Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Artemisinin (ATN) và các dẫn chất như artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L.. Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư [26]. Tuy nhiên, ART là dược chất không bền, độ ổn định phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng như dung môi trong quá trình bào chế và bảo quản. Do đó, nhằm tăng độ ổn định cũng như sinh khả dụng, công nghệ nano có thể được áp dụng. Các dạng bào chế chứa TP nano có khả năng giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lượng và khoảng thời gian như dự kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, kết quả làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể người bệnh [58]. Bên cạnh liposome, TP nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế nano thu hút được khá nhiều nghiên cứu. Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học được sử dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [116]. Ngoài ra, các polyme thân nước như chitosan (CS) hay PEG có thể được sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các tiểu phân nano (viết tắt là TP nano) PLGA như tăng cường sự bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44]. Trên cơ sở đó, luận án đã được thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm: 1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 3. Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat; 4. Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu phân nano artesunat.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒ HOÀNG NHÂN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƯỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về artesunat 2

1.1.1 Công thức 2

1.1.2 Tính chất vật lý 2

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat 2

1.1.4 Các phương pháp định lượng artesunat 4

1.1.5 Tác dụng ức chế tế bào ung thư 5

1.1.6 Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thư 8

1.2 Tiểu phân nano polyme 9

1.2.1 Đặc điểm 9

1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 10

1.2.3 Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA bằng chitosan hoặc PEG 11

1.2.4 Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano 14

1.2.5 Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm 18

1.2.6 Một số nghiên cứu về tiểu phân nano PLGA chức năng hóa bề mặt bằng cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa 19

1.3 Ứng dụng công nghệ nano trong điều trị bệnh ung thư 25

1.3.1 Đặc điểm sinh học của khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc nano 25

1.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano 26

1.3.3 Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư 27

1.3.4 Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano

chứa dẫn chất của artemisinin 28

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.1 Nguyên liệu 33

2.1.2 Tế bào và động vật thí nghiệm 34

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 34

2.2 Địa điểm nghiên cứu 35

2.3 Nội dung nghiên cứu 36

2.4 Phương pháp nghiên cứu 36

2.4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat 36

2.4.2 Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 41

2.4.3 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 46

2.4.4 Đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 47

2.4.5 Theo dõi độ ổn định 52

2.4.6 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo 53

2.4.7 Xử lý số liệu 56

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57

3.1 Kết quả bào chế tiểu phân nano artesunat 57

3.1.1 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và hấp phụ vật lý 57

3.1.2 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phương pháp phun điện trường 64

3.1.3 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG 69

3.2 Kết quả đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 80

3.2.1 Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS 80

3.2.2 Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG 84

3.3 Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 88

3.3.1 Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat 88

3.3.2 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg 93

3.4 Kết quả đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân

nano artesunat 95

3.4.1 Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 95 3.4.2 Hình thái của tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đông khô 96

3.4.3 Phổ nhiễu xạ tia X 96

3.4.4 Phân tích phổ hồng ngoại 97

3.4.5 Phân tích nhiệt vi sai 98

3.4.6 Khả năng giải phóng hoạt chất in vitro 98

3.5 Kết quả đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 99

3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 99

3.5.2 Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 100

3.5.3 Độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau khi phân tán lại 105

3.6 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat 106

3.6.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro của tiểu phân nano artesunat 106

3.6.2 Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat 110

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 113

4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat 113

4.1.1 Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan 113

4.1.2 Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG 119

4.2 Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat 124

4.2.1 Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan 124

4.2.2 Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG 126

4.3 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 128

4.4 Đánh giá các đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đông khô 133

4.5 Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm 136

4.6 Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo 138

4.6.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro 138

4.6.2 Tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo 141

4.7 Đóng góp mới của luận án 146

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 147 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

MPS Hệ thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System)

Microscopy)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phát triển khối u in vivo trên chuột

của artemisinin và dẫn chất 6

Bảng 1.2 Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư 27

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng 33

Bảng 3.1 Ký hiệu và các mức của biến độc lập 59

Bảng 3.2 Ký hiệu, các mức của biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa 60

Bảng 3.3 Các công thức thực nghiệm và đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS 60

Bảng 3.4 Công thức tối ưu của TP nano ART/PLGA-CS 63

Bảng 3.5 Kết quả một số đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS bào chế theo công thức tối ưu (n=3) 63

Bảng 3.6 Các mức và thông số thiết yếu của quá trình phun điện trường kép tạo TP nano nhân - vỏ ART/PLGA-CS 64

Bảng 3.7 Ký hiệu và các mức của các biến độc lập 72

Bảng 3.8 Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ưu hóa 72

Bảng 3.9 Các công thức thực nghiệm bào chế TP nano ART/PLGA-PEG 73

Bảng 3.10 Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0 77

Bảng 3.11 Một số đặc tính TP nano bào chế theo công thức tối ưu (n=3) 78

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế hỗn dịch nano ART 79

Bảng 3.13 So sánh một số đặc điểm của quá trình bào chế các TP nano PLGA bao CS hay PEG 88

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của tá dược tạo bánh đến chất lượng sản phẩm đông khô 89

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của thể tích đến hình thức sản phẩm đông khô 92

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của thời gian đông khô đến chất lượng sản phẩm 93

Bảng 3.17 Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART 95

Bảng 3.18 Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART 100

Bảng 3.19 Chỉ tiêu hình thức, thời gian phân tán lại của bột đông khô sau thời gian bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) 101

Bảng 3.20 Hàm lượng nước, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân sau khi phân tán lại của bột đông khô chứa TP nano ART bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và

ở điều kiện thực (15-35o

C, 50-90%) (n=3) 102 Bảng 3.21 Phần trăm hàm lượng ART, giới hạn tạp chất và độ vô khuẩn trong bột đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC 103 Bảng 3.22 Độ ổn định của hỗn dịch chứa TP nano ART sau khi phân tán lại trong 4 giờ ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) 106 Bảng 3.23 Giá trị IC50 của các công thức bao PEG đối với tế bào LLC 110 Bảng 3.24 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm khi dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi (n=6) 110 Bảng 3.25 Sự phát triển của khối u khi tiêm tĩnh mạch đuôi 111

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của ART 2 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS 37 Hình 2.2 Minh họa quá trình phun điện trường kép trong bào chế TP nano dạng nhân – sợi 38 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến 40 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình bào chế TP nano ART/PLGA-PEG sử dụng PLGA-PEG 40

Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm

chứa TP nano ART trên mô hình chuột gây u bằng dòng tế bào LLC khi dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi 56 Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ CS và PLGA tới KTTP và thế zeta của TP nano ART (n=3) 57 Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch CS đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS (n=3) 58 Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ hấp phụ CS đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS (n=3) 59 Hình 3.4 Hình ảnh mặt đáp của KTTP ở các điều kiện khác nhau: khi nhiệt độ = 25o

C (A), khi pH của dung dịch CS = 4,0 (B), và khi tỉ lệ CS/PLGA (kl/kl) = 0,6; và của thế zeta của TP nano ART/PLGA-CS khi pH của dung dịch CS = 4,0 62 Hình 3.5 Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức FM1-FM4 65 Hình 3.6 Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức FM5-FM8 66 Hình 3.7 Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức FM9-FM12 67 Hình 3.8 Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức: FM13-FM16 68 Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-PEG 69 Hình 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất/polyme đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-PEG 70

Hình 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-PEG 71 Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha dầu/nước đến đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-PEG 71 Hình 3.13 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến KTTP của TP nano ART/PLGA-PEG 74 Hình 3.14 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến PDI của TP nano ART/PLGA-PEG 75 Hình 3.15 Mặt đáp biểu thị ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến tỷ lệ nạp thuốc của

TP nano ART/PLGA-PEG 77 Hình 3.16 Hình ảnh TEM của TP nano ART/PLGA-CS 80 Hình 3.17 Phổ hồng ngoại của ART, CS, PLGA, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano ART/PLGA-CS 80 Hình 3.18 Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ TP nano ART/PLGA và ART/PLGA-CS (n=3) 81 Hình 3.19 Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột ART và TP nano ART/PLGA-CS (công thức FM15, ký hiệu NPs) (n= 3) 83 Hình 3.20 Hình ảnh chụp SEM của TP nano ART/PLGA-PEG 84 Hình 3.21 Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano ART/PLGA-PEG (NPs) 84 Hình 3.22 Phổ hồng ngoại của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano ART/PLGA-PEG (NPs) 85 Hình 3.23 Phổ 1

H-NMR của TP nano ART/PLGA-PEG trong CDCl3, D2O 86 Hình 3.24 Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ TP nano ART/PLGA-PEG và

TP nano ART/PLGA (n=3) 87 Hình 3.25 Ảnh hưởng của các tá dược tạo bánh đến sản phẩm sau đông khô (A) và sau khi phân tán lại (B) 89 Hình 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ saccarose và manitol đến KTTP và PDI trước và sau khi đông khô (n=3) 90 Hình 3.27 Ảnh hưởng kết hợp tá dược tạo bánh khác nhau đến chất lượng sản phẩm đông khô (n=3) 91 Hình 3.28 Hình ảnh bánh bị phồng rộp (A) và bánh còn ướt đáy (B và C) 92

Hình 3.29 Sản phẩm sau đông khô (A) và sau khi phân tán lại (B) với thời gian sấy sơ cấp 48 giờ 93 Hình 3.30 Hình ảnh bột đông khô pha tiêm trước (A) và sau khi phân tán lại (B) 95 Hình 3.31 Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-PEG sau đông khô 96 Hình 3.32 Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý (PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG (NPs_S) 96 Hình 3.33 Phổ hồng ngoại của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose (SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tương ứng (PM_S) 97 Hình 3.34 Giản đồ nhiệt vi sai của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose (SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tương ứng (PM_S) 98 Hình 3.35 Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm chứa

TP nano ART sau khi phân tán lại trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 và pH 7,4 (n=3) 99 Hình 3.36 Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý (PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG ở các thời điểm và điều kiện bảo quản khác nhau 103 Hình 3.37 Hình ảnh SEM của TP nano ART trong bột đông khô sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3 oC 104 Hình 3.38 Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC (n=3) 105 Hình 3.39 Khả năng thấm vào tế bào của TP nano C6-PLGA và C6/PLGA-CS trên tế bào MCF-7 (A, B) và tế bào A549 (C, D) 107 Hình 3.40 Tỷ lệ tế bào sống sót ở các dòng tế bào, (A) MCF-7, (B) A549 108 Hình 3.41 Hình dáng nhân tế bào dưới kính hiển vi lase quét đồng tiêu cự sau khi xử

lý tế bào trong 24 giờ với ART nguyên liệu, TP nano ART/PLGA và ART/PLGA-CS trên tế bào MCF-7 (A) và tế bào A549 (B) 109 Hình 3.42 Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm khi dùng đường tiêm tĩnh mạch đuôi (n=6) 111 Hình 3.43 Sự phát triển của khối u ở chuột sử dụng đường tiêm tĩnh mạch đuôi 112

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Artemisinin (ATN) và các dẫn chất như artesunat (ART) là sản phẩm của quá

trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L

Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư [26]

Tuy nhiên, ART là dược chất không bền, độ ổn định phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng như dung môi trong quá trình bào chế và bảo quản Do đó, nhằm tăng độ ổn định cũng như sinh khả dụng, công nghệ nano có thể được áp dụng Các dạng bào chế chứa TP nano có khả năng giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lượng và khoảng thời gian như dự kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, kết quả làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể người bệnh [58] Bên cạnh liposome, TP nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế nano thu hút được khá nhiều nghiên cứu

Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học được sử dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều

mô và tế bào [116] Ngoài ra, các polyme thân nước như chitosan (CS) hay PEG có thể được sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các tiểu phân nano (viết tắt là

TP nano) PLGA như tăng cường sự bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44]

Trên cơ sở đó, luận án đã được thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm:

1 Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm;

2 Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm;

3 Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat;

4 Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu

phân nano artesunat

2

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về artesunat

1.1.1 Công thức

- Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của ART

- Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - Decahydro - 3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano (4,3 – j) - 1,2 - benzodioxepin - 10 -

ol, hydrogen sucinat

- Tên khác: Dihydroartemisinin-12-alpha-succinat; Succinyl artemisinin; Quinghaosu reduced succinat este

ra, ART có khả năng tan một phần trong nước ở pH=7,4 do logD7,4 nhỏ nên có thể thích hợp với dạng thuốc tiêm khi chuyển qua dạng muối (như dạng muối kiềm natri) Ở dạng thuốc tiêm, acid artesunic được dùng kết hợp với natri hydrocarbonat

để tạo dạng muối natri artesunat ngay trước khi tiêm [1], [20]

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat

1.1.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm

Là dẫn chất este của ATN, ART kém ổn định ở nhiệt độ cao và sự có mặt của

3

dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt) khi bảo quản ở 9oC, 23oC, 36,5oC thì thời gian ổn định của ART lần lượt là 130 giờ, 10,6 giờ và 1,6 giờ [24] Độ ổn định của ART đạt được tối đa khi bảo quản thuốc ở 2-8o

C [12]

Đồng thời, độ ổn định của ART bị ảnh hưởng mạnh khi có độ ẩm cao Hàm lượng ART giảm nhanh trên 2%/năm khi bảo bảo quản nguyên liệu ART ở nhiệt độ 30-35oC và độ ẩm tương đối (gọi tắt là độ ẩm) 80-90% [6] Quá trình phân hủy của thuốc được chứng tỏ có liên quan nhiều đến độ ẩm hơn, ví dụ khi bảo quản ở nhiệt

độ 50oC và độ ẩm 60%, thuốc ít bị phân hủy hơn so với khi bảo quản ở nhiệt độ

40oC và độ ẩm 75% [12]

Khi nghiên cứu sự ổn định của ART trong môi trường huyết tương, nhiệt độ cao cũng làm ART kém ổn định Ví dụ, khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC, ART có thể ổn định đến 6 ngày so với 5 giờ ở nhiệt độ phòng (24oC), ở -25oC cho thấy không có sự phân hủy sau 8 tháng [24] Thời gian bảo quản càng lâu càng dẫn đến sự phân hủy ART, ví dụ ở nhiệt độ 4oC, sau 2, 3, 6 tháng bảo quản thì hàm lượng dược chất lần lượt giảm đến 6-18%, 25-37% và 59-80%; ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ giữa ART và dihydroartemisinin (DHA) càng giảm khi thời gian bảo quản càng kéo dài [102]

Do đó, bột khô là dạng thích hợp nhất để bảo quản như đối với công thức bào chế thuốc tiêm chứa ART để hạn chế sự không ổn định hoặc công thức chỉ được phối trộn với nước ngay trước khi sử dụng Ngoài ra công thức cần được bào chế trong điều kiện kiểm soát độ ẩm và độ ổn định cần được kiểm tra trong quá trình sản xuất dưới điều kiện kiểm soát độ ẩm và bao gói trong các bao bì tránh ẩm [12]

1.1.3.2 Ảnh hưởng của pH và xúc tác acid-base nói chung

Một số thuốc chịu sự phân hủy trong dung dịch khi cho thêm acid hay base Phụ thuộc vào pKa, hầu hết các thuốc thường tồn tại ở dạng muối của acid hay base yếu

Do đó, trong dung dịch nước, các phân tử thuốc sẽ phân ly một phần hay hoàn toàn Mặc dù các hệ đệm thường được dùng trong các dung dịch dược phẩm để điều chỉnh pH của dung dịch nhưng một vài hệ sẽ xúc tác quá trình phân hủy

Các thuốc có nhóm este succinat trong cấu trúc phân tử như ART có thể bị thủy phân khi có mặt nước Đặc biệt quá trình thủy phân sẽ được thúc đẩy bởi sự hiện diện nhiều hơn của nồng độ ion hydro hoặc hydroxyl hoặc bởi xúc tác acid-base nói chung của hệ đệm

4

Nói chung, ART kém ổn định ở pH acid ART thủy phân đáng kể khi pha loãng với dung dịch glucose 5% kl/tt với pH thấp khoảng bằng 5 [24] Đồng thời, mặc dù tan được trong dung dịch kiềm tuy nhiên lại dễ thủy phân tạo DHA, ví dụ hàm lượng ART giảm còn 92-93% khi đông khô dung dịch ART có pH 9,1-9,5 [2]

Do vậy, các nghiên cứu chỉ ra rằng, giá trị pH để duy trì ổn định của ART nên nằm trong khoảng từ 7,5-8,5 như ở pH 8,2 khi đông khô dung dịch ART, hàm lượng ART vẫn duy trì bằng 98,4% gần như ban đầu [2], thuốc ổn định nhất tại đệm phosphat pH 8 trong điều kiện nhiệt độ 2-8oC và 25o

C với hàm lượng còn lại sau 1 tuần lần lượt là 94,5 ± 0,2% và 94,6 ± 0,8% [12]

1.1.3.3 Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau

Các nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của các dung môi khan nước đến sự ổn định của ART như ethanol, dimethylsulfoxid (DMSO), PEG 400,…

Việc sử dụng ethanol có thể giảm tốc độ phân hủy của ART như quá trình phân hủy chỉ xảy ra sau 3 tháng ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên tạo nhiều sản phẩm khác nhau [71]

Đối với PEG 400, quá trình phân hủy xảy ra chỉ sau 1 tháng tuy nhiên DHA là chất phân hủy duy nhất, đồng thời là chất chống sốt rét khá hiệu quả Do đó, PEG

400 là tá dược có thể đáng quan tâm do chỉ tạo mỗi DHA [71]

Nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của các hệ dung môi khác nhau đến sự phân hủy của ART trong quá trình bào chế thuốc tiêm đông khô ART Các dung môi được sử dụng trong khảo sát bao gồm dung môi số 1, nước cất, ethanol, DMSO, hoặc hỗn hợp các dung môi Kết quả hỗn hợp dung môi số 1 và nước cất được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu vì có khả năng hòa tan các thành phần trong công thức và đảm bảo tránh sự phân hủy dược chất [2]

1.1.4 Các phương pháp định lượng artesunat

- Phương pháp quang phổ UV-Vis: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng thủy

phân trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 50  1 oC trong 60 phút tạo ra sản phẩm phân hủy có khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 289  1 nm [1]

- Phương pháp quang phổ huỳnh quang: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng tạo chất huỳnh quang màu nâu xanh với hỗn hợp acid acetic và acid sulfuric (tỉ lệ 2:1) ở nhiệt độ cao 100oC trong 5 phút Bước sóng kích thích là 303 nm và bước sóng phát xạ tương ứng của ART trong methanol là 609 nm [138]

5

- Phương pháp acid – base: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng acid – base

với dung dịch NaOH 0,05 M, dùng 2 giọt phenolphthalein/ethanol làm chất chỉ thị [166]

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Với nguyên tắc sắc ký

sử dụng hệ pha động bao gồm acetonitril và đệm phosphat pH 3, với cột sắc ký pha đảo C18, detector: UV 216 nm [156]

- Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS/MS): Với nguyên tắc định lượng ART và DHA trong huyết tương người dựa trên quá trình kết tủa protein bằng acetonitril, sử dụng ATN làm chất chuẩn nội, sau đó tiến hành phương pháp sắc ký lỏng qua cột C18 trước khi vào bộ phận khối phổ tứ cực chập ba [72]

1.1.5 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

1.1.5.1 In vitro

Artemisinin và các dẫn chất của nó (ATNs), trong đó bao gồm cả ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư như: Tế bào ung thư xương (dòng có tình trạng đột biến p53 khác nhau, HOS) [43]; Tế bào u não hình sao (U373MG) [124];

Tế bào ung thư thần kinh chưa trưởng thành (UKF-NB-3, UKF-NB-6, IMR-32) [114]; Tế bào ung thư sắc tố da (A375P, A375M, G361, LOX); Tế bào mô liên kết (HT-1080); Tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung (Hela); Tế bào bị bất diệt/chuyển dạng bởi Human papillomavirus; Tế bào ung thư biểu mô màng trong dạ con (HEC-1B); Tế bào ung thư tuyến tụy (BxPC3, MiaPaCa-2), Tế bào ung thư trực tràng (CLY, HT29) [43]

1.1.5.2 In vivo

Các mô hình thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vivo của các ATNs

đã được tiến hành và có thể tóm tắt một số kết quả như ở bảng 1.1:

6

Bảng 1.1 Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phát triển khối u in vivo trên

chuột của artemisinin và dẫn chất Thiết kế nghiên cứu

(Mô hình: Tế bào sử dụng/thời điểm bắt

đầu/Nhóm thử/Nhóm chứng dương)

Xenograft: tế bào ung thư vú

MDA-MB231/khối u đạt d=5-6mm/ART (200

hay 400mg/kg/ngày), 5 ngày,

i.p./doxorubicin (8mg/kg, i.v., tuần 1 lần/2

(100mg/kg, i.p., ba ngày một lần)

Khối u bị ức chế phụ thuộc liều; liều 100mg/kg tương tự gemcitabin, tuy nhiên sự giảm cân ghi nhận ở nhóm gemcitabin mà không có ở nhóm ART

[104]

Xenograft: tế bào ung thư phổi không tế

bào nhỏ A549/khối u đạt 100mm3

/ART (60mg, 120mg/kg/ngày), p.o., hai tuần

ART ở liều 120mg/kg giảm đáng kể

sự phát triển khối u (còn liều 60mg/kg thì không), khối u đạt 56% so với nhóm chứng ở ngày 14

[109]

Allograft: mảnh khối u từ tế bào LLC

(Lewis lung cancer)/Sau khi cấy/DHA (50,

100, 200 mg/kg/ngày, p.o., 25 ngày)/

Cyclophosphamid (50mg/kg/ngày, i.p.,

cách ngày x 5 lần) và với DHA

Xenograft: mảnh khối u từ tế bào ung thư

phổi A549/Khối u đạt 80-100mm3/như

trên/cisplatin (2mg/kg, i.p.)

DHA và thuốc hóa trị làm giảm kích thước khối u Việc kết hợp thuốc cho hiệu quả tốt hơn từng thuốc riêng lẻ

Sự di căn phổi tự phát được ức chế hoàn toàn khi dùng dạng kết hợp

[176]

Xenograft: tế bào ung thư gan

HepG-2/Khối u đạt 300mm3/ART và liposome

(45mg/kg/ngày), s.c., 14 ngày

ART và dạng liposome đều ức chế sự phát triển của khối u (lần lượt là 20,5% và 32,7%)

[89]

Allograft: tế bào LLC/Khối u đạt

100-150mm3 và kết thúc khi đạt 5cm3

(hoặc >6 tuần)/DHA và phức hợp nano với PEG và

transferrin (10mg/kg/ngày), i.v., hằng

ngày

DHA và phức hợp nano ức chế sự phát triển khối u và tăng tỉ lệ sống sót của chuột, trong đó phức hợp với

transferrin cho hiệu quả cao nhất

[107]

i.p.: đường tiêm màng bụng; p.o.: đường uống, i.v.: đường tiêm tĩnh mạch; s.c.: đường tiêm dưới

da

1.1.5.3 Một số thử nghiệm và báo cáo lâm sàng có liên quan

Mặc dù đã có rất nhiều các thử nghiệm in vitro và in vivo đã minh chứng tác

dụng ức chế tế bào ung thư của các ATNs, mới chỉ có một lượng ít các thử nghiệm

7

lâm sàng và các ca lâm sàng riêng lẻ được báo cáo cho đến nay ART đã được sử dụng trong các liệu pháp điều trị ung thư cho các kết quả tốt và ít có tác dụng phụ Hiện các nghiên cứu lâm sàng vẫn đang tiếp tục như một nghiên cứu pha I ở Đức nhằm đánh giá hiệu quả và khả năng dung nạp của liệu pháp sử dụng ART kết hợp ở bệnh nhân ung thư vú giai đoạn muộn Sau 4 tuần sử dụng ART đường uống, không thấy có bất kỳ một độc tính nào đối với thính giác liên quan liều sử dụng Ngoài ra, việc theo dõi thính lực trong các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo với thời gian sử dụng ART đường uống kéo dài hơn với liều lên đến 200mg/ngày đã được chứng nhận trong nghiên cứu ARTIC-M33/2 ở châu Âu với số đăng ký 2007-004432-23 và ở Mỹ với số đăng ký NCT00764036 [78] Các kết quả đã được công

bố từ nghiên cứu này cho thấy liều 200 mg/ngày (2,2-3,9 mg/kg/ngày) ART dùng đường uống là an toàn và dung nạp tốt vì vậy liều 200 mg/ngày được khuyến cáo sử dụng cho thử nghiệm pha II/III [59], [95], [160]

Một nghiên cứu lâm sàng pha I về tính an toàn và khả năng dung nạp của ART đường tiêm tĩnh mạch ở bệnh nhân với các khối u rắn đã được tiến hành ở Mỹ với

số đăng ký NCT02353026 Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân đã được dùng các liều tăng dần từ 8-45mg/kg vào ngày thứ nhất và ngày thứ tám theo chu kỳ 3 tuần một lần nhằm xác định liều gây độc, có thể kéo dài đến 11 chu kỳ/bệnh nhân [73] Công bố ban đầu từ nghiên cứu này cho thấy liều tối đa của ART theo đường tiêm

có khả năng dung nạp tốt (MTD – Maximum Tolerated Dose) là 18mg/kg [51] Một nghiên cứu khác về pha I đã hoàn thành ở Anh đã đánh giá hoạt tính chống ung thư và khả năng dung nạp của ART ở bệnh ung thư đại trực tràng [53] Nghiên cứu được thực hiện ở 20 bệnh nhân trước khi được phẫu thuật với việc sử dụng ART 200mg bằng đường uống hằng ngày trong 14 ngày Kết quả cho thấy ART có hiệu quả trên bệnh ung thư trực tràng (với khả năng tự chết ở hơn 7% tế bào được tìm thấy lần lượt ở 67% và 55% số bệnh nhân ở nhóm ART và nhóm giả dược) và có khả năng dung nạp tốt [97]

Bệnh viện TW Quân đội 108 phối hợp với Viện Y học nhiệt đới, Đại học Tuebingen, Đức cũng đang tiến hành nghiên cứu đánh giá mức độ an toàn và hiệu quả pha II của ART dùng đường uống liều 200 mg ngày một lần trong 14 ngày đối với bệnh nhân bị ung thư đại tràng giai đoạn II/III đang chờ phẫu thuật, hiện tại

8

nghiên cứu đang lựa chọn đối tượng nghiên cứu[150], tương tự như nghiên cứu của

St George ‗s, Đại học London, Anh trên bệnh nhân ở Anh [146]

Về các ca lâm sàng, có thể liệt kê các trường hợp được báo cáo như sau: một bệnh nhân nam 72 tuổi bị ung thư tế bào vảy thanh quản, ART tiêm và uống được

sử dụng trong khoảng thời gian 9 tháng Khối u đã giảm khoảng 70% sau hai tháng điều trị Ngoài ra, ART đã có hiệu quả trong việc tăng khả năng sống sót ở hai bệnh nhân với ung thư sắc tố mắt di căn trong liệu pháp điều trị kết hợp với hóa trị liệu chuẩn Một bệnh nhân đã có đáp ứng nhất thời sau khi phối hợp ART với fotemusine và bệnh nhân thứ hai có tình trạng ổn định sau khi phối hợp ART với dacarbazine, kèm theo sự giảm tình trạng di căn đáng kể Bệnh nhân này đã sống thêm được 47 tháng sau khi được chẩn đoán giai đoạn IV của ung thư sắc tố mắt [26]

Một thử nghiệm lâm sàng trên 120 bệnh nhân bị bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn muộn đã cho thấy sự cải thiện đáng kể về việc kiểm soát bệnh và thời gian tiến triển sau khi sử dụng ART kết hợp với các thuốc hóa trị liệu truyền thống ART kết hợp với vinorelbin và cisplatin đã tăng tỉ lệ sống sót lên 13% so với liệu pháp dùng vinorelbin hoặc cisplatin chuẩn mà không có tác dụng phụ nào do ART gây ra [26]

Năm 2015, trong một nghiên cứu trên bệnh nhân 81 tuổi bị ung thư tiền liệt

tuyến ở Đức, việc sử dụng bột cây thanh cao hoa vàng Artemisia annua dưới dạng

đóng vào viên nang (thành phần gồm 50mg cao đậm đặc kết hợp với tri calci phosphat, cellulose vi tinh thể, silic dioxid và magnesi stearat) phối hợp với hoạt chất bacalitumid đã làm giảm đáng kể ung thư tiền liệt tuyến di căn cấp dựa trên khả năng giảm lượng kháng nguyên đặc hiệu của bệnh ung thư này là PSA [115]

1.1.6 Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thư

Sự phá vỡ cầu nối peroxid nội phân tử và hình thành các gốc tự do là cơ chế thiết yếu dẫn đến tác dụng chống bệnh sốt rét cũng như tác dụng ức chế tế bào ung thư của ATNs [26]

Mặc dù trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào cơ chế

ức chế tế bào ung thư của ATNs, cơ chế phân tử vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ ATNs gây ra tác dụng ức chế tế bào ung thư bằng cách ngăn cản nhiều quá trình tín hiệu tế bào Các chất này có khả năng ngăn cản quá trình nhân lên, thúc đẩy chu

9

trình tự chết, chống di căn, chống tăng sinh của tế bào ung thư [43] Cơ chế đa phương thức này có thể giải thích tính hiệu quả của ATNs trong các loại ung thư đề kháng với nhiều thuốc Một thuận lợi nữa của ATNs trong liệu pháp điều trị ung thư

là tác dụng hiệp đồng khi kết hợp với các thuốc hóa trị liệu truyền thống, từ đó có thể giảm liều và tác dụng phụ của các thuốc này [11], [26], [43]

1.2 Tiểu phân nano polyme

Trong các loại polyme, acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) là một trong những polyme tổng hợp được sử dụng phổ biến do có khả năng phân hủy sinh học hoàn toàn dưới dạng các sản phẩm chuyển hóa là CO2 và nước thông qua chu trình Krebs hoặc bài tiết qua thận dưới dạng các monome ban đầu đồng thời có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [116]

Do đó, PLGA dưới dạng các hệ mang thuốc nano hoặc micro đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau thuộc ngành Y Dược như chẩn đoán và điều trị các bệnh tim mạch, miễn dịch học và vaccin, các bệnh viêm nhiễm,… đặc biệt trong điều trị bệnh ung thư [44]

Tuy nhiên, TP nano polyme PLGA vẫn có hạn chế như khả năng bị opsonin hóa

và bắt giữ bởi hệ lưới nội mô (reticulo-endothelial system - RES) hay hệ thực bào đơn nhân (mononuclear phagocytic system - MPS) của gan và lách, tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào [116] Do đó, các polyme thân nước đã được

sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các TP nano PLGA giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài

10

thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44]

1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme

Dựa vào quy trình bào chế có thể phân chia các phương pháp bào chế TP nano polyme thành 2 nhóm [4], [74], [119]:

- Nhóm các phương pháp kết tủa

- Nhóm các phương pháp nhũ hóa

Trong đó, có thể liệt kê các phương pháp bao gồm: Kết tủa do thay đổi dung môi, nhũ hóa và bốc hơi dung môi, tự nhũ hóa hay nhũ hóa và khuếch tán dung môi, keo tụ hay gel ion hóa, muối hóa, sử dụng dung môi siêu tới hạn, phun sấy, phun điện trường

Sau đây là tóm tắt một số phương pháp thường được sử dụng:

 Nhũ hóa và bốc hơi dung môi

Nhũ tương có thể được sử dụng để tạo TP nano bằng cách hòa tan dược chất và polyme vào pha dầu, sau đó cho nhỏ giọt hỗn hợp vào pha nước có chứa chất diện hoạt Quá trình đồng nhất hóa hay siêu âm có thể áp dụng để giảm kích thước của tiểu phân đến cỡ nano Tiếp theo, bốc hơi dung môi hữu cơ và thu TP nano bằng kỹ thuật đông khô

Trong phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương, đặc tính của TP nano tạo thành bị ảnh hưởng bởi các thông số như thời gian và cường độ của quá trình đồng nhất hóa, loại và lượng chất diện hoạt, tỉ lệ polyme và hoạt chất, tốc độ bốc hơi dung môi [119]

 Nhũ hóa và khuếch tán dung môi

Đối với phương pháp này, quá trình tạo thành TP nano đòi hỏi việc sử dụng ba pha là pha dầu, pha nước, pha pha loãng Đối với dược chất thân dầu, pha dầu sẽ bao gồm polyme, dược chất và dung môi thân dầu được nhũ hoá vào một dung dịch chứa chất ổn định đã được bão hoà trước đó bằng dung môi thân dầu Nhũ tương được phối hợp với một thể tích nước lớn hơn và được khuấy trộn nhẹ nhàng, dung môi khuếch tán từ giọt pha dầu vào môi trường, hình thành các TP nano polyme [119]

 Kết tủa do thay đổi dung môi

Dược chất thân dầu và polyme có thể được hòa tan trong dung môi thích hợp

11

(thường đồng tan với nước như aceton), sau đó phối hợp vào môi trường nước có chứa chất ổn định trong điều kiện thích hợp để polyme kết tủa và bao gói dược chất, hình thành hỗn dịch nano sau khi bốc hơi dung môi [119]

 Phun điện trường "electrospraying"

Kỹ thuật phun điện trường "electrospraying" là phương pháp phun hình thành dạng giọt mịn đối với một chất lỏng chứa dược chất và polyme dưới tác động của một lực điện trường

Một thiết bị phun điện trường "electrospraying" cơ bản gồm các bộ phận như đầu súng phun dạng mao quản được nối với nguồn điện cao thế, còn bộ phận thu mẫu được nối đất Một lực điện trường mạnh sẽ được tạo thành ngoài đầu súng phun Pha lỏng được phun ra khỏi đầu súng phun có dạng mao quản dưới dạng mặt khum "meniscus" và sẽ bị kéo dài ra, sau đó phân tán thành những giọt nhỏ dưới tác động của lực điện trường Dung môi sẽ bốc hơi tạo thành các TP nano polyme rắn [74], [129]

1.2.3 Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA bằng chitosan hoặc PEG

Dựa vào các đặc điểm sinh học của khối u bao gồm hiệu ứng tăng tính thấm và lưu giữ (EPR - Enhanced Permeability and Retention) do cấu trúc bất thường của lớp lót nội mạc của các mạch máu quanh khối u, pH acid ngoại bào của khối u và các kháng nguyên đặc hiệu của khối u, các chiến lược trong kỹ thuật bào chế TP nano đã được đưa ra nhằm tăng cường tính hướng đích và lưu giữ của TP nano Dựa vào hiệu ứng EPR, các dạng thuốc nano truyền thống có thể lưu giữ tại khối u do khả năng thấm cao của các mạch máu khối u Đồng thời, do sự dẫn lưu hệ bạch huyết bị bất thường ở khối u nên các TP nano có thể lưu tại khối u đủ lâu cho phép quá trình rã của TP nano và phóng thích thuốc xảy ra tại vị trí khối u [162] Tuy nhiên, các dạng thuốc nano truyền thống dễ bị bắt giữ bởi hệ thống thực bào và tương tác không đặc hiệu với protein và tế bào [116] Do đó, để có thể dẫn thuốc tới đích và tránh thanh thải của hệ thực bào, cần tiến hành đa chức năng hóa (hay biến tính bề mặt) TP nano PLGA bằng cách thay đổi điện thế bề mặt của TP nano PLGA từ âm sang dương; ―ngụy trang‖ tiểu phân; hoặc gắn với các phối tử hướng đích các thụ thể ở bề mặt tế bào khối u [4], [112]

12

Vì vậy, áp dụng đối với TP nano polyme truyền thống như TP nano PLGA, có thể biến tính bề mặt tiểu phân bằng các polyme thân nước chẳng hạn như thay đổi điện tích bề mặt của TP nano từ âm sang dương bằng chitosan (CS) [57], hoặc

―ngụy trang‖ tiểu phân bằng PEG (hay còn gọi là PEG hóa) [135]

tính in vitro kháng lại nhiều dòng tế bào ung thư người [38], [164]

* Phương pháp tiến hành

- Hấp phụ

Nguyên t c: Trong môi trường có pH thích hợp, nhóm NH2 của CS và COOH của PLGA điện ly tạo thành các ion trái dấu tương ứng -NH3+ và -COO- CS hấp phụ lên tiểu phân nano PLGA chủ yếu theo tương tác tĩnh điện giữa các nhóm -

NH3+ và các nhóm –COO- CS có thể được phối hợp ngay trong quá trình bào chế

TP nano PLGA [130] hoặc được hấp phụ lên bề mặt TP nano PLGA đã hình thành sẵn [35] Trong đó, tỷ lệ CS:PLGA, pH dung dịch CS là những yếu tố quyết định các đặc tính TP nano PLGA-CS tạo thành như KTTP và phân bố KTTP, thế zeta, hiệu suất mang thuốc,…

Ưu điểm của phương pháp là cách tiến hành đơn giản, thời gian hấp phụ nhanh

do đó giảm nguy cơ thủy phân, cắt mạch polyme làm phá vỡ cấu trúc TP nano polyme phân hủy sinh học Tuy nhiên, các polyme hấp phụ có thể bị phản hấp phụ

trong môi trường in vivo do sự thay thế bởi các thành phần của máu có ái lực cao

hơn với bề mặt tiểu phân nano, màng bao CS có tính ổn định tương đối tùy thuộc vào độ bền của tương tác tĩnh điện [35]

- Gắn kết hóa học

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên phản ứng hóa học giữa các nhóm

polyme PLGA sau khi bào chế bằng phương pháp thích hợp được phân tán vào các

13

dung dịch đệm như đệm phosphat pH 5,0, pH 6,0, đệm 2-(N-morpholino) ethansulfonic (MES) pH 5,5 N-hydroxy succinimid (NHS) và N-(3-dimethyl aminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid hydroclorid (EDC.HCl) là tác nhân hoạt hóa và loại nước được thêm vào hỗn hợp trên để hoạt hóa nhóm carboxyl trên PLGA TP nano PLGA có nhóm carboxyl hoạt hóa trên bề mặt cho phản ứng với nhóm amino của CS trong 24 giờ để tạo liên kết carbodiimid [35], [38]

Ưu điểm của phương pháp hóa học là tạo liên kết bền vững giữa CS và PLGA [35] Nhược điểm là quy trình phức tạp và thời gian phản ứng kéo dài gây giảm hiệu suất mang thuốc, tăng nguy cơ phá vỡ cấu trúc TP nano sử dụng polyme phân hủy sinh học [38], [164]

* Phương pháp tiến hành

- Hấp phụ

Trong các tác nhân PEG hóa trên, poloxame và poloxamin là các đồng polyme

lưỡng tính hay dùng Poloxame và poloxamin bao gồm các dãy đơn vị monome ethylen oxid (EO) và propylen oxid (PO), trong đó, càng nhiều đơn vị PO thì tính thân dầu của polyme càng tăng Do đó, phần thân dầu của các polyme với các đơn

vị PO có thể được sử dụng để hấp phụ và giữ các phân tử chất diện hoạt ở bề mặt của TP nano, trong khi đó, các polyme chứa phần EO thân nước hoặc phần PEG có thể hướng về phía dung dịch và bảo vệ bề mặt của tiểu phân

Phương pháp này có thuận lợi là dễ thực hiện và có thể tạo đặc tính tránh quá trình thực bào cho các tiểu phân Ngược lại, nó cũng có nhược điểm là các polyme PEG được hấp phụ ở bề mặt có thể bị phản hấp phụ, tạo ra các lỗ trên lớp bao phủ

bề mặt nơi các opsonin có thể gắn vào Tình huống thậm chí xấu hơn nếu các

14

polyme được hấp phụ trên các TP nano có khả năng phân hủy sinh học Trong trường hợp này, không chỉ quá trình phản hấp phụ xảy ra mà quá trình phân hủy của tiểu phân cũng có thể làm tăng sự mất mát của phần PEG được gắn vào bề mặt tiểu phân [127]

- Gắn kết hóa học

Do một số hạn chế nêu trên của quá trình hấp phụ, một vài phương pháp khác nhau đã được phát triển để gắn kết hóa trị chuỗi PEG vào bề mặt của TP nano Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tiểu phân với các chuỗi PEG được gắn kết hóa trị đạt thời gian tuần hoàn trong máu dài hơn so với tiểu phân tương tự chỉ với PEG hấp phụ ở bề mặt

Tuy vậy, phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định như thường khó để đảm bảo quá trình gắn kết hóa trị của chuỗi PEG xảy ra trên bề mặt và do đó rất khó

để kiểm soát và tối ưu hóa mật độ của lớp che phủ bề mặt và cấu hình của chuỗi PEG

Ngoài ra, sự gắn kết hóa trị của PEG trên toàn bộ tiểu phân có thể thích hợp hơn đối với các tiểu phân có khả năng phân hủy sinh học vì vẫn giữ được những lợi ích của chuỗi PEG gắn trên bề mặt tiểu phân trong toàn bộ quá trình phân hủy và ăn mòn chất mang [127]

1.2.4 Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano

1.2.4.1 Đánh giá kích thước, phân bố kính thước tiểu phân và thế zeta

Phương pháp quang phổ tương quan photon (PCS – Photon Correlation Spectroscopy) hay phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS – Dynamic Light Scattering) là một trong những phương pháp nhanh nhất và phổ biến nhất để xác định kích thước tiểu phân DLS được ứng dụng rộng rãi để xác định KTTP của các tiểu phân chuyển động Brown trong hỗn dịch keo với kích thước trong khoảng nano

và dưới micromét Việc chiếu một chùm ánh sáng đơn sắc (tia lase) lên trên một hỗn dịch chứa các tiểu phân hình cầu có chuyển động Brown gây ra một sự dịch chuyển Doppler khi ánh sáng va chạm với các tiểu phân đang chuyển động, làm thay đổi bước sóng của ánh sáng tới Sự thay đổi này liên quan đến kích thước của tiểu phân Ngoài ra, phương pháp cũng có thể cung cấp thông tin về sự phân bố kích thước và về sự chuyển động của các tiểu phân trong môi trường, về đo hệ số khuếch tán của tiểu phân và sử dụng hàm tương quan [168]

15

Bản chất và cường độ điện tích trên bề mặt của các TP nano là các đặc tính quan trọng vì chúng xác định sự tương tác của các tiểu phân với môi trường sinh học và tương tác tĩnh điện của chúng với các thành phần có hoạt tính sinh học Sự

ổn định của hệ keo thường được phân tích dựa trên thế zeta của các tiểu phân Các phép đo này có thể được thực hiện thông qua thiết bị phân tích thế zeta hoặc thiết bị

đo thế zeta và cho phép tiên đoán độ ổn định của nhiều hệ phân tán keo khác nhau khi bảo quản Mức độ thân dầu của bề mặt có thể được tiên đoán từ giá trị của thế zeta Thế zeta cũng có thể cung cấp các thông tin về bản chất của các vật liệu bao gói bên trong hoặc được bao trên bề mặt tiểu phân [168]

1.2.4.2 Đánh giá hình thái cấu trúc tiểu phân

Các đặc tính chung của TP nano như KTTP, hình thái có thể được xác định thông qua một số kỹ thuật kính hiển vi hiện đại như kính hiển vi điện tử quét (SEM

- Scanning Electron Microscopy), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM - Transmission Electron Microscopy và kính hiển vi lực nguyên tử (AFM - Atomic Force Microscopy)

SEM đưa ra những thông tin về hình thái bên ngoài và cấu trúc tinh thể của mẫu bằng cách quan sát trực tiếp Mặc dù có những thuận lợi về việc phân tích hình thái và KTTP, SEM cung cấp ít thông tin về sự phân bố kích thước của các tiểu phân và các lỗ xốp trên bề mặt Phần lớn các mẫu cách điện được bao bởi một lớp mỏng các vật liệu dẫn điện như carbon, vàng, hợp kim hay kim loại khác Carbon là màng bao dẫn điện phổ biến nhất trong phân tích nguyên tố, trong khi đó màng bao kim loại lại có hiệu quả nhất trong các ứng dụng chụp ảnh điện tử có độ phân giải cao

Nguyên tắc vận hành của TEM khác so với của SEM, mặc dù dữ liệu thu được thường giống nhau Tuy nhiên, quy trình chuẩn bị mẫu đo TEM là phức tạp và tốn nhiều thời gian hơn Các đặc tính bề mặt của mẫu thu được khi một chùm tia điện tử truyền qua một mẫu siêu mỏng, tương tác với mẫu khi nó đi qua

Trong khi đó, AFM đưa ra một số thuận lợi hơn so với TEM và SEM Nó sử dụng các phép toán dựa trên lực giữa bề mặt của các tiểu phân và các đầu dò Phương pháp này có quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản, chụp ảnh nhanh và có độ phân giải cao Thuận lợi lớn nhất của AFM đó là khả năng chụp các mẫu không dẫn

Phương pháp suy giảm phản xạ toàn phần (ATR - Attenuated total reflection) là một kỹ thuật chuẩn bị mẫu được dùng kết hợp với kỹ thuật đo quang phổ hồng ngoại Phương pháp này cho phép tiến hành đo mẫu trực tiếp ở pha rắn hay lỏng mà không cần giai đoạn chuẩn bị mẫu Điều này là do mức độ thâm nhập của tia hồng ngoại trong mẫu đo ATR không phụ thuộc vào bề dày của mẫu [168]

1.2.4.4 Phổ nhiễu xạ tia X

Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD, X-ray diffraction) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để xác định cấu trúc của một tinh thể chưa biết bằng cách sử dụng một chùm tia X song song, hẹp, đơn sắc chiếu vào mẫu

Phương pháp XRD dựa trên một phương trình cơ bản, đó là phương trình Bragg, trong đó liên kết khoảng cách mạng tinh thể với các góc quan sát của các nhiễu xạ khi tia X tán xạ từ một vật liệu kết tinh Đối với các vật liệu nano, các phép

đo thường được tiến hành đối với các mẫu bột có lượng lớn các tiểu phân định hướng ngẫu nhiên

Bước sóng tia X có thể lấy từ bức xạ Kα của đồng (1.5418Ǻ) [58] Sự xuất hiện hay biến mất các đỉnh nhiễu xạ sẽ thể hiện trạng thái kết tinh hay vô định hình của mẫu vật

17

1.2.4.5 Phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ứng dụng để phân tích định lượng trong xác định tạp chất, xác định các thành phần của công thức và định lượng dược chất trong công thức và dịch sinh học

Ngoài ra, nó còn được sử dụng để xác định kích thước và xác định định tính các thành phần có trong TP nano Độ chọn lọc và độ nhạy của phương pháp đối với sự dao động phân tử giúp cung cấp những thông tin về trạng thái lý hóa của các chất có hoạt tính sinh học trong công thức nano [168]

1.2.4.6 Phương pháp phân tích nhiệt vi sai

Phương pháp phân tích nhiệt vi sai (DSC- differential scanning calorimetry) được sử dụng nhiều trong phân tích các polyme Ngoài ra, chúng cũng được sử dụng để đánh giá sự tương tác giữa các polyme và dược chất khác nhau trong một

số công thức chứa tiểu phân micro hay nano Kết quả từ phân tích DSC cũng có ý nghĩa trong việc xác định hình thái kết tinh của các polyme, cũng như trạng thái phân tán rắn hay phân tử của dược chất được bao gói trong các hệ polyme Phương pháp DSC có nhiều ưu điểm như đánh giá nhanh các tương kỵ hoặc biến đổi có khả năng xảy ra bằng cách phát hiện các thay đổi về tính chất, có sự chuyển dịch hoặc biến mất của các quá trình nóng chảy, hoặc thu nhiệt và/hoặc tỏa nhiệt, và/hoặc sự dao động về năng lượng của các phản ứng hóa học đặc trưng [168]

1.2.4.7 Đánh giá hiệu suất nano hóa và khả năng nạp thuốc

Lượng thuốc được đưa vào TP nano phụ thuộc vào khả năng của môi trường

để hòa tan hay phân tán nó, và phụ thuộc vào khả năng hấp thụ của cấu trúc chất mang Hiệu quả nạp thuốc được thể hiện qua hai thông số: hiệu suất mang thuốc (EE – Encapsulation/Entrapment efficiency, %, gọi là hiệu suất nano hóa) và khả năng nạp thuốc (LC – Loading capacity, %, gọi là tỷ lệ nạp dược chất nano)

Hiệu suất nano hóa (EE) và khả năng nạp thuốc (LC) được tính theo công thức sau [168]:

18

Trong đó, hiệu suất nano hóa bị ảnh hưởng bởi đặc tính của dược chất, dung môi và chất mang Việc xác định những thông số này đôi khi có thể gặp khó khăn liên quan đến độ chính xác của việc phân tích dược chất Việc kết hợp các phương pháp phân tách và phân tích thích hợp cần được sử dụng Các phương pháp như thẩm tích, siêu ly tâm, lọc gel và ly tâm kết hợp màng lọc có thể được sử dụng Nồng độ dược chất có thể được đo trong môi trường lỏng hoặc trong pha rắn [168]

1.2.4.8 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro

Hiện tại, vẫn chưa có một phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược

chất in vitro nào được khuyến cáo bởi FDA hay các dược điển đối với các dạng

thuốc nano Một vài thách thức liên quan đến việc phát triển phương pháp đánh giá

giải phóng in vitro đối với các thuốc nano bao gồm khó khăn trong việc tách phần

dược chất hòa tan ra khỏi TP nano một cách nhanh chóng, hiệu quả và thiếu sự hiểu biết đầy đủ về cơ chế giải phóng/hòa tan từ dạng thuốc Ngoài ra, dạng thuốc nano

có thể rất phức tạp, đôi khi được thiết kế để không giải phóng dược chất cho đến khi dạng thuốc đi đến được cơ quan/mô đích Cần lưu ý một số yếu tố có liên quan đến phương pháp giải phóng như lựa chọn thiết bị, môi trường giải phóng, thể tích, điều kiện khuấy trộn (hay tốc độ chảy), nhiệt độ

Hiện có một số phương pháp đánh giá khả năng giải phóng in vitro được sử

dụng bao gồm khuếch tán qua màng, sử dụng dụng cụ hòa tan IV trong USP, hòa tan động và thẩm tích [133]

1.2.5 Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm

TP nano sau khi bào chế có thể đưa vào các dạng thuốc khác nhau thích hợp cho các đường sử dụng thuốc như đường uống, đường tiêm

Đối với đường tiêm, có thể dùng dưới hai dạng là thuốc tiêm hỗn dịch và thuốc tiêm đông khô [4], [123]

Hỗn dịch nano có thể được tiêm qua nhiều đường khác nhau như tiêm vào khớp, thông qua màng bụng cho đến tiêm tĩnh mạch Đặc biệt, đối với trường hợp tiêm tĩnh mạch, yêu cầu số lượng tiểu phân micro phải đủ ít, cụ thể là các tiểu phân

có kích thước lớn phải nhỏ hơn đường kính các mao mạch nhỏ nhất (5-6 μm) Do

đó, có hai cách để thực hiện việc này:

- Bào chế TP nano và tiến hành lọc qua màng lọc 5 μm

Thuốc tiêm đông khô thường có khả năng kết tụ tiểu phân trong quá trình bào chế, cần được phân tán lại kỹ trước khi dùng [4] Để hạn chế khả năng kết tụ, tăng

độ ổn định của sản phẩm, thường phải kết hợp các tá dược tạo khung như các loại đường trong quá trình đông khô [8] Tiến hành đông khô với dung dịch chất tạo khung như saccarose, manitol, trehalose, glucose, lactose, dextran với tỉ lệ từ 1-20% (kl/tt) và các tá dược khác (nếu cần) đã lọc loại khuẩn để thu sản phẩm [80]

Ngoài hai dạng hỗn dịch vô khuẩn và thuốc tiêm đông khô, TP nano dùng cho đường tiêm còn có thể bào chế dưới dạng bột phun sấy So với quá trình đông khô, quá trình phun sấy là phương pháp làm khô nhanh hơn, kinh tế hơn, gồm một giai đoạn và có thể thiết kế dưới dạng một quy trình liên tục Kỹ thuật phun sấy đã thu hút rất nhiều nghiên cứu về thiết kế công thức các hệ đưa thuốc kiểm soát giải phóng có kích thước micro hoặc nano Bằng việc áp dụng các công nghệ mới như

sử dụng thiết bị Nano Spray Dryer B-90 (Buchi, Đức), có thể giúp thiết kế công thức chứa các hợp chất nhạy cảm bởi nhiệt như protein, enzyme, với KTTP thu được trong khoảng 200 nm – 5 µm Đối với việc bào chế các hệ đưa thuốc vô khuẩn chứa các tiểu phân dùng cho đường tiêm, phương pháp phun sấy này có thuận lợi do

có thể được thực hiện trong điều kiện vô khuẩn [17]

1.2.6 Một số nghiên cứu về tiểu phân nano PLGA chức năng hóa bề mặt bằng cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa

1 2.6.1 Kết hợp với chitosan

a Bằng phương pháp hấp phụ

Yang và cộng sự (2009) sử dụng phương pháp bốc hơi dung môi bào chế TP nano PLGA chứa paclitaxel, sau đó hạt nano được được thay đổi đặc tính bề mặt bằng cách hấp phụ vật lý CS Hạt nano có KTTP khoảng 200-300nm trong môi trường nước cất và tăng đáng kể trong môi trường huyết tương chuột (CDF1) nhưng

20

dễ dàng phân tán về kích thước ban đầu sau 5 phút lắc nhẹ Thế zeta của TP nano PLGA chuyển từ âm sang dương khi có mặt CS và tăng khi pH môi trường acid

hơn Sự hấp thu in vitro, độc tính của hạt nano kháng lại dòng tế bào ung thư phổi

người A549 tăng đáng kể sau khi biến tính bề mặt bởi CS Nguyên nhân là do TP nano mang điện thế dương tương tác tĩnh điện với tế bào khối u mạnh hơn trong vi môi trường acid xung quanh khối u Đặc biệt, TP nano PLGA gắn CS tăng vận chuyển đặc hiệu paclitaxel đến đích tác dụng [169]

Duran-Lobato và cộng sự (năm 2015) đã tiến hành bào chế TP nano PLGA-CS theo phương pháp hấp phụ vật lý Đầu tiên, TP nano PLGA được bào chế bằng phương pháp kết tủa, sau đó được phối hợp vào dung dịch CS trong acid acetic Công thức nano bao CS làm tăng sự tương tác với tế bào ung thư Caco-2 và hạn chế khả năng bắt giữ bởi tế bào thực bào THP1 [57]

b Bằng phương pháp gắn kết hóa học

Chen và cộng sự (2009), Wang và cộng sự (2013) đã nghiên cứu bào chế TP nano PLGA-CS làm hệ đưa thuốc theo phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương N/D/N Trong đó CS được gắn lên bề mặt TP nano PLGA theo 2 hướng (hấp phụ vật lý và liên kết hóa học) Kết quả các đặc tính lý hóa của TP nano như KTTP, thế zeta, hiệu suất nano hóa phụ thuộc nhiều vào tỷ lệ CS:PLGA (kl/kl) Sự có mặt của

CS trên bề mặt TP nano PLGA được chứng minh bởi sự thay đổi thế zeta từ âm (không có CS) sang dương (có CS), phổ nhiễu xạ tia X, phổ FT-IR [38], [164] Năm 2013, Chalikwar và cộng sự đã nghiên cứu thay đổi đặc tính bề mặt của tiểu phân PLGA với CS bằng phản ứng hóa học dưới sự xúc tác của N, N – dicyclohexyl carbodiimid (DCC) Khả năng bám dính màng nhầy tăng được khẳng

định thông qua các thử nghiệm in vitro và ex vivo trên màng nhầy mũi cừu [36] 1.2.6.2 PEG hóa

a Bằng phương pháp hấp phụ

Với mục đích kéo dài thời gian tuần hoàn của paclitaxel điều trị ung thư, Parveen S và cộng sự (2011) tiến hành bào chế TP nano paclitaxel-PLGA-CS-PEG Quá trình bào chế TP nano PLGA-CS-PEG được thực hiện bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi, trong đó pha nước chứa đồng thời CS và PEG được phối hợp với pha dầu chứa PLGA và dược chất trước giai đoạn nhũ hóa Kết quả cho thấy cả CS và PEG đều làm tăng KTTP và thế zeta của TP nano PLGA Theo tác

21

giả, sự kết hợp của PEG vào TP nano là do liên kết hydro liên phân tử giữa nguyên

tử hydro tích điện dương trong nhóm amino của chitosan với nguyên tử oxy tích điện âm của PEG, từ đó hình thành nên mạng lưới bán đan xen (semi-interpenetrating network) của chitosan và PEG Mặc dù liên kết này yếu nhưng vẫn đảm bảo hình thành các TP nano, ngoài ra sự có mặt của PEG còn được phát hiện qua các đặc tính vật lý khác như sự thay đổi điện thế và hình thái học của TP nano với hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Công thức sử dụng cả PEG và

CS cho thời gian tuần hoàn trong máu dài hơn cũng như giảm khả năng bắt giữ bởi đại thực bào so với TP nano chỉ sử dụng CS hoặc TP nano PLGA không bao Cả hai công thức sử dụng CS có hoặc không có PEG thể hiện khả năng ức chế chu kỳ phát triển tế bào và sự tăng sinh lớn hơn so với công thức không bao, điều này có thể liên quan đến khả năng nhập bào cao hơn của các TP nano được bao gói [130]

Năm 2014, Shubhra và cộng sự đã sử dụng Pluronic F68 (poloxame 188) để thay đổi đặc tính bề mặt của TP nano PLGA chứa albumin huyết thanh người Đầu tiên, TP nano PLGA chứa albumin được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa từ nhũ tương kép N/D/N, sau đó, TP nano tạo thành được bao bằng cách phối hợp với dung dịch Pluronic F68 ở các nồng độ khác nhau từ 0,1-1% (kl/tt) Kết quả phân tích cho thấy đã có sự gắn kết của Pluronic F68 trên bề mặt của TP nano PLGA thông qua sự gia tăng kích thước và thế Zeta Nồng độ 0,5% là phù hợp để bao tiểu phân PLGA bởi vì quá trình hình thành micell xảy ra khi dùng nồng độ cao hơn với 1% Pluronic F68 Tiểu phân được bao gói đã giảm được 50% khả năng hấp phụ albumin huyết thanh bò so với tiểu phân chưa được bao gói [142]

Arunkumar và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu bào chế TP nano sử dụng PLGA-PEG nhằm làm tăng độ tan, sinh khả dụng và tác dụng chống ung thư của Lutein TP nano Lutein-PLGA-PEG được bào chế bằng kỹ thuật siêu âm nhũ tương đơn – bốc hơi dung môi PLGA (10 mg/ml), lutein (2 mg/ml), PEG (4 mg/ml) được hòa tan trong 2,5 ml DCM Nhũ tương nano lutein được hình thành bằng cách thêm từ từ pha hữu cơ vào 15 ml pha nước có chứa chất diện hoạt PVA (0,5-2,0%), siêu âm trong 10 phút Bốc hơi dung môi bằng khuấy từ 600 vòng/phút để tạo thành

TP nano Lutein-PLGA-PEG dưới dạng hỗn dịch trong nước Hỗn dịch được ly tâm

ở 12000 g trong 1 giờ Phần cắn được rửa 3 lần với nước cất để loại bỏ chất hoạt động bề mặt, đông khô thu sản phẩm KTTP từ 80-500 nm, trung bình 200 nm; độ

22

tan trong nước tăng 735 lần so với lutein; khả năng kiểm soát giải phóng bền vững 66% trong 72 giờ Phân tích phổ FT-IR cho thấy không có sự tương tác hóa học giữa lutein, PLGA và PEG, có thể là lực tương tác yếu giữa các phân tử như liên kết hydro [18]

Durán-Lobato và cộng sự (năm 2015) đã tiến hành bào chế TP nano PLGA-PEG như sau: hòa tan cannabinoid (CB13), PLGA, Span 60 trong acetonitril (ACN) để đạt PLGA nồng độ 1,5 % (kl/tt), tỷ lệ dược chất/polyme là 13% Thêm nhỏ giọt 5 ml dung dịch trên với tốc độ 5 ml/phút vào 15 ml pha nước có chứa Pluronic F68 (0,5% kl/tt) trong điều kiện khuấy từ Bốc hơi dung môi ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C để thu lấy các TP nano Phần cắn sau khi rửa 2 lần với nước cất được phân tán lại trong dung dịch chứa trehalose 0,5% (kl/tt) và tiến hành đông khô thu TP nano Sau đó TP nano CB13-PLGA được ủ với dung dịch PEG 4,5 % (kl/tt) trong 4 giờ dưới điều kiện khuấy Hoặc kết hợp PEG trong pha nước với tỷ lệ 0,045 mg/ml KTTP sau khi bao với PEG không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Nếu dùng phương pháp kết hợp PEG trong pha nước thì KTTP và PDI lớn nên phương pháp này không được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Thế zeta sau khi bao PEG giảm về giá trị tuyệt đối Phân tích phổ FT-IR cho thấy sự hiện diện của PEG trong tiểu phân bao CB13-PLGA-PEG được xác nhận bởi các dải hấp thụ ở 2883 cm-1 do sự lặp lại của liên kết C-H và tại 1146 cm-1 và 1102 cm-1 do lặp lại của liên kết C-C và đặc tính C-O-C

CB13-do mạch lặp đi lặp lại -OCH2CH2- của PEG [57]

b Bằng phương pháp gắn kết hóa học

- Chỉ sử dụng PLGA-PEG

Wang và cộng sự (năm 2007) đã tiến hành nghiên cứu bào chế TP nano arsenic trioxid (ATO) sử dụng chất mang PLGA-PEG bằng phương pháp nhũ hóa và khuếch tán dung môi Các yếu tố ảnh hưởng đặc tính TP nano gồm nồng độ và loại chất nhũ hóa, nồng độ polyme, nồng độ dược chất Nghiên cứu đã lựa chọn chất nhũ hóa Tween 80 (polysorbat 80) nồng độ 0,5%, nồng độ polyme trong pha hữu cơ là 4,0 mg/ml, tỷ lệ pha hữu cơ/pha nước là 10/60, nồng độ ATO là 0,1 mg/ml Kết quả cho thấy KTTP trung bình 120,8 nm; thế zeta -10,73 mV; hiệu suất bao gói 73,60%;

tỷ lệ nạp thuốc 1,36% Nghiên cứu giải phóng in vitro cho thấy TP nano

ATO-PLGA-PEG có khả năng giải phóng nhiều hơn 26 ngày, theo phương trình Higuchi

23

(% dược chất giải phóng = 6,3979t1/2 + 3,1529, r2 = 0,9518) Việc duy trì giải phóng chủ yếu phụ thuộc vào sự khuếch tán dược chất và sự ăn mòn cốt copolyme, điều này làm cho quá trình giải phóng chậm hơn có thể do PEG đóng vai trò quan trọng

trong việc điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất Nghiên cứu in vitro về tỷ lệ bắt giữ

TP nano bởi đại thực bào ở màng bụng chuột bằng sử dụng chất đánh dấu rhodamin

B cho thấy tỷ lệ bị bắt giữ của TP nano ATO-PLGA là 62%, TP nano PEG không chứa Tween 80 là 24%, TP nano ATO-PLGA-PEG chứa Tween 80 là 17% thấp hơn 3,7 lần Kết quả này có thể do chuỗi PEG đóng vai trò như một đám mây thân nước và làm giảm giá trị tuyệt đối thế zeta của TP nano nên làm giảm tương tác với các thành phần sinh học, giảm hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào Tween 80 cũng làm giảm giá trị tuyệt đối thế zeta, do đó làm giảm sự bắt giữ bởi các đại thực bào [165]

ATO-PLGA-Với mục đích cải thiện chỉ số điều trị và giảm các tác dụng không mong muốn của paclitaxel sử dụng chất mang Cremophor EL, Danhier F và cộng sự (năm 2009) đã tiến hành bào chế TP nano Paclitaxel-PLGA-PEG bằng phương pháp nhũ hóa đơn giản và keo tụ TP nano Kết quả, KTTP sử dụng phương pháp keo tụ TP nano nhỏ hơn so với phương pháp nhũ hóa đơn giản (112 nm với 190 nm), chỉ số phân bố kích thước tiểu phân của 2 phương pháp đều nhỏ (PDI < 0,2), hiệu suất bao gói của phương pháp keo tụ cao hơn phương pháp nhũ hóa đơn giản (70% và 37%)

Nghiên cứu tác dụng chống ung thư in vivo trên tế bào ung thư cổ tử cung cho thấy

TP nano Paclitaxel-PLGA-PEG ức chế sự phát triển của khối u tốt hơn khi so sánh với Taxol [45]

Năm 2016, Rietscher và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của PLGA được PEG hóa đến sự hình thành, khả năng mang protein và giải phóng của các TP nano Các TP nano PEG hóa chứa ovalbumin được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa nhũ tương kép với từng loại PLGA, PLGA-PEG khác nhau Kết quả, các tiểu phân thu được đều có KTTP nằm trong khoảng 170-220 nm (PDI < 0,15) đối với nhiều công thức khác nhau Công thức sử dụng PLGA-PEG làm tăng khả năng nạp thuốc của tiểu phân PLGA lên 6% trong khi làm tăng khả năng giải phóng dược chất lên 25% [135]

Trong nghiên cứu của Kumar và cộng sự (2016), các tác giả đã sử dụng PEG để bào chế TP nano hướng đích chứa miltefosin bằng phương pháp kết tủa

PLGA-24

nhằm đánh giá tác dụng của công thức đối với bệnh do nhiễm Leishmania nội tạng Trong đó, PLGA-PEG được tổng hợp hóa học thông qua các phản ứng giữa COOH–PEG–NH2 và PLGA–COOH dưới sự xúc tác của các tác nhân hoạt hóa nhóm carboxylic là NHS (N-hydroxysuccinimid) và EDC ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid)), sau đó phản ứng gắn kết với nhóm amin của kháng nguyên CD14 cũng được thực hiện dựa vào xúc tác tương tự KTTP thu được nằm trong khoảng từ 10-15nm thông qua hình ảnh TEM Liều của miltefosin trong công thức nano đã giảm được 50% so với liều của miltefosin truyền thống và amphoterecin B Sự ức chế thể amastigote ở mô lách bằng công thức nano chứa miltefosin (23,21 ± 23) là đáng kể hơn so với mitefosin truyền thống (89,22 ± 52,7)

và amphoterecin B (94,12 ± 55,1) Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có sự tăng về diện tích

bề mặt tiếp xúc của TP nano chứa miltefosin và sự giảm đáng kể về kích thước,

tăng hiệu quả trong cả nghiên cứu in vitro và in vivo hơn so với miltefosin truyền

thống, amphoterecin B [99]

- Sử dụng kết hợp giữa PLGA và PLGA-PEG

Về nghiên cứu kết hợp PLGA và PLGA-PEG, tác giả Ferenz và cộng sự (năm 2013) đã tiến hành bào chế vi nang chứa perfluorodecalin bằng phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung môi với tỉ lệ PLGA:PLGA-PEG tương ứng là 92:8 Công thức bào chế có khả năng gắn kết protein thấp (như với albumin, IgG) và giảm khả năng kết tụ Việc tiêm tĩnh mạch đuôi ở chuột các công thức bào chế là tương đối an toàn

và cho thời gian bán thải dài khoảng 1 giờ [64]

Boix-Garriga và cộng sự (năm 2015) đã nghiên cứu TP nano trong trị liệu bằng phương pháp quang học Các tỉ lệ khác nhau của PLGA-PEG (5%-15% PEG) đã được khảo sát trong quá trình bào chế TP nano chứa tác nhân nhạy cảm ánh sáng thân dầu là ZnTPP bằng phương pháp kết tủa Kết quả, lớp bao PEG đã làm giảm được kích thước và thế zeta (công thức với 5% và 10% PEG) so với công thức sử dụng PLGA và tăng cường độ ổn định khi có mặt protein huyết tương (công thức với 10% PEG) Công thức sử dụng PLGA-PEG giúp dễ dàng giải phóng oxy tự do

ra khỏi môi trường ngoài do đó làm tăng độc tính quang học đối với tế bào Hela in vitro Các công thức nano đều được nội thực bào, đưa đến các lysosome và thực

hiện quá trình tự chết tế bào khi tiếp xúc với ánh sáng kích thích Do vậy, công thức nano bao gói bởi PEG rất có tiềm năng là một hệ mang thuốc trong các ứng dụng

25

quang học [30]

Năm 2016, Lin và cộng sự đã phát triển và tối ưu công thức nano chứa sorafenib sử dụng kết hợp đồng thời hai polyme này bằng phương pháp nhũ hóa với các tỉ lệ PLGA/PLGA-PEG là 0:10, 5:5 và 10:0 Việc tăng tỉ lệ PLGA làm tăng KTTP, hiệu suất nano hóa và giảm tốc độ giải phóng dược chất Các công thức có

sử dụng PLGA-PEG làm tăng đáng kể thời gian tuần hoàn trong máu của TP nano

và tăng khả năng bắt giữ bởi gan xơ ở mô hình chuột gây xơ gan bằng CCl4 Việc dùng các TP nano có sử dụng PLGA-PEG chứa sorafenib bằng đường tiêm giúp cải thiện đáng kể tình trạng xơ gan thông qua hạ hàm lượng α-actin ở mô mềm và sự sản sinh collagen ở gan của chuột gây xơ gan Ngoài ra, các công thức này đã làm

co lại đáng kể các mạch máu bất thường và giảm tỉ trọng của các vi mạch dẫn đến quá trình lành hóa mao mạch ở tổ chức gan xơ Kết quả này thể hiện tiềm năng lâm sàng của các công thức nano PLGA chứa sorafenib trong ngăn ngừa và điều trị xơ gan [106]

1.3 Ứng dụng công nghệ nano trong điều trị bệnh ung thƣ

1.3.1 Đặc điểm sinh học của khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc nano

Bệnh ung thư có thể được định nghĩa như là một quá trình bệnh lý trong đó một số tế bào thoát khỏi sự kiểm soát, sự biệt hóa sinh lý của tế bào và tiếp tục nhân lên Những tế bào này có khả năng xâm lấn và phá hủy các tổ chức xung quanh Đồng thời chúng di trú và đến phát triển ở nhiều cơ quan khác nhau và hình thành nên di căn, cuối cùng gây tử vong

Bệnh ung thư là một thách thức của y học trong thời đại của chúng ta Bất chấp những nỗ lực tột độ và nhiều tiến bộ trong suốt 30 năm qua, việc kiểm soát bệnh ung thư vẫn còn những hạn chế Các hóa chất mới thường bị hạn chế sử dụng hoặc do độc tính cao hoặc do hiệu quả thấp Do vậy, quá trình phân phối thuốc sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra những tác nhân an toàn và hiệu quả [112] Việc phân phối thuốc có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi đường

sử dụng hoặc thay đổi thiết kế công thức thuốc

Cùng với sự phát triển của các ngành khoa học khác, trong vài thập kỷ qua, ngành Dược trên thế giới đã vận dụng những thành quả của khoa học nano nói chung vào lĩnh vực nghiên cứu phát triển các dạng thuốc mới, từ đó tạo ra cuộc

26

cách mạng cho ra đời các hệ phân phối thuốc mới nhằm khắc phục những hạn chế của các dược chất và dạng thuốc truyền thống trong điều trị các bệnh khó điều trị như ung thư, HIV, bệnh về gen,…[4], [112]

Ba đặc điểm sinh học của khối u được sử dụng làm căn cứ cho việc thiết kế TP nano chứa thuốc chống ung thư định hướng đến các khối u đích gồm [112]:

- Cấu trúc bất thường của lớp lót nội mạc của các mạch máu đi qua khối u dẫn đến hiệu ứng tăng tính thấm và lưu giữ (EPR – enhanced permeability and retention)

- pH ngoại bào của khối u thấp hơn cho phép giải phóng thuốc từ các TP nano tại pH thấp hoặc định hướng các khối u đích của các thuốc nhạy cảm với acid

- Các kháng nguyên đặc hiệu của khối u giúp định hướng các TP nano chứa thuốc đến các tế bào khối u có bộc lộ các kháng nguyên này

1.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano

1.3.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro

Một số dòng tế bào ung thư được lựa chọn cho các thí nghiệm đánh giá tác

dụng kháng ung thư in vitro của TP nano Các tế bào này được nuôi cấy bằng môi

trường Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hay môi trường Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) có bổ sung 10% FBS, 1% streptomycin/penicillin ở 37 0C và 5% CO2 Đánh giá tác dụng kháng ung thư của hỗn dịch nano sau khi pha trong môi trường phân tán trên các dòng tế bào ung thư sau các khoảng thời gian 24, 48 giờ bằng các kỹ thuật trypan blue, MTT (3-(4, 5-

(Fluorescence Activated Cell Sorting), [40]

1.3.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo

 Mô hình ghép dị loài (Xenograft model)

Chuột thiếu hụt miễn dịch (hay chuột ―nude‖ như BALB/c nude) được nuôi trong phòng sạch và theo đúng khuyến cáo của nhà cung cấp động vật

Sau khi tế bào ung thư được tăng sinh đủ số lượng, khối u được tạo dưới da đùi phải chuột đực nude bằng tiêm tế bào ung thư người với số lượng trung bình 106

tế bào/con Theo dõi sự xuất hiện và kích thước u được tính theo công thức:

V (mm3) = D x R2 x 0,5 Trong đó, V: thể tích khối u; D: chiều dài khối u; R: chiều rộng khối u

27

Kích thước khối u được đo bằng thước kẹp Khi khối u đạt thể tích trung bình khoảng 100 mm3, chuột sẽ được chia thành các nhóm: nhóm chứng âm tiêm nước muối sinh lý 0,9%, các nhóm thử với các dạng bào chế khác nhau (thường là dược chất nguyên liệu và dạng bào chế của TP nano) với các nồng độ khác nhau và nhóm chứng dương (nếu có) Theo dõi kích thước khối u, tỉ lệ sống chết đến khi kết thúc thí nghiệm [89]

 Mô hình ghép đồng loài (Allograft hay syngeneic model)

Các dòng tế bào ung thư ở chuột thường được sử dụng như dòng tế bào ung thư phổi chuột LLC có khả năng gây di căn mạnh, dòng tế bào ung thư vú chuột 4T1

Sử dụng chuột có hệ miễn dịch bình thường như chuột BALB/c Cách tiến hành gây khối u, đưa thuốc và đánh giá tương tự như ở mô hình ghép dị loài [86]

1.3.3 Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thư

Bảng 1.2 Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ

Mỹ

Ung thư tuyến tụy, ung thư

vú di căn, ung thư phổi không tế bào nhỏ [27]

Doxil/Caelyx

Doxorubicin HCl PEG hóa/20mg/10 ml hoặc 50mg/25ml/Liposome

Alza/Janssen, Tập đoàn Johnson Johnson, Mỹ

Ung thư tử cung, ung thư

vú, ung thư mô liên kết do AIDS, đa u tủy [27]

citrat/50mg/Liposome Gilead Science, Mỹ

Ung thư mô liên kết ở bệnh nhân AIDS [27]

Onco-TCS/

Marqibo

Vincristin sulfat/5mg/Liposome

Inex/Talon Therapeutics, Mỹ

Bệnh bạch cầu tăng lymphô bào cấp tính [27]

Onivyde

Irinotecan PEG hóa/43mg/10ml/

Ung thư xương không di căn [77]

28

Genexol-PM

100mg/micell polyme PEG-PLA

Paclitaxel/30-Samyang, Hàn Quốc Ung thư vú, ung thư phổi,

ung thư tử cung [14]

BIND-014

Docetaxel/TP nano polyme hướng đích kháng nguyên màng

BIND Therapeutics, Mỹ Ung thư tiền liệt tuyến giai

đoạn muộn (pha II) [21]

Nhận xét: Dựa vào bảng 1.2 cho thấy phần lớn các chế phẩm sử dụng trong

điều trị ung thư cho đến nay chứa dạng nano liposome Kể từ khi liposome được mô

tả lần đầu tiên vào những năm 1960 và được đề xuất làm hệ vận chuyển thuốc trong điều trị bệnh, công nghệ nano đã có một tác động đáng kể đến sự phát triển của các

hệ vận chuyển thuốc Do vậy ngoài dạng liposome đã được nghiên cứu khá kỹ, hệ nano polyme cũng như các vật liệu hữu cơ và vô cơ khác đã và đang được sử dụng

và tiếp tục nghiên cứu để làm các giá mang thuốc nhằm phát triển các phương thức điều trị hiệu quả

1.3.4 Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân nano chứa dẫn chất của artemisinin

1.3.4.1 Tiểu phân nano polyme

a Tiểu phân nano PLGA

Với mục đích sử dụng chất mang PLGA bào chế TP nano polyme chứa ART có

tác dụng chống ung thư in vitro trên một số dòng tế bào ung thư người, Nguyễn

Hạnh Thủy và cộng sự (năm 2014) đã sử dụng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương dầu/nước TP nano ART/PLGA bào chế được có khả năng ức chế tốt hơn dạng ART tự do ở các dòng tế bào ung thư người như tế bào ung thư vú MCF-7, tế bào ung thư phổi A549 và tế bào biểu mô SCC-7 [126]

Để cải thiện khả năng kiểm soát giải phóng dược chất và hướng đích tác dụng trong việc chống lại các tế bào ung thư biểu hiện qua thụ thể CD44, Trần Tuấn Hiệp

và cộng sự (năm 2016) đã tiến hành bào chế và đánh giá một số đặc tính của TP nano ART/PLGA-HA Trong nghiên cứu này, các TP nano ART/PLGA được bào chế sau đó được bao acid hyaluronic (HA) TP nano ART/PLGA-HA khắc phục được độ tan và độ ổn định kém, hơn nữa còn giúp cải thiện tác dụng so với dạng tự

do Độc tính trên các dòng tế bào SCC-7, MCF-7 cho thấy TP nano

ART/PLGA-HA có độc tính trên tế bào ung thư lớn hơn so với ART/PLGA TP nano