nghiên cứu quy trình tinh chế poliovirus phục vụ phát triển vắc xin bại liệt bất hoạt

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu quy trình tinh chế poliovirus phục vụ phát triển vắc xin bại liệt bất hoạt” là công trình nghiên cứu của tôi cùng nhóm nghiên cứu sả

-

PHẠM ÍCH TÙNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH CHẾ POLIOVIRUS PHỤC VỤ

PHÁT TRIỂN VẮC XIN BẠI LIỆT BẤT HOẠT

CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

2 GS.TS NGUYỄN ĐĂNG HIỀN

Hà Nội - Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu quy trình tinh chế poliovirus

phục vụ phát triển vắc xin bại liệt bất hoạt” là công trình nghiên cứu của tôi cùng

nhóm nghiên cứu sản xuất vắc xin bại liệt bất hoạt thuộc Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trương Quốc Phong và GS.TS Nguyễn Đăng Hiền Tôi đã nhận được sự đồng ý của trưởng nhóm và tất cả các thành viên trong nhóm nghiên cứu về việc công bố các nội dung thực hiện và kết quả thu được Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và rõ ràng

Học viên

Phạm Ích Tùng

Xác nhận của cơ quan

(Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế)

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Trương Quốc Phong

Giám đốc - Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học - Đại học Bách

Khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành

luận văn

Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Đăng Hiền Giám đốc trung tâm

nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế, đã tận tình chỉ bảo cho em trong

suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Em xin cảm ơn các thầy, cô bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực

phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quá

trình học tập và rèn luyện

Trong thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã nhận được sự chỉ dạy tận tình

đầy trách nhiệm của tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc Trung tâm Nghiên cứu Sản

xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu

đó

Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã

luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con đường học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 10 Năm 2017

Học viên

Phạm Ích Tùng

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ARN

ATCC

Axit Ribonucleic American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ)

BS

BTP

Bovine serum (huyết thanh bê) Bán thành phẩm

IgM

K

Imuno globulin M Mẫu đối chứng âm

POLYVAC Center for Research and Production of Vaccines and Biologicals

(Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế)

WHO/ TCYTTG World Health Organization /Tổ chức y tế thế giới

Mục lục

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vi rút Bại liệt 3

1.1.1.Về hình thái học 3

1.1.2.Về thành phần hóa học của vi rút Bại liệt 3

1.1.3.Về tính chất hóa lý 4

1.1.4.Về cấu tạo của kháng nguyên 4

1.1.5.Về tính sinh miễn dịch 5

1.2 Dịch tễ học bệnh bại liệt 5

1.2.1.Tình hình bệnh bại liệt ở Việt Nam 5

1.2.2.Tình hình bệnh bại liệt trên thế giới 6

1.3 Vắc xin Bại liệt 7

1.3.1.Vắc xin Bại liệt sống giảm độc lực (OPV) 7

1.3.2.Vắc xin Bại liệt bất hoạt (IPV) 7

1.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin IPV 8

1.4.1.Trên thế giới 8

1.4.2.Ở Nhật Bản 10

1.4.3.Ở Việt Nam 10

1.5 Các phương pháp tinh chế virus 11

1.6 Tiêu chuẩn của vắc xin IPV 13

1.6.1.Sản xuất 13

1.6.2.Kiểm định vắc xin thành phẩm 13

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1.Phương pháp nuôi thu Poliovirus 16

2.2.2 Phương pháp tinh chế Poliovirus 20

2.2.3 Phương pháp đánh giá hiê ̣u quả sản xuất bán thành phẩn vắc xin IPV 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38

3.1 Kết quả nuôi thu Poliovirus 38

3.2 Kết quả tinh chế Poliovirus 40

3.2.1 Kết quả tinh chế Poliovirus bằng siêu lo ̣c 40

3.2.2 Kết quả tinh chế Poliovirus bằng siêu ly tâm 42

3.2.3 Kết quả tinh chế Poliovirus bằng sắc ký 43

3.2.4 Kết quả bất hoạt Poliovirus 45

3.3 Kết quả đánh giá hiê ̣u quả sản xuất bán thành phẩm vắc xin IPV 47

3.3.1 Kiểm tra vô trù ng trong các giai đoa ̣n 47

3.3.2 Kết quả thử nghiệm nhận dạng 49

3.3.3 Kiểm tra hàm lượng protein 49

3.3.4 Kiểm tra nồ ng đô ̣ formandehyd tồn dư 50

3.3.5 Kết quả tinh chế Poliovirus thông qua đánh giá hiệu suất, hiệu quả thu được qua môi công đoạn 51

3.4 Đề xuất quy trình sản xuất IPV bán thành phẩm 53

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

Danh mục các bảng, biểu đồ

Bảng 2.1: Kiểm tra vô trùng mẫu vắc xin sau ly tâm 26

Bảng 2.2: Pha mẫu chuẩn BSA các nồng đô ̣ 32

Bảng 2.3: Pha mẫu chuẩn với thuốc thử Bradford 1X 32

Bảng 2.4: Pha dung di ̣ch formandehyd chuẩn 33

Bảng 2.5: Thực hiê ̣n phản ứng dung di ̣ch formandehyd chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng vớ i acetylaceton 34

Bảng 3.1: Kết quả nuôi thu Poliovirus 39

Biểu đồ 1: Thu nhận Poliovirus typ 1, 2, 3 từ dịch nuôi 40

Bảng 3.2 Kết quả tinh chế Poliovirus bằng siêu lo ̣c 41

Bảng 3.3 Kết quả tinh chế Poliovirus bằng phương pháp siêu ly tâm 42

Bảng 3.4: Kết quả tinh chế Poliovirus bằng sắc ký 45

Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra virus sống tồn dư 46

Bảng 3.6: Kết quả bất hoạt poliovirus 47

Bảng 3.7: Kết quả thử vô trùng trong các giai đoạn 48

Bảng 3.8: Kết quả định typ Poliovirus bằng thử nghiệm nhận dạng 49

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng protein 49

Bảng 3.10: Kết quả kiểm tra nồng độ formandehyd tồn dư 50

Bảng 3.11: Kết quả thu hồi Poliovirus qua các công đoạn 52

Danh mục các hình

Hình 1.1: Hình thái học Poliovirus[26 ] 3

Hình 1.2: Đă ̣c điểm của màng siêu lo ̣c[37] 11

Hình 1.3: Phân loa ̣i màng siêu lo ̣c dựa vào kích thước chất tan [37] 12

Hình 2.1: Tuyp tế bào Vero từ ngân hàng tế bào Polyvac 17

Hình 2.2: Thực hiện siêu lọc mẫu Poliovirus 21

Hình 2.3: Thực hiện siêu ly tâm mẫu Poliovirus 22

Hình 2.4: Đồ thi ̣ test cô ̣t 24

Hình 2.5: Đồ thi ̣ đường “cond” ≈ 9 ms/cm 25

Hình 3.1: Tế bào bám kín 1 lớp 38

Hình 3.2: Tế bào bi ̣ hủy hoa ̣i do Poliovirus 39

Hình 3.3: Kết quả nhồi cột gel 43

Hình 3.4: Sắc ký đồ tinh chế Poliovirus qua cột DEAE sepharose CL-6B 44

Hình 3.5: Tiêu chuẩn và kết quả protein toàn phần trong mẫu poliovirus 50

Hình 3.6: Tiêu chuẩn và kết quả nồng độ formandehyd tồn dư 51

Hình 3.7: Kết quả tinh sạch các typ Poliovirus qua các công đoạn 52

MỞ ĐẦU

Bệnh bại liệt do virus là một bệnh truyền nhiễm cấp tính Thể điển hình của

bệnh có biểu hiện liệt mềm và để lại di chứng, có thể dẫn tới tử vong Nguyên nhân

gây bệnh là do virus bại liệt (Poliovirus) týp 1, 2 và 3 [4]

Sabin là người đã tìm ra vắc xin phòng bại liệt uống (OPV, vắc xin sống

uống giảm độc lực) vào năm 1957 Vắc xin này đã được sử dụng trên toàn thế giới

60 năm qua Văc xin Sabin đã được các nhà khoa học đánh giá và thực tế kiểm

nghiệm là một loại vắc xin phòng bệnh bại liệt có nhiều ưu việt Chính vắc xin

Sabin đã giúp nhiều nước trên thế giới thanh toán được bệnh bại liệt Năm 1988 Tổ

chức Y tế Thế giới đã dựa vào những thành tựu do vắc xin đem lại để đưa ra

chương trình thanh toán bệnh bại liệt trên toàn thế giới vào năm 2000

Ở Việt nam từ những năm 60 của thế kỷ thứ 20, trẻ em đã được dùng vắc xin

bại liệt Đến năm 2000 Việt nam đã trở thành một trong số các nước trên thế giới

thanh toán được bệnh bại liệt Tuy nhiên do còn nhiều nước trên thế giới vẫn chưa

thanh toán được bệnh bại liệt nên Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo việc phòng

bệnh bằng vắc xin cho trẻ em cần được tiếp tục thực hiện

Vắc xin OPV có nhược điểm là chủng Sabin có nguồn gốc từ chủng hoang

dại được làm giảm độc lực, trong quá trình phát triển tự nhiên virus Sabin có thể bị

đột biến và quay trở lại dạng độc lực, có thể gây nên bệnh bại liệt liên quan đến việc

sử dụng vắc xin

Vắc xin IPV (vắc xin bại liệt bất hoạt) ra đời từ rất sớm năm 1955 (Jonas

Salt) chế phẩm IPV có ưu điểm cao là rất an toàn, không gây ra hiện tượng bệnh bại

liệt liên quan đến sử dụng vắc xin Trước tình hình đó tổ chức y tế thế giới đã

khuyến cáo các nước đang sử dụng OPV nên từng bước chuyển sang sử dụng vắc

xin IPV tiến tới sử dụng hoàn toàn bằng vắc xin này

Yêu cầu của vắc xin IPV cần độ tinh khiết cao, không chứa các tạp chất, các

protein lạ… Poliovirus tinh khiết thu được cần có hiệu giá cao, sau đó được bất hoạt

bằng formandehyd, lượng formandehyd tồn dư không quá 0.02% thể tích bán thành

phẩm thu được Để đảm bảo tính an toàn của vắc xin thành phẩm, đạt yêu cầu theo

quy định của Dược điển Việt Nam IV và theo tiêu chuẩn của WHO chúng tôi tiến

hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu quy trình tinh chế poliovirus phục vụ phát triển vắc xin bại liệt bất

hoạt”

Mục tiêu của đề tài:

- Xây dựng được quy trình tinh chế virus bại liệt sản xuất trên tế bào vero

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Nuôi thu Poliovirus

- Nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế Poliovirus

- Nghiên cứu bất hoạt Poliovirus và đánh giá hiệu quả sản xuất bán thành

phẩm vắc xin IPV.

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vi rút Bại liệt

1.1.1 Về hình thái học

Dưới kính hiển vi điện tử, vi rút Bại liệt có

dạng hình khối cầu đường kính khoảng

27-30nm bao gồm 1 protein capsit có cấu

trúc bền vững bao bọc lấy ARN của vi rút

Capsit bao gồm 60 tiểu đơn vị giống hệt

nhau xếp đối xứng 20 mặt, mỗi tiểu đơn vị

gồm 4 chuỗi polypeptit là VP1; VP2; VP3;

và VP4 Bằng phương pháp chiếu xạ tia X

người ta biết chi tiết cấu trúc của hạt vi rút

1.1.2 Về thành phần hóa học của vi rút Bại liệt

• Vật liệu di truyền của Poliovirus: Là ARN một sợi dương, có chiều dài

2,4m, trọng lượng phân tử 2,5 x 106 dalton cuộn lại nằm gọn trong vỏ capsit Đầu

5’ có một đoạn polypeptit được gọi là VPg gồm 11 axit amin gắn vào còn đầu 3’ bị

polyadenyl hóa ARN của vi rút được chia thành 3 vùng chủ yếu: Vùng không mã

hóa đầu 5’ bao gồm 740 nucleotide, chiếm khoảng 10% vật liệu di truyền Khung

đọc mở đơn bao gồm 6635 nucleotide chiếm khoảng 89% vật liệu di truyền Vùng

không mã hóa 3’ bao gồm 75 nucleotide, chiếm khoảng 1% vật liệu di truyền [4]

• Protein: Protein capsit của vi rút Bại liệt bao gồm 4 chuỗi polypeptit VP1

bao gồm 306 axit amin có trọng lượng phân tử 35,5 KDa; VP2 bao gồm 272 axit

amin có trọng lượng phân tử 30,0 kDa; VP3 gồm 238 axit amin có trọng lượng

phân tử 26,4 KDa và VP4 gồm 69 axit amin, trọng lượng phân tử 7 KDa Trong đó

VP1, VP2, VP3 tạo nên cấu trúc bề mặt của virus còn VP4 nằm trong vỏ capsit và

liên kết với axit nhân (ARN) Các Protein bề mặt tạo nên các vị trí kháng nguyên

trung hòa Ngoài ra vỏ capsit còn có tác dụng bảo vệ axit nhân và quyết định khả

năng hấp phụ của virus lên bề mặt tế bào thông qua các thụ thể đặc hiệu [4]

• Lipit: Virus Bại liệt không chứa lipit nên không nhạy cảm với tác động của

ete, cồn, phenol 1% và các thuốc tẩy thông thường Dựa vào đặc tính này người ta

sử dụng cloroform để xử lý bệnh phẩm trước khi phân lập virus mà không làm mất

hoạt tính của virus [4]

1.1.3 Về tính chất hóa lý

Virus Bại liệt rất nhạy cảm với nhiệt độ Ở 56oC virus bị bất hoạt hoàn toàn

trong vòng 30 phút Ở nhiệt độ 20-24oC virus bị bất hoạt vào cuối tháng thứ 3 Ở

nhiệt độ 37oC vius giảm hiệu giá hàng ngày vào khoảng 0,15 lg [5]

Virus Bại liệt tăng tính chịu nhiệt khi có mặt của của ion canxi hoặc ion

magie ở nồng độ 1M

Virus Bại liệt bền vững với dải pH rộng từ 2-10, nhưng pH thích hợp nhất tại

pH 6,5-7,2

Ngoài ra virus Bại liệt bị bất hoạt hoàn toàn bởi formandehyd nhưng tính

kháng nguyên vẫn bảo tồn nguyên vẹn [2]

1.1.4 Về cấu tạo của kháng nguyên

Kháng nguyên của hạt virus hoàn chỉnh có khả năng gây nhiễm trùng gọi là

kháng nguyên D (hay còn gọi là kháng nguyên N) Khi hạt virus bị đun nóng

50-600C hình thái của hạt virus bị thay đổi và kháng nguyên D chuyển thành kháng

nguyên C (hay còn gọi là kháng nguyên H) Kháng nguyên D có hằng số lắng là

160S còn kháng nguyên C có hằng số lắng là 80-90S [4,24]

Kháng nguyên D là hạt virus hoàn chỉnh bao gồm cả ARN và vỏ capsit, còn

kháng nguyên C chỉ là vỏ capsit không có axit nhân và VP4 Kháng nguyên D và C

không có phản ứng miễn dịch chéo Hai kháng nguyên này được phát hiện bằng

phản ứng kết hợp bổ thể và phản ứng kết tủa trên thạch

Kháng nguyên D có khả năng tạo kháng thể trung hòa đặc hiệu typ và bám

vào thụ thể của tế bào cảm thụ, nhờ chức năng này mà virus có thể xâm nhập vào

bên trong tế bào cảm thụ để nhân lên

Kháng nguyên C là kháng nguyên chung cho tất cả các typ, nó kích thích cơ

thể tạo ra kháng thể kết hợp bổ thể nhưng nếu dùng kháng nguyên này để chế tạo

kháng huyết thanh thì sẽ không thu được kháng thể trung hòa [4,5,24]

1.1.5 Về tính sinh miễn dịch

Miễn dịch thụ động được truyền từ mẹ sang con Kháng thể này chỉ xuất hiện

ở trẻ sơ sinh sau đó giảm dần và biến mắt khi trẻ được 6 tháng tuổi

Miễn dịch chủ động là sự đáp ứng miễn dịch khi cơ thể bị nhiễm virus tự

nhiên hoặc sử dụng vắc xin Đây là loại miễn dịch quan trọng mà loài người đã biết

ứng dụng để phòng bệnh bằng cách dùng vắc xin Khi bị nhiễm virus Bại liệt hoang

dại hoặc virus vắc xin, cơ thể tạo ra miễn dịch đặc hiệu chống lại virus Bại liệt

Kháng thể đặc hiệu chủ yếu là miễn dịch dịch thể bao gồm IgM, IgG và IgA

Kháng thể IgM và IgG phát hiện được sau khi nhiễm vi rút 2-3 ngày Hiệu

giá kháng thể cao ở những ngày đầu và hết sau 2-3 tháng Hiệu giá kháng thể IgG

tăng và tồn tại lâu nhất trong cơ thể có thể tới 40 năm, đây là kháng thể trung hòa có

khả năng chống lại vi rút Bại liệt đến hệ thần kinh trung ương Hiệu giá kháng thể

IgA phát hiện 2-6 tuần sau khi nhiễm vi rút nhưng hiệu giá thấp, tăng chậm trong 3

tháng đầu sau khi nhiễm vi rút và tồn tại trong 6 năm [2,4]

1.2 Dịch tễ học bệnh bại liệt

1.2.1 Tình hình bệnh bại liệt ở Việt Nam

Năm 1952 vụ dịch bại liệt lớn đầu tiên được phát hiện ở Hà Nội có khoảng

1500 người mắc Trong 3 năm liên tục 1957,1958,1959 đã xảy ra 3 vụ dịch lớn ở Hà

Nội và Miền bắc Việt Nam với hàng ngàn người mắc trong đó 80-90% là trẻ < 3tuổi

Vụ dịch năm 1959 với tỷ lệ mắc trên toàn miền bắc là 44,99/100.000 dân , còn riêng

Hà Nội tỷ lệ mắc là 226/100.000 dân Vắc xin bại liệt (Sabin) được sử dụng đầu tiên

ở Miền Bắc từ tháng 12 năm 1959 do Liên Xô cung cấp với số lượng ít Từ cuối

năm 1961 đầu năm 1962 bắt đầu dùng vắc xin Sabin do Việt Nam sản xuất và dùng

liên tục cho đến ngày nay [8]

Sau khi giải phóng miền nam thống nhất đất nước năm 1975 bệnh bại liệt

xuất hiện ở nhiều nơi trong cả nước nhất là các tỉnh phía nam

Năm 1981 Việt Nam tiến hành chương trình TCMR cho trẻ dưới 1 tuổi Đến

năm 1986 chương trình được mở rộng trên phạm vi cả nước Chương trình uống vắc

xin phòng Bại liệt đã đạt được kết quả cao Trong những năm 80 đạt 87% và trong

những năm 90 đạt trên 90% Kể từ năm 1993 hàng năm còn tổ chức 2 đợt những

ngày tiêm chủng toàn quốc cho trẻ dưới 5 tuổi uống 2 liều vắc xin bại liệt đạt trên

99% Do đó tình hình mắc bệnh bại liệt giảm đi rõ rệt Năm 1993, năm bắt đầu

chiến dịch những ngày TCTQ, có 152 ca bại liệt trong toàn quốc Năm 1994 còn 31

ca Năm 1995 còn 12 ca, đến 1996 chỉ còn 2 ca và năm 1997 chỉ còn 1 ca Đến năm

2000 Việt Nam đã công bố thanh toán được bệnh bại liệt, đến nay chưa phát hiện

thêm ca mắc mới nào [8]

1.2.2 Tình hình bệnh bại liệt trên thế giới

Năm 1887 một vụ dịch lớn sảy ra ở Stôckhôm, đây là vụ dịch bại liệt đầu

tiên được người ta biết đến

Từ cuối thế kỷ 19 và nửa đầu thế kỷ 20 nhiều vụ dịch lớn xảy ra ở châu Âu

và Mỹ Đặc biệt sau chiến tranh thế giới lần thứ II bệnh bại liệt đã lan tràn khắp thế

giới

Vắc xin phòng bệnh bại liệt được sử dụng đầu tiên ở Mỹ ( IPV-1955) và

Liên Xô vào năm 1959 (OPV) Đến năm 1974 TCYTTG bắt đầu thực hiện

CTTCMR trong đó có bại liệt Năm 1985 TCYTTG khu vực Mỹ La tinh đưa ra

chương trình thanh toán bại liệt trong khu vực Năm 1988 TCYTTG đưa ra chương

trình thanh toán bại liệt toàn cầu vào năm 2000 Số trẻ dưới 1 tuổi được tiêm chủng

vắc xin phòng Bại liệt đạt tới 85% Hàng năm các nước còn tổ chức 2 đợt những

ngày tiêm chủng toàn quốc cho toàn bộ số trẻ dưới 5 tuổi đạt trên 95% [7, 35]

Năm 1992 cả thế giới có 14.467 trường hợp thì vùng Đông và Nam Á

chiếm 9.184 (Gồm các nước Ấn Độ, Pakistan, Bangladet) và khu vực Tây Thái

Bình Dương có 1.890 ca ( gồm Trung quốc, Nhật Bản, Philipin) Ở Braxin nơi có tỷ

lệ mắc rất cao thì đến năm 1992 số ca do virus hoang dại đã không còn nữa Châu

Mỹ tuyên bố không còn bệnh bại liệt năm 1994 [11, 25]

Năm 2000, bệnh bại liệt được tuyên bố đã loại bỏ chính thức ở 37 quốc gia

phía tây Thái Bình Dương, bao gồm cả Trung Quốc và Úc [10]

Châu Âu tuyên bố không còn bệnh năm 2002

Cho đến năm 2012, bại liệt chỉ còn phổ biến ở 3 quốc gia là Nigeria, Pakistan,

và Afghanistan Song, trong thời gian gần đây, bệnh bại liệt đã vượt ra khỏi biên

giới của 3 quốc gia này và tiến sang các đất nước láng giềng Có tới 7 quốc gia đã

từng "xóa sổ" bệnh bại liệt ghi nhận nhiều trường hợp mắc bệnh trở lại sau nhiều

năm: Cameroon, Guinea, Ethiopia, Iraq, Israel, Somalia và Syria WHO đã từng hy

vọng có thể công bố xóa sổ bệnh bại liệt trên toàn cầu vào năm 2000 Cột mốc này

sau đó bị chuyển thành 2005, 2008, 2012, 2015 và giờ là 2018[6]

1.3 Vắc xin Bại liệt

1.3.1 Vắc xin Bại liệt sống giảm độc lực (OPV)

Vắc xin sống giảm độc lực còn gọi là vắc xin Sabin được sản xuất trên tế bào

thận khỉ tiên phát hoặc thứ phát (Vero)[12] Chủng của 3 typ dùng để sản xuất vắc

xin Sabin được nhận từ chủng giảm độc lực do Sabin cấy truyền và cải tạo từ chủng

hoang dại Virus vắc xin Sabin là virus giảm độc lực nên virus kích thích cơ thể tạo

cả miễn dịch tại chỗ và miễn dịch dịch thể Vì vậy OPV vừa ngăn chặn virus hoang

dại vào hệ thống thần kinh trung ương vừa ngăn chặn virus Bại liệt hoang dại xâm

nhập và nhân lên tại đường xâm nhập OPV tạo miễn dịch sớm và tồn tại lâu dài,

giá thành rẻ, dễ sử dụng nên sử dụng rộng rãi trên toàn cầu đặc biệt là các đang và

kém phát triển [8,10]

1.3.2 Vắc xin Bại liệt bất hoạt (IPV)

Vắc xin bại liệt bất hoạt hay còn gọi là vắc xin Salk được sản xuất trên tế bào

thận khỉ tiên phát hoặc thứ phát, chủng của 3 typ dùng để vắc xin là chủng hoang

dại Mahoney (đối với týp 1), MEF (týp 2) và Saukett (týp 3) Hầu hết các nhà sản

xuất trên thế giới đều dùng những chủng này trừ Thuỷ Điển họ dùng chủng

Brunenders cho týp 1 Đòi hỏi đầu tiên của văcxin Bại liệt bất hoạt là việc bất hoạt

hoàn toàn tính gây bệnh của virus mà không ảnh hưởng đến khả năng gây ĐƯMD

của chúng Vắc xin IPV chỉ có thể tạo ra được ĐƯMD dịch thể, chúng chỉ có thể

ngăn ngừa sự lan toả của virus từ hầu họng và ruột non đến hệ thần kinh trung ương

chứ không thể bất hoạt và ngăn ngừa sự nhân lên của virus ở hầu họng và ruột

được Khi bị nhiễm virus Bại liệt hoang dại những người được tiêm IPV vẫn đào

thải virus ra ngoài và trở thành một nguồn lây nguy hiểm Hay nói cách khác IPV

chỉ có thể bảo vệ cho từng cá nhân riêng lẻ [5,12]

1.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin IPV

1.4.1 Trên thế giới

Năm 1936, Brodie, Park và Kolmer đã dùng phương pháp hóa học để bất

hoạt hỗn dịch virus thu được sau khi gây nhiễm virus vào hệ thống thần kinh trung

ương của khỉ Nhưng do khả năng kiểm tra tính an toàn của vắc xin chưa được tốt

nên vắc xin gây ra nhiều tai biến và không được sử dụng

Năm 1948 Morgan đã chứng minh hỗn dịch virus Bại liệt typ II được bất

hoạt bằng Formandehyd có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên khỉ Cũng theo

phương pháp đó, người ta đã thực hiện với virus typ I Nghiên cứu trên chuột đã

khẳng định rằng virus Bại liệt typ II gây được miễn dịch trên loài gặm nhấm Năm

1952 tiến hành thử nghiệm trên đười ươi và 6 người tình nguyện cho thấy kháng thể

tồn tại trên 6 tháng Những kết quả nghiên cứu này cho thấy virus bất hoạt bằng

Formandehyd có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo vệ cơ thể khỏi bị bệnh Bại

liệt [31,35]

Một phát hiện có tính đột phá là virus Bại liệt có khả năng nhân lên trên các

nuôi cấy tế bào mô thần kinh của người và khỉ, sau đó người ta biết được rằng virus

Bại liệt có khả năng nhân lên trên nuôi cấy tế bào thận khỉ Hỗn dịch gặt được từ

nuôi cấy tế bào thận khỉ được bất hoạt bằng Formandehyd có khả năng gây đáp ứng

miễn dịch Hiệu lực bảo vệ của cả 3 typ vắc xin bất hoạt bằng Formandehyd đã

được chứng minh qua một thử nghiệm lớn trên thực địa của Thomas Francis năm

1954 Kết quả của thử nghiệm này cho thấy vắc xin có hiệu lực bảo vệ đạt 80-90%

trong đó typ I là 60-70%, typ II và typ III là 90 và trên 90% Sự khác biệt giữa các

typ và hiệu lực thấp hơn so với dự kiến là do sự có mặt của Thimerosal một chất

dùng làm chất bảo quản trong đó hàm lượng của chất này trong typ I lớn hơn typ II

và typ III Vấn đề này được chứng minh một cách rõ ràng khi người ta thay thế

Thimerosal bằng chất khác Vắc xin bất hoạt còn gọi là vắc xin Salk, được sản xuất

trên tế bào thận khỉ tiên phát, bất hoạt virus bằng formandehyd có nồng độ cuối

cùng là 1/4000 [32,34]

Tháng 4/1955, vắc xin Bại liệt bất hoạt đã được sử dụng trước mùa dịch Bại

liệt tại Mỹ Đến năm 1961 số trẻ mắc bệnh giảm xuống tới 90% so với giai đoạn

trước khi dùng vắc xin Kết quả này đạt được khi 54% dân số đã nhận đủ 3 hoặc

hơn 3 liều vắc xin bất hoạt chủ yếu là trẻ em [35]

Tiếp theo đó IPV đã được sản xuất và sử dụng ở nhiều nước trên thế giới,

phương pháp sản xuất, tinh chế, kiểm định vắc xin bại liệt bất hoạt đã có nhiều tiến

bộ và thay đổi so với phương pháp được sử dụng trong thời gian đầu

Ban đầu vắc xin được sản xuất trên NCTB thận khỉ tiên phát trong những

chai nhỏ ( Chai dẹt, dung tích 1,2-1,5 lít) Nhưng ngày nay nó đã được nuôi cấy trên

những bình lớn (Tank) với những vật mang vi thể (Microcarier) [31,33] Bước tiếp

theo của qui trình sản xuất là cô đặc nước nổi, tinh chế và bất hoạt bằng

formaldehyde để loại bỏ tính gây bệnh của virus mà vẫn giữ được tính kháng

nguyên [35] Đòi hỏi đầu tiên của vắc xin bại liệt bất hoạt là việc bất hoạt hoàn toàn

tính gây bệnh của virus mà không ảnh hưởng đến khả năng gây đáp ứng miễn dịch

của chúng Đó là kết quả của quá trình nghiên cứu quá trình virus bị bất hoạt tại

những nhiệt độ khác nhau cũng như là tại các nồng độ formandehyd khác nhau Với

những điều kiện thích hợp kháng nguyên vẫn còn tính miễn dịch tốt như thời điểm

mà virus chưa bị bất hoạt [32,35]

Để tránh nhiễm trùng trong quá trình sản xuất một số kháng sinh đã được sử

dụng như Streptomycin, Neomycin, Polymycin B Trong quá trình tinh chế các

kháng sinh này sẽ được làm giảm đến mức không thể chuẩn độ được ở vắc xin

thành phẩm Lượng nhỏ formandehyd và 2-phenoxyethamol còn lại trong vắc xin

được coi như là chất bảo quản

Hiện nay hầu hết các cơ sở sản xuất văc xin IPV như Mỹ và các nước Châu

Âu sử dụng chủng virus hoang dại [35]

1.4.2 Ở Nhâ ̣t Bản

Xuất phát từ viê ̣c sử du ̣ng vắc xin OPV đã ngăn chă ̣n được các vu ̣ di ̣ch lớn

trong năm 1960- 1961 từ 5606 trường hợp bi ̣ ba ̣i liê ̣t xuống còn 20 trường hợp năm

1963 Nhưng những năm sau đó các báo cáo sau đó chỉ ra rằng bê ̣nh ba ̣i liê ̣t có liên

quan đến virus vắc xin, viê ̣c sử du ̣ng vắc xin an toàn hơn để không còn virus vắc

xin lưu hành là yêu cầu cấp thiết Những nghiên cứu đầu tiên người ta nhâ ̣n thấy sử

dụng chủng virus hoang da ̣i để sản xuất vắc xin bất hoa ̣t thì hiê ̣u quả bảo vê ̣ tương

tự như sử du ̣ng chủng giảm đô ̣c lực của Sabin Song viê ̣c sử du ̣ng chủng đô ̣c lực để

sản xuất là rất nguy hiểm với các cơ sở sản xuất không đủ đảm bảo, dễ dàng đưa

virus hoang dại ra ngoài cô ̣ng đồng [19, 22, 23] Xuất phát từ tình hình trên từ cuối

những năm 70 viê ̣n nghiên cứu ba ̣i liê ̣t Nhâ ̣t Bản đã sử du ̣ng chủng giảm đô ̣c lực

củ a Sabin để sản xuất vắc xin ba ̣i liê ̣t bất hoa ̣t [14,15, 18, 21]

Vắc xin của Nhâ ̣t Bản sử du ̣ng tế bào Vero nuôi theo hê ̣ thống đô ̣ng bình lớn

có những ha ̣t rất nhỏ mang tế bào ( microcarrier system- celligen plus) chủng 3 typ

củ a Sabin được gây nhiễm trên tế bào Vero nuôi cấy trong hê ̣ thống này đều cho

hiệu giá cao Phần trăm thu hồi poliovirus tính theo nồng đô ̣ kháng nguyên D qua

các giai đoa ̣n như siêu lo ̣c, siêu ly tâm, cha ̣y qua cô ̣t sắc ký trao đổi ion và bất hoa ̣t

là 30-50% [33]

Hiện nay ở Nhâ ̣t Bản vắc xin ba ̣i liê ̣t bất hoa ̣t chủ yếu dùng ở da ̣ng vắc xin

phối hợp DTaP- sIPV được sử du ̣ng vào tiêm chủng tử năm 2012 [25]

1.4.3 Ở Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước sản xuất văcxin sống giảm độc lực từ

những năm 1960, đã khống chế được những vụ dịch lớn và đã thanh toán được bệnh

Bại liệt vào tháng 10 năm 2000 Hiện nay Việt Nam chưa sản xuất được văc xin

Bại liệt bất hoạt Theo khuyến cáo của TCYTTG (WHO) trong thời gian tới Việt

Nam phải dùng văc xin Bại liệt bất hoạt Trong khi nếu nhập văc xin thì nhà nước

không đủ kinh phí Chính vì vậy việc nghiên cứu và sản xuất IPV là rất cần thiết

cho sức khoẻ cộng đồng [1, 17, 20]

Trung tâm khoa học và sản xuất vắc xin Sabin –Bộ Y tế được sự tài trợ của

Bộ Khoa Học Công Nghệ và Bộ Y Tế đã bắt đầu nghiên cứu ứng dụng qui trình

công nghệ sản xuất vắc xin Bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin từ năm 2003 nhưng

hiệu quả còn thấp

1.5 Các phương pháp tinh chế virus

1.5.1 Siêu lọc

Phương pháp siêu lọc được sử dụng để cô đặc, làm sạch, đổi đệm, loại bỏ các

tạp chất có trọng lượng phân tử thấp hơn kích thước màng lọc Siêu lọc là quá trình

lọc dòng chảy tiếp tuyến, công nghệ sử dụng màng lọc có tính thẩm thấu ngược,

những chất được giữ lại quay trở về bình chứa mẫu, chất thấm qua màng được thải

ra ngoài

Người ta phân chia cho lọc, siêu lọc dựa vào kích thước của phân tử chất tan,

virus Tính chất của siêu lọc được quyết định bởi màng lọc và mục đích của người

sử dụng Nếu cô đặc thì thu lại tại bình chứa mẫu và trên dây lưu hồi, nếu lấy dung

dịch được làm sạch giữ lại các gel, hạt lơ lửng thì sản phẩm thu hồi là dung dịch ở

đường thải

Hi ̀nh 1.3: Phân loại màng siêu lọc dựa vào kích thước chất tan [37]

Sử du ̣ng màng siêu lọc loại 100KDa kích thước lỗ màng 0,01 µm để cô đă ̣c

Poliovirus Poliovirus có kích thước 27-30 nm tương đương 0,027 - 0,03µm, như

vậy màng siêu lo ̣c kích thước 0,01 µm phù hợp cho thực hiện siêu lọc Poliovirus

[13]

1.5.2 Siêu ly tâm

Phương pháp siêu ly tâm sử dụng máy siêu ly tâm với số vòng quay rất lớn,

sự quay tạo ra lực ly tâm nó tác động khác nhau vào các thành phần khác nhau, các

chất có trọng lượng khác nhau trong dung dịch cần ly tâm Công dụng của siêu ly

tâm là tách hỗn hợp các chất có trọng lượng phân tử khác nhau[13]

1.5.3 Sắc ký

Sắc ký có nhiều phương pháp khác nhau như sắc ký lọc gel, sắc ký giấy, sắc

ký trao đổi ion dùng để tách các tạp chất trong một hỗn hợp Nguyên tắc chung

của các phương pháp sắc ký là cho mẫu chứa chất cần phân tách trong pha động di

chuyển qua pha tĩnh Sự phân tách phụ thuộc vào bản chất của phương pháp sắc ký

nó phụ thuộc vào trong lượng phân tử, độ mang điện của các chất cần phân tách

Pha tĩnh ngăn cản sự chuyển động của các thành phần trong mẫu, khi các chất này

di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ tách được nhau theo thời

gian

1.6 Tiêu chuẩn của vắc xin IPV

1.6.1 Sa ̉ n xuất

Chủ ng sản xuất: Sản xuất được dựa trên hệ thống chủng giống gốc (Master

seed) của virus hoang dại hoặc virus giảm độc lực được cấy truyền không quá 2 lần

bằng phương pháp đã được phê chuẩn của Viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh

phẩm y tế (NICVB) Chủng được bảo quản ở nhiệt độ dưới âm ≤ -60oC.

Tế bào sản xuất: Tế bào sử dụng cho sản xuất có nguồn gốc từ tế bào thận

khỉ tiên phát hoặc tế bào Vero đạt các yêu cầu của Tổ chức Y tế thế giới Có thể sử

dụng huyết thanh động vật trong nuôi cấy tế bào [3, 9, 16, 29]

Qui trình sản xuất và kiểm định sản xuất: Qui trình sản xuất vắc xin phải

theo các quy trình của Tổ chức Y tế thế giới Chủng virus được nhân lên trên tế bào

thận khỉ tiên phát hoặc tế bào Vero và sử dụng môi trường thích hợp cho virus phát

triển Sau khi gặt, hỗn dịch virus được đông tan 3 lần, ly tâm bỏ cặn, lọc vô trùng,

sau đó vào qui trình cô đặc và tinh khiết kháng nguyên, bước tiếp theo là qui trình

bất hoạt virus bằng formaldehyd và trung hòa formaldehyd Sau cùng, hỗn dịch

virus được chế thành vắc xin bất hoạt, tam liên Phải thực hiện kiểm định trong suốt

quá trình sản xuất ở các công đoạn: Vật liệu nguồn (tế bào, môi trường nuôi cấy,…)

bán thành phẩm thô, bán thành phẩm sau khi siêu ly tâm, trước khi bất hoạt, sau khi

bất hoạt,… nhằm kiểm tra tác nhân ngoại lai, xác định hiệu giá vắc xin trước khi bất

hoạt, xác định kháng nguyên D, xác định độ tinh khiết của virus, xác định độ sống

tồn dư của virus sau khi bất hoạt [3, 11, 32]

1.6.2 Kiểm đi ̣nh vắc xin thành phẩm

Cảm quan: Vắc xin bại liệt bất hoạt là một dung dịch lỏng, trong

Thử nghiệm nhận dạng: Vắc xin bại liệt bất hoạt khi tiêm cho khỉ hoặc chuột

lang, phải tạo được kháng thể trung hòa đặc hiệu typs

Thử nghiệm vô khuẩn: Vắc xin bại liệt bất hoạt phải vô khuẩn khi kiểm tra

vô khuẩn sau 14 ngày theo dõi

Thử nghiệm an toàn chung: Vắc xin bại liệt bất hoạt phải an toàn khi thử

nghiệm trên chuột lang và chuột nhắt Chuột khỏe mạnh và tăng trọng bình thường

sau 7 ngày theo dõi

Thử nghiệm công hiệu: Xác định nồng độ kháng nguyên D của vắc xin bại

liệt bất hoạt từ chủng hoang dại: 40 đơn vị kháng nguyên D đối với týp 1 ; 8 đơn vị

kháng nguyên D đối với týp 2; 32 đơn vị kháng nguyên D đối với týp 3 Với vắc xin

bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin: 30 đơn vị kháng nguyên D đối với týp 1; 100 đơn

vị kháng nguyên D đối với týp 2; 100 đơn vị kháng nguyên D đối với týp 3 [3]

Nồng độ protein toàn phần: Không quá 0,1 µg protein trên 1 liều sử dụng [3]

Thử nghiệm chất gây sốt: Vắc xin bại liệt bất hoạt phải an toàn về mặt chất

gây sốt Khi tiêm cho thỏ, tổng số nhiệt độ tăng của 3 thỏ không quá 1,3oC [3]

Hàm lượng formandehyd tồn dư: Vắc xin bại liệt bất hoạt chứa một lượng

formaldehyd tự do không quá 0,02% (< 0,02 g/l) [3]

Bảo quản: Vắc xin bại liệt bất hoạt được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC, tránh

ánh sáng và không được đông băng

Hạn dùng: Trong điều kiện bảo quản như trên, vắc xin bại liệt bất hoạt có

hạn dùng là 24 tháng kể từ ngày kiểm tra công hiệu lần cuối cùng [3]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

➢ Chủng virus:

Virus Bại liệt typ I: WHO-IS-90C do Viện nghiên cứu Bại liệt Nhật Bản

cung cấp Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO) Được cấy truyền 2 lần (SO+2)

Hiệu giá: 108,3 CCID50/ml

Virus Bại liệt typ II: WHO-IIS-90A do Viện nghiên cứu Bại liệt Nhật Bản

cung cấp Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO) Được cấy truyền 2 lần (SO+2)

Hiệu giá: 108 CCID50/ml

Virus Bại liệt typ III: WHO-IIIS-79A do Viện nghiên cứu Bại liệt Nhật Bản

cung cấp Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO) Được cấy truyền 3 lần (SO+3)

và 2 lần chọn lọc bằng cách tạo đám hoại tử (SO+3+2 plaque) Hay còn gọi là

chủng RSO+2 Hiệu giá: 108,3 CCID50/ml

- Kháng huyết thanh đặc hiệu Polio typ I, II, II (20 UI / 0,1ml) (Nhật)

- Tế bào Hep2C kín 1 lớp trên chai nhựa 75cm2 Polyvac

- Các loại môi trường và dung dịch dùng cho tách (Trypsin), nuôi cấy

(DMEM) và gây nhiễm tế bào (M199) do Polyvac sản xuất

➢ Thiết bi ̣ và du ̣ng cu ̣

- Hệ thống máy tinh chế GE

(ÄKTAprime plus)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi thu Poliovirus

Sơ đồ quy trình

Tế bào Vero

↓

➢ Tế bào từ ngân hàng tế bào, ly tâm thu cặn chia ra các chai nuôi cấy ở 37oC, đến khi tế bào kín 1 lớp được tách và nuôi đến đời P142

Gây nhiễm virus

↓

➢ 3 typ virus Polio được gây nhiễm riêng rẽ trên các loạt tế bào khác nhau

Tế bào sau khi nhiễm virus phải được nuôi cấy tại một nhiệt độ

ổn định 33o C, độ giao động của nhiệt độ <0,50C Thời gian nuôi cấy 72 giờ

Thu Poliovirus ➢ Khi tế bào bi ̣ hủy hoa ̣i ≥ 90%, lắc kỹ các chai nuôi Hút

hết hỗn di ̣ch trong các chai vào 1 bình chứa

↓ Chia chai ly tâm ở 4000 vòng/ phút, trong 40 phút

Lọc vô trùng ➢ Poliovirus được lo ̣c vô trùng 0,22µm

Hình 2.1: Tuyp tế bào Vero từ ngân hàng tế bào Polyvac

Quy trình nuôi tế bào được thực hiê ̣n theo sơ đồ sau :

Tuyp tế bào Vero

➢ Pha loãng că ̣n chia ra chai nuôi P139 (chai tầng diện tích

bề mặt nuôi 636 cm2 ), nuôi cố đi ̣nh ở 37oC trong 7 ngày

↓

P140

+ Sau 7 ngày nuôi cấy tế bào phát triển bám kín 1 lớp trên bề

mặt chai, chai tế bào được rửa bằng dung di ̣ch Hank (-) + Tách tế bào bằng dung di ̣ch Trypsin -EDTA

+ Pha loãng hỗn di ̣ch tế bào

➢ Chia chai nuôi P140, nuôi trong 4 ngày ở 37oC

↓

P141

+ Sau 4 ngày nuôi cấy tế bào phát triển bám kín 1 lớp trên bề

mặt chai, chai tế bào được rửa bằng dung di ̣ch Hank(-) + Tách tế bào bằng dung di ̣ch Trypsin-EDTA

+ Pha loãng hỗn di ̣ch tế bào

➢ Chia chai nuôi P141, nuôi trong 4 ngày ở 37oC

↓

P142

+ Sau 4 ngày nuôi cấy tế bào phát triển bám kín 1 lớp trên bề

mặt chai, chai tế bào được rửa bằng dung di ̣ch Hank(-) + Tách tế bào bằng dung di ̣ch Trypsin

+ Pha loãng hỗn di ̣ch tế bào

➢ Chia chai nuôi P142, nuôi trong 4 ngày ở 37oC

Sau 4 ngày nuôi tế bào ở đời P142 tế bào bám kín 1 lớp trên bề mă ̣t chai nuôi có

thể sử du ̣ng để gây nhiễm virus

Chủ ng virus sử du ̣ng là chủng Sabin

➢ Tế bào kín 1 lớp

Rử a tế bào bằng dung di ̣ch Hank (-), hút bỏ môi trường rửa

Gây nhiễm

↓

➢ Bổ sung 10 ml chủng virus Polio vào mỗi tầng chai nuôi

Hấp phu ̣ trong 1giờ, ở 33oC

Bổ sung môi

trường duy trì

➢ Sử du ̣ng môi trường M199 để bổ sung vào các chai nuôi Thể tích nuôi trong mỗi chai từ 140 ml đến 150 ml

Nuôi cố đi ̣nh ở 33oC± 0,5oC trong 72 giờ tế bào bị hủy hoại trên 90% tiến hành thu Poliovirus

Sau 72 h nuôi poliovirus kiểm tra các chai nuôi, đô ̣ hủy hoa ̣i trên 90% có thể gă ̣t

thu poliovirus Hộn thu poliovirus ở các chai nuôi riêng lẻ vào trong 1 tank chứa

Ly tâm ở 4oC, 4000 vò ng/ phút trong 40 phút, thu

dịch nổi

Hộn chung di ̣ch nổi ở các chai ly tâm vào tank chứa

Lọc vô trùng ➢ Sử du ̣ng màng lo ̣c 0,22 µm

2.2.2 Phương pha ́ p tinh chế Poliovirus

Phương pháp tinh chế Poliovirus được thực hiê ̣n qua các bước như siêu lo ̣c,

siêu ly tâm, sắc ký và bất hoa ̣t qua các bước đều lấy mẫu để kiểm tra hiê ̣u giá, để

đánh giá hiê ̣u suất thu hồi ở các giai đoa ̣n Kiểm tra protein toàn phần trong mẫu sau

sắc ký, kiểm tra nồng đô ̣ formandehyt tồn dư để đánh giá kết quả sản xuất vắc xin

➢ Cô đặc vắc xin bằng hệ thống siêu lọc Millipore–

Pellicon màng 100KDa, kích thước lỗ màng 0,01 m

Nhằm loa ̣i bỏ các ion, muối vô cơ giữ lại poliovirus ở bình chứa ban đầu, tốc độ 400-500ml/ phút, áp suất <5 bar

Siêu ly tâm

↓

➢ Được thực hiê ̣n qua 2 bước + ly tâm 36.000 vòng/ phút trong 4 giờ, 4-6oC (thu cặn)

+ ly tâm 15.000 vò ng/ phút trong 30 phút, 4-6oC (thu nước nổi)

Chạy sắc ký

↓

➢ Dù ng phương pháp sắc ký trao đổi ion, ha ̣t sắc ký

DEAE Sepharose CL-6B, hệ đêm Photphat pH 7,0; tốc

độ ml/ phút

+ Thu dịch sau tinh chế lo ̣c vô trùng 0,22µm

Bất hoạt ➢ Bất hoa ̣t bằng formandehyde tỷ lê ̣ 0,025%, trong

12 ngày ở 37oC ( lọc 0,22µm vào ngày thứ 6) sau đó trung hòa formandehyde tồn dư thu vắc xin IPV BTP

Các bước thực hiê ̣n siêu lo ̣c

Rử a lo ̣c:

- Kết nối hê ̣ thống lo ̣c với chai chứa nước cất đã được lo ̣c vô trùng, để loa ̣i

bỏ các chất bảo quản trong màng lo ̣c và hê ̣ thống lo ̣c

Hình 2.2: Thực hiện siêu lọc mẫu Poliovirus

- Rử a màng và hê ̣ thống bằng PB 0,1M, sau đó tiếp tu ̣c cha ̣y loa ̣i bỏ toàn bô ̣

đê ̣m ra khỏi hê ̣ thống và màng lo ̣c

Chạy mẫu:

- Điều kiện dòng bơm 400 – 500 ml/phút, áp suất tối đa là 5 bar, nhiệt độ

mẫu trong quá trình chạy không quá 33oC

- Hệ thống lo ̣c đã được làm sa ̣ch, kết nối với chai chứa Polivirus

- Chạy mẫu nhằm loa ̣i bỏ nước và các ion qua đường thải và thu hồi

poliovirus cô đă ̣c trong chai chứa, lấy mẫu kiểm tra hiê ̣u giá sau siêu lo ̣c

Lưa trữ poliovirus cô đă ̣c trong nhiê ̣t đô ̣ -70oC

Thực hiên qua 2 bước: 1) ly tâm ở tốc đô ̣ 36.000 vòng/ phút trong 4 giờ, 4-6oC

2) ly tâm ở tốc đô ̣ 15.000 vòng/ phút trong 30 phút, 4-6oC

Hi ̀nh 2.3: Thực hiện siêu ly tâm mẫu Poliovirus

a) Ly tâm ở bước 1 nhằm thu Poliovirus bi ̣ lắng ở ống ly tâm, loa ̣i bỏ các

protein có tro ̣ng lượng phân tử nhỏ hơn tro ̣ng lượng phân tử Poliovirus như các

mảnh vỡ tế bào không bi ̣ lắng [13]

Cặn được hòa tan bằng đê ̣m PB 0,1M lắc nhe ̣ qua đêm ở 4-6oC, sau đó dùng

sóng siêu âm để đánh tan că ̣n và tách rời các ha ̣t virus

b) Ly tâm ở bước 2 nhằm loa ̣i bỏ những protein có tro ̣ng lượng phân tử lớn hơn

trọng lượng phân tử của Poliovirus bi ̣ lắng ở ống ly tâm, thu phần di ̣ch nổi chứa

Poliovirus[13] Lấy mẫu kiểm tra hiê ̣u giá của poliovirus trước khi cha ̣y sắc ký để

đánh giá hiê ̣u suất thu hồi của phương pháp

Sử du ̣ng phương pháp sắc ký trao đổi ion, nhằm giữ la ̣i trên cô ̣t các protein

tạp, Poliovirus không bám vào ha ̣t sắc ký đi ra ngoài và thu ở các ống thu phân đoa ̣n

pH đê ̣m ở trong khoảng cho phép của ha ̣t sắc ký và không gây biến tính

protein, Poliovirus Để protein có thể gắn được lên ha ̣t sắc ký, ít nhất pH phải

cách 0,5 hoặc tốt hơn là 1 đơn vị so với pI của nó, (cao hơn đối với anionit, thấp

hơn với cationit) pH cách quá xa sẽ tạo ra sự liên kết quá mạnh với nguy cơ gây

biến tính và hiệu suất thấp Protein không mang điện tích khi pH = pI, tuy nhiên,

nếu pH thấp hơn pI, protein sẽ mang điện tích dương và ngược lại, pH cao hơn pI,

protein sẽ mang điện tích âm Dựa vào điều này chú ng tôi chọn hạt trao đổi ion:

DEAE sepharose CL 6B là 1 anion yếu (dải pH: 2-9), tại điểm đẳng điện PI của

Poliovirus, Poliovirus là anion sẽ được tách ra và thể hiện trên sắc ký đồ và thu

được dựa vào sắc ký đồ

Ca ́ c bước thực hiê ̣n phương pháp sắc ký:

a) Nhồi cô ̣t:

Chai gel 500ml (chứa 20% cồn là chất bảo quản)

Cột sắc ký XK 50

➢ gel:

Lắc nhẹ nhàng chai hạt sắc ký cho đều

Để hạt sắc ký lắng xuống, dùng pipet hoặc bơm tiêm nhẹ nhàng hút cồn ra (khoảng

60ml)

Thêm 100ml đệm PB, khuấy nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí, chờ lắng

Hút hết đệm ra (khoảng 100ml)

Thêm 50ml đệm PB vào, khuấy nhẹ nhàng, tránh tạo bọt khí

➢ Cô ̣t sắc ký :

Rử a sa ̣ch cô ̣t, thêm đê ̣m PB vào ngâ ̣p màng lo ̣c 1-2 cm, nhe ̣ nhàng tránh ta ̣o bo ̣t khí

Khuấy nhe ̣ nhàng cốc đựng ha ̣t sắc ký cho từ từ vào cô ̣t tránh ta ̣o bo ̣t khí, đến khi

hết ha ̣t sắc ký đã chuẩn bi ̣

➢ Nén cô ̣t :

Chạy máy với tốc đô ̣ 15ml/ phút để nén gel, áp suất qua cô ̣t gel không quá 0,4 bar

( hiển thị trên bảng điê ̣n tử của máy) Nén hạt sắc ký đến vị trí tại đó chiều cao hạt

trong cột ổn định không bị thay đổi

b) ‘‘Test’’ cột :

Kiểm tra hiệu quả của quá trình nhồi cô ̣t, khả năng làm viê ̣c của cô ̣t sắc ký

Sử du ̣ng đê ̣m cha ̣y để cân bằng cô ̣t là NaCl 0,4M đến khi cô ̣t đã được cân bằng (đồ

thị của đường “Cond” ≈ 33 ms/cm)

Tiêm mẫu 8ml NaCl 0,8M (thể tích mẫu ≈ 2,5% thể tích cột)

Cài đă ̣t thông số ‘‘ Test’’ cô ̣t cha ̣y máy tới khi thu được đồ thi ̣

Phương pháp đo lường HETP và :

d 50v đườ ng kính ha ̣t gel

h : chiều cao 1 lớ p ha ̣t thực tế ( h< 3 là đa ̣t)

a : độ rộng bên phần tăng dần của đồ thị (bên trái)

b : độ rộng bên phần giảm dần của đồ thị (bên phải)

a, b tính tại vị trí 10% chiều cao đồ thị so với đáy 0,8 < < 1,8 là đạt

Vr : Thể tích từ lúc tiêm mẫu tới đỉnh đồ thị

Wh : Bề rộng 50% của đồ thị

c) Chạy mẫu:

Sau khi ‘ test cột’ cần phải cân bằng la ̣i cô ̣t bằng đê ̣m PB 0,1M đến khi đồ thi ̣ của

đường “Cond” ổn định ≈ 9 ms/cm

Dùng xilanh hút mẫu cần tinh chế (đảm bảo khi hút không sinh bọt khí bên

trong xilanh), tiêm mẫu qua van tiêm mẫu trên máy tinh chế, thể tích mẫu bằng 6%

thể tích cột

Cài đặt thông số chạy máy, sau đó quan sát đồ thi ̣ trên máy tính để thu

Poliovirus

Theo khuyến cáo của WHO thì hóa chất bất hoạt vi rút là formandehyd được

phép sử dụng trong sản xuất vắc xin, nhưng không được vượt quá nồng độ cho phép

(nồng độ theo thể tích không được vượt quá 0,1% bất kỳ lúc nào trong quá trình bất

hoạt) Hàm lượng formandehyd tồn dư không được vượt quá 0,02%

Đối với poliovirus sử du ̣ng formandehyd để bất hoa ̣t với tỷ lệ 0,025% trong

12 ngày ở 37oC Vào ngày thứ 6, và ngày thứ 12 kết thúc bất hoạt lấy mẫu để kiểm

tra poliovirus sống tồn dư Sau khi bất hoa ̣t formandehyd tồn dư được trung hòa

bằng Sodium bisulfit sau đó lo ̣c với màng 0,22µm