Giá trị của thử nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 và các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyết học và sinh hóa trong chẩn đoán và tiên lượng sớm sốt xuất huyết dengue nặng ở trẻ em

HUỲNH CÔNG THANHGIÁ TRỊ CỦA THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1 VÀ CÁC YẾU TỐ DỊCH TỄ, LÂM SÀNG, HUYẾT HỌC VÀ SINH HÓA TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG SỚM SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE NẶNG Ở TR

HUỲNH CÔNG THANH

GIÁ TRỊ CỦA THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1 VÀ CÁC YẾU TỐ DỊCH TỄ, LÂM SÀNG, HUYẾT HỌC

VÀ SINH HÓA TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG SỚM

SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE NẶNG Ở TRẺ EM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019

HUỲNH CÔNG THANH

GIÁ TRỊ CỦA THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1 VÀ CÁC YẾU TỐ DỊCH TỄ, LÂM SÀNG, HUYẾT HỌC

VÀ SINH HÓA TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG SỚM

SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE NẶNG Ở TRẺ EM

TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019

Tôi xin cam đoan đây là một phần trong công trình nghiên cứu đatrung tâm của tập thể Những số liệu, kết quả nêu trong luận án là trungthực và đã được sự đồng thuận của những người tham gia nghiên cứu để

sử dụng trong luận án

Tác giả

BS Huỳnh Công Thanh

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các biểu đồ

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Lịch sử của vấn đề nghiên cứu 5

1.2 Xét nghiệm chẩn đoán SXHD 8

1.3 Tiên lượng sớm SXHD nặng 22

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 29

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.3 Các sai lệch và biện pháp khắc phục 54

2.4 Vấn đề y đức trong nghiên cứu 55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

3.1 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trong 72 giờ đầu của mẫu nghiên cứu 56

3.2 Giá trị của xét nghiệm nhanh phát hiện NS1 virút dengue trong chẩn đoán SXHD ở dân số nghiên cứu 65

3.4 Mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ, lâm sàng và cận lâm sàng trong 72

giờ đầu với SXHD nặng 73

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 77

4.1 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trong 72 giờ đầu của mẫu nghiên cứu 77

4.2 Giá trị của xét nghiệm nhanh phát hiện NS1 virút dengue trong chẩn đoán SXHD ở dân số nghiên cứu 84

4.3 Mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyết học và sinh hóa trong 72 giờ đầu với SXHD, mô hình chẩn đoán sớm SXHD 88

4.4 Mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ, lâm sàng và cận lâm sàng trong 72 giờ đầu với SXHD nặng 95

4.5 Hạn chế của đề tài 102

KẾT LUẬN 103

KIẾN NGHỊ 105

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục 1: Phiếu thu thập số liệu

Phụ lục 2: Phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu

Phụ lục 3: Danh sách bệnh nhân trong nghiên cứu

Phụ lục 4: Phiếu chấp thuận của Hội đồng Y đức

Phụ lục 5: Phiếu cho phép sử dụng số liệu nghiên cứu

Dengue virusDấu hiệu cảnh báoEnzyme-Linked ImmunoSorbent AssayXét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn menHematocrit

Interferon gammaInterleukin

Nonstructure 1Phi cấu trúc 1Reverse Transcription Plymerase Chain ReactionPhản ứng khuếch đại gien phiên mã ngược

Sốt do nguyên nhân khácSốt xuất huyết Dengue

Tổ chức Y tế Thế giới

- TNF-αTumor necrosis factor α

Yếu tố hoại tử mô α

Bảng 1.1 Chẩn đoán xác định và có thể nhiễm dengue, phân tích kết quả

và đặc tính mẫu thử 14Bảng 1.2 Bảng phân loại và định nghĩa trường hợp SXHD theo

TCYTTG 2009 có điều chỉnh 23

Bảng 2.1.Định nghĩa, phân loạivà giátrịcácbiến sốtrong nghiêncứu 39Bảng 2.2 Lịch thu nhận máu và lượng máu lấy 46Bảng 2.3 Ngưỡng phát hiện của xét nghiệm one-step real-time multiplex

RT-PCR 49Bảng 3.1 Đặc điểm của dân số nghiên cứu 57Bảng 3.2 Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng trong 72 giờ đầu của những

trường hợp SXHD 60Bảng 3.3 Đặc điểm cận lâm sàng trong 72 giờ đầu của những trường

hợp SXHD 61Bảng 3.4 Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng trong 72 giờ đầu của những

trường hợp SXHD nặng 64Bảng 3.5 Đặc điểm cận lâm sàng trong 72 giờ đầu của những trường

hợp SXHD nặng 65Bảng 3.6 Bảng kết quả NS1 Ag Strip 66Bảng 3.7 Giá trị của thử nghiệm NS1 Ag Strip 66Bảng 3.8 Kết quả phân tích mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ và lâm

sàng trong 72 giờ đầu với SXHD 70Bảng 3.9 Kết quả phân tích mối liên quan giữa các yếu tố cận lâm sàng

trong 72 giờ đầu với SXHD 71

Bảng 3.11 Kết quả phân tích mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ và

lâm sàng trong 72 giờ đầu với SXHD nặng 74Bảng 3.12 Kết quả phân tích mối liên quan giữa các yếu tố cận lâm sàng

trong 72 giờ đầu với SXHD nặng 75Bảng 4.1 So sánh giá trị thử nghiệm nhanh NS1 Strip ở các nơi và so

với các xét nghiệm NS1 ELISA và xét nghiệm nhanh khác 85

Hình 1.1 Cấu trúc của DENV 9

Hình 1.2 Thời điểm phát hiện DENV và các kháng thể IgM, IgG 10

Hình 1.3 Mô hình đáp ứng kháng thể trong sơ nhiễm và tái nhiễm dengue 11

Hình 1.4 Biểu đồ thời gian của sơ nhiễm và tái nhiễm dengue cùng các phương pháp có thể sử dụng để phát hiện nhiễm virút 13

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gien của DENV 18

Hình 1.6 Phân loại trường hợp SXHD theo TCYTTG 2009 có chỉnh sửa 22

Hình 2.1 Các bước thực hiện xét nghiệm NS1 Ag Strip 52

Hình 2.2 Phân tích kết quả xét nghiệm Dengue NS1 Ag Strip 53

Hình 3.1 Sơ đồ phân loại bệnh của những trẻ tham gia nghiên cứu 56

Hình 3.2 Phân bố các phương pháp xác định chẩn đoán trong những trường hợp SXHD 58

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 45

Biểu đồ 3.1 Tần sốvà tỉlệ SXHD của mẫu nghiên cứu 57

Biểu đồ 3.2 Tần số trường hợp SXHD qua các năm 58

Biểu đồ 3.3 Phân loại SXHD trong nghiên cứu 59

Biểu đồ 3.4 Tần số và tỉ lệ nhập viện của SXHD trong nghiên cứu 59

Biểu đồ 3.5 Phân bố týp huyết thanh DENV theo năm 62

Biểu đồ 3.6 Biểu đồ Venn các biến chứng nặng SXHD 63

Biểu đồ 3.7 Tỉ lệ NS1 dương tính theo nhóm tuổi 67

Biểu đồ 3.8 Tỉ lệ NS1 dương tính theo ngày bệnh 67

Biểu đồ 3.9 Tỉ lệ NS1 dương tính theo týp huyết thanh 68

Biểu đồ 3.10 Tỉ lệ NS1 dương tính theo đáp ứng miễn dịch 68

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt xuất huyết dengue (SXHD) là bệnh nhiễm siêu vi do muỗi lây truyền

có tốc độ lan nhanh nhất trên thế giới Trong hơn 50 năm qua, tần suất mớimắc tăng lên gấp 30 lần với sự mở rộng vùng địa lý sang những quốc gia mới,

từ thành thị đến nông thôn Ở những vùng có dịch, SXHD là một trong nhữngnguyên nhân hàng đầu gây nhập viện và tử vong ở trẻ em Ước tính trên toànthế giới, có trên 3 tỉ người sống trong vùng dịch tễ dengue trên hơn 100 quốcgia, hằng năm có khoảng 100 triệu trường hợp bệnh có biểu hiện lâm sàng,khoảng 2% đến 5% trong số đó là nặng [124]

SXHD là một bệnh hệ thống và “động”, với diễn tiến bệnh và kết cuộckhó đoán trước Biểu hiện có thể từ không triệu chứng đến sốc, xuất huyếtnặng có thể gây tử vong Hầu hết các trường hợp bệnh tự giới hạn và hồiphục, tuy nhiên có tỉ lệ nhỏ các trường hợp bệnh diễn tiến nặng, đa số đặctrưng bởi thất thoát huyết tương có thể kèm theo xuất huyết

Ở hầu hết các quốc gia đang phát triển có những bệnh dịch gây sốt nhưsởi, sốt thương hàn, leptospirosis hay các dịch bệnh do vi rút đường hô hấpkhác Trong vài ngày đầu của sốt, các bệnh này có thể giống nhau về biểuhiện lâm sàng như đau đầu, đau cơ và phát ban gây khó khăn cho công việcchẩn đoán của các bác sĩ tuyến cơ sở Các dấu hiệu của SXHD như xuất huyếthay thất thoát huyết tương thường thấy sau giai đoạn sốt cấp thoái lui, điểnhình là sau ngày 3 hay 4 của sốt Và những dấu hiệu cảnh báo (DHCB) cũngnhư dấu hiệu nặng của bệnh cũng xuất hiện trong giai đoạn này Một số bệnhnhân sốt nghi ngờ SXHD, kể cả các bệnh sốt khác bị nhập viện theo dõikhông cần thiết vì lý do không muốn bỏ sót các trường hợp SXHD diễn tiếnnặng Việc nhập viện những bệnh nhân nghi ngờ SXHD không cần thiết nàycho thấy đã gây nên gánh nặng tài chính đáng kể ở các quốc gia đang pháttriển [40],[121] Lý tưởng là chỉ những bệnh nhân SXHD cảnh báo hoặc nặng

mới nên nhập viện Phân biệt sớm SXHD trong 72 giờ đầu với các bệnh sốtkhác giúp các nhà lâm sàng nhận diện được những bệnh nhân cần theo dõi sáthơn những DHCB hoặc dấu hiệu nặng của bệnh SXHD, hạn chế sử dụngkháng sinh không cần thiết Chẩn đoán sớm những trường hợp chỉ điểm cũng

có thể giúp các hành động kiểm soát vec-tơ sớm trong cộng đồng được dễdàng và hạn chế lây truyền bệnh thêm Tuy nhiên, việc xác định chẩn đoánSXHD bằng xét nghiệm huyết thanh học chỉ thực hiện sau ngày 5 và bằngchứng của thất thoát huyết tương khó đo lường Ngoài ra những xét nghiệmđắt tiền như PCR không sẵn có tại y tế tuyến cơ sở của những quốc gia nghèo.Trong thời gian gần đây, một trong những công cụ giúp chẩn đoán sớm SXHDngay từ ngày sốt đầu tiên được sử dụng ngày càng nhiều là xét nghiệm pháthiện kháng nguyên NS1 của vi rút dengue (DENV) Tuy nhiên, giá trị chẩnđoán của xét nghiệm này thay đổi qua nhiều nghiên cứu thực hiện tại nhiềunơi [49],[104],[114], chúng tôi muốn đánh giá lại giá trị của xét nghiệm nhanhNS1 trên dân số trẻ em Tiền Giang

Đối với dân số không tiếp cận được với xét nghiệm nhanh NS1 cũng nhưnhững phương tiện xét nghiệm đắt tiền khác cần có những chỉ tố lâm sàngvà/hoặc cận lâm sàng đơn giản và sớm nhằm đưa ra một chẩn đoán đáng tincậy cho những trường hợp SXHD ưu tiên nhập viện Trong khi chờ đợi mộtxét nghiệm chẩn đoán SXHD sớm nhanh, nhạy và giá thành rẻ được phổ biếnrộng rãi thì rất cần các mô hình chẩn đoán sớm

Song song đó, SXHD là một bệnh biểu hiện lâm sàng phức tạp, có thểdiễn tiến nặng dẫn đến tử vong Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) năm 2009

đã đưa ra các dấu hiện cảnh báo các trường hợp có thể diễn tiến nặng, tuynhiên những dấu hiệu và triệu chứng này thường xuất hiện sau 72 giờ Do đó,việc nhận diện nhóm bệnh nhân nguy cơ bị SXHD nặng trong giai đoạn sớmtrước 72 giờ sẽ giúp các bác sĩ cho nhập viện và theo dõi sát phát hiện sớmbiến chứng nặng để điều trị kịp thời Ngoài ra, nó sẽ gợi ý cho việc nhắm đến

những chiến lược tiêm ngừa và những thử nghiệm lâm sàng can thiệp điều trịtrong tương lai.

Vì những lý do trên, chúng tôi đặt ra câu hỏi nghiên cứu giá trị của thửnghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 trong chẩn đoán sớm SXHD tại TiềnGiang là như thế nào và vai trò của các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyết học vàsinh hóa trong chẩn đoán sớm SXHD từ đó xây dựng mô hình chẩn đoán sớmSXHD cũng như vai trò của các yếu tố này trong tiên lượng sớm SXHD nặng

ở trẻ em ra sao? Từ đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Giá trị của thử

nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 và các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyếthọc và sinh hóa trong chẩn đoán và tiên lượng sớm SXHD nặng ở trẻ em”.Nghiên cứu này là một nhánh của nghiên cứu đa trung tâm của Đơn vị nghiêncứu lâm sàng Đại học Oxford- Việt Nam (OUCRU-VN) hợp tác thực hiện tại

5 tỉnh thành phía Nam, trong đó có Tiền Giang

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Mô tả đặc điểm lâm sàng, huyết học và sinh hóa trong 72 giờ đầu củaSXHD

2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiênđoán âm của thử nghiệm phát hiện nhanh NS1 vi rút dengue (Dengue NS1AgStrip) trong chẩn đoán SXHD trong 72 giờ đầu

3 Xác định mối liên quan giữa các yếu tố dịch tễ, lâm sàng, huyết học vàsinh hóa trong 72 giờ đầu với SXHD và xây dựng mô hình chẩn đoán sớmSXHD trong 72 giờ đầu

4 Xác định các yếu tố tiên lượng sớm trong 72 giờ đầu SXHD nặng

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1.1 Trên thế giới

Bản ghi chép cổ xưa nhất đến nay về căn bệnh có lâm sàng tương đồngvới sốt dengue được tìm thấy trong bộ sách bách khoa về triệu chứng bệnh vàđiều trị bằng tiếng Trung Hoa phát hành lần đầu trong khoảng thời nhà Tần(năm 265- 420), sau đó được biên tập chính thức vào năm 610 (thời nhàĐường) và một lần nữa vào năm 992 thời Bắc Tống [160]

Bệnh giống SXHD cũng được mô tả trong những bản viết tại Tây Ấn vàonhững năm 1600 mà không có những hình ảnh lâm sàng chi tiết [60] Bản mô

tả đầu tiên về hội chứng lâm sàng đặc trưng của SXHD được Benjamin Rush,người đã chăm sóc cho những bệnh nhân trong suốt trận dịch năm 1780 tạiPhiladelphia viết [176]

Tên gọi “sốt gãy xương” dành cho dengue được cho là tên gọi phổ biếnnhất cho bệnh này trong trận dịch đầu tiên được mô tả về một căn bệnh có lâmsàng tương đồng với dengue tại Philadelphia vào năm 1780 [175] Những trậndịch này được phỏng đoán có nguyên nhân là do dengue dựa vào bệnh cảnhlâm sàng và dịch tễ hay gặp ở Bắc Mỹ trong suốt thế kỷ 18 và 19 DENV gầnnhư chắc chắn là nguyên nhân của bệnh sốt 5 đến 7 ngày gây ra ở những thựcdân Châu Âu tại Châu Á nhiệt đới trong suốt giai đoạn này Căn bệnh tương

tự cũng xảy ra ở những thực dân tại Châu Úc nhiệt đới

Vào năm 1801, nữ hoàng Tây Ban Nha đã dùng thuật ngữ “dengue” để

mô tả căn bệnh sốt cấp xảy ra ở các thành viên trong triều đình Tây Ban Nhavới các triệu chứng đau nhức xương khớp, xuất huyết và vàng da [175] Trậndịch lớn ở Caribe năm 1828, xảy ra ở một cộng đồng đa chủng tộc, đa ngôn

ngữ đã giúp quốc tế hóa việc sử dụng thuật ngữ “dengue” cho căn bệnh này

và dùng trong y văn liên tục đến ngày nay

Sự phát hiện tác nhân và nhận diện vật truyền bệnh [162]

Các nhà nghiên cứu đã sớm có gợi ý rằng DENV được truyền qua muỗi,nhưng đến năm 1906, sự truyền bệnh thật sự do một vật truyền bệnh thật sự,muỗi Aedes aegypti, mới được Bancroft chứng minh Simmons cũng chứngminh vai trò của Aedes albopictus trong việc lây truyền DENV Sau đó, một

số loài Aedes khác cũng thấy có vai trò lây lan bệnh

Kimura and Hotta là những người đầu tiên phân lập được DENV từ mẫumáu của những bệnh nhân trong trận dịch dengue tại Nagasaki, Nhật Bản năm

1943 và từ đó đã mở ra kỷ nguyên mới cho các nghiên cứu về dengue [162].Trong các trận dịch dengue từ năm 1897 đến 1902 ở Úc, năm 1928 ở Hy Lạp

và năm 1931 ở Đài Loan, người ta đã mô tả một hội chứng nặng đặc trưng vớisốc, xuất huyết và tử vong Đến năm 1960, trong khi nghiên cứu về bệnh bạiliệt ở Philippin, Hammon đã phân lập được 2 týp virút dengue mới, gọi làDENV-3 và 4 [61]

Hội nghị Các bệnh SXH do muỗi được TCYTTG tổ chức tại Bangkok từngày 19 đến 24 tháng 10 năm 1964 đã giới thiệu thuật ngữ “SXHD” [59].Năm 1966, Cohen và Halstead đã công bố bản mô tả kinh điển đầy đủ về hộichứng sốc dengue, bao gồm sinh lý bệnh do thất thoát dịch và protein quanhững mao mạch bị tổn thương, từ đó đưa ra những nguyên tắc hồi sức hợp lý[41] Tỉ lệ mắc SXHD đã tăng rất nhanh trên thế giới trong những thập niêngần đây Không những thế, bệnh SXHD còn lây lan ra nhiều khu vực màtrước đây chưa từng xảy ra và bùng phát thành nhiều vụ dịch lớn

1.1.2 Tại Việt Nam [5]

Từ năm 1913, Gaide đã có báo cáo đầu tiên về bệnh giống như denguetại miền Bắc và miền Trung Năm 1929, Boyé đã viết về một vụ dịch denguetại miền Nam Năm 1958, Chu Văn Tường và cộng sự thông báo về một trận

dịch SXHD nhỏ tại Hà Nội căn cứ trên một số bệnh nhi điều trị tại bệnh việnBạch Mai Vào năm 1960 có 2 vụ dịch nhỏ xảy ra ở Cái Bè và An Giang(miền Nam Việt Nam) được chẩn đoán lâm sàng là SXHD Cùng năm đó cómột vụ dịch dengue cổ điển rất lớn bùng phát ở các tỉnh miền Bắc Đến năm

1963, vụ dịch SXHD đầu tiên được xác định mầm bệnh ở Việt Nam bùng phát

ở đồng bằng sông Cửu Long đã được báo cáo Năm 1969 xảy ra trận dịchSXHD ở Miền Bắc Từ đó, SXHD tăng dần và lan rộng ra cả nước, từ cácthành phố lớn đông dân về các vùng nông thôn, cứ vài năm lại xảy ra một trậndịch SXHD Năm 1983 là năm có SXHD lớn nhất trên phạm vi cả nước Một

vụ dịch lớn năm 1997 tấn công 42 tỉnh thành trong cả nước bao gồm 19/19tỉnh miền Nam, 14/14 tỉnh miền Trung và Tây Nguyên và 9/28 tỉnh miền Bắcvới tổng số bệnh nhân 107.188 người

Giai đoạn từ 1980 - 1999, trung bình mỗi năm ghi nhận 100.000 trườnghợp mắc, 300 - 400 trường hợp tử vong, tỉ lệ tử vong trung bình từ 0,08-0,09% Giai đoạn từ 2000 – 2015, nhờ có Chương trình mục tiêu quốc gia,tình hình dịch đã giảm, trung bình mỗi năm ghi nhận khoảng 50.000 đến100.000 trường hợp mắc, gần 100 trường hợp tử vong Tuy nhiên, theoTCYTTG, so với tình hình chung của thế giới trong giai đoạn 2004-2010, ViệtNam là quốc gia đứng thứ 3 về số ca mắc SXHD trung bình mỗi năm [66].Trong những năm gần đây, bệnh sốt xuất huyết đã giảm, có tỉ lệ mắctrên/100.000 dân là 56,7, thấp hơn so với một số nước và tỉ lệ phần trăm tửvong/ mắc (0,029) thấp nhất so với các quốc gia trong khu vực Trong 7 thángđầu năm 2017 ghi nhận 58.888 trường hợp mắc, trong đó có 50.497 trườnghợp nhập viện và 17 trường hợp tử vong [3]

Tại Tiền Giang, kể từ trận dịch đầu tiên vào năm 1960 xuất hiện ở Cái Bèđược mô tả và xác định, SXHD đã phát thành dịch lớn vào các năm 1979,

1983, 1987, 1988 Theo số liệu Hội nghị giao ban Công tác điều trị SXHD

khu vực phía Nam, trong năm 2017 Tiền Giang không còn nằm trong 10 tỉnh

có số trường hợp mắc SXHD cao nhất cả nước nhưng lại là một trong 12 tỉnh

có số tử vong cao nhất (2 trường hợp) [2] Tỉnh Tiền Giang nằm trong vùngkhí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm thuộc vùng đồng bằng Sông Cửu Long cókhí hậu với nhiệt độ cao ổn định (nhiệt độ trung bình 26,90C), lượng mưa(lượng mưa trung bình 1450 mm) và độ ẩm (83%) thích hợp để muỗi sốngsót, sinh sản và phát triển Song song đó, tình trạng đô thị hóa diễn ra nhanh,mật độ cân cư khá đông cùng với tập quán sinh hoạt của người dân đã tạođiều kiện thuận lợi cho bệnh SXHD lây lan và diễn ra quanh năm

1.2 XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN SXHD

1.2.1 DENV:

Vi rút gây bệnh SXHD thuộc họ Flaviviridae, giống flavivirut DENVcấu tạo bởi một ARN sợi đơn cực dương, khoảng 11.000 nucleotide, nằmtrong lõi capsid hình khối hai mươi mặt, đường kính 30 nm, bên ngoài là vỏlipo-protein tạo thành khối cầu (đường kính 50 nm) Các protein cấu trúc lõi

C, tiền màng prM và vỏ E của virion được mã hoá từ đầu 5’ của bộ gien vi rút

Có 7 protein không cấu trúc (ký hiệu là NS) là: NS1, NS2A, NS2B, NS3,NS4A, NS4B và NS5 Glycoprotein vỏ có liên quan tới hoạt tính ngưng kếthồng cầu và hoạt tính trung hoà vi rút để tạo ra kháng thể Protein lõi C có thểchiết tách sau khi hoà tan lớp vỏ với chất tẩy ion Protein không cấu trúc NS1vừa là enzym vừa là kháng nguyên đặc hiệu cho DENV, trong khi các proteinkhông cấu trúc khác (NS2A-NS2B, NS3, NS4A-NS4B và NS5) cũng có vaitrò như một men nhưng không có tính kháng nguyên [6],[9],[17]

DENV hình thành một phức hệ khác biệt so với các vi rút thuộc giốngflavivirut khác do đặc điểm kháng nguyên và đặc điểm sinh học Có 4 týphuyết thanh được đặt tên là: DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4 Nếunhiễm một trong 4 týp này sẽ tạo được miễn dịch suốt đời đối với týp huyết

thanh đó nhưng không gây miễn dịch bảo vệ chéo cho các týp khác mặc dù 4týp có sự tương đồng về mặt kháng nguyên [10],[17].

Hình 1.1 Cấu trúc của DENV

“Nguồn: Marianneau P,1997” [90].

1.2.2 Đáp ứng miễn dịch của bệnh SXHD

Đáp ứng miễn dịch của bệnh SXHD bao gồm đáp ứng bẩm sinh và thuđược Các đáp ứng này ảnh hưởng lên sự nhân lên của vi rút và mức độ nặngcủa bệnh, từ nhiễm trùng không triệu chứng đến thoát huyết tương và xuấthuyết đe dọa tử vong

Nhiễm vi rút huyết thông thường xảy ra ở bệnh nhân SXHD trước khikhởi sốt và có các triệu chứng, đạt đỉnh cao vào 2- 3 ngày sau khi khởi bệnh,hoặc 2- 3 ngày trước khi hạ sốt Đáp ứng kháng thể khi nhiễm DENV baogồm kháng thể IgM và IgG kháng các protein vỏ vi rút Đáp ứng miễn dịchthay đổi tùy thuộc vào tình trạng sơ hay tái nhiễm bệnh, vì thế việc chẩn đoánhuyết thanh học bệnh SXHD cũng tùy thuộc vào giai đoạn bệnh Hình 1.2 mô

tả các thời điểm phát hiện DENV và các kháng thể IgM, IgG thông thườngtrong sơ nhiễm

Nhiều năm

3 tháng

Phát hiện IgGPhân lập vi rút

Khởi triệu chứng Phát hiện IgM

Hình 1.2 Thời điểm phát hiện DENV và các kháng thể IgM, IgG.

“Nguồn: Tổ chức Y tế Thế giới, 2006” [106].

Sự đáp ứng kháng thể đối với nhiễm dengue khác nhau tùy theo tìnhtrạng miễn dịch của ký chủ Với những người chưa bị nhiễm flavivirut hoặctiêm ngừa vắc xin của 1 loại flavivirut (như sốt vàng, viêm não Nhật Bản…),bệnh nhân sẽ có đáp ứng kháng thể sơ nhiễm, đặc trưng với tình trạng tăngchậm của kháng thể chuyên biệt Kháng thể IgM xuất hiện đầu tiên Nhữngkháng thể này được phát hiện trong 50% bệnh nhân vào ngày 3-5 sau khởibệnh, sau đó tăng lên 80% vào ngày 5 và 99% vào ngày 10 Đỉnh của IgM vàokhoảng 2 tuần sau khi khởi bệnh và giảm dần đến mức không phát hiện đượcvào thời điểm 2-3 tháng sau khởi bệnh Kháng thể IgG có thể được phát hiện

ở hiệu giá thấp vào cuối tuần thứ nhất, sau đó tăng chậm IgG trong huyếtthanh vẫn còn phát hiện được sau nhiều tháng, thậm chí suốt đời [120]

Đối với những trường hợp tái nhiễm DENV (đã có nhiễm DENV hoặc cóthể bị nhiễm hay tiêm ngừa flavivirut không phải DENV trước đó), hiệu giákháng thể tăng nhanh chóng và phản ứng rộng với nhiều loại flavivirut [68].Miễn dịch tương đồng (chống lại với cùng DENV gây nhiễm trước đó) thì kéodài suốt đời Sau một thời gian ngắn bảo vệ chéo, có thể xảy ra nhiễm DENVkhác Đáp ứng thứ phát là kháng thể IgG xuất hiện sớm, thường trong giaiđoạn sốt, tăng nhanh và được quy cho đáp ứng nhớ lại Số lượng IgM thay đổivới tỉ số IgM: IgG ≤ 1,8; được đo bằng ELISA bắt IgM Có thể là đáp ứngkháng thể dengue IgM phản ánh số epitope mà vi rút nhiễm trình

diện Ví dụ, những trường hợp chủng ngừa viêm não Nhật Bản sau đó nhiễmDENV phát triển nhiều kháng thể IgM hơn so với những cá thể nhiễm DENVlần thứ 2 Tỉ lệ và số lượng kháng thể được sản xuất trong suốt quá trìnhnhiễm DENV lần 2 được sử dụng để xác định đáp ứng huyết thanh học đốivới nhiễm DENV Loại kháng thể chiếm ưu thế là IgG phát hiện với mức cao,ngay cả trong giai đoạn cấp và tồn tại từ 10 tháng cho đến suốt đời Mức IgM

ở giai đoạn hồi phục sớm trong tái nhiễm dengue thấp hơn so với sơ nhiễm và

có thể không phát hiện được trong một số trường hợp Để phân biệt sơ nhiễm

và tái nhiễm dengue, ngày nay người ta thường dùng tỉ lệ kháng thể IgM/IgGhơn là thử nghiệm HI

Dengue sơ nhiễm Dengue tái nhiễm

Ngày sau khi khởi phát triệu chứng Ngày sau khi khởi phát triệu chứ ng

Hình 1.3 Mô hình đáp ứng kháng thể trong sơ nhiễm và tái nhiễm

dengue

* “Nguồn: Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh Hoa Kỳ” [35]

Do các kháng thể tăng tương đối chậm nên kết quả huyết thanh học có thể âm tính trong giai đoạn sớm của bệnh Chính vì vậy bệnh phẩm cần được

thu thập ít nhất 7 ngày sau khi khởi triệu chứng Kháng thể IgM sinh ra trongbệnh SXHD phản ứng cao nhất với týp huyết thanh vi rút gây bệnh, nhưngcũng cho phản ứng chéo với các týp huyết thanh DENV khác và với cácflavivirut khác ở mức thấp hơn Lý tưởng là kháng thể IgM nhận biết khángnguyên DENV cần được so sánh định lượng với các flavivirut khác đang lưuhành trong cùng vùng địa lý.

Kháng thể sinh ra trong bệnh SXHD có khả năng bảo vệ chống lại týphuyết thanh DENV khác loài trong thời gian ngắn Mức kháng thể trung hòatương quan với khả năng bảo vệ nhiều bệnh nhiễm vi rút, đây cũng là trườnghợp của bệnh SXHD Sự hiện diện mức kháng thể có thể đo lường đượcthường mang tính bảo vệ, ngoại trừ mức kháng thể phản ứng chéo thấp sinh rabởi một vi rút khác týp huyết thanh với vi rút gây bệnh Trong trường hợp này,kháng thể sẽ tăng cường sự nhân lên vi rút và độ nặng của bệnh (theo giảthuyết tăng cường miễn dịch trong sinh bệnh học bệnh SXHD)

Tóm lại, đáp ứng miễn dịch trong sơ nhiễm DENV đặc trưng bởi khángthể IgM xuất hiện sớm tăng cao, còn kháng thể IgG xuất hiện muộn ở mức độthấp và tăng dần Trong tái nhiễm thì ngược lại, kháng thể IgG xuất hiện sớm,tăng cao nhanh và tồn tại suốt đời, còn kháng thể IgM xuất hiện muộn ở mức

độ thấp, đôi khi xét nghiệm không tìm thấy kháng thể IgM (âm tính giả) [47]

1.2.3 Các xét nghiệm chẩn đoán nhiễm DENV [147]

Chẩn đoán nhiễm dengue đã đi một đoạn đường dài và ngày nay đã cónhiều kỹ thuật mới Chẩn đoán SXHD nhanh và chính xác vô cùng quan trọngtrong khảo sát dịch tễ, điều trị lâm sàng, nghiên cứu và thử nghiệm vắc xin.Các phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng để xác định nhiễm dengue có liênquan đến phát hiện vi rút, acid nucleic của vi rút, kháng nguyên hoặc khángthể hoặc là sự kết hợp các kỹ thuật này với nhau

1.2.3.1 Xét nghiệm chẩn đoán và giai đoạn bệnh

Sau khởi phát bệnh, vi rút có thể được phát hiện trong huyết thanh, huyếttương, các tế bào máu tuần hoàn hay các mô khác trong 4-5 ngày đầu Tronggiai đoạn sớm của bệnh, người ta dùng các phương pháp như phân lập vi rút,phát hiện acid nucleic hoặc kháng nguyên Ở cuối giai đoạn cấp, xét nghiệmmiễn dịch học là một phương pháp lựa chọn để chẩn đoán.

Có nhiều phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng để giúp điều trị bệnhnhân và kiểm soát bệnh Tùy theo mục đích (như chẩn đoán lâm sàng, khảosát dịch tễ, phát triển vắc xin), trang bị xét nghiệm và sự thông thạo kỹ thuậttại chỗ, chi phí và thời điểm lấy máu mà người ta lựa chọn phương pháp chẩnđoán nào

Giai đoạn vi rút huyết trong dengue ở bệnh nhân thì ngắn, điển hình xuấthiện 2-3 ngày trước khởi sốt và kéo dài trong 4-7 ngày bệnh Trong suốt giaiđoạn này, có thể phát hiện DENV, axit nucleic của nó và kháng nguyên vi rútlưu hành [147]

Hình 1.4 Biểu đồ thời gian của sơ nhiễm và tái nhiễm dengue cùng các

phương pháp có thể sử dụng để phát hiện nhiễm vi rút.

“Nguồn: TCYTTG, 2009” [145].

1.2.3.2 Các phương pháp chẩn đoán để phát hiện nhiễm dengue

[147]

Chẩn đoán xác định nhiễm dengue bởi các xét nghiệm: phát hiện vi rút,

bộ gien vi rút hay kháng nguyên NS1, hoặc đảo ngược huyết thanh của IgMhoặc IgG trong mẫu huyết thanh kép (IgM/IgG chuyển từ âm sang dương tínhhoặc tăng gấp 4 lần hiệu giá kháng thể chuyên biệt)

Tiêu chuẩn chẩn đoán một trường hợp có thể nhiễm dengue là huyếtthanh học IgM dương tính hoặc hiệu giá kháng thể xét nghiệm ức chế ngưngkết hồng cầu có giá trị từ 1/1280 trở lên

Bảng 1.1 Chẩn đoán xác định và có thể nhiễm dengue, phân tích kết quả

và đặc tính mẫu thử “Nguồn: TCYTTC, 2012” [46]

Xác định Phân lập vi rút Vi rút được phân lập Huyết tương (lấy

Phát hiện bộ gien RT-PCR (+) hoặc

Phát hiện kháng NS1 (+)

Đảo ngược huyết IgM chuyển từ (-) sang (+) Huyết thanh cấp thanh IgM trong mẫu huyết thanh kép (ngày1-5)và

huyết thanh hồi Đảo ngược huyết IgG chuyển từ (-) sang (+)

thanh IgG trong mẫu huyết thanh kép phục (15-21 ngày

hoặc IgG tăng gấp 4 lần sau mẫu huyết giữa 2 mẫu huyết thanh thanh đầu)

kép

Nồng độ IgG cao Nồng độ IgG cao trong

1.2.3.3 Phân lập vi rút

Trong giai đoạn sớm của bệnh, phân lập và định danh DENV thường sửdụng rộng rãi và là xét nghiệm chuẩn vàng cho chẩn đoán bệnh SXHD hiệntại Trong phương pháp này, huyết thanh bệnh nhân cấy truyền vào các dòng

tế bào muỗi Sau khi vi rút nhân lên trong tế bào nhiễm, týp huyết thanh vi rút

sẽ dễ dàng định danh bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang nhuộm tế bàonhiễm với các kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho mỗi týp huyết thanh DENV.Chủng vi rút phân lập rất quan trọng cho các nghiên cứu vi rút học tiếp diễn

và xác định đặc tính sinh học của chúng Thời gian nhiễm DENV trong máungắn, tiêu biểu là bắt đầu 2 hoặc 3 ngày trước khi khởi sốt và kéo dài cho đếnngày thứ 4 hoặc 5 của bệnh Huyết thanh là mẫu bệnh phẩm chọn lựa chophương pháp phân lập vi rút, tuy nhiên DENV cũng có thể phát hiện trong cácbệnh phẩm khác như huyết tương, bạch cầu và mô tử thiết

Nhược điểm của phương pháp này là quy trình tốn nhiều thời gian, đòihỏi kết quả nuôi cấy và nhu cầu về thiết bị nuôi cấy tế bào cũng như kỹ năngphòng thí nghiệm chuyên nghiệp Ngoài ra, một số chủng vi rút không dễdàng phát hiện vì nồng độ vi rút thấp trong mẫu bệnh phẩm

1.2.3.4 Phát hiện axit nucleic vi rút [146]

Phát hiện RNA DENV từ máu, huyết tương và huyết thanh bằng phảnứng khuếch đại gien phiên mã ngược (RT-PCR) là một phương pháp nhạy,chuyên biệt và nhanh chóng để xác định nhiễm dengue Chúng cho độ nhạy

và độ đặc hiệu tốt hơn khi so với phân lập vi rút với thời gian quay vòngnhanh hơn nhiều

Tất cả những xét nghiệm phát hiện axit nucleic liên quan đến 3 bước cơbản: (i) chiết tách axit nucleic và tinh chế; (ii) khuếch đại axit nucleic; (iii)phát hiện sản phẩm khuếch đại Có thể xảy ra kết quả dương tính giả và có thểphòng ngừa điều này bằng cách cô lập chính xác các bước khác nhau của xétnghiệm và quan sát quy trình khử nhiễm nghiêm ngặt

Độ nhạy của RT-PCR thông thường thay đổi từ 48,4 đến 98,2% và cógiới hạn phát hiện ở mức 1–50 đơn vị thành lập mảng (PFUs) [155],[161],[169],[180] Những xét nghiệm này sử dụng những mồi gắn với những vùngbảo tồn đã biết của bộ gien DENV nhằm tránh cho kết quả âm tính giả donhững đột biến tự nhiên trong quá trình sao chép bộ gien RNA vi rút Độ nhạycủa RT-PCR tùy thuộc nhiều vào cửa sổ cơ hội ngắn ngủi trùng với giai đoạn

vi rút huyết, có thể kéo dài đến 8 ngày kể từ lúc khởi bệnh Tuy nhiên, PCR hiếm khi dương tính sau ngày thứ 6

RT-Real-time RT-PCR (RT-PCR định lượng) dựa trên huỳnh quang có độnhạy và ngưỡng phát hiện tốt hơn (0,1-3,0 PFUs) nhờ độ nhạy của phát hiệnhuỳnh quang trong máy luân nhiệt (thermocycler) [38],[125],[140],[152],[168] là hệ thống xét nghiệm một bước sử dụng cặp mồi và các que dò đặchiệu cho mỗi týp huyết thanh DENV Chỉ cần sử dụng một que dò huỳnhquang phát hiện và định lượng sản phẩm của phản ứng mà không cần điện di.Nhiều xét nghiệm RT-PCR định lượng được triển khai hoặc ở dạng “đơn mồi”(chỉ phát hiện một týp huyết thanh DENV mỗi lần xét nghiệm) hoặc “đa mồi”(có thể định danh tất cả bốn týp huyết thanh DENV từ một mẫu bệnh phẩmduy nhất) RT-PCR đa mồi còn tránh khả năng bội nhiễm trong quá trình thaotác mẫu bệnh phẩm [38],[70],[168],[178],[180]

Ngoài mẫu thử máu, RT-PCR có thể được sử dụng để phát hiện RNADENV trong mô, kể cả những mẫu cố định formalin RNA DENV có thể đượcphát hiện trong mẫu thử nước tiểu và nước bọt, sử dụng real-time RT-PCR.Đối với nước tiểu, mẫu thử được thu thập từ ngày 6 đến ngày 16 sau khởi sốtcho thấy tỉ lệ phát hiện cao hơn (50-80%) so với những mẫu lấy từ ngày 1 đếnngày 3 (25-50%) [163] Do đó RT-PCT phát hiện dengue sử dụng mẫu thửnước tiểu có thể mở rộng cửa sổ cơ hội cho việc phát hiện RNA vi rút so vớimẫu thử máu (đến ngày 8) Tuy nhiên nồng độ RNA trong mẫu thử

nước tiểu và nước bọt thấp (10–50 PFUs/ml) so với mẫu thử huyết thanh (7,9

Gần đây, phương pháp LAMP PCR (PCR khuếch đại qua trung gianvòng) đã được phát triển hứa hẹn thay đổi trang thiết bị ít đắt tiền hơn và dễthực hiện hơn so với xét nghiệm RT-PCR và real-time PCR Tuy nhiên, việcthực hiện chúng cần được so sánh với những phương pháp phát hiện axitnucleic gần đây

1.2.3.5 Phát hiện kháng nguyên vi rút

Kháng nguyên NS1 của DENV

NS1 flavivirut là một glycoprotein trọng lượng phân tử là 46-50kilodalton chứa 353-354 acid amin, biểu hiện ở cả hai dạng liên kết màng(mNS1 = membrane associated NS1) và bài tiết (sNS1 = secreted NS1) và có

cả hai định tố đặc hiệu nhóm và đặc hiệu týp Điều khác thường vớiglycoprotein vi rút này là protein không tạo thành một phần của cấu trúc hạt

vi rút (virion) nhưng lại được biểu hiện trên bề mặt tế bào nhiễm cũng nhưđược bài tiết ra ngoài tế bào NS1 di chuyển vào lưới nội bào tương qua trình

tự tín hiệu kỵ nước mã hóa trong vùng tận cùng C của vỏ E, là nơi nó đượcnhị trùng nhanh chóng sNS1 chịu sự oligomer hóa hơn nữa trước khi bài tiếtdưới dạng hexamer (hình 2.1) Chức năng của NS1 chưa được biết đầy đủnhưng bằng chứng ban đầu cho thấy NS1 có liên quan trong sự sao chépRNAvi rút NS1 được sản sinh ở tất cả các flavivirut và đóng vai trò then chốt

cho sự nhân lên và sống còn của vi rút Protein NS1 chỉ được bài tiết trong tế bào động vật có vú, nhưng không có trong tế bào côn trùng [10],[24],[44].

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gien của DENV.

Bộ gien của DENV mã hóa 3 protein cấu trúc: lõi (C), màng (M) và vỏ (E) và 7 protein không cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5).

Mức NS1 DENV huyết tương hoặc huyết thanh có liên quan đến nồng độ

vi rút máu và độ nặng của bệnh [63],[83],[151] Alcon đã báo cáo khángnguyên NS1 được tìm thấy trong máu tuần hoàn từ ngày đầu đến ngày thứ 9của bệnh: mức NS1 0,04 đến 2 µg/ml trong mẫu huyết thanh giai đoạn cấp và0,04 µg/ml trong giai đoạn hồi phục (ngày 8 trở đi) Trong tái nhiễm, nồng độNS1 thay đổi từ 0,01 đến 2 µg/ml và không thể phát hiện trong mẫu huyếtthanh hồi phục [23],[48],[149] Shu và cộng sự cũng có những báo cáo tương

tự [122] NS1 thậm chí có thể phát hiện đến 18 ngày sau khởi bệnh ở một sốtrường hợp nhiễm DENV-1 [148] Do đó việc xác định kháng nguyên NS1trong bệnh nhân SXHD là một xét nghiệm hứa hẹn trong chẩn đoán sớm bệnhnhân SXHD và mở ra cửa sổ cơ hội lớn hơn cho chẩn đoán SXHD nếu so vớiphân lập vi rut, RT-PCR hay NASBA [109],[163] Các kit phát hiện dựa trênthu bắt NS1 có độ nhạy thay đổi từ 54,2% đến 93,4% [29],[30],[32],[37],[48],[75],[85],[108],[133],[139],[140],[153],[167],[170] và cho thấy có thể xácđịnh nhiễm dengue ở những mẫu huyết thanh có RT-PCR âm tính và tái nhiễm[153] Tuy nhiên, xét nghiệm phát hiện NS1 kém nhạy hơn trong tái nhiễm(67,1–77,3%) so với sơ nhiễm (94,7–98,3%) [29],[37],[75],[167], có lẽ do cókháng thể kháng NS1 phản ứng chéo làm hạn chế phát hiện các protein NS1

tự do trong huyết tương hoặc huyết thanh [83],[149]

Kháng thể kháng NS1 cũng có thể sử dụng để phát hiện nhiễm denguetrong các nguồn mẫu thử khác như các mô gan, phổi và thận [84] qua hóa mômiễn dịch, có thể sử dụng trong các nghiên cứu sau tử vong Kháng thể đơndòng NS1 chuyên biệt týp huyết thanh đã được xây dựng và ứng dụng cho cácxét nghiệm nhận diện týp huyết thanh dengue dựa vào NS1 Nghiên cứu củaPuttikhunt và cộng sự cho thấy độ nhạy chung là 76,5% và độ đặc hiệu là100% trong chẩn đoán dengue, trong khi đó độ nhạy từng týp huyết thanh là100% cho DENV-1, 3 và 4 và 82,4% đối với DENV-2 [174] Tuy nhiên độnhạy của những xét nghiệm này thay đổi theo những dòng DENV khác nhaubởi vì mức độ bài tiết NS1 có vẻ tùy thuộc vào từng dòng [179]

1.2.3.6 Phát hiện kháng thể (IgM và IgG)

Phát hiện kháng thể kháng dengue (IgM và IgG) là xét nghiệm được sửdụng rộng rãi nhất trong chẩn đoán dengue [42] Có 2 phiên bản của nhữngtest này: ELISA hoặc test nhanh ELISA cho độ nhạy tốt hơn, trong khi đó ưuđiểm của test nhanh là sử dụng tại giường bệnh

Đáp ứng kháng thể hình thành IgM kháng dengue có thể phát hiện sớmvào ngày 3-5 sau khởi bệnh Mức IgM tiếp tục tăng trong khoảng 2 tuần sau

đó và có thể tồn tại trong khoảng 179 ngày đối với sơ nhiễm và 139 ngày đốivới tái nhiễm [172] Do đó, mẫu IgM đơn làm tăng khả năng một bệnh nhânsốt bị dengue, tuy nhiên nếu muốn chẩn đoán xác định cần phải có huyếtthanh kép để chứng minh sự gia tăng hiệu giá kháng thể IgM

Người ta thấy đáp ứng IgM sớm (dưới 2 tháng) có thể phản ứng chéo vớitất cả 4 týp huyết thanh [156] và các flavivirut khác [166] Do đó thông tindịch tễ học về tỉ lệ lưu hành cuả các flavivirut khác sẽ hữu ích để hướng dẫnphân tích một kết quả IgM dương tính Dương tính giả cũng thấy ở nhữngbệnh nhân nhiễm dengue hoặc sốt rét trước đó [159]

Trong sơ nhiễm, IgG có thể chỉ được phát hiện sau 10 ngày khởi bệnh,điều này khiến nó ít hữu dụng trong chẩn đoán sớm Tuy nhiên sự tăng nhanhcủa mức IgG trong tái nhiễm (từ ngày 4 sau khởi bệnh) [103] có thể gợi ýdengue khi sử dụng tỉ số IgM và IgG [32],[152],[159],[166],[172] Bệnh nhânSXHD được xác định là sơ nhiễm nếu tỉ số kháng thể IgM/IgG kháng DENVlớn hơn 1,8; hoặc là tái nhiễm nếu tỉ số trên nhỏ hơn 1,8 khi xét nghiệmnhững mẫu huyết thanh bệnh nhân SXHD ở những vùng lưu hành bệnh [68].Phát hiện kháng thể trung hòa dengue

Kháng thể trung hòa ức chế nhiễm vi rút và do đó có thể cho độ đặc hiệutốt hơn trong phân biệt kháng thể kháng dengue với kháng thể flavivirut phảnứng chéo khác [86],[177] Những kháng thể này có thể đo bằng xét nghiệmtrung hòa giảm đám hoại tử (plaque reduction neutralizing tests (PRNTs) doRussell phát triển đầu tiên [177] Đến nay, PRNT vẫn là xét nghiệm được sửdụng rộng rãi nhất cho các nghiên cứu miễn dịch Tuy nhiên, nó đòi hỏi tốncông sức, thời gian và cho công suất thấp [173], do đó nó không được sử dụngthường quy trong chẩn đoán SXHD Các xét nghiệm mới như xét

nghiệmvi trung hòa ELISA…đã được phát triển để vượt qua những hạn chếliên quan đến PRNT.

1.2.4 Chẩn đoán sớm nhiễm DENV

Trong giai đoạn sớm, bệnh SXHD có biểu hiện tương tự các bệnh sốt cấpkhác Hậu quả là chẩn đoán SXHD thường bị trì hoãn hoặc nhầm lẫn với cácbệnh khác Do đó, muốn chẩn đoán xác định SXHD sớm, cần thực hiện cácxét nghiệm chẩn đoán Những xét nghiệm này phải phù hợp sử dụng tronggiai đoạn sớm của bệnh, có thể kể như là RT-PCR, phân lập vi rút và phát hiệnNS1 Tuy nhiên, RT-PCR là một xét nghiệm đắt tiền và đòi hỏi trang thiết bị

và kỹ thuật mà không phải nơi nào cũng có sẵn, trong khi đó phân lập

vi rút cho kết quả muộn không đáp ứng mục đích chẩn đoán sớm cho thựchành lâm sàng Gần đây, xét nghiệm phát hiện NS1 cho kết quả nhanh, độnhạy và độ đặc hiệu khá tốt và giá thành cũng không quá đắt, do đó có thểđược áp dụng rộng rãi hơn trên các cơ sở y tế nhằm giúp chẩn đoán xác địnhsớm SXHD

Tuy nhiên, đối với những nơi có cơ sở hạ tầng và trang thiết bị còn hạnchế, chẩn đoán thường dựa vào lâm sàng và công thức máu Phân loại SXHDđược TCYTTG đưa ra vào năm 2009 dựa trên những triệu chứng và dấu hiệulại thường không xuất hiện trong vài ngày đầu của bệnh Do đó, một mô hình

có giá trị dựa trên lâm sàng và xét nghiệm thường quy sẽ hữu ích để giúpnhận biết sớm SXHD, đặc biệt ở những cơ sở y tế ban đầu

1.3 TIÊN LƯỢNG SỚM SXHD NẶNG

1.3.1 Phân loại dengue của TCYTTG và các định nghĩa [58]

Trọng tâm của phân loại trường hợp SXHD là phân biệt giữa sốt dengue

cổ điển và SXHD hay SXHD nặng Để làm rõ những khác biệt này, một ủyban của TCYTTG đã phát triển những hướng dẫn phân loại trường hợpSXHD vào năm 1974, dựa trên những nghiên cứu về các kiểu bệnh trên trẻ

em tại Thái Lan vào những năm 1960, sau đó được điều chỉnh và phát hànhmột vài lần Tuy nhiên, rõ ràng là hệ thống phân loại này không áp dụng toàncầu để điều trị lâm sàng thích hợp Vào năm 2006, Nhóm Công tác Khoa họcdengue TCYTTG đề nghị nghiên cứu thêm về chẩn đoán SXHD và phân loạibệnh nhân để có điều trị tối ưu Những nghiên cứu xa hơn về việc sử dụnghướng dẫn lâm sàng chẩn đoán SXHD, bao gồm nghiên cứu kiểm soát SXHD(nghiên cứu DENCO), đưa đến việc phân loại lại SXHD thành trường hợpnặng và không nặng Sau đó lại được sửa lại thành SXHD có và không cóDHCB và SXHD nặng, và được ban hành năm 2009

tương nặng

3 Suy cơ quan nặng

Hình 1.6 Phân loại trường hợp SXHD theo TCYTTG 2009 có chỉnh sửa

“Nguồn: S R Hadinegoro (2012)” [58].

Bảng 1.2 Bảng phân loại và định nghĩa trường hợp SXHD theo

TCYTTG 2009 có điều chỉnh.

“Nguồn: S R Hadinegoro (2012)” [58].

Tiêu chuẩn cho SXHD ± DHCB

Sống/ du lịch đến vùng Đau ở bụng hoặc sờ tương nặng dẫn đến:

Sốt và 2 trong số các Ói dai dẳng SXHD)

tiêu chuẩn sau: Tích tụ dịch lâm sàng Tích tụ dịch kèm suy

Đau, nhức Gan to > 2cm Được đánh giá bởi bác.Thử nghiệm dấu dây Xét nghiệm: tăng Hct sĩ lâm sàng

thắt (+) cùng lúc với giảm nhanh 3 Tổn thương cơ quan

* (Đòi hỏi theo dõi sát 1.000 U/LSXHD khẳng định bằng và can thiệp điều trị) Hệ thần kinh trung

có dấu hiệu của thất

Tiêu chuẩn cho SXHD

nặng

Phân loại 2009 thành những mức độ nặng được xem là nhạy hơn trongviệc bắt được bệnh nặng so với hướng dẫn 1997, với độ nhạy lên đến 92% sovới 39% (1997).

1.3.2 Những yếu tố tiên lượng SXHD nặng

Có những bằng chứng cho thấy mức độ biểu hiện nặng của nhiễm DENVtùy thuộc vào một số yếu tố, ví dụ những yếu tố liên quan vi rút (như độc lựcDENV, tải lượng vi rút) những thành phần vi rút và tình trạng ký chủ khácnhau (tuổi, di truyền, tình trạng dinh dưỡng, phản ứng miễn dịch ký chủ, bệnhkết hợp, dấu hiệu lâm sàng và xét nghiệm cũng như nồng độ các chất khácnhau trong huyết tương)

1.3.2.1 DENV

Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và trên thú vật đã chỉ ra rằngmức độ biểu hiện nặng của nhiễm DENV được cho là bị ảnh hưởng bởi nhữngthuộc tính nội tại và độc lực của dòng và týp huyết thanh bị nhiễm Nhữngquan sát trên người cũng gợi ý rằng nhiễm vi rút liên tiếp thì quan trọng cho

độ nặng của bệnh

Thực tế cho thấy rằng nhiễm khác týp thứ phát với chuỗi gien châu Á củatýp huyết thanh DENV-2 thì liên quan đến SXHD và hội chứng sốc SXHD ởĐông Nam Á và châu Mỹ Ngược lại chuỗi gien châu Mỹ của týp huyết thanhDENV-2 liên quan với bệnh nhẹ, được cho là ít có khả năng nhân lên trong

Aedes aegypti [141].

1.3.2.2 Thành phần vi rút

Bộ gien vi rút mã hóa 3 protein cấu trúc (C, prM, E) và ít nhất 7 proteinphi cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5) Trong số cácprotein phi cấu trúc, NS1 được nói đến nhiều và được cho là giữ vai trò chínhtrong mức độ nặng của bệnh, bởi vì nồng độ NS1 tự do trong huyết thanh liênquan với nồng độ vi rút máu và độ nặng của bệnh Nồng độ NS1 ≥ 600 ng/mLtrong vòng 72 giờ đầu khởi bệnh có thể được sử dụng như là một yếu tố đểtiên lượng SXHD [83]

1.3.2.3 Tải lượng vi rút

Tải lượng vi rút cao đóng vai trò quan trọng trong việc gây SXHD Từngày 1 đến ngày 4 của bệnh, tải lượng vi rút ở những trường hợp SXHD nặngcao hơn những trường hợp không nặng [113].

1.3.2.4 Tuổi

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng trẻ nhũ nhi và người lớn tuổi liên quan vớiSXHD nặng Hai nhóm tuổi này nằm trong nhóm bệnh nhân được TCYTTGkhuyên nên nhập viện

1.3.2.5 Di truyền

Nghiên cứu đã cho thấy chủng tộc da đen có nguy cơ bị SXHD/ hộichứng sốc SXHD thấp hơn so với người da trắng Hơn nữa, trong tái nhiễm,những người nhóm máu AB có nguy cơ cao bị SXHD độ 3 hơn độ 1 và 2 hoặcsốt dengue [26]

1.3.2.6 Tình trạng dinh dưỡng

Nghiên cứu trên 245 trẻ nhũ nhi ở Việt Nam chủ yếu bị nhiễm DENVtiên phát cho thấy những trẻ nhũ nhi có chiều cao và cân nặng thấp so với tuổichiếm số lượng ít hơn trong số những trẻ bị SXHD/ hội chứng sốc SXHD sovới 533 trẻ khỏe mạnh [165] Tuy nhiên một nghiên cứu khác cho thấy trẻ bịsuy dinh dưỡng có nguy cơ bị hội chứng sốc SXHD cao hơn Do đó, cần cónhững nghiên cứu sâu hơn trước khi sử dụng tình trạng dinh dưỡng như là yếu

tố tiên lượng cho SXHD nặng

1.3.2.7 Phản ứng miễn dịch ký chủ

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đáp ứng miễn dịch ký chủ có thể đóngvai trò trong phát triển SXHD và sốc SXHD, bao gồm đáp ứng miễn dịch quatrung gian tế bào, sản phẩm cytokin của các tế bào khác nhau

1.3.2.8 Những tế bào của đáp ứng miễn dịch tự nhiên

Trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên, tế bào giết tự nhiên đóng vai trò quantrọng Chúng gia tăng số lượng sau nhiễm vi rút Nhiều nghiên cứu cho kết

quả khác nhau Do đó, cần có những nghiên cứu xa hơn trước khi sử dụng sốlượng tế bào giết tự nhiên như là một yếu tố tiên lượng SXHD nặng.

1.3.2.9 Những tế bào của đáp ứng miễn dịch chuyên biệt

Tế bào lympho T và B bị hoạt hóa khi phơi nhiễm với kháng nguyênDENV Sự hoạt hóa lympho T dẫn đến hoạt hóa bổ thể và sản xuất nhiềucytokin khác nhau và sự hoạt hóa lympho T quá mức có thể dẫn đến đáp ứngcytokin bệnh lý có liên quan đến bệnh nặng

Cytokin

Nồng độ cytokin và những thụ thể hòa tan được của chúng ở những bệnhnhân SXHD cao hơn bệnh nhân sốt dengue đã gợi ý vai trò của một sốcytokin nào đó trong độ nặng của bệnh Do đó, sự gia tăng của một số cytokin

có thể được sử dụng như là yếu tố tiên lượng SXHD nặng [26],[126]

Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Một trong những thuyết về bệnh sinh của SXHD và hội chứng sốc SXHDđược đề xuất cách đây 3 thập kỷ được gọi là thuyết tăng cường phụ thuộckháng thể (antibody dependent enhancement, viết tắt ADE) Giả thuyết này đềxuất rằng những kháng thể trung hòa sẽ cho sự bảo vệ lâu dài đối với nhiễmthứ phát vi rút tương đồng trong khi đó trong nhiễm týp huyết thanh DENVkhác loại, kháng thể có sẵn không trung hòa được mà còn có thể có hại

Bên cạnh các kháng thể chống lại vi rút còn có một số kháng thể chốnglại NS1 Kháng thể chuyên biệt với NS1 gắn tế bào nội mạc được cho là gópphần vào hội chứng thất thoát mạch máu thông qua việc hoạt hóa dòng thác

bổ thể phụ thuộc kháng thể Thêm vào đó, NS1 gây ra tự kháng thể vớiprotein gian bào và tiểu cầu, đưa đến giảm tiểu cầu Một giả thuyết khác làkháng thể NS1 phản ứng chéo với tế bào nội mạc và gây tổn thương thôngqua hoạt hóa quá trình viêm của tế bào nội mạc Do đó nồng độ kháng thể

NS1 là một ứng cử viên tiên lượng cho độ nặng của bệnh, nhưng không thể sửdụng là yếu tố tiên lượng sớm do xuất hiện muộn trong quá trình bệnh.

1.3.2.10 Bệnh đi kèm

Những bệnh nhân có bệnh đi kèm như tiểu đường, cao huyết áp, suy thậnđược xếp vào nhóm B, khuyên nhập viện theo hướng dẫn của TCYTTG vì làyếu tố nguy cơ bệnh nặng

1.3.2.11 Biểu hiện lâm sàng và kết quả cận lâm sàng

Những biểu hiện lâm sàng có thể được sử dụng như yếu tố tiên lượngnặng là đau bụng, gan to, lừ đừ, tay chân lạnh và xuất huyết Về cận lâm sàng,tiểu cầu đếm ≤ 75.000/mm3 và hematocrit tăng hơn 22% so với giá trị nền làyếu tố tiên lượng nặng [73]

1.3.2.12 Nồng độ các chất khác nhau và tế bào tuần hoàn trong huyết tương/ huyết thanh

Nồng độ elastase cao hơn ở những bệnh nhân bị sốc, tràn dịch màngbụng, tràn dịch màng phổi so với những bệnh nhân huyết áp bình thường.Nồng độ thrombomodulin hòa tan, Hyaluronan huyết thanh cũng tăng rõrệt ở những bệnh nhân hội chứng sốc SXHD Ở những bệnh nhân xác địnhSXHD, nồng độ cao Nitric oxide trong huyết thanh có thể sử dụng như là yếu

tố tiên lượng nặng

Các nghiên cứu cũng cho thấy nồng độ các phân tử kết dính hòa tan(sICAM, sVCAM) và số lượng tế bào nội mạc trong tuần hoàn cũng tăngtrong những trường hợp SXHD nặng

Trong tương lai, những xét nghiệm này được nghiên cứu và phát triểnthành những xét nghiệm có hiệu quả về kinh tế để sử dụng như là yếu tố tiênlượng sớm của SXHD nặng

1.3.3 Tiên lượng sớm SXHD nặng

Mặc dù có những tiến bộ trong điều trị và hồi sức, SXHD với biến chứngnặng vẫn còn là nguyên nhân tử vong ở nhiều quốc gia Châu Á và Mỹ Latinh

Tỉ lệ tử vong SXHD đã giảm trong hơn 2 thập kỷ qua và hiện tại còn dưới 1%với điều trị thích hợp [103] nhưng có thể lên đến 26% trong SXHD nặng nếuđiều trị không đúng [116] Một trong những cái giá để đạt được tỉ lệ tử vongthấp chính là gánh nặng đối với hệ thống y tế ở một lượng lớn trường hợpSXHD nhập viện và theo dõi sát.

Thật là một thử thách lớn đối với bác sĩ đa khoa và thậm chí bác sĩchuyên khoa nhiễm để tiên đoán trong vài ngày đầu tiên của bệnh rằng bệnhnhân nào sẽ diễn tiến thành SXHD nặng Những triệu chứng và dấu hiệu điểnhình của biến chứng nói chung chỉ xuất hiện trong giai đoạn nguy hiểm từngày 4 đến ngày 6 của bệnh [79],[103],[123] Do đó, tại nhiều nơi, các bác sĩlàm việc trong phòng khám hoặc khoa cấp cứu thường tiếp cận thận trọng vớinhững trường hợp nghi SXHD và cho bệnh nhân nhập viện theo dõi Điều nàyđưa đến việc bị chia sẻ nguồn lực y tế còn hạn chế, phân loại bệnh nhânkhông đúng, nhập viện không cần thiết và tăng chi phí cho bệnh nhân Nhữngnghiên cứu trước đây đã phát triển những tiếp cận khác nhau để nhận diệnnhững yếu tố tiên lượng sớm SXHD nặng bằng cách sử dụng hồi quy logistichoặc cây phân loại và hồi quy [112],[129],[171] Tuy nhiên, kết quả từ nhữngnghiên cứu trước đây nói chung không hữu dụng ở những cơ sở có nguồn lựchạn chế như là những nơi không có sẵn kỹ thuật RT-PCR và huyết thanh họcthường quy Hơn nữa, đa số những nghiên cứu này chỉ chú ý đến SXHD(DHF), một nhóm trường hợp không nhất thiết có lâm sàng nặng [54],[103],[157],[164] Thật ra, lý do cơ bản để ra đời hệ thống phân loại trường hợpTCYTTG năm 2009 là để phân loại chính xác hơn và không bỏ sót nhữngtrường hợp SXHD nặng trên lâm sàng, bao gồm sốc, xuất huyết nặng và suy

cơ quan [103] Thêm vào đó, hầu hết những nghiên cứu tiên lượng sớm cógiới hạn đáng kể không đưa ra giá trị tiên đoán dương và âm của công cụ tiênlượng hoặc công cụ tiên lượng dựa trên dữ liệu bệnh nhân đã nhập viện [39],[52],[73],[129],[154]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1 Nghiên cứu thử nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1 DENV và các mô hình chẩn đoán sớm:

Nghiên cứu trên thế giới

Alcon S và cs (2002) [23] đã chứng minh rằng kháng nguyên NS1 củaDENV hiện diện trong huyết thanh bệnh nhân dengue từ ngày đầu tiên saukhởi sốt cho đến ngày thứ 9 Nồng độ kháng nguyên NS1 của DENV tìm thấy

là 0,04 - 2 g/mL trong huyết thanh cấp (từ ngày 0 đến ngày 7), và trong huyếtthanh giai đoạn hồi phục (sau ngày 8) là 0,04 g/mL Trong trường hợp táinhiễm DENV, mức kháng nguyên NS1 của DENV tìm thấy là 0,01 - 2 g/mLtrong huyết thanh cấp và không phát hiện trong huyết thanh giai đoạn hồiphục

Libraty (2002) [82] đã chứng minh nồng độ kháng nguyên NS1 dengue

tự do trong huyết tương bệnh nhân có liên quan chặt chẽ với nhiễm vi rúthuyết và cao hơn ở bệnh nhân SXHD so với bệnh nhân sốt dengue Như vậy,việc phát hiện sớm kháng nguyên NS1 dengue có thể hữu ích trong điều trịbệnh nhân SXHD và các nghiên cứu tương lai về mối tương quan của NS1trong sinh bệnh học vi rút của bệnh SXHD

Xu H và cs (2006) [148] chứng minh kháng nguyên NS1 DENV-1 có thểphát hiện trong huyết thanh bệnh nhân SXHD từ ngày đầu tiên đến 18 ngàysau khi khởi bệnh, với đỉnh cao vào ngày 6 đến ngày 10 Kháng nguyên NS1dengue và kháng thể IgM kháng DENV được phát hiện đồng thời bằng xétnghiệm ELISA trong huyết thanh bệnh nhân cấp nhưng tỉ lệ dương tính củakháng nguyên NS1 dengue cao hơn kháng thể IgM từ ngày 1 đến ngày 3 củabệnh Xét nghiệm trên 469 người cho máu khỏe mạnh, nghiên cứu tìm thấy độđặc hiệu của xét nghiệm ELISA kháng nguyên NS1 DEN (BIO-RAD) là98,9% Không có phản ứng chéo nào xảy ra giữa 4 týp DENV với các