây D indica L in

vitro (mũi thứ 11, thời gian lưu là 6,622, chiếm

% diện tích là 5,42%)

KẾT LUẬN

Drosera indica L nuôi cấy in vitro có chứa 1

hợp chất có khả năng kháng oxy hóa mạnh được cô lập từ cao chloroform bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi chloroform: ethyl acetate (3:7) và sắc ký cột sephadex với hệ dung môi chloroform: methanol (1:1), hợp chất được xác định là quercetin Hợp chất này có

hàm lượng 0,058mg/g cây in vitro tươi khi xác

University of Science, VNU-HCM

ABTRACTS: Extracts from Drosera species have been published as therapeutics, especially as

antioxidants In this research, quercetin was screened and isolated for antioxidant properties from D indica L in vitro plantlets Its structure has been elucidated on the basic of its spectral data mainly, 1 H-,

quercetin

Key words: Drosera indica L., antioxydants, quercetin

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Budzianowski J, Skrypczak L,

Kukulczanka K (1993) Phenolic

compounds of Drosera intermedia and

Drosera spathulata from in vitro

cultures Acta Hortic 330 Pp 277-280

[2] Culham A, Gornall RJ (1994) The

naphthoquinones in the Droseraceae

Biochem System Ecol 22 Pp 507-515

[3] Crouch, Finnie JF & Staden VJ (1990) Studies on isolation of plumbagin from

in vitro and in vivo grown Drosera

species Plant Cell, Tissue and Organ

Culture Vol.21 Pp 79-82

[4] Dalva TF, César CA, Helha OS, Terezinha JF, Elisangela V, Kátia EC,

Trang 37

Juliana Feijó SD, Sílvio L, Dennis PS,

Raimundo BF (2004) Antimicrobial

Activity and Chemical Investigation of

Brazilian Drosera Mem Inst Oswado

Cruz, Rlo de Janeiro.Vol 99 No 7 Pp

753-755

[5] Grevenstuk T, Goncalves S, Almeida S,

Coelho N, Quintas C, Gaspar MN,

Romano A (2009), Evaluation of the

antioxidant and antimicrobial properties

of in vitro cultured Drosera intermedia

extracts, Nat Prod Commun Vol 4

Pp 1063-1068

[6] Houli LI, Guangxi Z, Weiwei Z, Yukun

M, Lingbing L (2006) Studies on the

preparation of quercetin solid lipid

nanoparticles and oral absorption in

mice, Nanoscience vol 11, pp 306-310

[7] Kolodziej H, Pertz HH, Humke A

(2002) Main constituents of a

commercial Drosera fluid extract and

their antagonist activity at muscarinic

M3 receptors in guinea-pig ileum, Die

[10] Mohd Z, Abdul-Hamid A, Osman A

(2002) Antioxidative activity of extracts from Mengkudu (Morinda citrifolia L.) root, fruit, leaf, Food Chemistry vol 78,

pp 227-231

[11] Zuofa Z, Jie jin, Liangen S (2008)

Antioxidant activities of the derivatives

of polysaccharide extracted from a

Chinese medical herb (Ramulus mori),

Food Sci Technol Res., vol 14, pp

160-168

SỰ RA HOA IN VITRO CỦA CÂY DỀN XANH (Amaranthus viridis L.) TRONG ĐIỀU

KIỆN KHÔ HẠN DO PEG

Huỳnh Thị Diễm Phúc, Trịnh Cẩm Tú, Phan Ngô Hoang

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

(Bài nhận ngày 21 tháng 03 năm 2011, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 01 tháng 06 năm 2011)

TÓM TẮT: Sự thiếu nước là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển ở

thực vật Sự khô hạn gây ra bởi PEG 6000 cản sự tăng trưởng của rễ chính và kích thích sự phát triển

rễ phụ IAA 2mg/l kích thích sự ra hoa sớm thông qua sự cản kéo dài rễ chính và kích thích sự phát triển các rễ phụ Hoạt tính IAA tăng cao trong khi hoạt tính ABA trong rễ giảm mạnh khi cây chuyển từ giai đoạn dinh dưỡng sang giai đoạn ra hoa Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong mối tương quan giữa phát triển rễ và ra hoa được thảo luận

Từ khóa: Amaranthus viridis, Polyethylene Glycol, phát triển rễ, sự khô hạn, sự ra hoa

MỞ ĐẦU

Thực vật có nhiều kiểu đáp ứng khác nhau

trước những điều kiện khô hạn để duy trì các

hoạt động sinh lý cần thiết như: tránh hạn (rễ

ăn sâu, đóng khí khẩu), chịu hạn (sản xuất

những tác nhân làm dịu stress), thoát hạn (hoàn

tất chu trình sống trong thời gian ngắn, trước

khi chết vì hạn) (Bùi Trang Việt 2002, Xiong

và cộng sự 2006) Dền xanh là loài thực vật có

khả năng chịu hạn tốt từng được sử dụng trong

các nghiên cứu đáp ứng với sự khô hạn (Liu và

Stützel 2004) Trong bài báo này, sự phát triển

của bộ rễ và sự ra hoa của cây Dền xanh đáp

ứng với sự khô hạn nhân tạo do PEG 6000

trong điều kiện in vitro được theo dõi Phân

tích sự biến đổi mô phân sinh, mối tương quan

giữa phát triển rễ và ra hoa cũng như vai trò

của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã

được nghiên cứu

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Cây Dền xanh (Amaranthus viridis L.) hai

ngày tuổi (rễ chính dài khoảng 4,2 ± 0,5mm với hai tử diệp ) được nảy mầm trong điều kiện

in vitro từ hạt trên môi trường MS½

(Murashige và Skoog 1962, khoáng đa lượng giảm 50%)

Phương pháp

Khảo sát sự phát triển hoa của cây Dền xanh (Amaranthus viridis L.)

Các cây Dền xanh in vitro hai ngày tuổi trên

môi trường MS½ được chuyển vào các ống nghiệm có chứa 12ml môi trường MS½ có hoă ̣c không có bổ sung IAA với nồng độ thay đổi từ 0,5 đến 2 mg/l Sự phát triển hoa (tỉ lệ ra hoa, thời điểm xuất hiện hoa) được theo dõi theo thời gian

Khảo sát sự phát triển rễ và ra hoa của cây Dền xanh trong điều kiện khô hạn được tạo bởi PEG

Trang 39

Các cây Dền xanh in vitro hai ngày tuổi được

đặt cấy trên môi trường MS½ có hay không có

bổ sung PEG 6000 (Polyethylene Glycol ) với

nồng độ thay đổi từ 0,5 đến 5% Sự phát triển

của bộ rễ (số lượng rễ, chiều dài rễ chính, trọng

lượng tươi của bộ rễ) và sự phát triển hoa (tỉ lệ

ra hoa, thời điểm xuất hiện hoa ) được theo dõi

theo thời gian Tất cả các mẫu cấy đươ ̣c đă ̣t

trong điều kiện ánh sáng 3.000 ± 500lux

(12/12), nhiệt độ 28 ± 20C và ẩm độ 80 ± 5%

Biến đổi hình thái và giải phẫu học

Hình thái phát triển của bộ rễ cây Dền xanh

in vitro tăng trưở ng trong điều kiê ̣n khô ha ̣n

đươ ̣c theo dõi và chụp hình qua kính hiển vi soi

nổi Sự biến đổi của mô phân sinh ng ọn chồi

trong quá trình ra hoa của cây Dền xanh in

vitro được quan sát bằng cách thực hiê ̣n các lát

cắt do ̣c qua mô phân sinh ngo ̣n chồi , nhuộm

hai màu (đỏ carmin-xanh iod) và quan sát dư ới

kính hiển vi quang học

Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng

thực vật

Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng th ực

vâ ̣t nội sinh của bô ̣ rễ cây Dền xanh in vitro ở

giai đoa ̣n trước và sau giai đoạn ra hoa được

xác định bằng sinh trắc nghiệm sau sự ly trích

và cô lập trên sắc kí bản mỏng Silicagel F254,

với dung môi di chuyển là chloroform:

metanol: acetic acid (80: 15: 5), nhiệt độ 32oC

Xử lý số liệu

Các số liệu ghi nhận được xử lý thống kê

bằng phần mềm Statistical Program Scientific

System (SPSS) phiên bản 11.5

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Sƣ̣ biến đổi của mô phân sinh và sự ra hoa

của cây Dền xanh trong điều kiện in vitro

Trong sự phát triển hoa của cây Dền xanh ,

mô phân sinh ngo ̣n dinh dưỡng với da ̣ng đỉnh nhọn đặc trưng sẽ tăng mạnh kích thước bề

rô ̣ng để trở thành mô phân sinh hoa tự với da ̣ng đỉnh bằng phẳng (Hình 1.1; 1.2), thời điểm này kích thước bề rộng của mô phân sinh hoa tự có thể đa ̣t đến 450 ± 40m Trong khi đó , ở trạng thái dinh dưỡng , kích thước bề rộng của mô phân sinh ngo ̣n chỉ khoảng 200 ± 30m Cùng với mô phân sinh ngo ̣n , các mô phân sinh dinh dưỡng ở vị trí nách lá ngay bên dưới cũng xảy

ra sự biến đổi tương tự để trở thành các mô phân sinh hoa tự ở nách lá

Khi mới hình thành, mô phân sinh hoa tự ở đỉnh ngọn hoạt động tạo ra các mô phân sinh hoa tự thứ cấp ở vùng ngoại vi trong khi các

mô phân sinh hoa tự ở vị trí nách lá hoạt động tạo các mô phân sinh hoa (Hình 1.3, 1.4, 1.5)

Mô phân sinh hoa tự ở đỉnh ngọn sau khi tạo một số mô phân sinh hoa tự thứ cấp sẽ tiếp tục tạo các mô phân sinh hoa bên dưới và sau cùng

sẽ trở thành mô phân sinh hoa ở đỉnh ngọn Dường như hoạt động của mô phân sinh hoa tự

ở vị trí nách lá gần giống hoạt động của mô phân sinh hoa tự thứ cấp dẫn xuất từ mô phân sinh hoa tự ở đỉnh ngọn Các mô phân sinh hoa khi được tạo ra sẽ tiếp tục phân hóa tạo các cơ quan hoa để hình thành một nụ hoa hoàn chỉnh (Hình 1.6; 1.7)

Như vậy, khác với Dendrobium, mô phân

sinh hoa tự luôn duy trì một vùng tế bào gốc đảm bảo cho sự kéo dài và tạo nụ hoa cho phát

hoa (Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang Việt 2006) thì

ở Dền xanh, mô phân sinh hoa tự trở thành mô

phân sinh hoa trên cùng tương tự như cách phát

triển của hoa Tím Phi (Nguyễn Thị Luyến và

cô ̣ng sự 2008)

IAA kích thích sự ra hoa sớm cũng như gia

tăng tỷ lệ ra hoa cây Dền xanh Môi trường

MS½ bổ sung IAA với các nồng độ từ 0,5 đến

2mg/l đều tạo được hoa sớm hơn so với các cây

trên môi trường đối chứng MS½ Hơn nữa, sự

gia tăng nồng độ IAA từ 0,5 đến 2mg/l dẫn đến

sự gia tăng tỉ lệ ra hoa, đặc biệt là tỉ lệ này đạt

tỉ lệ 100% ở ngày thứ 67 trên môi trường có bổ

sung IAA 2mg/l (Bảng 1) Sự hiện diện của nụ

hoa đầu tiên được ghi nhận dưới kính hiển vi

soi nổi ở cây Dền xanh 55 ngày tuổi tăng

trưởng trên các môi trường MS½ có bổ sung

IAA trong khi ở cây Dền xanh tăng trưởng trên

môi trường MS½ là 94 ngày tuổi Ở thời điểm

này, các nụ hoa đã có lá đài màu xanh bao

ngoài cánh hoa, nhị và nhụy (Hình 8.1)

Ảnh hưởng của sự khô hạn lên sự phát

triển rễ và ra hoa cây Dền xanh in vitro

Phân tử PEG trơ, có cấu trúc chuỗi không

thấm nước, không bị hấp thu bởi thực vật,

thường được sử dụng như một tác nhân gây ra

sự khô hạn trong các nghiên cứu in vitro ở một

số cây họ đậu, Nho, Cà chua, Dền (Berg và

cộng sự 2006) Ở cây Dền xanh, sự hiện diện

của PEG trong môi trường nuôi cấy cản mạnh

sự kéo dài của rễ chính đồng thời kích thích sự

tạo mới rễ phụ và gia tăng trọng lượng tươi bộ

rễ Các biểu hiện thay đổi này của bộ rễ được

ghi nhận rõ nhất ở cây Dền xanh tăng trưởng

trên môi trường MS½ có PEG 1% trong giai

đoạn từ 24 đến 38 ngày tuổi (bảng 3 và 4) Đặc biệt, hoa chỉ xuất hiện trên môi trường MS½ có

bổ sung PEG 1% với tỷ lệ 33% ở 55 ngày tuổi

(Bảng 2) Như vậy, khác với Arabidopsis

thaliana, sự cản phát triển của rễ chính kích

thích sự ra hoa sớm (Trần Nguyễn Ngọc Sa, 2009), ở Dền xanh sự tăng số rễ phụ và trọng lượng tươi cả hệ rễ đã rút ngắn thời gian ra hoa

trong điều kiện khô hạn được tạo bởi PEG

Sự thay đổi hoa ̣t tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vâ ̣t

Hoạt tính IAA trong rễ tăng mạnh khi các cây chuyển từ giai đoạn dinh dưỡng (38 ngày tuổi) sang ra hoa (55 ngày tuổi) ở môi trường

có bổ sung IAA 2mg/l hoặc thấp hơn khi được

bổ sung PEG 1% và không đổi ở môi trường không có sự tạo hoa (Bảng 5) Sự gia tăng hoạt tính của IAA nội sinh là cần thiết cho quá trình

ra hoa ở cây Dền xanh in vitro Mặt khác, IAA

được biết đến như một tác nhân gây kích thích tạo sơ khởi rễ nhưng cản tăng trưởng các sơ khởi này (Bùi Trang Việt, 2000) Có lẽ trong trường hợp này, IAA kích thích sự ra hoa sớm thông qua tác động cản sự tăng trưởng dài của

rễ chính và kích thích sự tạo nhiều rễ phụ Ngươ ̣c với IAA , hoạt tính ABA giảm trước và sau sự ra hoa ta ̣o điều kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i cho sự hình thành cơ quan hoa Sự khô hạn do PEG 1% làm gia tăng hoạt tính ABA trong rễ cây Dền xanh ở thời điểm trước và sau khi ra hoa đã ké o theo sự giảm tỷ lê ̣ ra hoa của các cây tăng trưởng trên môi trường này Theo Sharp

và cộng sự (2009), chính sự gia tăng ABA từ rễ dưới điều kiê ̣n khô ha ̣n cản sự cảm ứng của mô phân sinh trong quá trình ra hoa ở cây

Trang 41

đóng vai trò cản sự phát triển hoa và chính điều

này đã làm giảm tỷ lệ ra hoa của các cây Dền

xanh tăng trưởng trong điều kiện khô hạn so

với các cây Dền xanh tăng trưởng trên môi

trường có bổ sung IAA 2mg/l

Tóm lại, điều kiện hạn đã thúc đẩy Dền xanh

rút ngắn chu trình phát triển với những biểu

hiện ở rễ như rễ phụ mới hình thành nhiều

nhưng bị cản kéo dài, trọng lượng gia tăng

mạnh sau khi rễ chính bị cản, từ đó thúc đẩy

hình thành hoa sớm Hoạt tính IAA cao dường

như thích hợp cho giai đoạn ra hoa và ABA

được sản xuất nhiều trong điều kiện khô hạn

góp phần cản sự phát triển hoa ở cây Dền xanh

KẾT LUẬN

Trong sự phát triển hoa cây Dền xanh, mô phân sinh hoa tự ở đỉnh ngọn hoạt động tạo mô phân sinh hoa thứ cấp và mô phân sinh hoa

Mô phân sinh hoa tự ở vị trí nách lá chỉ có thể tạo mô phân sinh hoa

Sự khô hạn gây ra bởi PEG 6000 ở nồng

độ 1% hoặc sự bổ sung IAA vào môi trường nuôi cấy kích thích sự ra hoa sớm cũng như gia tăng tỷ lệ ra hoa ở cây Dền xanh tăng trưởng

trong điều kiện in vitro

Trên môi trường có sự ra hoa sớm và mạnh (MS½ với IAA 2mg/l), hoạt tính IAA trong rễ tăng và hoạt tính ABA giảm khi cây chuyển từ

giai đoạn dinh dưỡng sang ra hoa

IN VITRO FLOWERING OF AMARANTHUS VIRIDIS L IN PEG-INDUCED

DROUGHT CONDITION

Huynh Thi Diem Phuc, Trinh Cam Tu, Phan Ngo Hoang

University of Science, VNU-HCM

ABSTRACT: Water deficit is one of the most important factors affecting plant physiology and

development Drought induced by PEG6000 inhibited main root and stimulated lateral root development 2mg/l IAA supplemented in MS½ media causes early flowering by suppressing main root elongation and stimulating lateral root development The increasing of IAA and decreasing of ABA in root are necessary in Amaranthus viridis flowering Roles of plant growth regulators on the relationship between root development and flowering were discussed

Key words: Amaranthus viridis, drought, flowering, Polyethylene Glycol, root development

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Berg L and Zeng Y.J., Response of

South African indigenous grass species

to drought stress induced by PEG 6000

South African Journal of Botany (72):

284-286 (2006)

[2] Bùi Trang Việt, Sinh lý thực vật – Phát

triển Nxb Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí

Minh, 333 tr (2000)

[3] Liu F and Stützel H., Biomass

partitioning, specific leaf area, and water

use efficiency of vegetable amaranth

(Amaranthus spp.) in response to

drought stress Scientia Horticulturae

(102): 15-27, (2004)

[4] Murashige T., and Skoog F., A revised

medium for rapid growth and bioassays

with tobacco tissue cultures Physiol

Plant 15: 473- 497 (1962)

[5] Nguyễn Thị Kim Luyến, Nguyễn Thị

Hồng Anh, Trịnh Cẩm Tú, Bùi Trang

Việt, Bùi Văn Lệ, Sự nuôi cấy mô phân

sinh ngọn và nụ hoa Tím phi

(Saintpaulia ionantha Wendl) Tạp chí

Phát triển Khoa học và Công nghệ ĐH

Quốc gia TP Hồ Chí Minh Vol 11 (7):

25-30 (2008)

[6] Sharp R.G., Else M.A., Cameron R.W and Davies W.J., Water deficits promote flowering in Rhododendron via regulation of pre and post initiation development Scientia Horticulturae

(120): 511-517 (2009)

[7] Trần Nguyễn Ngọc Sa, Ảnh hưởng của

sự tăng trưởng rễ lên sự ra hoa ở

(ecotype Columbia) Khóa luận cử nhân

Sinh học, 61 trang (2009)

[8] Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang Việt , Sử

dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nghiên cứu sự phát triển phát hoa Dendrobium

sonia Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh Vol 9 (9): 83-88 (2006)

[9] Xiong L., Wang R.G., Mao G., and Koczan J.M., Identification of drough tolerance determinants by genetic analysis of root response to drought stress and abscisic acid Plant Physiology (142): 1065-1074 (2006)

Trang 43

Hình 1.1 Mô phân sinh dinh dưỡng ở đỉnh ngo ̣n cây Dền xanh 52 ngày tuổi trên môi trường MS½ với đỉnh nho ̣n

và hai phác thể lá

Hình 1.2 Mô phân sinh hoa tự ở đỉnh ngo ̣n cây Dền xanh 52 ngày tuổi trên môi trường MS½ có IAA 2mg/l

Hình 1.3 Mô phân sinh hoa tự ở đỉnh ngo ̣n cây Dền xanh với mô phân sinh hoa tự thứ cấ p đươ ̣c ta ̣o ra từ vùng ngoại vi

Hình 1.4 Mô phân sinh hoa tự ở vi ̣ trí nách lá (cấu trúc đỉnh nho ̣n gần giống mô phân sinh dinh dưỡng)

Hình 1.5 Mô phân sinh hoa tự ở vi ̣ trí nách lá với mô phân sinh hoa được ta ̣o ra từ vùng ngoa ̣i vi

Hình 1.6 Mô phân sinh hoa tự ở vi ̣ trí nách lá với mô ̣t nu ̣ hoa phát triển từ mô phân sinh hoa

Hình 1.7 Mô phân sinh hoa tự (a) và nụ hoa đang kéo dài cuống (b)

Hình 1.8 Các nụ hoa cây Dền xanh 55 ngày tuổi trên môi trường MS½ có bổ sung PEG 1%

Bảng 1 Tỷ lệ ra hoa cây Dền xanh tăng trưởng

trên môi trường MS½ có bổ sung IAA

Bảng 2 Tỷ lệ ra hoa cây Dền xanh tăng trưởng trên

môi trường MS½ có bổ sung PEG

Các mẫu tự kèm theo sau số trung bình và sai số chuẩn biểu hiện sự khác biệt theo dòng ở mức p = 0,05 Các chữ số kèm theo sau số trung bình và sai số chuẩn biểu hiện sự khác biệt theo cột ở mức p = 0,05

Bảng 4 Sự thay đổi tổng số rễ phụ cây Dền xanh trên môi trường MS½ có bổ sung PEG

Đối chứng 6,0±1,0 a,1 5,7±0,3a,1 7,0±1,5a,1 7,3±0,3a,1,2 14,0±0,6b,1,2

PEG 1% 8,7±1,2a,1 9,3±0,3a,1,2 10,3±0,9a,1,2 13,7±2,3a,2,3 32,0±2,5b,3PEG 2,5% 11,0±1,5a,1,2 16,0±2,5ab,3 14,7±2,0ab,2 15,0±2,5ab,3 17,3±1,2b,2 PEG 5% 14,0±1,5a,2 12,8±1,8a,2,3 12,0±1,5a,2 15,0±2,9a,3 17,7±1,2a,2