Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch in vitro với kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT 6, CFP 10, TB7 7 ở bệnh nhân lao phổi và người nhà tiếp xúc tại tỉnh

Ở Trung Quốc, người ta đã thử nghiệm test datrên chuột với kháng nguyên tiết ESAT-6 và theo dõi đáp ứng miễn dịch tế bàoqua việc định lượng IFN-γ ở môi trường nuôi cấy tế bào đơn nhân/đạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y - DƯỢC

LUẬN ÁN CHUYÊN KHOA CẤP II

Người hướng dẫn khoa học:

Hướng dẫn 1: PGS.TS.TRẦN THỊ MINH DIỄMHướng dẫn 2: TS HOÀNG VIẾT THẮNG

HUẾ – 2012

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sốliệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác.

Ký tên

Đỗ Phúc Thanh

AFB Acid Fast Bacillus Trực khuẩn kháng axít

AIDS Acquired Immune Deficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch

AUC Area Under The Curve Diện tích dưới đường cong

CD Cluster of Differentiation Cụm biệt hóa

CDC Control Diseases Center Trung tâm Kiểm soát bệnh tật

CFP-10 Culture Filtrate Protein 10 Kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn

lao

CR Complement Receptor Thụ thể của bổ thể

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch liên

ESAT-6 Early Secretory Antigenic TargetKháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý dược phẩm và thực

phẩmGM-CSF Granulocyte-Monocyte Clony Yếu tố kích thích tạo dòng bạch

Stimulating Factor cầu hạt và bạch cầu đơn nhânHIV Human Immunodeficiency Virus Vi rút gây suy giảm miễn

dịch ở ngườiHLA Human Leucocyte Antigen Kháng nguyên bạch cầu ngườiHRP Horseradish Peroxidase Enzym Peroxidaza

IFN-γ Interferon-gamma

nguyên đặc hiệu vi khuẩn laoIgA Immunoglobulin A

MDR Multi-Drug Resistance Kháng đa thuốc

MT Mycobacterium tuberculosis Vi khuẩn lao

MHC Major Histocompatibility Phức hợp hòa hợp tổ chức chính

Complex

NOS2 Nitric Oxide Synthase Enzym tổng hợp ô-xít ni-tricMIP-α Macrophage IFNlammatory

protein –αα

Nramp Natural resistance associated Protein của đại thực bào liên quan

macrophage protein đến tính kháng tự nhiên

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerazaPPD Purified Protein Derivative Dẫn xuất Protein tinh khiết

QFT-G QuantiFERON-Gold Tên bộ hóa chất định lượng IFN-γRANTES regulation on activation normal

T cell expressed and secreted

RFLP Restriction fragment length Tính đa hình chiều

polymorphism dài đoạn cắt giới hạn

ROC Receiver Operating Đường cong nhận dạng

Characteristic

SGOT Serum Glutamic Oxaloacetic (Men gan SGOT)

TransaminaseSGPT Serum Glutamate Pyruvate (Men gan SGPT)

Transaminase

khuẩn laoTBGL Tuberculosis Bacillus glycolipid Kháng nguyên glycolipid vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một số khái niệm, định nghĩa và các chỉ số dịch tễ học bệnh lao 3

1.2 Sinh bệnh học của bệnh lao 4

1.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch và kỹ thuật chẩn đoán 14

1.4 Tình hình bệnh lao 18

1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước có liên quan đề tài 23

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3 Các bước tiến hành 30

2.4 Các biến số trong nghiên cứu 35

2.5 Các bước thực hiện 36

2.6 Xử lý số liệu 38

2.7 Đạo đức nghiên cứu 40

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41

3.1 Đặc điểm chung của các mẫu nghiên cứu 41

3.2 Xác định tỉ lệ dương tính và nồng độ IFN- ở nhóm bệnh nhân lao phổi và người nhà bệnh nhân lao phổi 49

3.3 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của IGRA (QFT-QIT), khảo sát sự liên quan giữa tỷ lệ và nồng độ IFN-γ với một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng 54

Chương 4 BÀN LUẬN 62

4.1 Đặc điểm chung, triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng của các mẫu nghiên cứu 62

AFB (+) và người nhà BNLP 714.3 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của IGRA (QFT-QIT), khảo sát sự

liên quan giữa tỷ lệ và nồng độ IFN-γ với một số đặc điểm lâm sàng

và cận lâm sàng 77

KẾT LUẬN 83 KIẾN NGHỊ 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Tình hình dịch tễ bệnh lao Việt Nam 2011 19

Bảng 1.2 Tình hình bệnh lao tại Bình Định từ năm 2006 –α 2010 21

Bảng 1.3 Kết quả thực hiện năm 2011 22

Bảng 1.4 Tình hình thu nhận bệnh nhân lao tại các Huyện, Thành phố 22

Bảng 1.5 Tỷ lệ khỏi bệnh nhân lao phổi AFB(+) mới 23

Bảng 3.1 Phân bố theo nhóm tuổi người nhà và bệnh nhân lao phổi 41

Bảng 3.2 Tuổi trung bình của các nhóm nghiên cứu 42

Bảng 3.3 Phân bố theo giới các nhóm nghiên cứu 42

Bảng 3.4 Phân bố theo trình độ học vấn 43

Bảng 3.5 Phân bố theo nghề nghiệp 43

Bảng 3.6 Chỉ số khối cơ thể (BMI) 44

Bảng 3.7 Chỉ số khối cơ thể (BMI) ở người nhà BNLP 45

Bảng 3.8 Triệu chứng lâm sàng 45

Bảng 3.9 Triệu chứng lâm sàngở người nhà bệnh nhân lao phổi 46

Bảng 3.10 Kết quả xét nghiệm đờm 47

Bảng 3.11 Kết quả phim X quang phổi 47

Bảng 3.12 Số lượng bạch cầu ở người nhà và bệnh nhân lao phổi 48

Bảng 3.13 Số lượng tế bào lympho ở người nhà bệnh nhân lao phổi 49

Bảng 3.14 Tỷ lệ IGRA ở bệnh nhân LP (n=40) 49

Bảng 3.15 Nồng độ IFN- theo kết quả xét nghiệm IGRA 50

Bảng 3.16 Tỷ lệ IGRA (+) và trị trung bình IFN- theo giới 50

Bảng 3.17 Tỷ lệ IGRA, trị trung bình IFN-γ theo nhóm tuổi 51

Bảng 3.18 Tỷ lệ IGRA (+) và nồng độ trung bình IFN- theo BMI 51

Bảng 3.19 Tỷ lệ IGRA (+) và nồng độ IFN- ở nhóm người nhà BNLP 52

Bảng 3.20 Tỷ lệ IGRA (+), trị trung bình IFN- theo giới ở người nhà BNLP 52

Bảng 3.22 Tỷ lệ IGRA, trị trung bình IFN- theo BMI ở người nhà BNLP 53 Bảng 3.23 Liên quan về IGRA (+) và IGRA(-) giữa nhóm chứng và BNLP54 Bảng 3.24 Diện tích dưới đường cong ROC và giá trị ở các điểm cắt

của IFN- 54

Bảng 3.25 Diện tích đường cong ROC giữa nhóm chứng và nhóm BNLP với các yếu tố IFN-, tế bào lympho, Bạch cầu (BC), SGOT, SGPT 55 Bảng 3.26 Giá trị điểm cắt các biến số 56

Bảng 3.27 Tỷ lệ IGRA , trị trung bình IFN- thời gian mắc bệnh 56

Bảng 3.28 Liên quan giữa tỷ lệ IGRA (+), trị trung bình IFN- theo triệu chứng lâm sàng 57

Bảng 3.29 Tỷ lệ IGRA (+), trị trung bình IFN- theo AFB 57

Bảng 3.30 Liên quan với số lượng HC, Hb, BC, tế bào lympho 58

Bảng 3.31 Thời gian tiếp xúc với bệnh nhân lao của nhóm người nhà 59

Bảng 3.32 Tỷ lệ IGRA (+), trị trung bình IFN- theo thời gian tiếp xúc BNLP 60

Bảng 3.33 Liên quan giữa tỷ lệ IGRA (+), nồng độ trung bình IFN- với triệu 60

Bảng 4.1 Liên quan giữa nhóm BNLP và người nhà BNLP 82

Biểu đồ 2.1 Đường cong ROC tìm giá trị ngưỡng chẩn đoán 39

Biểu đồ 3.1 Phân bố theo tuổi 41

Biểu đồ 3.2 Phân bố theo giới 42

Biểu đồ 3.3 Chỉ số khối cơ thể (BMI) 44

Biểu đồ 3.4 Triệu chứng lâm sàng ở nhóm lao phổi 46

Biểu đồ 3.5 Kết quả xét nghiệm đờm 47

Biểu đồ 3.6 Kết quả phim X quang phổi 48

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ IGRA ở bệnh nhân LP 50

Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ IGRA(+) ở nhóm người nhà bệnh nhân lao phổi 53

Biểu đồ 3.10 Biểu diễn đường ROC và diện tích dưới đường cong (AUC) 55 Biểu đồ 3.11 Tương quan giữa IFN-và bạch cầu của nhóm BNLP 58

Biểu đồ 3.12 Tương quan giữa IFN-và tế bào lympho của nhóm BNLP 59 Biểu đồ 3.13 Thời gian tiếp xúc với bệnh nhân lao 59

Biểu đồ 3.14 Tương quan giữa IFN-và BC của nhóm người nhà BNLP 61

Biểu đồ 3.15 Tương quan giữa IFN-và lympho của nhóm người nhà BNLP 61

Hình 1.1 Vai trò của TNF-α trong nhiễm trùng lao (S Ehles, 2005) 10

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Cơ chế đáp ứng miễn dịch trong lao theo Kaufmann SH (2001) 11

Sơ đồ 1.2.Trình diện kháng nguyên của đại thực bào và quá trình khởi động 12

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 30

Sơ đồ 2.2 Ủ tế bào đơn nhân 31

Sơ đồ 2.3 Pha các dung dịch chuẩn bằng dung dịch pha loãng 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hằng năm có khoảng 9 triệu người bị mắc bệnh lao và 1/3 dân số thếgiới, khoảng 2 tỷ người có nguy cơ nhiễm lao, trong số đó đáng quan tâm làtình hình nhiễm lao tiềm ẩn (latent tuberculosis infection, LTA), mặc dù ngườinhiễm lao tiềm ẩn không có biểu hiện lâm sàng và không lây nhiễm nhưng cónguy cơ phát triển thể lao hoạt động và lây nhiễm, hằng năm có khoảng 2 triệungười tử vong do bệnh lao, việc điều trị LTA sẽ giúp khống chế sự tiến triểnsang thể lao hoạt động

Hiện nay test da tuberculin vẫn được xem là xét nghiệm miễn dịch cógiá trị trong chẩn đoán bệnh lao hoạt động, tuy nhiên test tuberculin có một sốhạn chế về độ nhạy cũng như độ đặc hiệu Đối với người đã chủng vắc xinBCG thì kết quả vẫn dương tính, hơn nữa test đòi hỏi bệnh nhân phải trở lại đểđọc kết quả do đó một số người đã không quay trở lại Ngoài ra, đáp ứng miễndịch tế bào chống vi khuẩn lao không những đáp ứng đối với protein cấu trúc

vi khuẩn mà còn là đối với các protein tiết trong quá trình vi khuẩn ký sinhtrong đại thực bào Do đó trong nhiều năm trở lại đây, người ta đã nghiên cứuthử nghiệm in vitro gồm các kỹ thuật đánh giá các cytokin (IFN-γ, TNF-α, IL-12) tiết ra từ các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch chống lao như tế bào đơnnhân/đại thực bào, tế bào lympho T, tế bào lympho B

Những nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch đối với các protein tiết mở ramột hướng mới về việc sản xuất một vắc xin chống vi khuẩn lao đặc hiệu và cóhiệu quả bảo vệ cao hơn BCG Ở Trung Quốc, người ta đã thử nghiệm test datrên chuột với kháng nguyên tiết ESAT-6 và theo dõi đáp ứng miễn dịch tế bàoqua việc định lượng IFN-γ ở môi trường nuôi cấy tế bào đơn nhân/đại thực bào

và tế bào lympho T

Trong bệnh lao, đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào do các tế bàolympho T và đại thực bào thực hiện thông qua các cytokin Khi cơ thể tiếp xúc

với vi khuẩn lao lần đầu tiên thì sẽ sản xuất các tế bào lympho T mẫn cảm (tếbào lympho TCD4+ và TCD8+) Khi vi khuẩn lao xâm nhập những lần sau thìcác tế bào này sẽ phản ứng lại và tiết nhiều cytokin hòa tan, đặc biệt là IFN-γ.

Đo nồng độ IFN-γ được sản xuất từ nuôi cấy tế bào đơn nhân ngoại vi khi

được kích thích bởi kháng nguyên đặc hiệu của Mycobacterium tuberculosis (MT) có thể đánh giá đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào của từng cá thể ở, kỹ

thuật này gọi là kỹ thuật IGRA (Interferon Gamma Releasing Assay), nó đã

mở ra một cách nhìn mới trong lĩnh vực miễn dịch học chẩn đoán bệnh lao.Nghiên cứu sử dụng bộ hóa chất QuantiFeron-TB Gold in tube (QFT-

GIT) sử dụng kháng nguyên đặc hiệu MT là ESAT-6, CFP-10, TB7.7 kích hoạt

các tế bào đơn nhân máu ngoại vi sau đó đo lượng IFN-γ được tiết ra sau phảnứng, phân tích, so sánh để tìm mối tương quan giữa đáp ứng miễn dịch nói trên

và các dữ liệu lâm sàng, X-quang phổi, chỉ số AFB xét nghiệm đàm …

ở bệnh nhân lao và người tiếp xúc trong gia đình, nhằm xác định người nhiễmlao có nguy cơ phát triển thành bệnh lao, đồng nghĩa với chẩn đoán sớm bệnhlao, và đây cũng là một mục tiêu chính trong chương trình phòng chống lao

quốc gia Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch

in vitro với kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT-6, CFP-10, TB7.7 ở bệnh nhân lao phổi và người nhà tiếp xúc tại tỉnh Bình Định” Mục tiêu của

đề tài như sau:

1. Xác định tỉ lệ dương tính và nồng độ IFN- γ sản xuất từ các tế bào đơn nhân máu ngoại vi sau khi kích hoạt bởi kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao là ESAT-6, CFP-10, TB 7.7 ở nhóm người lao phổi AFB (+) và người nhà tiếp xúc.

2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của thử nghiệm trên trong chẩn đoán bệnh lao, mô tả sự liên quan giữa nồng độ IFN- γ với một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM, ĐỊNH NGHĨA VÀ CÁC CHỈ SỐ DỊCH TỄ HỌC BỆNH LAO

1.1.1 Nhiễm lao

1.1.1.1 Tỉ lệ nhiễm lao

Là tỉ lệ số người nhiễm lao (người có phản ứng tuberculin dương tính)trong một quần thể tại một thời điểm nhất định

Tỉ lệ nhiễm lao cho thấy mức độ nhiễm lao trong cộng đồng

1.1.1.2 Nguy cơ nhiễm lao hàng năm (Annual rick of tuberculous infection ARTI):

Là khả năng một người lành có thể bị nhiễm hoặc tái nhiễm lao trongkhoảng thời gian một năm

Nguy cơ nhiễm lao hàng năm đánh giá gián tiếp tình hình bệnh lao và xuhướng dịch tễ của bệnh lao

1.1.2 Tỷ lệ mắc lao

1.1.2.1 Tỉ lệ hiện mắc (prevalence rate)

Tỉ lệ người hiện mắc lao trong quần thể dân số nhất định tại khoảng thờigian hoặc thời điểm xác định

Tỉ lệ hiện mắc cho thấy mức độ trầm trọng của dịch bệnh về số nguồn lâyđang lưu hành, xu hướng dịch tễ, và hiệu quả của chương trình chống lao

1.1.2.2 Tỉ lệ mắc mới hàng năm (incidence rate).

Tỉ lệ người mới mắc bệnh lao trong quần thể nhất định trong khoảng thờigian một năm

Tỉ lệ mới mắc cho phép đánh giá tác động của các yếu tố nguy cơ củabệnh lao và là căn cứ hoạch định chính sách can thiệp để làm giảm các nguy cơ

đó trong một quần thể [6]

1.2 SINH BỆNH HỌC CỦA BỆNH LAO

1.2.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể xuất hiện tại tổn thươngtrong những ngày đầu nhiễm lao nhằm tiêu diệt VK Nếu đáp ứng tốt, số lượng

VK ít, VK lao có thể bị tiêu diệt ngay Thành phần miễn dịch không đặc hiệuđược biết gồm có: bạch cầu hạt trung tính, đại thực bào phế nang, tế bào T-γ/δ,T-α/β, protein của đại thực bào liên quan đến tính kháng tự nhiên (Nramp) vàmột số tế bào khác [10], [32]

Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể đối với bệnh lao được thựchiện theo hai phương thức: đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và đápứng miễn dịch dịch thể

Ngày nay, nhiều công trình nghiên cứu sâu hơn cũng đã làm sáng tỏvai trò của đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào trong đáp ứng miễn dịchbệnh lao Kiểu đáp ứng này giúp cơ thể khống chế loại trừ MT thông qua hoạthoá đại thực bào.

Đại thực bào tiêu diệt MT, các kháng nguyên của MT được giải phóng,trong đó có kháng nguyên LAM (lipopolyarbinomanose) Kháng nguyên LAMkích thích đại thực bào tiết ra các cytokin TNF-α, IL-1, -6, -8 và protein vậnmạch có tác dụng kích thích quá trình chuyển tế bào đơn nhân thành tế bàodạng biểu mô và tế bào khổng lồ Langhans, tại tổn thương hình thành nên uhạt, giới hạn sự lan tràn của VK lao [82]

Miễn dịch qua trung gian tế bào được phân lớp tế bào lympho T thựchiện, chúng tuần hoàn trong máu và hạch bạch huyết, có thể di chuyển qua cáckhoảng trống giữa các tế bào Mỗi kiểu đáp ứng miễn dịch được kiểm soát bởicác dòng lympho khác nhau Các nhóm lympho T thực hiện ba chức năngchính: hỗ trợ (Th), ức chế (Ts) hoặc gây độc (Tc) Tế bào T hỗ trợ, chủ yếu lànhóm tế bào T mang dấu ấn bề mặt CD4+ (lympho T CD4), có nhiệm vụ kíchthích đáp ứng miễn dịch của tế bào khác Nhóm tế bào T gây độc, chủ yếu là

tế bào T mang kháng nguyên bề mặt CD8 (lympho T CD8), có nhiệm vụ nhậnbiết và tiêu diệt những tế bào đã bị nhiễm và hoạt hoá tế bào thực bào tiêu diệttác nhân gây bệnh [1], [20], [82]

Miễn dịch tế bào đóng vai trò quyết định trong đáp ứng miễn dịch bảo

vệ cơ thể chống lại VK lao, các loại tế bào tham gia vào quá trình miễn dịchrất phong phú [28], [54], điển hình là một số loại sau:

- Quần thể tế bào lympho T:

Dựa trên cấu trúc thụ thể bề mặt của tế bào lympho T, quần thể tế bàolympho T được chia ra các nhóm T CD1,3,4,8, v.v Tế bào lympho T có 2chức năng chính là sản xuất ra các cytokin để hoạt hoá đại thực bào và diệt cácđại thực bào kém hoạt hoá chứa MT Sự thay đổi các đặc điểm chức năng của

tế bào lympho T trước và sau điều trị đã đưa ra giả thiết về dấu ấn miễn dịchmới của tình trạng lao lâm sàng và khối lượng lớn kháng nguyên VK lao, đâycũng là vấn đề cần được đánh giá ở những nghiên cứu rộng hơn trong tươnglai [82].

* Tế bào lympho T CD1: một số tác giả cho rằng T CD1 nhận dạng kháng nguyên lipid và hoạt hoá tiêu diệt các đại thực bào chứa MT

* Tế bào lympho T CD4: có vai trò chủ chốt trong đáp ứng miễn dịchbảo vệ chống VK lao của cơ thể T CD4 có 2 chức năng chính là nhận dạngcác kháng nguyên ngoại bào từ phân tử MHC lớp II, tiết ra IFN-γ và cáccytokin khác hoạt hoá đại thực bào để thực bào MT, khởi xướng đáp ứng miễndịch tế bào Đại thực bào thiếu thụ thể của CD4 sẽ giảm khả năng di chuyển,giảm khả năng tiết TNF-α, giảm khả năng hoá hướng động đối với MCP-1 vàgiảm khả năng gắn với tế bào biểu mô mạch

* Tế bào lympho T CD8: T CD8 tiết các cytokin IFN-γ, IL-4 vì vậy cóvai trò trong điều hoà cân bằng giữa Th1 và Th2 Một số tác giả cho rằng, TCD8 nhận dạng kháng nguyên nội bào từ phân tử MHC lớp I Ngoài ra, T CD8

có vai trò phân giải tế bào đuôi gai, đại thực bào chứa MT, tạo điều kiện cho các đại thực bào khác thực bào [10], [82]

* Tế bào lympho T-γ/δ: vai trò của các tế bào lympho T γ/δ trong đápứng miễn dịch ở bệnh lao cũng chưa được biết hết Tế bào lympho T γ/δ là tếbào có nhân to, có thể phát triển thành tế bào đuôi gai trong hệ bạch huyết Tếbào T γ/δ có vai trò trong đáp ứng miễn dịch sớm, và trong lao tiềm tàng [82]

Th1 và Th2 là 2 phân týp của tế bào lympho T CD4, do tế bào T CD4biệt hoá thành trong quá trình đáp ứng miễn dịch Tế bào Th1 tiết ra IL-2 vàIFN-γ, có vai trò trong đáp ứng miễn dịch bảo vệ nhiễm khuẩn nội bào Tế bàoTh2 tiết ra IL-4, IL-5, IL-10 Điều hoà cân bằng giữa đáp ứng Th1 và đáp ứngTh2 phản ánh kết quả đáp ứng miễn dịch của cơ thể

- Vai trò của các Interleukin (IL):

Vai trò đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao phụ thuộc các tế bào miễndịch thông qua cytokin Việc giảm tổng hợp cytokin có liên quan đến tìnhtrạng dinh dưỡng của bệnh nhân lao, ví dụ như các vi chất ở nồng độ thấp[28], [32].

* IL-1: IL-1 gồm IL-1 (α) và IL-1 (β) do đại thực bào tiết ra Cùng vớiTNF- α, IL-1 có vai trò đáp ứng trong giai đoạn cấp của bệnh như gây sốt, suykiệt, tạo điều kiện bộc lộ thụ thể của IL-2 và giải phóng IL-2, tham gia hìnhthành u hạt

* IL-2: là cytokin đa chức năng do tế bào lympho Th dạng hoạt tínhtổng hợp và tiết ra, cụ thể do Th1 tiết ra khi Th1 được hoạt hoá và có vai tròhoạt hoá đại thực bào [10], [82] Chức năng ban đầu của IL-2 là hỗ trợ pháttriển tế bào T đặc hiệu kháng nguyên và tạo trí nhớ định hình Ngoài ra, IL-2

có khả năng tác động đến tế bào giết tự nhiên (NK), tế bào B và chức năngthực bào Như vậy, IL-2 gia tăng hoạt tính diệt khuẩn của đại thực bào, tăngkhả năng tạo cytokin và bộc lộ thụ thể của cytokin trên bề mặt tế bào Trongthực tế, IL-2 cần thiết cho quá trình phòng vệ của cơ thể chống nhiễm khuẩn tếbào Mặc dù, IL-2 kích thích chức năng miễn dịch tế bào nhưng không đặchiệu riêng biệt cho kiểu đáp ứng týp 1 Tế bào T tiết IL-2 và tế bào Th2 xuấthiện ngay sau khi có kháng nguyên kích thích và biệt hoá thành dòng tế bàotýp 1 hoặc týp 2 dưới tác động của cytokin khác IL-2 kích thích T CD4 tiếtIFN- ở giai đoạn khởi đầu và trình diện, nhưng chỉ tác động tiết IL-4 tronggiai đoạn khởi đầu Tóm lại, IL-2 đóng vai trò trung tâm trong quá trình miễndịch tế bào và miễn dịch dịch thể, tạo ra đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao dokhởi động một “kho chứa” tế bào lympho T đặc hiệu

* IL-4: do Th2 tiết ra, làm giảm đáp ứng của Th1, nhưng không tăng đáp ứng của Th2 IL-4 tăng cường IFN- tới u hạt

* IL-6: do tế bào lympho B tiết ra, tham gia giảm phản ứng viêm, tạomáu, biệt hoá tế bào lympho T, ngăn chặn đáp ứng của tế bào lympho T [28],[82].

* IL-8: do tế bào đơn nhân, đại thực bào, tế bào biểu mô phế quản, tếbào xơ và cả tế bào lympho T tiết ra, có vai trò liên kết tổ chức tạo thành hanglao, làm cho tổn thương ổn định, hoá hướng động quan trọng, có khả năngchiêu mộ bạch cầu đa nhân, tế bào lympho và bạch cầu ưa bazơ

* IL-10: có tác dụng chống viêm, được tiết từ đại thực bào và tế bàolympho T khác, có tác dụng ức chế tiết IL-12, do đó làm giảm tiết IFN- IL-

10 trực tiếp ức chế đáp ứng của T CD4 và chức năng của tế bào trình diệnkháng nguyên (APC)

* IL-12: do đại thực bào và tế bào đuôi gai tiết ra IL-12 kích thích T CD4 biệt hoá thành Th1

* IL-18: do đại thực bào tiết ra, khởi động hoạt động của IFN-

* Interferon-gamma (IFN-): là cytokin chính trong việc kiểm soátnhiễm lao, được sản xuất bởi tế bào T CD4+ và T CD8+, cũng như tế bào NK.IFN-γ tăng khả năng trình diện kháng nguyên, tập trung tế bào lympho TCD4+ và/hoặc tế bào Tc tham gia vào việc loại bỏ vi khuẩn Mặc dầu bản thânIFN-γ đơn thuần không đủ kiểm soát nhiễm vi khuẩn, nó được yêu cầu đápứng bảo vệ đối với bệnh nguyên này IFN-γ là yếu tố hoạt hóa chính của ĐTB

và ở chuột nó ức chế nhân lên của vi khuẩn lao IL-4, IL-6 và GM-CSF in vitro

có thể tiêu diệt vi khuẩn bởi ĐTB hoặc một mình hoặc hiệp đồng với IFN-γ Ởngười nếu thiếu hụt gen tổng hợp IFN-γ hay thụ thể của nó được chứng minhnhiễm khuẩn nặng Mặc dầu sự sản xuất IFN-γ thay đổi theo từng đối tượng,một số nghiên cứu cho thấy nồng độ IFN-γ bị ức chế ở bệnh nhân lao thể hoạtđộng Một số ý kiến khác thấy MT có thể ngăn cản ĐTB thoát khỏi đáp ứngvới lượng IFN-γ đầy đủ

Một số nghiên cứu đáp ứng trước và sau tiêm vaccin BCG, chứng minhBCG có ít hiệu quả để dẫn đáp ứng miễn dịch theo hướng bảo vệ tế bào Th1.Trong trường hợp viêm lao màng phổi, kiểu đáp ứng Th1 được thấy ở dịchmàng phổi.

Để xác định biểu hiện của khởi đầu nhiễm trùng với MT phản ảnh sựthay đổi cân bằng của cytokin tế bào T, người ta đánh giá sự sản xuất cytokin

in vitro ở trẻ em nhiễm lao và phản ứng tuberculin ở nhóm khỏe mạnh Sảnxuất IFN-γ hầu như giảm nặng ở bệnh nhân mắc bệnh phổi tiến triển trungbình và đã lâu (far advanced lung disease) và ở bệnh nhân suy dinh dưỡng Sảnxuất IL-12, IL-4, và IL-10 như nhau ở bệnh nhân và người khỏe mạnh; nhữngkết quả này cho thấy đáp ứng miễn dịch khởi đầu đối với lao là kèm theo giảmIFN-γ, điều này không do giảm sản xuất IL-12 hay tăng sản xuất IL-4 hay IL-

10 [32], [82]

* Yếu tố gây hoại tử u (Tumour Necrosis Factor-alpha: TNFα):

TNF-α chủ yếu do đại thực bào tiết ra, ngoài ra TNF-α cũng được tổnghợp bởi tế bào đuôi gai và lympho khác

TNF-α có một số chức năng: phối hợp với IFN-  kích thích đại thựcbào tăng tổng hợp NOS2; tăng sự di chuyển và định vị tế bào trong mô; tănghoạt động của thụ thể tế bào; tăng kết dính MT vào thụ thể bề mặt đại thựcbào; là yếu tố chính gây hoại tử tế bào ở phổi, hình thành bã đậu tại tổn thươngtrong đáp ứng miễn dịch của cơ thể, TNF-α còn có vai trò quan trọng hơn ởvách tổn thương, ngăn chặn sự phát triển của MT và góp phần hình thành uhạt Tình trạng sốt kéo dài và sút cân trong bệnh lao là do đại thực bào tiếtTNF-α dai dẳng Theo Algood Holly M.Scott (2005), nhận xét TNF-α có vaitrò chủ yếu trong kiến tạo cấu trúc, duy trì tính ổn định bền vững của u hạt, qua

đó sẽ cố định vị trí nhiễm khuẩn, ngăn ngừa phát sinh miễn dịch bệnh lý [32],[82]

Số liệu lâm sàng và thực nghiệm cho thấy TNF-α có hiệu quả khácnhau tại các thời điểm nhiễm MT khác nhau, liên quan đến miễn dịch bệnh lý

và phòng vệ Trong thời kỳ đầu nhiễm khuẩn, TNF-α thúc đẩy MT vượt quangưỡng tế bào biểu mô phổi và gây nhiễm, do MT cảm ứng tế bào biểu môphổi tiết TNF-α, gây ức chế khả năng bảo vệ của tế bào biểu mô phổi Khi hìnhthành đáp ứng viêm, TNF-α thúc đẩy huỷ hoại tế bào ở phổi và các vùng khácqua cơ chế chết theo chương trình (apoptosis) TNF-α có khả năng kiểm soátnhiễm VK lao [8], [28], [82]

A Đại thực bào tiếp nhận TNF-α: chiêu mộ các tế bào.

B LymphoT tiếp nhận TNF-α từ các đại thực bào: tăng cường diệt VK.

C Đại thực bào và lymphoT tiếp nhận

TNF-α, IFN-  điều hòa phản ứng viêm quá mức (tự chết của lymphoT)

D Điều trị thuốc kháng TNF-α: tổ chức hạt bị phá hủy, VK lan tràn.

Hình 1.1 Vai trò của TNF-α trong

nhiễm trùng lao (S Ehles, 2005)

* TGF-β (Transforming Growth Factor-β): TGF-β tồn tại trong u hạt,

do tế bào đơn nhân tiết ra TGF- β hỗ trợ chống viêm, do có khả năng ức chếđại thực bào tổng hợp ROI, RNI, ức chế tăng sinh lympho T, ảnh hưởng đếnchức năng của tế bào NK, điều tiết giảm giải phóng IFN- , TNF-α và IL-1(β) TGF-β có thể là yếu tố tham gia ức chế đáp ứng miễn dịch của cơ thể [8],[10], [82]

Sơ đồ 1.1 Cơ chế đáp ứng miễn dịch trong lao theo Kaufmann SH (2001)

*Miễn dịch dịch thể:

Miễn dịch dịch thể có vai trò thứ yếu trong hệ thống miễn dịch bảo vệ

cơ thể chống lại MT Kháng thể dịch thể không trực tiếp tiêu diệt được MT,nhưng có tính độc với MT, thúc đẩy quá trình thực bào thông qua hiện tượngopsonine hóa

Trong mối tương tác giữa vi khuẩn và tế bào, bên cạnh quần thểlympho T còn có sự tham gia của tế bào lympho B thông qua tế bào Th và từ

đó sản sinh ra globulin miễn dịch gồm: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE [8], [10],[82]

1.2.3 Vi khuẩn lao đề kháng với hệ miễn dịch của cơ thể

- MT ức chế sự kiểm soát của 2 phân tử MHC lớp I và lớp II trong quá trình trình diện kháng nguyên của đại thực bào với lympho T CD8, T CD4

- MT làm giảm các dấu ấn của T CD4 và tăng apoptosis của các tế bàonày (kéo dài 6 - 12 tháng kể từ khi bắt đầu điều trị lao)

- MT hạn chế hiện tượng thực bào của đại thực bào, do chúng chiếm thụ thể bổ thể CR3, CR4 của đại thực bào [8], [10], [82]

- Khi ở trong phagosome của đại thực bào, MT ngăn cản sự hòa màngcủa các túi a-xít, ngăn cản hoạt động của bơm proton ATP-ase, tăng pH trongphagosomes lên 6,3 - 6,5 (bình thường 4,5), MT khó bị tiêu diệt

- MT “bắt” đại thực bào sản xuất quá mức các cytokin có tác dụng ứcchế lympho T (IL-10, IL-1, IL-12, IL-15, v.v.) làm giảm chức năng tế bào T

và ức chế các cytokin tiền viêm

Vi khuẩn lao bị kết dính với đại thực bào nhờ các tuy thể CR3, TLRs….

Đại thực bào

Xử lý kháng nguyên, trình diện kháng nguyên qua các phân tử MHC lớp 1,2

Tế bào Th1 nhận được tín hiệu

kháng nguyên sẽ hoạt hóa tiết ra

Cytokin (Interleukin và IFN-) 

Cytokin khởi động đáp ứng

miễn dịch trung gian tế bào

Tế bào Th2 nhận được tín hiệu kháng nguyên sẽ hoạt hóa tế bào lympho B, biệt hóa tương bào sản xuất kháng thể

Kháng thể tham gia vào đáp ứng miễn dịch dịch thể

Sơ đồ 1.2.Trình diện kháng nguyên của đại thực bào và quá trình khởi động đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể trong bệnh lao [8], [32].

-U hạt: Tế bào T CD4+ chiếm chủ yếu ở lớp bao quanh u hạt và kể cá tế

bào T CD8+ U hạt trưởng thành ở người, tế bào tua được phát hiện ở giữa các

tế bào dạng biểu mô Hiện tượng apoptosis chủ yếu ở tế bào dạng biểu mô.Tăng sinh vi khuẩn xảy ra tại chổ có cả tế bào xuất xứ từ đại thực bào và tế bàolympho Sự dính tế bào của các dòng tế bào tại u hạt thực hiện qua trung giancủa các yếu tố dính, ít nhất bởi yếu tố ICAM-1, một phân tử bề mặt được giatăng bởi vi khuẩn hoặc LAM [83] Các tế bào dạng biểu mô biệt hóa sản xuấtcác protein nền ngoại bào (osteopontin, fibronectin), hoạt động như cộng sựneo tế bào cytokin qua các intergrin [10], [32]

Sinh thiết hạch lympho cho thấy có 4 loại dựa trên cấu trúc của u hạt, loại

và số lượng tế bào, tính chất của hoại tử: (1) quá sản (22,4%) u hạt tế bào dạngbiểu mô và ít hoại tử, (2) u hạt gồm tế bào dạng biểu mô, đại thực bào, tế bàolympho và tương bào với hoại tử bả đậu ái toan, (3) giảm hoạt tính (17,7%) uhạt tổ chức kém với đại thực bào, tế bào dạng biểu mô chưa chín, tế bàolympho và tương bào, chủ yếu hoại tử bả đậu ái kiềm, (4) không hoạt động(3,6%) u hạt không tổ chức tốt với đại thực bào, tế bào lympho, tương bào vàbạch cầu nhân đa dạng không có hoại tử bả đậu [32], [82]

- Chemokin: sự tương tác giữa đại thực bào với các tế bào hiệu ứng khác

xảy ra ở giữa các cytokine và chemokin Các phân tử này sử dụng tập trung tếbào viêm cũng như các tế bào lympho và hoạt hóa chúng

- Interleukin -8: Tập trung thu hút BCTT, tế bào T, và ái kiềm để đối

phó với các kích thích Được tiết chủ yếu bởi tế bào xơ non, tế bào lympho, tếbào sừng IL-8 là chất hoạt hóa BCTT [10], [32]

Nồng độ IL-8 tăng trong dịch rửa tiểu phế quản hoặc dịch nuôi cấy tế bào lympho, biểu lộ gen cũng tăng so với nhóm chứng [82].

- Các chemokin khác: các chemokin khác liên quan đáp ứng miễn dịch

đối với vi khuẩn lao như MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1),RANTES (regulation on activation normal T cell expressed and secreted), cảhai giảm trong pha hồi phục sau khi điều trị, đối kháng với IL-8 Thực nghiệmtrên chuột in vivo và in vitro, chứng minh vi khuẩn lao gây sản xuất một loạtchemokin như RANTES, MIP-α (macrophage IFNlammatory protein –αα),MIP-2, MCP-1, MCP-3, MCP-5, và IP10 [32], [82] Thụ thể 2 của chemokinC-C (CCR2) là thụ thể đối với MCP-1, 3, 5 và hiện diện trên đại thực bào và tếbào T hoạt hóa Chuột không có CCR2-/- cực kỳ nhạy cảm với vi khuẩn lao vàthiếu hụt sự tập trung đại thực bào tại phổi Các tài liệu gần đây chứng minhTNF-α có thể điều biến tăng biểu lộ MIP-α, MIP1-β, MIP1, MIP2, CINC(cytokine –αinduced neutrophil chemoattractant) và RANTES, và nó có thể ảnhhưởng sự tập trung của BCTT, tế bào lympho, và tế bào đơn nhân/đại thực bào[10], [32], [82]

RANTES, MCP-1, MIP1-α, và MIP-β tăng sau nhiễm vi khuẩn in vitro

ở các đại thực bào phế nang Ở người CCR5, thụ thể của RANTES, MIP1-α,

và MIP-β tăng trên đại thực bào phế nang ở bệnh nhân lao phổi [10], [82]

1.3 CƠ CHẾ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH VÀ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN 1.3.1 Kháng nguyên ESAT-6 (Early Secretory Antigenic Target 6

KDa), CFP-10 (Culture Filtrate Protein 10) và TB 7.7

Lao là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi vi khuẩn MT, thường lây lancho vật chủ mới qua trung gian các giọt bắn phần tử mang mầm bệnh trongkhông khí từ bệnh nhân lao phổi (khạc ra vi khuẩn) Một cá nhân mới bị nhiễmbệnh có thể phát triển thành bệnh lao trong vòng vài tuần, vài tháng hoặc lâuhơn, nhưng đa số người nhiễm bệnh vẫn chưa hoặc không biểu hiện triệuchứng Phản ứng Tuberculin thường biểu hiện dương tính ít nhất sau 2 đến 10

tuần sau khi nhiễm vi khuẩn lao hoặc sau chủng BCG Tuy nhiên, một số cáthể, bao gồm cả những người có đề kháng hoặc không đề kháng miễn dịch vớiTuberculin có thể cho kết quả âm tính Ngược lại, một số cá thể không nhiễmlao hoặc nhiễm Mycobacterium khác vẫn cho kết quả dương tính vớiTuberculin [32], [45], [73].

Nhiễm lao (hay bệnh lao tiềm ẩn) phải được phân biệt với mắc bệnh laothật sự Mục đích chính của chẩn đoán nhiễm lao là để chẩn đoán sớm và xemxét điều trị phòng ngừa bệnh lao

Phân tích so sánh hệ gen Mycobacterium cho phép xác định vùng gen RD1

mã hóa cho các protein kháng nguyên, chỉ có ở M tuberculosis nhưng vắng

mặt trong tất cả các chủng Mycobacterium khác Gen RD1 mã hóa protein

ESAT-6 và CFP-10, là các kháng nguyên protein tiết đặc hiệu của M tuberculosis có khả năng hoạt hóa các tế bào T tiết ra IFN-γ, trong khi các

kháng nguyên khác có trong BCG hoặc các Mycobacterium khác không có khảnăng này

Khi cơ thể bị nhiễm MT thì tế bào lympho trong máu đã “tiếp xúc” và cóthể “nhận diện” các kháng nguyên của MT Bằng chứng của đáp ứng miễndịch từ các tế bào lympho T bị hoạt hóa được ghi nhận bởi sự tiết ra cáccytokin và IFN-γ Việc phát hiện và định lượng IFN-γ bằng kỹ thuật IGRA đolường nồng độ IFN-γ được tiết ra từ các tế bào lympho T máu ngoại vi khi bịkích hoạt bởi kháng nguyên đặc hiệu là một thử nghiệm in vitro đánh giá giántiếp đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào của cá thể đó với tình trạng nhiễm lao[52], [63], [89]

CFP-10 (10-kDa culture filtrate protein) là một kháng nguyên góp phầnvào độc lực của MT CFP-10 là một phức hợp 1:1 heterodimeric liên kết chặtchẽ với kháng nguyên tiết ESAT-6 (6kDaA early secreted antigen target).Trong các tế bào MT, hai loại protein này là phụ thuộc lẫn nhau cho sự ổnđịnh Phức hợp ESAT-6/CFP-10 được bài tiết bởi hệ thống tiết ESX-1, còn

được gọi là khu vực RD1 Khu vực RD1 là di truyền và có mặt trong tất cả cácchủng MT MT sử dụng hệ thống tiết ESX-1 này để cung cấp các yếu tố độclực vào đại thực bào và các tế bào bạch cầu đơn nhân trong quá trình nhiễmtrùng MT.

TB 7.7 là kháng nguyên glycolipid MT (TBGL), đã được nghiên cứu với các

kỹ thuật ELISpot với kết quả dương tính là 88% ở đối tượng bệnh nhân laohoạt động, và 62% ở những người trong vùng dịch tễ của lao [89]

1.3.2 Quá trình phát triển kỹ thuật IGRA (Interferon Gamma Release Assay), kỹ thuật in vitro lượng giá đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc

đo lường nồng độ IFN-γ tiết ra từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi khi bị kích thích bởi ESAT-6, CFP-10, TB 7.7 và những ứng dụng đã được chấp nhận

TSTs đã được sử dụng trên toàn thế giới trong hơn một thế kỷ như là một

sự trợ giúp trong việc chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn và lao hoạt động Một kếtquả TST (+) phản ảnh cá thể có mắc bệnh lao hiện tại hoặc nguy cơ mắc laotương lai Tuy nhiên, có nhiều hạn chế nhất định liên quan đến TST TSTdương tính giả có thể là kết quả của tiêm chủng BCG

Xét nghiệm IGRA phát hiện nhiễm lao là phương pháp đo nồng độ IFN-γgiải phóng ra sau khi có tiếp xúc với kháng nguyên đặc hiệu với MT Trongnghiên cứu này, chúng tôi sử dụng loại IGRA dựa trên phương pháp ELISA,thế hệ mới sử dụng bộ hóa chất Quantiferon-TB Gold In Tube (Cellestis,Victoria,Australia) Đây là một thử nghiệm mới, đơn giản, bệnh nhân chỉ lấymáu một lần không phải quay trở lại đọc kết quả như thử nghiệm TST [73]

Năm 2001, bộ hóa chất QFT sử dụng kháng nguyên của M avium trởthành áp dụng kỹ thuật IGRA đầu tiên được chấp thuận bởi FDA để hỗ trợ choviệc chẩn đoán nhiễm M tuberculosis CDC đã ban hành hướng dẫn về việc sửdụng của QFT trong năm 2003 Tuy nhiên, độ đặc hiệu của QFT thấp hơn TST

và bộ hóa chất QFT ngừng áp dụng từ năm 2005

Để cải thiện độ đặc hiệu kỹ thuật IGRA mới đã được phát triển Bộ hóa

chất QuantiFERON-TB Gold (QFT-G) (Cellestis Limited, Carnegie, Victoria,Australia) ra đời và đã trở thành IGRA “thế hệ” thứ hai được chấp thuận bởi

FDA như là một sự trợ giúp cho việc chẩn đoán nhiễm M tuberculosis

QFT-G sử dụng kháng nguyên peptide tổng hợp đặc hiệu cho MT là ESAT-6 vàCFP-10 Những protein này có khả năng kích thích tế bào miễn dịch trong hầuhết các người bị nhiễm lao tiết ra IFN-γ, khả năng này không thấy ở người đãchủng vắc-xin BCG và các trường hợp nhiễm nontuberculous mycobacteria Như vậy, các kháng nguyên dùng trong thử nghiệm QFT-G đã cải thiện so với

QFT Mặc dù, ESAT-6 và CFP-10 có mặt ở M kansasii, M szulgai, và M marinum, tuy nhiên các nhiễm khuẩn này rất hiếm gặp ở người Bộ hóa chất sử

dụng thêm chứng âm cho mỗi mẫu bệnh phẩm thử nghiệm để làm tăng độchính xác Năm 2005, CDC đã ban hành hướng dẫn cho việc sử dụng QFT-G

và áp dụng trong những người có nguy cơ cao cho sự tiến triển bệnh đang hoạtđộng nếu bị nhiễm bệnh Đối với IGRAs để đo lường IFN-γ một cách chínhxác, một mẫu máu có chứa các tế bào bạch cầu sống là cần thiết

Năm 2007, bộ hóa chất QuantiFERON-TB- Gold In Tube (QFT-GIT)(Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia) đã được phát triển và trởthành IGRA “thế hệ” thứ ba được chấp thuận bởi FDA như là một sự trợ giúpcho việc chẩn đoán nhiễm MT Vật liệu và kháng nguyên trong QFT-GIT đượcchứa trong các ống đặc biệt được sử dụng để thu thập máu cho thử nghiệmnày, kháng nguyên thử nghiệm bao gồm một hỗn hợp của 14 peptide đại diệncho các trình tự axit amin toàn bộ ESAT-6 và CFP-10 và một phần của trình tựcủa TB7.7 để làm tăng độ nhạy và đặc hiệu Thử nghiệm bao gồm 3 phản ứngxảy ra đồng thời cho mỗi mẫu bệnh phẩm gồm phản ứng đặc hiệu, phản ứngchứng dương và phản ứng chứng âm

Tháng 7 năm 2008, T-Spot đã trở thành IGRA “thế hệ” thứ tư được chấpthuận bởi FDA T-Spot có ưu điểm là có thể đếm được số lượng các tế bàomiễn dịch bị kích hoạt bởi kháng nguyên đặc hiệu và cho một ngưỡng chẩn

đoán xác định, sự chuyển đổi giá trị T-Spot từ âm sang dương có thể địnhhướng cho một tình trạng nhiễm khuẩn mới [73].

Để được hỗ trợ trong việc phát triển các khuyến cáo liên quan đến sử dụngcác kỹ thuật IGRA, CDC đã triệu tập một nhóm các chuyên gia để xem xét cácbằng chứng khoa học và cung cấp ý kiến về việc sử dụng các thử nghiệmIGRA Kết quả của nghiên cứu kiểm tra độ nhạy, đặc hiệu là tốt Mặc dù sốliệu về tính chính xác của IGRA và khả năng của chúng để dự đoán bệnh laohoạt động đến nay vẫn tiếp tục nghiên cứu trong các quần thể khác nhau,nhưng chưa có khiếm khuyết lớn nào đã được báo cáo [73]

Tóm lại, TST và các IGRA (QFT, QFT-G, QFT-GIT và T-Spot) có thểđược sử dụng như hỗ trợ trong chẩn đoán nhiễm trùng lao theo FDA phêchuẩn Đó cũng là cơ sở cho chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tại Việt Nam nhằmđóng góp những kết quả mới được thực hiện tại tỉnh Bình Định

1.4 TÌNH HÌNH BỆNH LAO

1.4.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG –α WHO report 2011 - GlobalTuberculosis Control), khoảng một phần ba dân số thế giới đã nhiễm lao Bệnhlao là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai trong các bệnh nhiễm trùngvới khoảng 1,2 đến 1,5 triệu người tử vong mỗi năm Tình hình lao khángthuốc đang xảy ra ở hầu hết các quốc gia

Theo ước tính của TCYTTG, năm 2010 có 8,8 triệu bệnh nhân lao mới,1,1 triệu người tử vong trong số bệnh nhân lao không nhiễm HIV và khoảng350.000 bệnh nhân đồng nhiễm lao/HIV tử vong Khoảng 13% bệnh nhân lao

có đồng nhiễm HIV Mặc dù, tình hình bệnh lao có chiều hướng thuyên giảm

kể từ năm 2006, và tỷ lệ mắc lao mới giảm từ năm 2002, bệnh lao vẫn đang làmột vấn đề y tế cộng đồng toàn cầu

Tình hình lao kháng thuốc đang xảy ra ở hầu hết các quốc gia Vấn đề cấpthiết hiện nay là cung cấp những trang bị, kỹ thuật mới như chẩn đoán, thuốc

chống lao và văcxin, đặc biệt tại những nơi có tình hình dịch tễ HIV và laokháng thuốc cao [7], [97], [99].

Trên toàn cầu, khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết dobệnh lao là ở các nước có thu nhập thấp và vừa, khoảng 80% số bệnh nhân laothuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao, tỷ lệ điều trị thành công đạt 82%nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% Như vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao chưađược điều trị tiếp tục lây lan cho cộng đồng [7], [97]

Sự gia tăng của bệnh lao trên thế giới có sự góp phần của đại dịchHIV/AIDS và sự kháng thuốc của MT Theo TCYTTG, đại dịch HIV/AIDS đãlàm tăng ít nhất 30% số bệnh nhân lao toàn cầu Đến cuối năm 2006 trên thếgiới có khoảng 42 triệu người nhiễm HIV trong đó 50% là đồng nhiễm lao.Những người đồng nhiễm lao và HIV có nguy cơ phát triển thành bệnh lao caogấp 30 lần so với những người chỉ nhiễm lao [6]

1.4.2.Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2011, TCYTTG ước tínhViệt nam đứng thứ 12 trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu:

Bảng 1.1 Tình hình dịch tễ bệnh lao Việt Nam 2011

Tỷ lệ tử vong do lao (loại trừ HIV) / 100.000 dân 34

Tỷ lệ lao kháng đa thuốc trong bệnh nhân mới (%) 2,7

Tỷ lệ kháng đa thuốc trong bệnh nhân điều trị lại (%) 19

% HIV dương tính trong số BN lao được xét nghiệm HIV 8 %

* Nguồn: Global tuberculosis control 2011 – WHO [ 97], [99 ].

Theo ước tính của TCYTTG, tỷ lệ tử vong do lao là 34/ 100.000 dân,khoảng 29.000 người tử vong do lao Tỷ lệ lao hiện mắc các thể là334/100.000 dân, khoảng 290.000 bệnh nhân Tỷ lệ lao mới mắc các thể hàngnăm là 199/100.000 dân, khoảng 180.000 bệnh nhân [ 98].

Năm 2010, có 42.356 bệnh nhân lao được xét nghiệm HIV, chiếm tỷ lệ43% tổng số bệnh nhân lao Tỷ lệ HIV dương tính trong số bệnh nhân lao xétnghiệm là 8%, thấp hơn so với tỷ lệ nhiễm HIV ước tính trong số bệnh nhânlao tại báo cáo năm 2010 của TCYTTG (17%) Đồng nhiễm lao/HIV khôngchỉ làm tăng số bệnh nhân lao, mà còn làm giảm hiệu quả điều trị củaCTCLQG và tăng tỷ lệ tử vong do lao Hai cơ chế ngân sách hiện có hỗ trợ chomột số hoạt động phối hợp lao/HIV là Quỹ toàn cầu và Dự án LIFE GAP doPEPFAR hỗ trợ và CDC triển khai Bộ Y tế cùng với CTCLQG và Cục phòngchống HIV/ AIDS đã ban hành quy trình phối hợp về chẩn đoán, điều trị vàquản lý các bệnh nhân lao/ HIV [7]

Tỷ lệ lao kháng đa thuốc là 2,7% trong số bệnh nhân lao mới và 19%trong số bệnh nhân lao điều trị lại TCYTTG ước tính năm 2010 có khoảng3.500 (95% CI: 2.600-4.700) bệnh nhân lao kháng đa thuốc trong số bệnh nhânlao phổi được khám phát hiện [7], [97], [98], [99]

Thành công của CTCLQG trong việc điều trị bệnh nhân và hạn chế lâytruyền bệnh lao trong cộng đồng đang bị đe doạ do tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIVcao, tình hình bệnh lao kháng thuốc, tình hình chẩn đoán, điều trị bệnh lao cònyếu trong các cơ sở y tế tư nhân; sự tiếp cận không đầy đủ của người nghèo vàcác nhóm đối tượng đặc biệt đối với các dịch vụ chữa lao chất lượng cao, thiếuhụt ngân sách trong việc cung cấp thuốc cũng như quản lí bệnh nhân lao kháng

đa thuốc, … , [6]

Theo kết quả điều tra tình hình nhiễm và mắc lao toàn quốc năm

2006-2007, nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở Việt Nam là 1,67%; tỷ lệ hiện mắc laophổi AFB (+) các thể ở Việt nam là: 145/ 100.000 dân và tỷ lệ hiện mắc laophổi AFB (+) mới là: 114/ 100.000 dân Như vậy, vẫn còn một số lượng đáng

kể bệnh nhân lao phổi AFB dương tính trong cộng đồng chưa được phát hiện

và CTCL cần tiếp tục nỗ lực trong công tác phát hiện, quản lí để hạn chếnguồn lây và giảm dịch tễ bệnh lao trong cộng đồng [6].

1.4.3 Tình hình bệnh lao tại tỉnh Bình Định

1.4.3.1 Đặc điểm tình hình

Bình Định là một trong 5 tỉnh nằm trong địa bàn vùng kinh tế trọngđiểm miền trung Diện tích tự nhiên toàn tỉnh là 6.024 km2(chiếm 1,8% diệntích cả nước), dân số khoảng 1,6 triệu người (1,9% dân số so với cả nước) Địahình đa dạng bao gồm: miền núi, đồng bằng, cồn cát ven biển, và hải đảo

Bệnh viện Lao và Bệnh Phổi tỉnh Bình Định là bệnh viện chuyên khoatuyến tỉnh, thực hiện chức năng khám, chữa bệnh lao và các bệnh phổi đồngthời thực hiện Chương trình Mục tiêu Quốc gia Phòng chống Bệnh lao trên địabàn tỉnh

Năm 2010, công tác phòng chống lao trên địa bàn tỉnh được sự quan tâmcủa chính quyền các cấp, cộng đồng, Hội Phụ nữ, Hội Chữ thập đỏ và đặc biệt

là sự đóng góp tích cực của hệ thống y tế tư trong hoạt động phát hiện bệnhnhân lao [2]

1.4.3.2 Tình hình bệnh lao tại tỉnh Bình Định

Bảng 1.2 Tình hình bệnh lao tại Bình Định từ năm 2006 – 2010 [2]

Bảng 1.3 Kết quả thực hiện năm 2011[2]

7 Tỷ lệ phát hiện lao phổi AFB(+) mới /100.000 85 54

dân

Bảng 1.4 Tình hình thu nhận bệnh nhân lao tại các Huyện, Thành phố [2]

Huyện, Thành phố Chỉ tiêu BN lao Thực hiện Đạt (%)

Bảng 1.5 Tỷ lệ khỏi bệnh nhân lao phổi AFB(+) mới [2]

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Bệnh lao là bệnh lây truyền qua đường hô hấp do hít phải không khí

có chứa MT được sinh ra trong quá trình ho khạc, hắt hơi hay nói chuyện vớingười bị lao phổi trong giai đoạn tiến triển Do vậy phát hiện sớm và điều trịsớm làm giảm nhanh chóng khả năng lây truyền bệnh lao Nguy cơ nhiễm laocủa người tiếp xúc tùy thuộc vào thời gian tiếp xúc, mức độ tiếp xúc, đậm độcác hạt nhiễm vi khuẩn trong không khí và yếu tố chủ thể Nguy cơ chuyển từnhiễm lao sang mắc bệnh lao khoảng 10% trong đời nếu một người nhiễm lao

từ lúc nhỏ, tuy nhiên ở người suy giảm miễn dịch như đồng nhiễm HIV thìnguy cơ chuyển từ nhiễm lao sang bệnh lao tăng lên rất cao, khoảng 10%/năm[6], [32]

Không có nhiều các nghiên cứu về miễn dịch trong bệnh lao, các nghiêncứu hầu hết tập trung vào nghiên cứu dịch tễ, lâm sàng Ngày nay, vấn đề nổi

trội trong các nghiên cứu về bệnh lao trong nước thuộc về các lĩnh vựclao/HIV, lao kháng thuốc và các bệnh cơ hội khác.

Tuy nhiên năm 2009 tác giả Lưu Thị Liên và cộng sự tại Bệnh viện Lao vàBệnh phổi Hà Nội sử dụng kỹ thuật IGRA sử dụng bộ hóa chất QTF-Gold vàphản ứng Mantoux thực hiện trên đối tượng là 300 nhân viên y tế làm việc tạibệnh viện, kết quả cho thấy QTF-Gold dương tính 47,3% và phản ứngMantoux dương tính 61,1% Nhóm nghiên cứu cho rằng “Ước tính tỷ lệ nhiễmlao bằng IGRA hoặc TST trên đối tượng là nhân viên y tế làm việc trong môitrường bệnh viện là cao Chương trình kiểm soát lây nhiễm cần được tăngcường tại Việt Nam Trong cộng đồng không đồng nhất về tiêm chủng BCG,thì IGRA dường như ước tính nhiễm lao chính xác hơn so với các tiêu chuẩnkhác như là phản ứng Mantoux” [19], [69]

Năm 2010, Lê Thượng Vũ và cộng sự nghiên cứu 84 tràn dịch màng phổi

do lao, ung thư, viêm phổi nhập viện tại khó hô hấp bệnh viện Chợ rẫy kết luậnIFN-γ có độ chính xác cao trong chẩn đoán nguyên nhân lao trên các tràn dịchmàng phổi tiết với độ nhạy 94,45, độ đặc hiệu 89,6% ở điểm cắt 33pg/mlnhưng điểm cắt 391pg/ml thì độ nhạy là 77,2% và độ đặc hiệu cao hơn 95,8%[39]

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Những nghiên cứu về miễn dịch bệnh lao trong những năm gần đây cũngchú tâm nhiều đến các chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn

Năm 2004, Sharma SK nghiên cứu trên 101 bệnh nhân lao màng phổi, địnhlượng nồng độ IFN-γ thực hiện bằng kỹ thuật ELISA, ghi nhận rằng nồng độtrung bình IFN-γ ở nhóm lao và không lao khác biệt rất rõ (p<0,001), diện tíchdưới đường cong (AUC) là 0,954, điểm cắt 138pg/ml, độ nhạy 90,2%, độ đặchiệu 97,3%, giá trị tiên đoán âm 85,7%, giá trị tiên đoán dương là 98,3%, kếtluận ước tính mức độ IFN-γ trong dịch màng phổi rất có giá trị trong chẩnđoán bệnh lao màng phổi [88]

Coral H 2009, cho rằng người tiếp xúc trong gia đình của bệnh nhân laophổi có nguy cơ cao lây nhiễm vi khuẩn lao và phát triển bệnh sớm Xác địnhcác cá thể có nguy cơ bị bệnh lao là một mục tiêu mong muốn để kiểm soátbệnh lao Xét nghiệm đo lường IFN-γ sử dụng kháng nguyên đặc hiệu của M.tuberculosis để phát hiện nhiễm vi khuẩn lao đã được đề nghị thay thế cho thửnghiệm tuberculin trên da (TST) Ngoài ra, các mức sản xuất IFN-γ đáp ứngvới các kháng nguyên có thể có giá trị dự báo Nhóm nghiên cứu ước tính tỷ lệnhiễm bệnh lao bởi IGRA và TST trong cộng đồng người tiếp xúc lao, và đánhgiá nồng độ IFN-γ tương quan với khả năng phát triển bệnh lao Nghiên cứutrên cộng đồng gồm 2060 người tiếp xúc trong gia đình với bệnh nhân lao và

766 cá nhân từ cộng đồng ở Medellins, Colombia năm 2009; các đối tượngđược theo dõi trong 2-3 năm sau khi tiếp xúc bệnh lao Đồng thời với thửnghiệm Tuberculin, đo lượng IFN-γ phản ứng với kháng nguyên ESAT-6,CFP-10, HspX và Ag85A; kết quả được đánh giá ở ngày thứ 7 sau nuôi cấymáu Kết quả TST dương tính 65,9% ở đối tượng tiếp xúc và 42,7% từ cộngđồng (OR= 2,60; p <0,0001) Phản ứng IFN-γ dương tính 66,3% trong đốitượng tiếp xúc và 24,3% từ cộng đồng (OR = 6,07, p <0,0001) Không có sựkhác biệt có ý nghĩa giữa các tỉ lệ (-) và (+) của đáp ứng IFN-γ, tuy nhiên, sựphát triển bệnh lao trong số người tiếp xúc có nồng độ IFN-γ cao đã được quansát (p=0,007) Nhóm nghiên cứu kết luận kỹ thuật đo lượng IFN-γ rất hữu ích

để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh lao trong số người tiếp xúc bệnh nhân lao và xácđịnh những người có nguy cơ cao phát triển bệnh [46]

Simsek H năm 2010 tại Thổ Nhĩ Kỳ nghiên cứu so sánh thử nghiệmTuberculin và T-SPOT-TB để chẩn đoán bệnh lao tiềm ẩn và bệnh lao hoạttính, nghiên cứu trên 136 đối tượng chia ba nhóm khác nhau (47 bệnh nhân laophổi hoạt tính, 47 người khỏe mạnh không tiếp xúc bệnh lao và 42 nhân viên y

tế có tiền sử tiếp xúc gần với bệnh nhân lao) Kết quả cho thấy độ nhạy của kỹthuật T- SPOT-TB là 83,0% và giá trị dự báo âm tính là 82,6% ở bệnh lao

đang hoạt động; các tỷ lệ này cao hơn có ý nghĩa so với thử nghiệm Mantoux

là 38,3% và 60,8%, tương ứng Độ đặc hiệu của T-SPOT.TB là 80,9% thấphơn so với thử nghiệm Mantoux là 95,7% [89]

Khả năng của T-SPOT-TB và thử nghiệm Tuberculin để chẩn đoán bệnhlao tiềm ẩn là như nhau 54,8%; Nhưng trong chẩn đoán lao hoạt động T-SPOT-TB trội hơn về độ nhạy 83,0% Thử nghiệm T- SPOT-TB được khuyếncáo là cần thiết sử dụng trong các nghiên cứu thuần tập để chẩn đoán bệnh laotiềm ẩn [89]

Theo Kumar, năm 2010 tại Ấn Đô, sử dụng xét nghiệm miễn dịch gắnenzym (ELISA) đánh giá khả năng chẩn đoán bệnh lao khi dùng phức hợpkháng nguyên 30/32 kDa (transferase mycolyl-Ag85) và protein đặc hiệuESAT-6 và CFP-10 Kết quả cho thấy độ nhạy cao 84,1% với phức hợp Ag85,

so với ESAT-6 là 64,9% và CFP-10 là 66%, với độ đặc hiệu tương tự như hầuhết (Ag85: 85,2%, ESAT-6: 88,9%, CFP-10: 85,2%) Như vậy việc sử dụngphức hợp kháng nguyên Ag85 cùng với ESAT-6 và CFP-10 có triển vọngtrong việc giảm thiểu sự không đồng nhất trong trường hợp lao hoạt động [63].Tại Nhật Bản 2010, tác giả Guio và Ashino nghiên cứu dựa trên thử nghiệmELISpot với kháng nguyên glycolipid MT Với 17 mẫu nuôi cấy vi khuẩn lao (+),

13 mẫu chứng từ những người ở trong vùng lưu hành bệnh lao và 13 mẫu chứng

từ khu vực không dịch tễ lao Tế bào đơn nhân máu ngoại vi được nuôi cấy trênđĩa đã phủ với kháng thể kháng IFN-γ Phản ứng dương tính với ELISpot là 88%,62% và 31% ở các nhóm đối tượng bệnh lao, vùng có dịch tễ bệnh lao và vùngkhông có dich tễ bệnh lao Ngược lại, nồng độ kháng thể kháng Glycolipid cao ở

12 bệnh nhân lao 71%, nhưng chỉ 8% từ nhóm vùng lưu hành bệnh lao và các thểtrong vùng không dịch tễ bênh lao Tác giả kết luận, bệnh lao tiềm ẩn có liên quanđến kết quả ELISpot dương tính và hiệu giá thấp của mức kháng thể khángTBGL, trong khi kết quả dương tính ELISpot và kháng thể cao ở bệnh nhân laohoạt động Hiệu giá thấp kháng thể

là một dấu hiệu hữu ích để xác định bệnh lao tiềm ẩn trong cá thể có ELISpotdương tính trong vùng lưu hành bệnh lao [52].

Năm 2010, Dyrhol-Riise A Thông báo một kết quả của tác giả Pai M.(2008) độ nhạy của QFT-TB là 70-78%, độ đặc hiệu là 99% ở những ngườikhông tiêm BCG và 96% ở những người có tiêm BCG và cho rằng QFT-TB làmột kỹ thuật có độ đặc hiệu tốt trên người không bị ảnh hưởng BCG [51].Năm 2011, Lee JE nghiên cứu tại Hàn quốc nhằm đánh giá độ chính xáccủa thử nghiệm TST và QTF- GIT trong chẩn đoán lao phổi, thực hiện trên

100 bệnh nhân được chẩn đoán lao phổi (có tổn thương X-quang phổi theo tiêuchuẩn chẩn đoán lao phổi của Tổ chức Y tế Thế giới, có BK đàm âm tính) và

43 bệnh nhân khác được chẩn đoán không lao Kết quả cho thấy: QTF-IT có

độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương tính và giá trị tiên đoán âm tínhlần lượt là: 93%, 95%, 98% và 84% [68]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu gồm 3 nhóm

2.1.1.Nhóm đối tượng 1

Tiêu chuẩn chọn:

Bệnh nhân: được chẩn đoán bệnh lao phổi có xét nghiệm đàm AFB dươngtính (Theo CTCLQG)

Tiêu chuẩn loại trừ:

Bệnh nhân lao có HIV (+), điều trị thuốc ức chế miễn dịch hoặc corticoid kéo dài

2.1.2.Nhóm đối tượng 2

Tiêu chuẩn chọn:

Người tiếp xúc trong gia đình với bệnh nhân lao phổi có AFB (+), thời gianchung sống trong gia đình ≥ 2 tháng

Tiêu chuẩn loại trừ:

Người có HIV (+), điều trị thuốc ức chế miễn dịch hoặc corticoid kéo dài

2.1.3 Nhóm chứng (đối tượng 3)

- Chọn 40 trường hợp khỏe mạnh, không bệnh truyền nhiễm, không tiếp xúc nguồn lây lao, tiền sử không tiêm BCG

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu:

Bệnh Viện lao và Bệnh phổi tỉnh Bình Định và một số phường, xã thuộc tỉnh Bình Định

2.1.5 Thời gian nghiên cứu:

Thời gian 12 tháng (từ tháng 4/2011 đến tháng 4/2012)