SO SÁNH TÍNH KHÁNG VÀ ĐA KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH Escherichia coli TRÊN MẪU PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI VÀ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH TÍNH KHÁNG VÀ ĐA KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH Escherichia coli TRÊN MẪU PHÂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SO SÁNH TÍNH KHÁNG VÀ ĐA KHÁNG KHÁNG SINH CỦA

VI KHUẨN CỘNG SINH Escherichia coli TRÊN MẪU PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI VÀ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Họ và tên sinh viên: TRẦN NGUYỄN TƯỜNG VI Ngành: CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Niên khóa: 2006-2010

Tháng 7/2010

SO SÁNH TÍNH KHÁNG VÀ ĐA KHÁNG CỦA VI KHUẨN CỘNG SINH

Escherichia coli TRÊN MẪU PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI

VÀ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Thực hiện bởi

Trần Nguyễn Tường Vi

Luận văn được đệ trình để hoàn tất yêu cầu cấp bằng Kỹ sư Chế Biến Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn: Th.s Nguyễn Hoàng Nam Kha

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2010

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi xin cảm tạ:

Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm TPHCM

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản

Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Chế Biến Thủy Sản

Thầy Nguyễn Hoàng Nam Kha

Cùng toàn thể thầy cô Khoa Thủy Sản, gia đình và bạn bè đã tận tình hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài này

Do kiến thức còn hạn chế và là lần đầu tiên thực hiện đề tài này nên không khỏi

có những thiếu sót Kính mong nhận được sự chỉ dạy, góp ý, phê bình của quý thầy cô

và các bạn

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 56 chủng E coli đã được phân lập thuần

trên người từ khoa Chăn nuôi thú y trường Đại Học Nông Lâm, 2 chủng đã được phân lập thuần từ Đại học Y Dược và 14 chủng phân lập từ 5 mẫu phân từ Bệnh Viện Đa Khoa Thủ Đức, TPHCM

Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ trên các chủng E coli phân lập từ người cho

kết quả như sau:

Về tính kháng kháng sinh: tỷ lệ vi khuẩn E coli trên người kháng với 15 loại

kháng sinh thử nghiệm lần lượt là Am (78,5%), Ax (77,1%), Ge (18,8%), Ne (20,1%),

Te (72,9%), Dx (28,5%), Ci (22,2%), Nr (22, 2%), Ng (38,2%), Bt (63,2%), Cl (18,1%), Fr (1,4%), Co (20,8%), Sm (44,4%), Kn (13,2%)

Về tính đa kháng: 85% các chủng E coli trên người có tính đa kháng (kháng với hai loại kháng sinh trở lên), 4,2% chủng E coli nhạy cảm với cả 15 loại kháng sinh

thử nghiệm

So sánh kết quả kháng sinh đồ của 72 chủng E coli phân lập từ người với 72 chủng E coli phân lập từ cá thấy rằng Am, Ax, Bt bị kháng tương đương nhau Sm là

kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất trong họ Aminoglycosides để trị bệnh cho

người và cá Ng bị kháng nhiều hơn Ci và Nr trong họ Quinolone Vi khuẩn E coli

trên cá kháng Co với tỷ lệ gấp 5 lần trên người Hai kháng sinh cấm Cl và Fr bị kháng trên cá với tỷ lệ cao hơn trên người

Vi khuẩn E coli phân lập từ cá thể hiện tính đa kháng cao hơn vi khuẩn phân lập

từ người

MỤC LỤC

Trang Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng – biểu – hình viii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt Vấn Đề 1

1.2 Mục Tiêu Nghiên Cứu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Vi Khuẩn Escherichia Coli 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 3

2.2 Định Nghĩa Kháng Sinh, Phân Loại và Cơ Chế Tác Động 4

3.1.2 Mẫu 14 3.1.3 Kháng sinh sử dụng 14

3.1.4 Một số vật liệu khác 14

3.2 Phương Pháp Nghiên Cứu 15

3.2.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 15

3.2.2 Làm thuần 15 3.2.3 Thử nghiệm khả năng sinh indol 15

3.2.4 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate 16

3.2.5 Giữ giống 17 3.2.6 Định danh vi khuẩn 17

PHỤ LỤC

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

1 ADH : Arginine dihydrolase

2 ADN : Acid Deoxyribonucleic

3 ARN : Acid Ribonucleic

4 CIT : Citrate

5 CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute

6 EC broth : Escherichia coli broth

7 EMB : Eosin Methylene Blue Agar

8 FDA : Food and Drug Administration, United States

17 ODC : Ornithine decarboxylase

18 ONPG : O-Nitrophenyl β-D- galactopyrannoside

19 PABA : p-aminobenzoic acid

20 PGA : pteroyglutamic acid

21 R : Resistive

22 S : Sensitive

23 SCA : Simmons Citrate Agar

24 TDA : Tryptophane deaminase

25 TSB : Trypticase Soy Broth

26 TSI : Triple Sugar Iron Agar

27 VP : Voges-Proskauer

DANH SÁCH CÁC BẢNG - BIỂU ĐỒ - HÌNH ẢNH BẢNG NỘI DUNG TRANG

4.1 Vi khuẩn E coli phân lập từ phân người và phân lập

từ cá tra kháng với kháng sinh 26 4.2 Tính đa kháng của vi khuẩn E coli phân lập

từ phân người và E coli phân lập từ cá tra 29

BIỂU ĐỒ NỘI DUNG TRANG

4.1 Vi khuẩn E coli trên người và trên cá tra kháng

4.2 Tính đa kháng của vi khuẩn E coli phân lập từ người

và phân lập từ cá tra 30

HÌNH NỘI DUNG TRANG

4.1 Kết quả định danh vi khuẩn bằng test API 20E 24 4.2 Vi khuẩn E coli phân lập từ người kháng với kháng sinh 31 4.3 Vi khuẩn E coli phân lập từ cá kháng với kháng sinh 32

Escherichia coli (E coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế nhất trong hệ

vi sinh vật đường ruột của người và các loài động vật Hầu hết các dòng E coli không

gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá nuôi nước ngọt có sản lượng lớn

nhất ở nước ta hiện nay Sản lượng cá tra cả năm 2009 thu hoạch ước tính đạt 1.006 nghìn tấn (theo báo cáo của Trung tâm Tin học và Thống kê (Bộ NN&PTNT)), chiếm 39,2% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, cá tra được nuôi công nghiệp với mật độ cao là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến dịch bệnh (chủ yếu do vi khuẩn) xảy

ra thường xuyên do môi trường nuôi bị ô nhiễm

Việc sử dụng kháng sinh không đúng liều lượng và thời gian trong điều trị bệnh trên người cũng như trên cá là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành tính kháng và

đa kháng kháng sinh trên hệ vi khuẩn cộng sinh Đánh giá tính kháng và đa kháng

kháng sinh của hệ vi khuẩn cộng sinh trên người, đại diện là vi khuẩn E coli, là vấn đề

cấp thiết, rất được quan tâm hiện nay Ngoài ra, việc tìm hiểu khả năng lan truyền tính kháng này thông qua việc so sánh tính kháng và đa kháng của vi khuẩn cộng sinh

(E coli) trên người và trên cá tra, một mắt xích trong chuỗi thức ăn, là một định hướng

mới cần được nghiên cứu Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “So sánh tính kháng

và đa kháng kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh E coli trên mẫu phân lập từ người và

cá tra”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn E coli từ mẫu phân người

Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ với 15 loại kháng sinh trên vi khuẩn E coli

đã được phân lập

So sánh tính kháng và đa kháng giữa E coli phân lập từ mẫu phân người và cá

tra

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi Khuẩn Escherichia coli

Vi khuẩn Escherichia coli được phân lập và mô tả đầu tiên vào năm 1885 bởi bác

sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich

E coli là trực khuẩn Gram âm không bào tử, di động nhờ chùm mao, kích thước

khoảng 1-1,5 μm E coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý, có mặt thường xuyên và chiếm

ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ở ruột già (M T Parker, 1983)

2.1.1 Phân loại:

Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn E coli thuộc:

Họ: Enterobacteriaceae

Giống: Escherichia

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

E coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi Nhiệt độ tối thích là 35 – 37oC (nhiệt độ phát triển có thể lên đến 45 – 49oC), pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu nhất là

7,2 – 7,4) E coli có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ

ở 44oC trong môi trường canh EC(Escherichia coli broth), có khả năng sinh indole khi

được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton

E coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar), sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng tròn màu trắng đục, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3 mm

Trên môi trường thạch EMB (Eosin Methylene Blue Agar), E coli cho khuẩn lạc

xanh ánh kim

Trên môi trường thạch MacConkey, E coli cho khuẩn lạc tròn, lõm ở tâm, màu

đỏ hồng

Trên môi trường thạch nghiêng TSI (Triple Sugar Iron Agar), E coli tạo acid /

acid (vàng / vàng) E coli có khả năng sử dụng cả hai loại đường glucose và lactose,

lên men kị khí glucose và lactose sinh ra acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường dẫn đến thay đổi màu sắc của môi trường từ màu xanh lá cây chuyển sang màu vàng,

không có khả năng sinh H2S

Để phân biệt E coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dựa trên tính chất sinh hóa đặc trưng của E coli được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red

(MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC

E coli cho kết quả IMViC là + + - - (Trần Linh Thước, 2002)

2.2 Định Nghĩa Kháng Sinh, Phân Loại và Cơ Chế Tác Động

2.2.1 Định nghĩa kháng sinh

Kháng sinh là chất hữu cơ có nguồn gốc sinh học, bán tổng hợp hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc giết chết vi trùng trên cơ sở tiếp hợp với một điểm tiếp nhận (receptor) trong quá trình biến dưỡng, dẫn đến sự ngưng trệ quá trình sống của vi khuẩn (Nguyễn Như Pho, 2004)

2.2.2 Phân loại

2.2.2.1 Theo khả năng diệt khuẩn

a/ Kháng sinh tĩnh khuẩn: làm ngưng sự phát triển của vi khuẩn Bạch cầu và

đại thực bào diệt khuẩn giúp cơ thể có điều kiện tham gia chống bệnh, ít tái phát bệnh sau khi ngưng kháng sinh Thích hợp với các bệnh có diễn tiến chậm, các trường hợp phòng bệnh Các nhóm kháng sinh: Tetracycline, Macrolide, Phenicol

b/ Kháng sinh sát khuẩn: diệt vi khuẩn, thích hợp cho các bệnh nhiễm trùng cấp

tính Do cơ thể không tham gia chống bệnh nên bệnh dễ tái phát sau khi ngưng kháng sinh Nhóm: Quinolones, Aminosides, Polypeptides, Betalactams, Sulfamid+Trimethoprim (Nguyễn Như Pho, 2004)

2.2.2.2 Theo cấu tạo hóa học

Các kháng sinh được phân loại theo cấu tạo hóa học, từ đó chúng có chung một

cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn tương tự Mặt khác, trong cùng một họ kháng sinh, tính chất dược động học và sự dung nạp thường khác nhau, và đặc điểm về phổ kháng khuẩn cũng không hoàn toàn giống nhau, vì vậy cũng cần phân biệt các kháng sinh trong cùng một họ (Dược lý học 2007, Đại học Y Hà Nội)

Beta-Lactamines: Penicilline G, Ampicilline, Amoxicilline, Cephalosporine

Aminosides: Streptomycin, Gentamycin, Neomycin

Tetracyclines: Oxytetracylin, Chlortetracylin, Doxycyclin, Tetracyclin base

Phenicol: Chloramphenicol, Thiamphenicol, Florphenicol

Sulfamides: Sulfadimidin, Sulfametoxazol, Sulfadimetoxin

Furans: Furaltadone, Furazolidone, Nitrofurantoin

Macrolides: Spiramycine, Lincomycine, Tylosine

Quinolones: Oxolinique, Flumequine, Fluoroquinolones

Polypeptides: Colistine, Polymyxine

Nitroimidazoles: Dimetridazole, Ronidazole

Dyaminopyrimidin: Trimethoprime, Ormethoprime, Pyrimethamine, Diaveridine (Nguyễn Như Pho, 2004)

2.2.3 Cơ chế tác động

2.2.3.1 Tác động lên thành tế bào vi khuẩn

Thành tế bào vi khuẩn có cấu tạo từ chất Peptidoglycan gồm nhiều dây Polysaccharid thẳng dọc và những đoạn ngang Pentapeptid Polysaccharid gồm nhiều phân tử đường mang amin: N-acetyl-glucosamine và N-acetyl-muramic (chỉ có ở vi khuẩn)

Tiến trình hình thành vách tế bào bắt đầu bằng sự chuyển đổi L-alanin thành alanin Sau đó hai D-alanin kết hợp với nhau Tiếp đến D-alanin dipeptid nối với ba amino acid khác và một đường N-acetyl muramic acid để tạo thành đường Pentapeptid

D-Pentapeptid kết hợp với Isoprenyl phosphate rồi di chuyển từ tế bào chất ra ngoài màng tế bào Tại đây chúng kết hợp với nhau để kéo dài thành chuỗi Peptidoglycan Bacitracin ngăn cản tiến trình này bằng cách gắn với Isoprenyl phosphate tạo phức hợp vô dụng

Vancomycin ngăn cản sự di chuyển đường Pentapeptid thành chuỗi đa phân tử bên ngoài màng tế bào

Giai đoạn cuối là hình thành dây ngang giữa các dây Peptidoglycan bằng cách nối D-alanin của một chuỗi với diaminopimelic acid của chuỗi kế cận nhờ enzyme transpeptidase

β-lactamin ức chế giai đoạn này do cấu trúc của nó giống D-alanin (một vị trí trên Peptidoglycan mà enzyme gắn vào)

2.2.3.2 Tác động lên màng bào tương

Màng bào tương có nhiệm vụ bao bọc và ngăn cách dịch tương bào Có tính thấm chọn lọc, điều hòa sự trao đổi với môi trường bên ngoài

Kháng sinh thuộc nhóm polypeptid (Colistin, Polymicin) và Polyens (chất kháng nấm) gắn kết trên các chất hóa học riêng biệt làm xáo trộn chức năng thẩm thấu khiến các chất trong màng bào tương như Mg2+, K+, Ca2+ thoát ra ngoài (tác động như một chất tẩy loại cation)

Trimethoprim ức chế dihydrofolat reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrofolat thành tetrahydrofolat (dạng hoạt động của acid folic)

2.2.3.5 Tác động lên sự tổng hợp các acid nucleic

Rifampicin: ức chế men ARN polymerase

Nhóm quinolones: ức chế men ADN gyrase cần thiết cho sự nhân đôi phân tử ADN

Nhóm nitrofurans: bám vào các base của ADN làm đứt đoạn chuỗi xoắn ADN (Nguyễn Như Pho, 2004)

2.3 Sự kháng thuốc

2.3.1 Cơ chế kháng thuốc

2.3.1.1 Vi khuẩn sản xuất enzyme phá hủy tác dụng của thuốc

Ví dụ: Vi khuẩn Staphylococci và các vi khuẩn Gr- có khả năng tiết enzyme

cephalosporinase (β.lactamase) phá hủy kháng sinh cephalosporine, làm cho kháng sinh này mất tác dụng Tuy nhiên kháng sinh cephalosporine các thế hệ sau có khả năng kháng cephalosporinase

- Ở vi khuẩn Gr- có thể tiết enzyme adenylylase, phosphorylase, acetylase phá hủy tác dụng của các loại kháng sinh nhóm Aminosides

- Tương tự, enzyme acetyltransferase của một số vi khuẩn phá hủy tác dụng của Cloramphenicol

2.3.1.2 Vi khuẩn làm thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc

Vi khuẩn có khả năng thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào khiến kháng sinh không thể đi vào tế bào vi khuẩn Do đó kháng sinh không thể kìm hãm hay tiêu diệt vi khuẩn

Ví dụ : Vi khuẩn E coli có thể thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào

khiến nhóm kháng sinh Tetracyclines, không thể vào bên trong tế bào để gắn với tiểu

phần 30s của ribosom vi khuẩn E coli, để ngăn cản ARN vận chuyển chuyển acid

amin vào vị trí A trên ARNm-ribosom để tạo chuỗi polypeptid

2.3.1.3 Vi khuẩn làm thay đổi điểm tác động của thuốc

Vi khuẩn có khả năng thay đổi điểm tiếp nhận kháng sinh để vô hiệu hóa tác dụng của kháng sinh

Ví dụ: Kháng sinh streptomycin sau khi xâm nhập vào vi khuẩn (Salmonella), gắn với tiểu phần 30s của ribosom, làm vi khuẩn đọc sai mã thông tin trên ARNm khiến quá trình tổng hợp protein bị gián đoạn Nhưng vi khuẩn có khả năng thay đổi cấu trúc điểm tiếp nhận (receptor) tiểu phần 30s của ribosom (do đột biến NST làm mất hoặc thay đổi một loại protein ở tiểu phần 30s) làm streptomycin không thể gắn

với tiểu phần 30s được, do đó quá trình tổng hợp protein ở vi khuẩn vẫn diễn ra bình thường

2.3.1.4 Vi khuẩn có thể thay đổi con đường biến dưỡng để thoát khỏi tác động của thuốc

PABA (p-aminobenzoic acid) là nguồn nguyên liệu cần thiết cho vi khuẩn tổng hợp acid folic để phát triển Do sulfamid có cấu trúc hóa học gần giống với PABA nên sulfamid đã tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic của vi khuẩn Những vi khuẩn có thể sử dụng trực tiếp acid folic từ môi trường thì đều không chịu ảnh hưởng của sulfamid Những vi khuẩn khác có thể thay đổi con đường biến dưỡng như sử dụng acid folic từ ngoài môi trường hoặc tự tổng hợp PABA trong tế bào mà không cần PABA từ bên ngoài

2.3.1.5 Vi khuẩn thay đổi enzyme

Ví dụ: Vi khuẩn nhạy Sulfamides có thể sản xuất ra enzyme tetrahydropteroic acid synthetase có ái lực cao đối với sulfonamides hơn PABA Sulfamides sẽ không gắn với PABA để ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic nữa mà gắn với enzyme tetrahydropteroic acid synthetase Kết quả là quá trình tổng hợp acid folic vẫn diễn ra bình thường

2.3.2 Nguồn gốc của đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn

Đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn được chia làm hai loại: đề kháng tự nhiên và đề kháng thu nhận

2.3.2.1 Đề kháng tự nhiên

Bản thân vi khuẩn vốn có tính kháng với kháng sinh, ví dụ: streptomycete có một

số gene kháng với kháng sinh do nó sinh ra, hoặc màng tế bào một số vi khuẩn Gram

âm có cơ chế hình thành rào cản ngăn cản sự thẩm thấu xâm nhập của kháng sinh, hoặc một số vi sinh vật thiếu hệ thống vận chuyển kháng sinh, hoặc thiếu điểm tiếp nhận kháng sinh

2.3.2.2 Đề kháng thu nhận:

Phát sinh trong quá trình phát triển của vi khuẩn do có sự thay đổi (đột biến hay tiến hóa theo chiều dọc) về cấu trúc di truyền nhiễm sắc thể hoặc do thu nhận gene kháng từ các vi khuẩn cùng hoặc khác loài (tiến hóa theo chiều ngang)

a) Tiến hóa theo chiều dọc: hoàn toàn tuân theo học thuyết tiến hóa của Darwin

– nguyên tắc chọn lọc tự nhiên: sự đột biến ngẫu nhiên trong chromosome (NST) của một vi khuẩn sẽ tạo ra tính kháng cho vi khuẩn đó trong quần thể Trong môi trường chọn lọc kháng sinh, vi khuẩn không đột biến bị tiêu diệt còn vi khuẩn đột biến này sẽ sống sót và phát triển mạnh

b) Tiến hóa theo chiều ngang: vi khuẩn nhận gene kháng từ các vi sinh vật

khác Ví dụ như: streptomycete có gene kháng với streptomycin (kháng sinh do nó sinh ra), nhưng bằng cách nào đó đoạn gene này thoát ra và đi vào E coli hoặc

Shigella Hoặc, khả năng thường xảy ra hơn là một số vi khuẩn đột biến sinh gene

kháng rồi truyền gene này cho các vi khuẩn khác qua các quá trình chuyển gen như: biến nạp (transformation), tải nạp (transduction) hay tiếp hợp (conjugation) (Kenneth Todar, 2002)

Y Học, Trung Tâm Đào Tạo Và Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TPHCM, 1993)

Có 2 phương pháp làm kháng sinh đồ là: Phương pháp đĩa khuếch tán (định tính

và bán định lượng) và phương pháp pha loãng (định lượng)

2.4.2 Nguyên lý

Các chủng vi khuẩn khác nhau có độ nhạy cảm với các loại kháng sinh ở mức độ khác nhau, chúng biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa giấy kháng sinh có chứa một nồng độ xác định khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn – kháng sinh

2.4.3 Ứng dụng

Được thử nghiệm trên bất cứ vi khuẩn nào gây ra tiến trình nhiễm trùng nhằm đảm bảo được kháng sinh trị liệu khi không thể đoán trước một cách chính xác độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh nếu chỉ dựa vào định danh vi khuẩn

Làm kháng sinh đồ để tìm hiện tượng kháng lại kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh, giúp chọn được loại kháng sinh tốt nhất để điều trị bệnh

Kiểm tra xem thuốc kháng sinh có còn tác dụng với vi khuẩn gây bệnh hay không

Thăm dò và điều tra để tìm tính kháng sinh của các dược liệu, áp dụng vào điều trị và nghiên cứu kháng sinh mới

2.4.4 Môi trường cơ bản để thực hiện kháng sinh đồ

Thạch Mueller-Hinton (MH agar) là môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh đồ, các vi khuẩn dễ mọc vì các lý do:

- Cho kết quả có tính lập lại cao khi thử nghiệm kháng sinh đồ với các loại môi trường

- Ít ức chế với Sulfamides, Trimethoprime và Tetracycline

- Thích hợp tăng trưởng cho hầu hết các vi khuẩn dễ mọc Một số lượng lớn các dữ liệu và kinh nghiệm là có từ kháng sinh đồ thực hiện trên môi trường này

2.4.5 Một số ứng dụng đạt được

Theo Nguyễn Hoàng Nam Kha và các cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu

“Thử nghiệm kháng sinh đồ trên vi khuẩn Gram âm được phân lập từ cá da trơn

(Pangasius spp)” được nuôi bè ở sông Mekong đã cho kết quả 92 chủng vi khuẩn được phân lập Trong đó, 11 chủng E coli có tỷ lệ kháng trên 90% đối với trimethoprim-

sulphamethoxazole (SXT) và oxytetracycline (OTC) Chloramphenicol (C) và

Ampicillin (AM) bị kháng trên 54% Tất cả các chủng E coli phân lập đều nhạy cảm

với nitrofurantoin (FT)

Theo Arias ML, Monge R, Artavia J, González P (2000) đã nghiên cứu “Kiểu nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn Gram âm phân lập từ thức ăn thông ruột” Nghiên cứu đã định danh 75 chủng trực khuẩn Gram âm phân lập được từ hỗn dịch thức ăn thông ruột tại ba trung tâm y tế ở Costa Rica và thử kháng sinh đồ (phương pháp Kirby – Bauer cải tiến và phương pháp ATB do Biomériaux đưa ra) Kết quả định danh cho

thấy nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế là: Aeromonas spp (22,7%), Klebsiella spp (18,7%), Proteus spp (18,7%), và Enterobacter spp (4%) Kết quả thử kháng sinh đồ

(phương pháp Kirby – Bauer cải tiến) còn cho thấy 36% các chủng kháng với Amoxycillin – Clavulanic acid, 25,3% kháng với Cefalor và 14,7% kháng với Cefuroxime Tất cả các chủng nhạy cảm với Imipenem và Ciprofloxacin Phương pháp ATB cho kết quả: vi khuẩn thể hiện tính kháng với Amoxycillin (74,6%), Amoxycillin – Clavulanic acid (34,6%), Ticarcillin – Cefalotine (22,6%) và Piperacilline (2,6%) Tất cả các chủng đều nhạy cảm với mười loại kháng sinh thử nghiệm khác

Báo Dược lâm sàng tên tiếng Anh là Clinical Pharmacy Informations (Rational

use of drugs) của đại học Dược Hà Nội số 10/2006 đăng bài “Báo cáo hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam sáu tháng đầu năm 2006” tại 10 bệnh viện tham gia chương trình “ASTS: Antibiotic Susceptibility Test Surveillance” trong đó có bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Trung ương Huế, bệnh viện Chợ Rẫy, v.v Kết quả được thống kê cho thấy: Năm vi khuẩn

gây bệnh thường gặp nhất là : Klebsiella spp 17,8%, E coli 16,0%, Acenetobacter spp 12,2%, Pseudomonas aeruginosa 11,5% và Staphylocoocus aureus 9,8% Ở E.coli

kháng sinh hàng đầu Gentamicin và kháng sinh ưa chuộng cefotaxim đã bị đề kháng ở mức 51,0% và 50,3% Ceftazidim và Cefepim bị đề kháng ở mức 28,4% và 21,6% Kháng sinh dự trữ Ertapenem và Imipenem đã có 2,1% và 1,5% đề kháng Tại các

bệnh viện miền Bắc, mức độ kháng Ampicillin của E coli trên 90% ở hầu hết bệnh

viện, trừ Huế 74,4%, bệnh viện Việt Tiệp ở Hải Phòng 84,8%

Theo Trần Thị Thanh Nga, Võ Thị Chi Mai, Trần Ngọc Sinh đã nghiên cứu

“Tình hình đề kháng kháng sinh ở khoa Tiết niệu, bệnh viện Chợ Rẫy trên 61 mẫu nước tiểu ở người bệnh điều trị ở khoa Tiết niệu, bệnh viện Chợ Rẫy cho thấy kiểu

mẫu đề kháng thuốc của E coli như sau :

AMX-NAL-SXT-CHL-NOR-CIP-GEN-CFP Amoxicillin (16/16 = 100%), Nalidixic acid (16/16 = 100%), Sulfamethoxazole (15/16 = 93,8%), Chloramphenicol (14/16 = 87,5%), Norfloxacin (14/16 = 87,5%), Ciprofloxacin (13/16 = 81,2%), Gentamicin (12/16 = 75%), Cefoperazone (11/16 = 68,75%)

Trimethoprim-Nghiên cứu về những ảnh hưởng đến sức khỏe con người và những xuất bản định

kỳ liên quan đến tính kháng kháng sinh trong sản phẩm thức ăn gia súc đã có những

báo cáo về vi khuẩn kháng kháng sinh phân lập được từ các trang trại và xác gia súc đang làm tăng thêm mối quan tâm về việc sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp có thể đóng một vai trò trong việc chọn ra những chủng kháng trong các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm Việc tạo ra những chủng vi khuẩn mang tính kháng kháng sinh hiện là một vấn đề còn gây tranh cãi Nhiều người cho rằng việc sử dụng kháng sinh bừa bãi trong nông nghiệp sẽ tạo ra một nguồn vi sinh vật mang tính kháng trong môi trường mà có thể gây tác động xấu đến sức khỏe con người thông qua chuỗi thức ăn Một số người khác lại cho rằng việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh của con người sẽ làm tăng tính kháng kháng sinh của hệ vi khuẩn cộng sinh trên người và

vi khuẩn trong môi trường Các nhà sản xuất thuốc thú y cho rằng hiện chưa có đủ bằng chứng để kết luận là có mối liên hệ giữa việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn gia súc và sự phát sinh ra các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Tuy nhiên tất cả đều đồng ý rằng, sự lan truyền và sự phổ biến của các vi khuẩn gây bệnh mang tính kháng kháng sinh là một vấn đề quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng (Bộ môn Vi Sinh,

Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm (FDA), Trung tâm quốc gia về Nghiên cứu độc chất, Jefferson, Arkansas, Hoa Kỳ, 2001)

Theo Shannon Brownlee, Washington Post (2000), vi khuẩn kháng thuốc truyền

từ gia súc sang người chủ yếu theo đường ăn thịt sống hoặc nấu không kỹ Ngoài ra có thể truyền trực tiếp từ môi trường chăn nuôi ở các trại chăn nuôi gia súc Vấn đề sử dụng thay thế nhiều loại thuốc kháng sinh mới cũng là một nguyên nhân làm vi khuẩn quen thuốc Trong thực tế, có hàng nghìn loại kháng sinh được sử dụng vào giữa những năm 1960 và nếu loại nào không hiệu lực thì bác sỹ thay thế ngay bằng loại khác Các nhà khoa học đã xác định được những loại vi khuẩn có thể kháng với tất cả các loại kháng sinh Trong khi đó, các công ty dược liệu chỉ có một vài loại thuốc mới trên thị trường Đến nay FDA đã xác định được những loại kháng sinh mới và quan trọng như: fluoroquinolones và synercid chỉ để sử dụng cho con người Còn những thuốc khác có thể dùng để phòng trị bệnh cho gia súc, nhưng không được cho vào thức

ăn nhằm mục đích tăng trọng (trích dẫn bởi Nguyễn Quang Sáng, Viện chăn nuôi nông nghiệp)

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật Liệu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thí nghiệm đã được tiến hành từ ngày 28/3/2010 đến ngày 28/6/2010 tại phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản trường Đại Học Nông Lâm TPHCM

3.1.2 Mẫu:

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 56 chủng E coli đã được phân lập thuần trên người từ khoa Chăn nuôi thú y trường Đại Học Nông Lâm, 2 chủng E coli đã được phân lập thuần từ Đại học Y Dược và 5 mẫu phân để phân lập E coli từ Bệnh

Viện Đa Khoa Thủ Đức, TPHCM

Ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, que cấy, bộ test API 20E

Tủ cấy, nồi hấp áp lực, tủ sấy, tủ đông, tủ ủ, máy lắc

Môi trường: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth (TSB), Mueller Hinton agar (MH), MacConkey Agar (MC), Eosin Methylene Blue Agar (EMB), Simon Citrate agar (SCA)…

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu

3.2.1.1 Sơ đồ thực hiện phân lập E coli

Mẫu phân

Cấy trên MC (thử nghiệm lên men lactose)

Chọn khuẩn lạc đặc trưng (đỏ, tròn lõm đặc trưng)

Cấy lại trên EMB (khuẩn lạc phát ánh xanh đặc trưng)

Chọn 1 khuẩn lạc đặc trưng

Cấy trên TSB và SCA

Kiểm tra indole, citrate

Kết luận sơ bộ E coli

Định danh kiểm tra bằng API 20E

Kết luận E coli

3.2.2 Làm thuần

Vi khuẩn sau khi được phân lập thì tiếp tục được làm thuần bằng cách chọn những khuẩn lạc riêng lẻ từ các đĩa phân lập và tiến hành cấy ria chúng vào đĩa petri khác với môi trường tương tự như môi trường dùng để phân lập Tiến hành tiếp tục ít nhất hai lần đến khi ta quan sát thấy không có khuẩn lạc khác (hình dạng, kích cỡ, màu sắc)

3.2.3 Thử nghiệm khả năng sinh indol

3.2.3.1 Nguyên tắc

Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên indol Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của indol với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-

DMABA) Nhân pyrrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của DMABA tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ

3.2.3.4 Đọc kết quả

Phản ứng dương tính: xuất hiện vòng đỏ trên bề mặt canh trường

Phản ứng âm tính: canh trường không đổi màu

3.2.4 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

3.2.4.1 Nguyên tắc

Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất và nguồn đạm ammonium Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm tăng giá trị pH của môi trường Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường

Chủng thuần trên môi trường NA được cấy ria trên bề mặt môi trường SCA trong ống thạch nghiêng Ống thạch được ủ ở 35oC trong 24-48 giờ