Xác Định Thành Phần Hệ Vi Sinh Vật Trong Xử Lý Nước Thải Công Nghiệp

Tuy nhiên những thông tin chúng ta có được về hệ vi sinh vật này chưa thật nhiều và ngoài ra các kỹ thuật sinh học phân tử kể trên chỉ cho phép phát hiện những sinh vật có số lượng >1% c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HỆ VI SINH VẬT TRONG

XỬ LÝ NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

Hà nội, 10/2005

BỘ G-IÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HỆ VI SINH VẬT TRONG

XỬ LÝ NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

Người hướng dẫn khoa học TS.VŨ NGUYÊN THÀNH

HÀ NỘI, 10/2005

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Vũ Nguyên Thành cán bộ Bộ môn Vi sinh Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn cao học

Tôi xin chân thành cám ơn TS Lê Đức Mạnh và lãnh đạo Viện Công nghiệp Thực phẩm, các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách khoa

Hà nội, các anh chị em đồng nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Báo cáo này nhận được sự hỗ trợ của chương trình KHCN trọng điểm cấp nhà nước trong khuôn khổ đề tài KC 04-21 "Nghiên cứu hệ thống sinh học hoạt lực cao, điều khiển tự động trong quá trình xử lý kỵ khí đối với nước thải bị ô nhiễm chất hữu cơ" do TS Lê Đức Mạnh làm Chủ nhiệm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Thành phần vi sinh vật trong xử lý nước thải sinh hoạt 2

1.2 Bùn hoạt tính 3

1.3 Một số vi sinh vật gây bệnh liên quan tới nước thải 4

1.4 Các phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu xử lý nước thải 8

1.5 Một số thành tựu của sinh học phân tử trong nghiên cứu xử lý nước thải 12

1.6 Phương pháp điện di trong gradient biến tính DGGE 17

1.7 Các phương pháp phát hiện vi sinh vật gây bệnh 18

PHẦN 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Nguyên vật liệu 20

2.2 Máy móc thiết bị 21

2.3 Hóa chất 22

2.4 Phương pháp tiến hành 26

PHẦN 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Hệ vi sinh vật bùn kỵ khí của nhà máy sữa Hà Nội theo đánh giá bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh 33

3.2 Định tên các chủng vi sinh vật phân lập từ hệ thống xử lý nước thải nhà máy sữa bằng giải trình tự rDNA và xác định vai trò sinh lý trong hệ thống 38

3.3 Cấu trúc hệ sinh thái bùn kỵ khí của hệ thống UASB nhà máy sữa Hà Nội theo đánh giá bằng phương pháp DGGE 46

3.4 Xác định Salmonella trong nước thải 58

3.5 Xác định E coli trong nước thải 60

3.6 Xác định Shigella trong nước thải 64

KẾT LUẬN 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

1

MỞ ĐẦU

Xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh được coi là một nhánh của công nghệ sinh học có quy mô lớn nhất về diện tích và thể tích Các trung tâm xử lý nước thải phát triển nhanh chóng về cả số lượng và quy mô Các kỹ thuật và thiết kế mới trong hệ thống xử lý nước thải cũng như các luận điểm về thiết kế không ngừng tiến hóa Mặc dù tất cả các hệ thống này đều dựa trên hoạt động của các hệ vi sinh vật, kiến thức của chúng ta về các hệ vi sinh vật này còn rất hạn chế và hoàn toàn không bắt nhịp kịp với sự phát triển của các thiết kế hệ thống Các nghiên cứu trong vòng 10 năm gần đây đã chứng tỏ sự yếu kém của kỹ thuật phân lập vi sinh trong việc đánh giá các hệ sinh thái phức tạp như bùn hoạt tính, tại đó có sự tham gia của nhiều chuỗi thức

ăn liên tục trong một phức hợp cộng sinh Việc tái tạo các điều kiện thích hợp cho việc nuôi cấy những vi sinh vật này trong điều kiện biệt lập hầu như vẫn nằm ngoài khả năng của con người

Trong thời gian gần đây một loạt các kỹ thuật mới đã được phát triển nhằm đánh giá thực trạng của hệ sinh thái không thông qua phân lập vi sinh Các phương pháp này tập trung đánh giá hệ vi sinh thông qua phân tích ribosome ARN hoặc gen

mã hóa chúng Các kỹ thuật có thể tạm chia làm 2 dạng, kỹ thuật sử dụng mẫu dò phân tử (molecular probe) và phương pháp fingerprinting Dạng sử dụng kỹ thuật mẫu dò phân tử bao gồm các phương pháp như FISH hay dot-plot hybridisation Nhóm phương pháp này đòi hỏi thông tin cơ bản như trình tự rARN/rDNA của vi sinh vật quan tâm Nhóm phương pháp thứ hai dựa trên sự khác nhau về độ dài, trình tự bên trong của đọan rRNA/rDNA quan tâm Các phương pháp này bao gồm kỹ thuật T-RFLP, ARDRA, DGGE, TGGE, SSCP, RISA…Ưu điểm của chúng là tương đối đơn giản và không đòi hỏi thông tin ban đầu về vi sinh vật cần nghiên cứu Các kỹ thuật sinh học phân tử đã góp phần làm thay đổi cơ bản trong quan niệm về cấu trúc

hệ vi sinh vật bùn hoạt tính Tuy nhiên những thông tin chúng ta có được về hệ vi sinh vật này chưa thật nhiều và ngoài ra các kỹ thuật sinh học phân tử kể trên chỉ cho phép phát hiện những sinh vật có số lượng >1% của tổng số lượng vi sinh vật có trong

hệ Những vi sinh vật có số lượng nhỏ trong một hệ sinh thái biến động có thể đóng vai trò quyết định trong sự thích nghi của hệ sinh thái Ngoài ra sự có mặt của các vi sinh vật có số lượng thấp, vi sinh vật nuôi cấy được có thể sẽ quyết định tính an toàn

và việc cấp phép cho chất lượng nước thải sau xử lý Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện việc đánh giá hệ vi sinh vật bùn kỵ khí của hệ thống xử lý nước thải nhà máy sữa, xưởng bia viện Công nghiệp Thực phẩm bằng cả kỹ thuật phân lập và kỹ thuật không thông qua phân lập nhằm so sánh và khai thác ưu điểm của từng phương

pháp và xác định vi sinh vật gậy bệnh E coli, Salmonella, Shigella bằng phương pháp

vi sinh và sinh học phân tử

PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thành phần vi sinh vật trong xử lý nước thải sinh hoạt

Nước thải có một khu hệ vi sinh vật đặc trưng Nước thải sinh hoạt mà phần chủ yếu là phân, nước rửa và thức ăn thừa, chứa rất nhiều vi khuẩn Nước thải chứa trung bình từ 3-16 triệu vi khuẩn hoại sinh trong 1ml Trong đó chủ yếu là các vi khuẩn gây

thối như Pseudomonas fluorescens, P aeruginosa, Proteus vulgaris, Bacillus cereus,

B subtilis, Aerobacter (Enterobacter) cloacae, Zooglea ramigera… Ngoài ra cũng

nhiều đại diện các nhóm sinh lý khác mà trước hết là các vi sinh vật phân giải đường, tinh bột, mỡ, urê và xenluloza Tỷ lệ các vi khuẩn của nhóm coliform, một chỉ thị quan trọng của độ nhiễm phân trong nước là tương đối cao Ở trong nước thải thành phố số lượng coliform dao động giữa vài trục nghìn đến vài trăm nghìn trong 1 ml

Cũng rất hay gặp loài Acrobacter (Enterobacter) acrogenes là bọn cũng thuộc về họ

Enterobacteriaceae như Escherichia coli và Streptococcus faecalis là loại vi khuẩn

cũng có nguồn gốc từ đường ruột người Bên cạnh đó còn có nhiều bacteriophage Trong nước thải giàu chất hữu cơ, các vi khuẩn dạng ống giữ một vai trò quan trọng

trong đó trước hết phải kể đến Sphaerotilus natans Ngoài nước thải sinh hoạt

Sphaerotilus natans hay gặp nhất ở nước thải nhà máy xenluloza cũng như các nhà

máy thực phẩm Nhiều loại nước thải chứa các vi khuẩn oxi hóa lưu huỳnh nhất là các

giống Thiobacillus Các vi khuẩn phản nitrat hóa như Thiobacillus denitrificans,

Micrococcus denitrificans và các vi khuẩn khác như vi khuẩn tạo thành metan và các

vi khuẩn khí nổ cũng hay gặp trong nước thải sinh hoạt và một số loại nước thải công nghiệp Bên cạnh vi khuẩn trong nước thải giàu chất hữu cơ cũng chứa nhiều loại nấm Thường thì nước thải thành phố chứa nhiều nấm men, giống hay gặp nhất trong

nước thải là Saccharomyces Bên cạnh đó còn có những số lượng nhỏ các loài

Candida, Cryptococcus, Rhodotorula và các loài khác

Trong nước thải hàm lượng vi sinh vật gây bệnh chiếm một tỉ lệ đáng kể Các vi sinh vật trong nước thải sống được trong thời gian ngắn hay dài còn phụ thuộc vào loại nước và tùy điều kiện Vì rằng một phần trong số chúng mang độc tố nên trong các sông hồ và các vùng nước thải hay gặp nhất là các vi khuẩn đường ruột gây bệnh

như Salmonella typhi và S paratyphi gây bệnh thương hàn Ít gặp hơn là các vi khuẩn

lị Shigella Ở các vùng nhiệt đới thường gặp Vibrio cholera gây dịch tả Ở trong nước thải gần như bao giờ cũng tìm thấy bào tử Clostridium gây bệnh như Cl perfringens,

Cl novyi và Cl septicum Vì bọn này sống tương đối lâu trong các chất lắng, đôi khi

chúng có thể tăng sinh ít nhiều ở đó Thỉnh thoảng cũng quan sát được những sự

nhiễm trùng do các phẩy khuẩn ưa mặn chẳng hạn như Vibrio alginolyticus gây ra

bệnh viêm tai giữa [1]

3

Các vi khuẩn gây bệnh thỉnh thoảng cũng tồn tại trong các động vật nhuyễn thể và các động vật ăn lọc khác có nguồn gốc từ các nguồn nước bị nhiễm nước thải Trong

các nấm gây bệnh, giả nấm men Candida albicans và các loài họ hàng hay gặp nhất

trong các nguồn nước nhiễm nước thải Ngoài ra còn gặp các nấm bậc cao thường là

các nấm da gây các bệnh ngoài da thuộc lớp nấm bất toàn Các loài Trichophyton sống

cả ở trong cát của các bãi tắm

Bên cạnh vi khuẩn và nấm, nước thải sinh hoạt chứa rất nhiều vi rút gây bệnh cho người Ở đó chúng cũng giữ được độc tố của mình trong những thời gian dài ngắn khác nhau Vì thế nước bị nhiễm bẩn có thể gây nên bệnh nhiễm trùng của các polyovirut Trong nước thải của các thành phố chúng có thể được phát hiện vào mỗi mùa hè Tuy nhiên bệnh thường gặp nhiều hơn lại là bệnh đường ruột do virut, thường xuất hiện vào mùa hè sau khi ăn uống phải nước ô nhiễm Tác nhân gây bệnh thường

là các virut coxsackie và ecovirut

Ngoài các vi sinh vật gây bệnh cho người, trong nước thải còn chứa các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và thực vật Bọn này không những gây bệnh cho động vật thủy sinh mà còn gây bệnh cho cả gia súc và động vật hoang dại

Bảng 1 Thành phần vi sinh vật trong nước thải sinh hoạt [3]

và ấu trùng Các dạng vi sinh vật làm sạch nước thải không chỉ đơn thuần là do việc phân huỷ chất hữu cơ mà còn nhờ sự tạo bông và gắn kết các chất tạo thành màng nhầy có khả năng keo tụ và kết lắng Bùn hoạt tính có chất lượng tốt là bùn có màu vàng nâu, dễ lắng và có khả năng thu hồi nhanh

Bảng 2 Quần thể vi sinh vật có chức năng trong bùn hoạt tính hiếu khí

Vi khuẩn Chức năng trong bùn hoạt tính

Pseudomonas Phân huỷ hyđratcacbon và phản ứng nitrat

Arthrobacter Phân huỷ hyđratcacbon

Bacillus Phân huỷ hyđratcacbon, protein

Cytophaga Phân huỷ các polyme

Zooglea Tạo thành chất nhầy polysacarit, hình thành các chất keo tụ

Acinetobacter Tích luỹ polyphotphat, phản nitrat

Nitrobacter Nitrat hoá

Nitrosomonas Nitrat hóa

Sphaerotilius Phát triển nhiều tiêm mao

Các loại vi sinh vật thường có trong bể kị khí

Những nhóm vi sinh vật gồm những vi khuẩn không sinh metan, được phân lập từ

bể kị khí có Clostridium sp., Peptococus anaerobus, Biphidobacterium sp.,

Desulphovibrio spp., Corynebacterium sp., Lactobacillus, Actinomyces, Staphylococcus, Escherichia coli Những nhóm hoá sinh gồm những nhóm sinh enzim

phân giải protein, phân giải ure hoặc phân giải xenluloza Một nhóm vi sinh vật thứ ba chuyển hoá hidro và axit axetic thành khí metan và dioxit cacbon Nhóm này kị khí hoàn toàn được gọi là nhóm sinh metan Các vi sinh vật sinh metan được bắt nguồn từ một tổ tiên chung được gọi là các vi khuẩn cổ (archeo bacteria) Nói chung, chúng là

các vi sinh vật hình que (Methanococcus, Methanosarcina) Vi khuẩn quan trọng nhất

trong nhóm sinh metan là nhóm sử dụng hidro và axit axetic Tốc độ phát triển của chúng rất chậm Vì vậy, sự trao đổi chất của chúng thường xuyên làm hạn chế tốc độ trong xử lý kị khí nước thải hữu cơ Khí metan và CO2 được tạo thành thì xử lý nước thải kị khí được coi như đã hoàn thành Khí metan không hoà tan do đó nó được tách

ra khỏi nước thải và bay lên

1.3 Một số vi sinh vật gây bệnh liên quan tới nước thải

5

Một trong những nhóm vi sinh vật gây bệnh quan trọng có thể gặp trong nước thải

là nhóm vi sinh vật đường ruột Họ vi khuẩn đường ruột bao gồm các trực khuẩn Gram

âm, kích thước trung bình 2-4µm  0,4-0,6 µm, một số loài có có hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện, không có enzym oxydaza, lên men đường glucoza có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể

di động hoặc không Nếu di động thì chúng có nhiều tiêm mao xung quanh thân và không sinh bào tử

Khi vào vật chủ, chúng sản sinh hai loại độc tố: nội độc tố và ngoại độc tố, tuỳ thuộc vào từng loài Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều có nội độc tố, tức là chúng chỉ được giải phóng khi vi khuẩn bị li giải Bản chất hoá học của chúng là lipopolysaccharid (LPS) của vách tế bào Tuy tính độc không cao bằng các ngoại độc tố nhưng nó có thể gây ra tình trạng sốc, và nếu không được điều trị kịp thời, cũng dễ chuyển thành sốc không hồi phục, đi đến tử vong Còn ngoại độc tố ta chỉ thấy ở một

số thành viên như Shigella shiga, ETEC (enterotoxigenic Escherichia coli) Vi khuẩn

đường ruột không những là căn nguyên chính gây nhiễm khuẩn đường tiêu hoá, mà còn

có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác như tiết niệu, hô hấp, thần kinh…như E

coli chẳng hạn

Về mặt kháng nguyên, họ vi khuẩn đường ruột có ba nhóm cơ bản: kháng nguyên

O, kháng nguyên H, kháng nguyên K Kháng nguyên O hay còn gọi là kháng nguyên thân của vi khuẩn, là một phức hợp protein, polyozid và lipit, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên, còn lipit quyết định tính độc Còn kháng nguyên H chỉ có ở những vi khuẩn có tiêm mao, chúng được gọi là các kháng nguyên tiêm mao của vi khuẩn Bản chất của chúng là protein Cuối cùng, kháng nguyên K hay kháng nguyên bề mặt, nằm bên ngoài kháng nguyên thân Nó có thể dưới dạng lớp vỏ dày quan sát được bằng kính hiển vi quang

học (như ở Klebsiella) hoặc dưới một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển

vi điện tử (như ở Salmonella typhi)

Salmonella [5]

Bệnh thương hàn được biết đến từ rất lâu (1820) nhưng đến năm 1884 người ta

mới phân lập được vi khẩn Salmonella gây ra bệnh này Về mặt hình thái, Salmonella

là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 3,00,5μm, có nhiều tiêm mao xung

quanh thân (trừ S gallinarum và S pullorum gây bệnh ở gà vịt) Giống như các vi

khuẩn đường ruột khác, chúng thuộc loại hiếu kỵ khí tuỳ tiện Về mặt tính chất sinh

lý, người ta thấy Salmonella không lên men đường lactoza, nhưng lên men đường

glucoza và sinh hơi, sử dụng được citrat ở môi trường Simmons, oxidaza (+), lysin decacboxylaza (-), ONPG (+), ureaza (-), MR (-), VP (-), H2S (+)

Dựa trên cấu trúc kháng nguyên, Salmonella được chia thành các nhóm, các loài, và

các typ huyết thanh khác nhau Người ta đã tìm được gần 70 yếu tố kháng nguyên O Các yếu tố này khi kết hợp với kháng nguyên H được tìm thấy ở hầu hết các loài

Salmonella, đã giúp người ta thu được trên 1500 typ huyết thanh Còn về kháng

nguyên K, người ta chỉ thấy có ở S typhi và S paratyphi

Hầu hết sự nhiễm Salmonella là thông qua đường tiêu hoá Chúng đi qua dạ dày và

vào tới ruột non Khi tới được ruột rồi chúng tương tác với bề mặt niêm mạc tại mảng Peyer và nhờ các không bào chúng đi vào được các biểu mô ruột Chúng cũng có thể

gây ra sự phá huỷ bề mặt niêm mạc Đối với các loài Salmonella gây bệnh thương hàn như S typhi thì chúng đi sâu vào các mô bên dưới trước khi chúng đi vào hệ lưới nội

mô, nơi mà chúng sống sót, nhân lên và gây nhiễm sang các mô khác Còn đối với các

loài gây viêm dạ dày ruột như S typhimurium và S enteritidis thì chúng không xâm nhập vào sâu hơn lớp biểu mô ruột

Để có thể gây bệnh Salmonella cần các yếu tố sau đây: (a) Sự gắn bám: để tránh các cử động nhu động không có lợi, Salmonella tổng hợp một số yếu tố giúp cho quá

trình gắn bám vào các tế bào biểu mô ruột Đó là: các pili kiểu 1 giúp gắn chúng vào

tế bào eukaryote và MRHA (manose-resistant haemaglutin) - một dạng chất tiết giúp

cho một số loài Salmonella ngưng kết hồng cầu (b) Về độc tố Salmonella có khả năng

tiết ra ba loại độc tố: enterotoxin, cytotoxin và endotoxin (lipit A) Trong đó

enterotoxin rất giống với choleratoxin của Vibrio cholera Cả hai loại toxin đều liên

kết với Gm ganglioside và gây ra một sự tăng cAMP nội bào do chúng đều tác động vào enzym adenylcyclaza Còn cytotoxin, người ta thấy rằng chúng có khả năng phá huỷ bề mặt lớp niêm mạc ruột, phá huỷ mô làm cho những người nhiễm vi khuẩn này thường xuất hiện máu trong phân, hoặc sự ức chế quá trình tổng hợp protein ở tế bào eukaryote và gây ra sự kéo dài các tế bào CHO Cuối cùng là lipit A, chúng tương tác

và hoạt hoá các đại thực bào và các tế bào lympho khiến giải phóng một số yếu tố giúp cho việc gây ra một số hiệu quả như sốt, tăng bạch cầu, hạ huyết áp (mà có thể

dẫn tới sốc)

Escherichia coli [35]

Escherichia được Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885 Nó là đại biểu điển

hình của họ vi khuẩn đường ruột, bao gồm nhiều loài: E coli, E adecarboxylase, E

blattae, E fergusonii, E hermanii, và E vulneris, nhưng trong đó E coli được xem là

có vai trò quan trọng nhất E coli là trực khuẩn Gram (-) Kích thước trung bình 2 đến

3µm  0,5 µm nhưng trong điều kiện không thích hợp như trong môi trường có kháng sinh thì vi khuẩn có hình dạng dài như sợi chỉ Rất ít chủng trong số chúng có vỏ, như-

ng hầu hết lại có tiêm mao nên chúng có khả năng di động Chúng có thể phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường trong một phổ nhiệt độ rộng từ 5oC đến 40oC

7

Trong những điều kiện thích hợp chúng phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút Về tính chất sinh lý, chúng có khả năng lên men nhiều loại đư-ờng như glucoza, lactoza… và có sinh hơi, không sinh indol, H2S, không sử dụng được nguồn cacbon của citrat trong môi trường Simmons, thử nghiệm VP (Voges Prokauer)

âm tính nhưng chúng lại có enzym decarboxylaza nên chúng có khả năng khử carboxyl của lysin, ornitin, arginin và axit glutamic Ngoài ra chúng còn có enzym beta-

galactosidaza Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E coli được chia thành các typ huyết

thanh khác nhau Và hiện nay người ta cũng đã xác định gần 160 yếu tố kháng nguyên

O, khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K và gần 50 yếu tố kháng nguyên H Sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên này sẽ cho chúng ta một số lượng lớn các typ huyết thanh khác nhau Mỗi typ được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K như O157: H7, O86:B7…

Dựa vào tính chất gây bệnh, người ta chia E coli thành các loại sau:

EPEC (Enteropathogenic E coli) E coli gây bệnh đường ruột

ETEC (Enterotoxigenic E coli): E coli sinh độc tố

EIEC (Enteroinvasive E coli): E coli xâm nhập đường ruột

EAEC (Enteroadherent E coli): E coli bám dính đường ruột

EHEC (Enterohaemorrhagic E coli): E coli gây chảy máu đường ruột

Trong đường tiêu hoá E coli chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%) Tuy nhiên, E coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trong nó đứng

đầu trong các vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, đứng hàng

đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết E coli có thể gây nhiều bệnh khác

như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương Theo báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp (1988-

1994) thì E coli đứng thứ hai sau S aureus về tỷ lệ phân lập được từ các loại bệnh phẩm ở nước ta Tuy nhiên cơ chế gây bệnh ở các loại E coli là khác nhau

Vi khuẩn lỵ (Shigella)

Shigella là tác nhân gây ra bệnh lỵ trực khuẩn Nó được Chantemesse mô tả từ năm

1888 và nhưng phải đến năm 1898 mới phân lập được Đây là một bệnh rất hay gặp ở nước ta, có thể rải rác thường xuyên hoặc có thể tạo nên các vụ dịch địa phơng

Shigella là trực khuẩn mảnh, bắt màu Gram âm, dài từ 1- 3 m, khi mới nuôi cấy có

dạng cầu trực khuẩn Chúng không có tiêm mao, không có vỏ và không sinh bào tử Và

như các vi khuẩn đường ruột khác, Shigella là vi khuẩn hiếu kỵ khí tuỳ tiện nhưng phát

triển tốt trong điều kiên hiếu khí

Về mặt tính chất sinh vật hoá học, Tất cả Shigella đều lên men đường glucoza, hầu

hết không sinh hơi, một số trường hợp có sinh hơi nhưng rất yếu, nhưng không lên men

lactoza, trừ Sh sonei có khả năng lên men chậm sau từ hai ngày đến hai tuần Sh

flexneri, Sh boydii và Sh sonnei có khả năng lên men manitol; còn Sh dysenteriae

không có khả năng này Tất cả chúng đều không sinh H2S, không sử dụng citrat trong môi trường Simmons, không sinh indol

Về cấu trúc kháng nguyên, tất cả đều có kháng nguyên thân O, một số có kháng nguyên K và tất cả đều không có kháng nguyên H Dựa trên tính đặc hiệu của kháng

nguyên thân O, cũng như một số tính chất sinh lý người ta chia Shigella thành 4 nhóm: Nhóm A: được gọi là Sh dysenteriae, không lên men manitol Có mời typ huyết thanh,

các typ này không không có quan hệ kháng nguyên với nhau Typ 1 còn có tên là trực khuẩn shiga, ngoài nội độc tố chúng còn sản sinh ra ngoại độc tố mạnh

Nhóm B: có tên là Sh flexneri, có khả năng lên men đường manitol trừ một vài ngoại

lệ Có 6 typ huyết thanh, các typ huyết thanh này còn có cả thành phần kháng nguyên đặc hiệu typ và thành phần kháng nguyên chung cho cả 6 typ

Nhóm C: có tên là Sh boydii, có khả năng lên men manitol trừ một vài ngoại lệ Có 15

typ huyết thanh

Nhóm D: được gọi là Sh sonei, có khả năng lên men đường manitol Là nhóm duy nhất

có khả năng lên men đường lactoza nhưng chậm và chỉ có một typ huyết thanh duy nhất

1.4 Các phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu xử lý nước thải

Có thể dễ dàng nhận thấy rằng ngày nay xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học là thể loại ứng dụng công nghệ vi sinh có quy mô lớn nhất về thể tích và diện tích Các nhà máy xử lý nước thải phát triển nhanh chóng về cả số lượng và quy mô Yêu cầu chất lượng nước sau xử lý cũng như lượng nước thải cần xử lý ngày càng gia tăng Mặc dù vậy, các quá trình cơ bản liên quan đến xử lý nước thải hầu như không có gì thay đổi Trong mọi quá trình nước thải đều được tập trung lại sau đó vi sinh vật được tạo điều kiện để có thể thích ứng, phát triển và phân hủy các thành phần trong đó Kiến thức của chúng ta về các quá trình sinh học thực sự diễn ra trong quá trình xử lý nước thải hoàn toàn không bắt nhịp kịp với nhịp độ tiến hóa của thiết bị và luận điểm của các kỹ sư thiết kế Thậm chí bùn họat tính, một tác nhân chủ yếu của quá trình xử

lý, vẫn thường được coi như một “hộp đen” không thể xuyên qua Sự thiếu hiểu biết này của chúng ta xuất phát từ hạn chế của ngành vi sinh vật học kinh điển vốn dựa trên nền tảng của phương pháp phân lập vi sinh hoàn toàn chưa được thích ứng để nghiên cứu những hệ sinh thái phức tạp Thêm vào đó sự đa dạng của những hệ sinh thái này cũng làm nản lòng một số nhà vi sinh vật học Trong các hệ thống hiện nay

về lý thuyết các chu trình được kiểm soát bới con người nhưng trên thực tế trong đa số trường hợp nó được quyết định bởi quá trình thích nghi và biến đổi của hệ vi sinh vật

Các công cụ phân tử

Phương pháp tiếp cận thông qua sinh học phân tử để đánh giá hệ vi sinh vật về cơ bản sử dụng các kỹ thuật phát hiện và phân tích ribosome ARN hoặc gen mã hóa chúng Để đánh giá động học của hệ sinh thái, các kỹ thuật thường dùng có thể chia làm hai nhóm Nhóm thứ nhất sử dụng các mẫu dò phân tử, điều có thể thực hiện một khi thông tin về nhóm vi sinh vật quan tâm đã được biết trước Nhóm thứ hai liên quan tới việc đánh giá các đoạn ADN và không đòi hỏi phải biết trước về cấu trúc hệ sinh thái trước khi bắt đầu nghiên cứu Phương pháp sử dụng mẫu dò bao gồm “mẫu

dò huỳnh quang lai tại chỗ” (FISH - Fluorescent In situ Hybridisation) và “lai điểm”

(dot-plot hybridisation) Các kỹ thuật này dựa trên việc thiết kế những oligonucleotid

đã đánh dấu (mẫu dò phân tử) và nhắm đích vào các phân tử 16S rARN của từng chủng loại hoặc một nhóm vi sinh vật Với phương pháp FISH việc lai các mẫu dò huỳnh quang thực hiện trực tiếp trên tế bào đã được cố định và sau đó tế bào quan tâm được theo dõi sử dụng kính hiển vi huỳnh quang hoặc flow cytometry Trong phương pháp dot-plot acid nucleic được tách chiết, gắn lên màng sau đó lai với các mẫu dò phóng xạ Kết quả thông thường được đánh giá bằng tỷ lệ giữa lượng tế bào được phát hiện bằng mẫu dò đặc hiệu hơn so với số tế bào phát hiện được bằng mẫu dò tổng

số Dạng phương pháp không đòi hỏi thông tin ban đầu về hệ vi sinh vật cần nghiên cứu bao gồm các kỹ thuật đánh giá fingerprinting của 16S rDNA thu nhận được từ nucleic acid tách chiết từ mẫu phẩm Kỹ thuật T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) và ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) phân tách hỗn hợp 16S rDNA theo kích thước của chúng sau khi cắt bằng enzyme cắt hạn chế Kỹ thuật DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) và TGGE (Thermal Gradient Gel Electrophoresis) khai thác sự khác nhau trong độ bền vững của liên kết giữa hai mạch của DNA để phân tách phân tử 16S rDNA trong gradien biến tính (gradien nhiệt đối với TGGE và gradien hóa chất đối với DGGE)

Kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) phân tách các ADN mạch đơn dựa vào cấu trúc bậc hai của chúng RISA (rRNA Intergenic Spacer Analysis) khai thác sự khác nhau về độ dài của đoạn giữa hai gen 16S rRNA và 23S

rRNA của các vi sinh vật Tất cả các phương pháp này đều bao gồm các bước phân lập ADN từ mẫu và phản ứng PCR Cấu trúc hệ vi sinh vật được thể hiện thông qua phổ pik (SSCP, T-RFLP) hoặc phổ băng (ARDRA, T/DGGE, RISA) Ngoại trừ ARDRA, phương pháp sản sinh ra một số băng nhất định cho mỗi loài trong các phương pháp khác mỗi băng/pik tương ứng với một loại vi sinh vật Để định danh loài các băng có thể được cắt và giải trình tự

Vì các kỹ thuật trên đánh giá thông qua gen ARN do vậy chúng đều có hạn chế là chỉ đánh giá được sự có mặt của các vi sinh vật mà không cho biết họat tính của chúng Cũng chính vì lẽ đó những vi sinh vật được nghiên cứu đầu tiên thuộc về nhóm có mối quan hệ chặt chẽ giữa phân loại và chức năng (ví dụ nhóm sinh metan, khử nitơ, nhóm vi sinh vật tạo sợi) Dù vậy, liên quan đến quá trình xử lý nước thải, điều chốt yếu vẫn là họat tính chứ không phải chỉ là sự có mặt của các nhóm chức năng Để có được những thông tin về hoạt tính, còn cần phải có nhiều đột phá mới trong phương pháp tiếp cận với hệ sinh thái Việc theo dõi đồng thời các thông số kỹ thuật và sự thay đổi của cấu trúc hệ vi sinh vật được sử dụng để tìm mối liên hệ giữa các quá trình biến đổi và đóng góp của các nhóm vi sinh vật nhất định Cuối cùng, kỹ thuật FISH được kết hợp với các kỹ thuật khác để đánh giá trạng thái sinh lý của tế bào Những kỹ thuật này bao gồm việc sử dụng đồng thời các vi điện cực và sensor

để đánh giá in situ nồng độ O2, NH4+, NO2- và NO3-; việc nhuộm các thể nội bào, quá trình hấp thụ các chất đánh dấu phóng xạ kết hợp với vi ảnh phóng xạ Việc kết hợp các kỹ thuật như vậy đã cho phép gắn kết các chức năng cụ thể cho một số nhóm vi

sinh vật nhất định in situ Liên quan tới phương pháp fingerprinting, phương pháp

này đã được thích ứng để phát hiện đồng thời rRNA và rDNA Lượng rRNA trong tế bào được biết là gần như tỉ lệ thuận với hoạt lực trao đổi chất của tế bào Bằng việc cho thêm cơ chất nhất định và theo dõi sự biến đổi của tỉ lệ rRNA/rDNA quan tâm, tính lực trao đổi chất và quan hệ với cơ chất của quần thể có thể được đánh giá Tuy nhiên phương pháp này có thể sẽ không đem lại kết quả đối với một số nhóm vi sinh vật nhất định, tỉ lệ rRNA/rDNA của chúng có thể vẫn giữ ở mức cao kể cả khi tế bào đang ở trạng thái đói dinh dưỡng

Đánh giá các kỹ thuật sinh học phân tử hiện hành

Trong lĩnh vực sinh thái học vi sinh vật điều quan trọng phải chấp nhận là chúng

ta không có và có thể sẽ không bao giờ có những kỹ thuật cho phép đánh giá toàn bộ

hệ vi sinh vật Những quan sát đầu tiên của Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723)

bị hạn chế bởi độ phân giải của kính hiển vi Sau này các phương pháp phân lập vi sinh cũng chỉ cho phép nuôi cấy một phần rất nhỏ của hệ vi sinh vật Gần đây nhất, các phương pháp đánh giá không cần nuôi cấy đã mở ra một tầm nhìn hoàn toàn mới

11

về cấu trúc đa dạng của hệ vi sinh vật trong nước thải Tuy nhiên, các thành tựu to lớn của kỹ thuật sinh học phân tử cũng không che hết được yếu điểm của nó là khả năng sản sinh những sai lệch

Một nhược điểm chính của việc thiết kế các mẫu dò nằm ở chỗ nó hoàn toàn phụ thuộc vào số lượng trình tự 16S rRNA có được tại thời điểm thiết kế Cho đến thời điểm này khi mà đã có hơn 22000 trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu, con số này vẫn rất nhỏ bé so với số lượng trình tự có thật trong thiên nhiên Như vậy sự “đặc hiệu” của mẫu dò có thể không thật sự là đặc hiệu Để làm giảm nhược điểm này, một

tổ hợp mẫu dò với độ đặc hiệu tăng dần có thể được sử dụng Tuy nhiên, khi có một số lượng lớn các quần thể vi sinh vật cần theo dõi đồng thời, số lượng hạn chế của các chất đánh dấu (4 mầu trong FISH) và việc đòi hỏi sự tương đồng trong điều kiện lai có thể là trở ngại lớn Một số vấn đề liên quan tới FISH bao gồm: (1)-việc miêu tả hệ sinh thái sử dụng các mẫu dò có phổ bao trùm lớn ví dụ như proteobacteria-beta, Cytophaga-Flavobacter hay vi khuẩn gram (+) với GC thấp sẽ không đem lại nhiều thông tin về họat tính của hệ sinh thái; (2)-vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) không chỉ khác nhau về khả năng bảo quản tế bào và khả năng thẩm thấu mà đôi khi cả hai điều trên đều có thể không thực hiện được; (3)-FISH không cho phép phát hiện tế bào với

số lượng ribosome nhỏ, đặc điểm thường liên quan tới họat tính trao đổi chất thấp Với các kỹ thuật fingerprinting ADN và ARN, vấn đề có thể nảy sinh trong quá trình tách chiết ADN cũng như PCR Không có phương pháp tách chiết ADN nào là vạn năng và luôn có khả năng một quần thể vi sinh vật nhất định sẽ bị bỏ sót Quá trình khuếch đại bằng PCR cũng sản sinh một loạt các sai lệch: (1)-cái gọi là mồi

“toàn năng” không thể là toàn năng; (2)-giá trị GC của sản phẩm PCR có thể sẽ thay đổi họat lực của Taq polymerase; quá trình khuyếch đại theo cấp số của PCR sẽ làm thay đổi tương quan thực tế so với gốc xuất phát Kết quả là những số liệu đạt được trên thực tế chỉ là bán định lượng Một khó khăn nữa là mặc dù việc định danh từng pik hoặc băng là hoàn toàn có thể nhưng sẽ tốn nhiều thời gian và trong một hệ vi sinh vật rộng và phức tạp, mỗi băng hay pik riêng biệt có thể chứa nhiều hơn là một quần thể

Cuối cùng, bất kể kỹ thuật gì được lựa chọn, mẫu dò phân tử hay là fingerprinting, các kỹ thuật này chỉ phát hiện được những quần thể chiếm đa số Các kỹ thuật này không cho phép phát hiện những quần thể với số lượng nhỏ hơn 1% của hệ sinh thái Những quần thể yếm thế trong hệ sinh thái, có thể sẽ rất quan trọng cho quá trình thích ứng, như vậy vẫn chưa thể phát hiện được

Một danh sách dài những sai lệch có thể có tuy vậy không thể làm giảm đi tầm quan trọng của việc ứng dụng các công cụ sinh học phân tử và quá trình tích lũy thông tin Với bất kể phương pháp gì trong vi sinh vật học, sai lệch luôn tồn tại và cần được

lưu ý Phương pháp áp dụng mẫu dò phân tử là phương pháp đánh giá hệ sinh thái có định lượng nhất hiện nay FISH kết hợp với quan sát sử dụng kính hiển vi quét laser được chứng minh là rất hữu hiệu trong việc đánh giá cấu trúc và họat tính của hệ sinh thái Phương pháp fingerprinting đòi hỏi phản ứng PCR và một vài mồi nhất định cho phép so sánh các thời điểm khác nhau trong động học phát triển của hệ sinh thái cũng như các hệ sinh thái với nhau Một bức tranh cơ bản ban đầu về hệ sinh thái có thể được nhanh chóng đưa ra với những kỹ thuật dạng này

1.5 Một số thành tựu của sinh học phân tử trong nghiên cứu xử lý nước thải

Quá trình phân hủy kị khí

Phân hủy kị khí được sử dụng rộng rãi như một phương pháp đơn giản và hiệu quả

để giảm thiểu ô nhiễm gây ra bởi chất thải hữu cơ Việc tìm hiểu những cơ sở cơ bản của hệ sinh thái vi sinh liên quan tới quá trình này là điều kiện tiên quyết để kiểm soát quá trình Những nghiên cứu sử dụng trình tự 16S rDNA đã minh chứng sự đa dạng

vi sinh trong những hệ sinh thái này Cho tới nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá được tòan bộ sự đa dạng của hệ sinh thái và mỗi hệ sinh thái như vậy thường chứa trên

100 loài Trong đa số trường hợp các loài phát hiện được đều là những loài mới và một số nhánh của chúng thuộc những nhóm mà cho tới nay vẫn chưa rõ về vai trò chuyển hóa vật chất trong hệ sinh thái kỵ khí ví dụ như nhóm Green non sulfur, Spirochetes, Synergistes

Những đóng góp trong lĩnh vực nghiên cứu động học của hệ sinh thái kỵ khí được thể hiện một cách xúc tích trong cuốn “Ổn định như thế nào thì gọi là ổn định? Chức năng đối lại Cấu trúc hệ sinh thái” của Fernandes (1999) Các kết quả nghiên cứu động học trong 2 năm cho thấy hệ xử lý kỵ khí với các thông số môi trường ổn định trên thực tế lại chứa một hệ vi sinh vật không hề ổn định Các kỹ thuật ARDRA và SSCP cho thấy nhóm vi sinh vật chủ đạo liên tục thay đổi Trong một nghiên cứu khác, các hệ sinh thái được thử nghiệm thông qua việc biến đổi đột ngột nồng độ cơ chất, kết quả cho thấy hệ sinh thái có thành phần vi sinh vật ổn định lại không ổn định

về chức năng

Ưu thế của sự đa dạng cũng được minh chứng trong một nghiên cứu của Schmidt

và Ahring, các tác giả này cho thấy nếu hệ thống UASB chỉ được đưa vào một loài sử dụng acetat và sinh metan sẽ kém ổn định hơn nhiều so với một hệ với hai loài tương

tự Những nghiên cứu này được thực hiện trong một hệ thống kín và do vậy minh chứng được mối quan hệ giữa đa dạng vi sinh và tính ổn định của hệ thống

Động học của vi sinh vật sinh metan trong quá trình khởi động hệ thống xử lý nước thải kỵ khí được nghiên cứu sử dụng mẫu dò phân tử và phương pháp fingerprinting

Trong cả hai trường hợp Methanoseata là loại vi sinh vật sinh metan chủ đạo được đưa vào đã bị thay thế bằng Methanosarcina

13

Động học chức năng dựa trên việc đồng thời đánh giá 16S rRNA (lượng ribosome) và 16S rDNA (lượng tế bào) được thực hiện trên một hệ thống xử lý kỵ khí quy mô phòng thí nghiệm với cơ chất là đường glucose Kết quả thí nghiệm cho thấy một sự cách biệt rõ ràng giữa sự có mặt của các nhóm vi sinh vật tạo nên hệ sinh thái và hoạt tính chức năng thực tế của chúng Một số nhóm vi sinh vật có số lượng thấp theo đánh giá bằng DNA nhưng lại có hoạt lực rất cao thể hiện qua đánh giá bằng rRNA Vai trò của các nhóm vi sinh vật như Spirochetes và Synergistes trong quá trình sử

dụng glucose và lactat trong hệ thống kỵ khí được thể hiện in situ thông qua việc đánh

giá động học họat lực của các nhóm vi sinh vật trong điều kiện bất cân đối về acetat

Từ kết quả của những nghiên cứu dựa trên việc phân lập và nuôi cấy, trong nhiều

năm Nitrosomonas và Nitrobacter được coi là những vi sinh vật oxy hóa ammoni và

vi sinh vật oxy hóa nitrit đóng vai trò quan trọng trong quá trình nitrit hóa của bùn hoạt tính Sự phát triển của kỹ thuật áp dụng mẫu dò phân tử đã làm thay đổi căn bản

quan niệm này Nitrosococcus mobilis và nhóm vi sinh vật gần với Nitrospira được

chứng minh là nhóm chủ đạo có mặt trong bùn hoạt tính nitrit hóa của hệ thống xử lý

nước thải giàu ammoni Mặt khác, Nitrosospira và Nitrospira spp lại là thành phần vi

sinh vật tham gia nitrit hóa chủ yếu trong nước thải nghèo ammoni Trong một số

nghiên cứu khác các vi sinh vật Nitrosomonas và nhóm gần Nitrospira là nhóm chủ

yếu trong biofilm của nước thải sinh hoạt và biofilm nitrit hóa tự dưỡng Mặc dù có vài tập hợp của vi khuẩn nitrit hóa trong nhiều hệ xử lý, hiện nay vẫn chưa thật sự rõ ràng về mối liên hệ giữa các cặp quần thể đó và vai trò chức năng trong hệ thống

Sự kết hợp của các kỹ thuật đánh giá động học như FISH với kính hiển vi quét laser

và vi cảm biến đã chỉ ra một số quy luật trong sinh thái của quần thể nitrit hóa Sự

phân bố trên biofilm nitrit hóa của vi khuẩn oxy hóa ammoni (Nitrosomonas trong một trường hợp và Nitrosospira trong trường hợp khác) và vi khuẩn oxy hóa nitrit (Nitrospira trong cả hai trường hợp) cho thấy có sự tương quan với gradien của nồng

độ ammoni: vi khuẩn oxy hóa ammoni phân bố ở phần ngoài trong khi đó vi khuẩn oxy hóa nitrit phân bố ở phần trong của biofilm Tốc độ phản ứng tổng thể được xác định trong vi trường phân bổ và được so sánh với mật độ tế bào để tính toán tốc độ

riêng của chuyển hóa in situ Tốc độ oxy hóa ammoni trên tế bào của Nitrosospira

spp từ 10-100 lần nhỏ hơn so tốc độ này của chủng thuần khiết đã công bố; tốc độ

oxy hóa nitrit của Nitrospira spp nhỏ hơn từ 200 tới 2000 lần so với tốc độ của

Nitrobacter spp trên môi trường nuôi cấy (hiện nay Nitrospira vẫn chưa thể phân lập

thuần khiết)

Nghiên cứu động học cũng được thực hiện để đánh giá tác động hủy họai của việc cung cấp nguồn cacbon đối với hệ nitrit hóa tự dưỡng, một vấn đề thường gặp trong các nhà máy xử lý nước thải Tất cả các thí nghiệm đều chỉ ra rằng trong hệ sinh thái

nitrit hóa các vi sinh vật Nitrosomonas và Nitrobacter áp đảo, trong khi đó các vi sinh

vật dị dưỡng chỉ chiếm thành phần thiểu số Nguồn cacbon bổ sung vào những hệ sinh thái này sẽ dẫn tới sự giảm thiểu về số lượng của vi sinh vật nitrit hóa và sự gia tăng dẫn tới áp đảo của vi sinh vật dị dưỡng Sự thay đổi về số lượng này đôi khi đồng nhất với sự hoán vị của các tập đoàn vi sinh vật nitrit hóa Trong một trường

hợp một nhóm vi sinh vật oxy hóa ammoni nhưng không phải là Nitrosomonas đã thế chỗ, trong trường hợp khác vi khuẩn oxy hóa nitrit là Nitrobacter được thay thế bằng

Nitrospira Như vậy sự áp đảo của một nhóm vi sinh vật nhất định trong hệ thống

nitrit hóa phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có tỷ lệ Nitơ/Cacbon và nồng độ oxy

Một số nghiên cứu gần đây với biofilm nitrit hóa cho thấy Nitrosomonas và

Nitrobacter đặc trưng cho hệ thống có nồng độ ammoni và oxy cao, trong khi đó hệ

thống có nồng độ ammoni thấp sẽ thuận lợi hơn cho Nitrosospira và Nitrospira

Quá trình làm sạch phospho

Quá trình làm sạch phospho trong nước thải được thực hiện thông qua việc làm giàu những vi sinh vật có khả năng tích lũy phospho trong bùn hoạt tính Việc làm giàu này có thể đạt được bằng cách xử lý kết hợp kỵ khí-và hiếu khí với sự có mặt của nguồn cacbon dồi dào Nguồn cacbon tạo tích lũy sau quá trình kỵ khí sẽ được sử dụng trong quá trình hiếu khí để tích lũy phosphat nội bào

Việc xác định vi sinh vật tích lũy phosphat theo phương pháp nuôi cấy vi sinh đã

dẫn đến sai lầm khi cho rằng vai trò này được đóng góp bởi Acinetobacter Việc xác định Acinetobacter bằng FISH nhanh chóng chỉ ra rằng nhóm vi sinh vật này không

thật sự áp đảo để có thể coi là tác nhân tích lũy phosphat trong bùn hoạt tính Những nghiên cứu tiếp theo được tập trung để định vị nhóm vi sinh vật tích lũy phosphat Các chiến lược sử dụng bao gồm việc so sánh các mẫu bùn hoạt tính với khả năng tích lũy phosphat khác nhau và làm giàu trong thời gian dài bùn hoạt tính có khả năng tích lũy phosphat Tất cả những nghiên cứu này kết thúc bằng việc chỉ ra nhóm vi sinh vật

gần với Rhodocyclus thuộc proteobacter beta và tạm thời đặt tên là Candidatus

Accumulibacter phosphatis Việc xác định trực tiếp nhóm vi sinh vật này cuối cùng

được thực hiện sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử FISH kết hợp đồng thời với việc nhuộm các hạt phosphat

sử dụng oxy hoặc nitrat cho sản sinh năng lượng đã được nghiên cứu bằng việc thay đổi các hệ thống xử lý trong phòng thí nghiệm từ điều kiện kỵ khí-hiếu khí sang kỵ khí-tuyệt đối không oxy Sự bền vững của hệ vi sinh trong quá trình chuyển đổi xác định bởi kỹ thuật SSCP cùng với các chỉ số môi trường trong nhiều ngày cho thấy cùng một hệ sinh thái có thể hô hấp với cả oxy và nitrat

Bởi vì hiệu quả của bùn tích lũy phosphat dựa trên việc làm giàu một nhóm vi sinh vật nhất định đối lại sự phá hủy của các nhóm vi sinh vật khác còn đang trong giai đọan nghiên cứu, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong lĩnh vực này chắc chắn sẽ có một tương lai sáng sủa

Vi khuẩn dạng sợi

Trong hệ thống sử dụng bùn hoạt tính, sự phát triển quá mức của vi khuẩn dạng sợi gây ra một số vấn đề trong tạo bọt và kết lắng Việc ngăn chặn tình trạng này thông thường được thực hiện thông qua việc đánh giá khả năng kết lắng [chỉ số thể tích bùn kết lắng (Sludge Volume Index - SVI)] và theo dõi sự phát triển của vi khuẩn dạng sợi bằng kính hiển vi Việc định tên vi khuẩn dạng sợi trong bùn hoạt tính được thực hiện thông qua các đặc điểm hình thái và một số phản ứng nhuộm màu thông thường kết hợp với khóa phân loại phát triển bởi Eikelboom (1975) Mẫu dò phân tử cho các nhóm vi khuẩn dạng sợi chính được thiết kế để đánh giá chính xác hơn các nhóm vi sinh vật có hình thái tương tự nhau và cho phép định danh cả những vi sinh vật có hình thái biến đổi theo các giai đoạn phát triển Các mẫu dò phân tử này đã được áp dụng để phát hiện sự phát triển của vi sinh vật dạng sợi trong các hệ thống xử lý ở quy

mô pilot Nhiều kết quả khác nhau được thông báo Trong một nghiên cứu, sự có mặt

của nhóm vi khuẩn gần với Thiothrix hoặc Sphaerotilus natans được khẳng định là có

liên quan tới chỉ số SVI Trong một nghiên cứu khác, chỉ số SVI giữ ở mức ổn định

khi nhóm vi sinh vật dạng sợi chủ đạo thay đổi từ Microthrix parvicella sang

Thiothrix sp và hai loài chưa biết khác Các thực nghiệm ở quy mô pilot cho thấy

việc cấp cơ chất gián đoạn làm gia tăng quá trình trung gian trong sự phát triển của

Thiothrix sp không nhận biết được khi đánh giá chỉ số SVI cũng như việc lọai bỏ bể

kết lắng sẽ làm biến mất toàn bộ vi sinh vật dạng sợi trong vòng 15 ngày và tương ứng

là sự suy giảm của chỉ số SVI

Cuối cùng, các thí nghiệm kết hợp đánh giá quá trình hấp thụ cơ chất đánh dấu phóng xạ với chụp ảnh vi phóng xạ và quan sát qua kính hiển vi đã được thực hiện để đánh giá các yếu tố quyết định sự phát triển của vi sinh vật dạng sợi Khả năng sử

dụng các acid béo trong điều kiện hiếu khí được phát hiện cho Microthrix parvicella Sau đó, sự phổ biến của vi khuẩn sulfur Thiothrix spp được phát hiện khi kết hợp với

acetate hay bicarbonat trong điều kiện dị dưỡng (heterotrophic), dị dưỡng-tự dưỡng

(mixotrophic) và tự dưỡng hóa học vô cơ (chemolithoautotrophic) Thiothrix được

chứng minh là hoạt động cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí Khả năng phát triển cả

dị dưỡng và tự dưỡng, sự kích thích mạnh của thiosulfate và bicarbonat được coi là

những yếu tố quyết định cho khả năng cạnh tranh áp chế của vi khuẩn Thiothrix đối

với các vi khuẩn khác trong bùn hoạt tính

Bổ trợ sinh học (bioaugmentation)

Bổ trợ sinh học (bioaugmentation) là biện pháp bao gồm việc đưa vào hệ sinh thái một loài chọn lọc nhằm làm tăng khả năng của hệ sinh thái Mặc dù biện pháp này thường được trình bày như một khả năng lớn lao trong việc xử lý chất thải, hiệu quả của chúng trên thực tế còn có nhiều bàn cãi Một số thực nghiệm bổ trợ sinh học ở quy mô lớn được thông báo là làm tăng hiệu quả của hệ thống (tuy nhiên thường là chỉ trong một thời gian ngắn) Một số nghiên cứu khác cho thấy bổ trợ sinh học chỉ đem lại một hiệu ứng nhỏ với quá trình xử lý Lý do được đưa ra để giải thích cho những thất bại thực nghiệm này bao gồm: khả năng thích ứng của vi sinh vật bổ sung, giới hạn của cơ chất, sự cạnh tranh của vi sinh vật bổ sung với vi sinh vật bản địa, hoặc do

bị protozoa ăn hết Những nghiên cứu này thường bị hạn chế do không có những số liệu sinh thái về hoạt tính, số phận của chủng đưa vào cũng như tương tác của chúng với hệ vi sinh vật bản địa Các kỹ thuật sinh học phân tử sẽ tìm thấy nhiều ứng dụng trong lĩnh vực này Chỉ có một số ít nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật phát hiện để theo dõi số phận của vi sinh vật đưa vào Tất cả những nghiên cứu này đều kết luận là bổ trợ sinh học chỉ có tác dụng ngắn ngủi hoặc không có tác dụng đối với hiệu quả của hệ thống và điều này luôn đi đôi với sự biến mất của vi sinh vật bổ trợ Trong hai nghiên cứu liên quan tới việc đưa chủng thuần khiết vào bùn hoạt tính, sự giảm số lượng của chủng bổ trợ được kết luận là do bị protozoa ăn mất

Kết luận

Trong nhiều năm, các nhà vi sinh vật học đã cố gắng giải thích hoạt động của hệ sinh thái bằng những số liệu dựa trên các chủng vi sinh vật đại diện trên môi trường nuôi cấy và nghĩ rằng có thể điều khiển và tối ưu hệ thống bằng cách bổ sung những chủng vi sinh vật hữu hiệu vào thời điểm thích hợp Ngày nay, chúng ta hiểu rằng những vi sinh vật đại diện này là không thích hợp và cấu trúc hệ sinh thái phức tạp hơn nhiều so với dự đoán ban đầu Hơn thế nữa, sự bền vững về các thông số kỹ thuật thường không gắn với sự ổn định trong hệ sinh thái Nói một cách khác sự biến đổi trong cấu trúc hệ sinh thái lại đảm bảo sự bền vững của các thông số kỹ thuật Như

17

vậy, bởi vì cấu trúc hệ sinh thái là không bền vững về khía cạnh vi sinh, các số liệu về động học của các tập đoàn vi sinh phải được đánh giá dựa trên một thực tế là: sự thay đổi của các tập đoàn vi sinh là bình thường và có thể không liên quan tới các biến động Đây là lúc các hệ thống xử lý phải được xem không phải chỉ là tổng đơn thuần của các vi sinh vật tham gia mà là một hệ bao gồm các quá trình, mỗi quá trình lại được thực hiện không phải bới một loại vi sinh vật mà là một tổ hợp vi sinh vật Trong phân tích cuối cùng phải thừa nhận là cho tới nay chúng ta vẫn chưa có khả năng theo dõi sự thể hiện của một gen nhất định trong hệ sinh thái (phát hiện RNA thông tin) cũng như chưa thể đưa thêm vào một vi sinh vật hữu hiệu để tham gia hệ sinh thái

Tuy nhiên, đã có một số yếu tố tích cực như sau: (1) chúng ta đã có thể theo dõi

động học của hệ thống in situ, không chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm mà cả trên quy

mô thực tế; (2) chúng ta đã bắt đầu hiểu về động học của các tập đoàn vi sinh vật và những kiến thức đem lại thực sự phong phú; (3) một số kỹ thuật mới sẽ sớm được áp dụng ví dụ như kỹ thuật chíp DNA (microarray) Với kỹ thuật như vậy chúng ta sẽ có thể đánh giá đồng thời hàng trăm tới hàng nghìn gen cho một mẫu phẩm môi trường Liên quan tới việc phát triển các hệ thống xử lý mới, các hệ thống này sẽ phải đảm bảo điều kiện cho sự hình thành và phát triển của các hệ sinh thái hiệu quả Các kỹ sư thiết kế vẫn sẽ tiếp tục nắm vai trò đi đầu Tuy nhiên, nếu độ chính xác cao hơn là mục tiêu, và chắc chắn là như vậy, kiến thức vi sinh sẽ là chỗ dựa tốt nhất

1.6 Phương pháp điện di trong gradient biến tính DGGE

Gradient biến tính được dùng để phát hiện sự đa hình của các đoạn ADN Các đoạn gen kích thước nhỏ nằm trong khoảng (200-700bp) được chạy trên gen acrylamide với độ biến tính gradient từ thấp tới cao; các đoạn gen sẽ được dịch chuyển từ từ theo trọng lượng phân tử, nhưng khi ở trong một điều kiện biến tính cao hơn, mỗi đoạn sẽ đạt tới một điểm ở đó ADN bắt đầu biến tính (melt), mỗi đoạn ADN

có trình tự khác nhau sẽ có vị trí biến tính ở các điểm khác nhau Chỉ cần thay đổi một trình tự cũng có thể làm thay đổi vị trí điểm biến tính Sự đa hình có thể được phát hiện thông qua quá trình di chuyển này

Nguyên lý: Điện di biến tính dùng để xác định sự khác nhau của các điểm biến tính

trong đoạn DNA kích thước nhỏ (trong khoảng 200-700 bp) mà chỉ khác nhau ít nhất

1 ký tự Khi một đoạn DNA được đặt trong môi trường vật lý biến tính tăng dần, đoạn ADN sẽ biến tính dần dần Khi điều kiện trở nên khắc nghiệt hơn phần biến tính của đoạn ADN sẽ phân tách thành mạch đơn Phần biến tính được tách ra không giống như việc mở khóa fecmotuya mà theo từng bước rất nhanh Tốc độ dịch chuyển của đoạn DNA trong gel acrylamid thay đổi tùy theo cấu trúc vật lý của chúng sau khi

biến tính Phần biến tính dịch chuyển chậm hơn so với các đoạn mạch đôi khi điện di trong gel polyacrylamid Trình tự khác nhau sẽ cho các vị trí biến tính khác nhau trong gradient và như vậy sẽ cho ta điểm dừng khác nhau trong gel So sánh các đoạn DNA cạnh nhau trên gel gradient biến tính có khả năng phát hiện đoạn đột biến

Có thể đánh giá cấu trúc của hệ vi sinh vật bằng phương pháp phân lập ADN tổng số, khuyếch đại một đọan gen bằng PCR (thông thường là rDNA) và điện di trong gradien biến tính (DGGE) Các vạch ADN sau điện di đặc trưng cho từng vi sinh vật và phổ điện di thể hiện trạng thái của cả hệ Các vạch ADN có thể được phân tách, đọc trình

tự, và tên loài được xác định Ưu điểm lớn nhất của kỹ thuật này có thể đánh giá thực trạng của hệ mà không phải nuôi cấy, phân lập và do vậy ngay cả những vi sinh vật không nuôi cấy được cũng có thể được phát hiện và đánh giá Trong thực tế, tác nhân biến tính được dùng là nhiệt (nhiệt độ duy trì ở 60 oC) kết hợp với formamide (trong khoảng từ 0-40%) và urea (trong khoảng từ 0-7M)

1.7 Các phương pháp phát hiện vi sinh vật gây bệnh

Dựa vào tính chất sinh lý sinh hoá

Phương pháp dựa trên các tính chất sinh lý và sinh hoá của từng loại vi sinh vật chúng ta có thể xác định được tên của vi sinh vật đó, như đối với các vi khuẩn đường ruột người ta thường xác định dựa trên 4 môi trường sau: môi trường Klisler, môi tr-ường ure-indol, môi trường manit di động, môi trường lysin decarboxylaza Ưu điểm chính của phương pháp là hầu hết các phòng xét nghiệm vi sinh đều có thể thực hiện được Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là cồng kềnh, tốn kém và cần phải có thời gian Đặc biệt, không phân biệt được giữa chủng gây bệnh và chủng là thành

phần vi khuẩn bình thường trong ruột như ở E coli

Định typ huyết thanh

Phương pháp dựa trên các công thức kháng nguyên người ta xác định tên các vi sinh vật này Người ta thấy ở vi khuẩn đường ruột thường có ba loại kháng nguyên là: kháng nguyên thân, kháng nguyên lông, kháng nguyên vỏ và sự phối hợp ba loại kháng nguyên này sẽ tạo nên công thức kháng nguyên của chúng Ưu điểm của phương pháp

là quá trình thực hiện định typ đơn giản, nhanh và cũng thực hiện được ở nhiều phòng thí nghiệm Nhược điểm của phương pháp là có quá nhiều typ huyết thanh do vậy việc xác định tất cả các typ huyết thanh sẽ rất tốn kém, và chỉ thực hiện được ở một số phòng thí nghiệm nhất định

19

Các phương pháp sinh học phân tử

Hiện nay chủ yếu là hai phương pháp: PCR và phương pháp lai ADN, trong đó PCR là phương pháp đang được các nước trên thế giới ứng dụng rất rộng rãi PCR là kỹ thuật khuyếch đại ADN in vitro với sự xúc tác của ADN polymeraza bằng việc kéo dài các đoạn mồi về phía đầu 3' của nó Ưu điểm của phương pháp này cho kết quả đáng tin cậy, độ chính xác cao, cho kết quả nhanh hơn hai phương pháp trên Tuy nhiên trong quá trình nhân một đoạn gen cần phải chọn mồi có tính đặc hiệu cao Nhược điểm của phương pháp cần phải đầu tư thiết bị ban đầu tốn kém Một phòng thí nghiệm dùng

để kiểm nghiệm bằng phương pháp sinh học phân tử cần có máy PCR, máy ổn nhiệt, máy li tâm eppendorp, máy điện di, máy soi UV

PHẦN 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

m3/ngày đêm, mức ô nhiễm 1500-2000 mg/l, BOD5 1000-1400 mg/l, SS 1200 mg/l

Hệ thống đi vào hoạt động ổn định từ năm 2002 với chất lượng nước thải đạt tiêu chuẩn (TCVN 5945/95, loại B) Các mẫu được lưu trữ đầy kín trong ống 50 ml và bảo quản trong điều kiện lạnh (trong đá) cho tới lúc phân tích vi sinh (sau 3h) Để phục vụ cho mục đích phân tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử mẫu được bảo quản ở -20C Các dụng cụ, hóa chất sử dụng đều thuộc loại dành cho sinh học phân tử

Hệ thống xử lý nước thải tại Viện Công nghiệp Thực phẩm

Hệ thống được đặt tại Viện Công nghiệp Thực phẩm và thực thi xử lý nước thải xưởng bia thực nghiệm của Viện Hệ thống được thiết kế dựa trên nguyên lý xử lý kỵ khí Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá sự có mặt của các vi sinh vật gây bệnh trong nước thải trước và sau xử lý

Chủng giống

Các chủng chuẩn Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri trong

nghiên cứu được cung cấp bới Viện Công nghiệp thực phẩm, Đại học Y Hà nội, Viện Công nghệ Sinh Học và Viện dinh dưỡng

Danh sách mẫu nước trong thí nghiệm xác định vi sinh vật gây bệnh

Bảng 3 Các mẫu ở xưởng bia của Viện Công nghiệp Thực phẩm

Ngày lấy mẫu

+ 18/4/2005 Mẫu 42 + Đục, không bị màu đen

Mẫu 43

+ Trong màu đen

21

25/4/2005 Mẫu 44

+ Mẫu 45

+ 4/5/2005 Mẫu 46

+ Mẫu 47

+ 27/5/2005 Mẫu 50

Bộ điện di ngang Pharmacia Biotech

Thiết bị DGGE SciePlas - UK

Box cấy BioblockScientific - Pháp

Cân điện tử Precisa - Thụy Điển

Kính hiển vi quang học Eclipse E600, Nikon - Nhật

Lò vi sóng LG - Hàn Quốc

Máy chụp ảnh gel Olympus

Máy đo pH Toledo - Anh

Máy lắc ổn nhiệt Eppendorf - Đức

Máy lắc ống nghiệm IKA KS130 Basic - Nhật

Máy ly tâm cao tốc Heraeus, Sepatech - Đức

Máy PCR PE-GeneAmp PCR System 9700 - Mỹ

Máy so mầu Genios - Áo

Máy soi gel Benchtop UV Transilluminator VWR – Mỹ

Nồi hấp thanh trùng Himayatoko - Nhật

Tủ lạnh giữ giống Electrolux - Thụy Điển

Tủ nuôi cấy Sanyo - Nhật

Tủ sấy Sanyo - Nhật

Đĩa petri, ống nghiệm có nắp, ống Eppendorf, ống Falcon, Pipetman, đầu côn các loai, que cấy các loại

2.3 Hóa chất

Hóa chất dùng tách ADN

Dung dịch đệm SSC

20SSC: pha 175,3 g NaCl và 88,2 g Sodium citrate trong 800ml nước cất Điều chỉnh

pH tới 7,0 bằng dung dịch 14N HCl Sau đó định mức bằng nước cất vô trùng tới 1 lit Hấp thanh trùng áp suất 1 at thời gian 15 phút Nồng độ cuối cùng bao gồm 3,0 M NaCl và 0,3 M sodium acetate

Hoá chất dùng trong PCR

-Enzym Taq ADN Polymerase 5 U/l (Qiagen, ĐH Quốc gia HN)

-dNTPs gồm: ATP, TTP, GTP, CTP (Pharmacia-Biotech)

- Mồi

Hóa chất dùng trong điện di và nhuộm

- Marker: Thang ADN mẫu dùng trong điện di gen (Gibco)

- 1% Agarose pha trong 0,5x TAE

- Ethidium bromide dùng để nhuộm gen

- Đệm TAE x 0,5 (Tris Acetate EDTA)

Hóa chất dùng điện di DGGE

40% Acrylamide (37,5:1 Acrylamide: bisacrylamide)

Pha 194,8 g acrylamide cho loại điện di và 5,2g bisacrylamide

Đong đến 500ml nước deion

Bảo quản trong tối khoảng 4 0C

0% biến tính (6,5% acrylamide trong 1TAE buffer) :

81 ml 40% acrylamide stock

10ml 50XTAE buffer

409 ml dd H20

Tổng cộng 500ml; bảo quản dung dịch ở 40C trong điều kiện tối

100% biến tính (6,5% acrylamide, 40% formamide, 7 M urea, trong 1X TAE buffer)

242 g Trizma base 2M TRIS

136,1 g sodium acetate 1M sodium acetate

18,6 g Na2EDTA 50mM EDTA

20% Ammonium persulfate (20% APS)

Pha 2 g amonium persulfate vào 10 ml dd H20 Bảo quản ở nhiệt độ -20C

Môi trường xác định vi sinh vật gây bệnh trong nước thải

Môi trường đếm Coliform trong nước thải (Desoxycholate Agar)

Môi trường pha loãng mẫu

Pha NaCl O,85%, hút 9 ml NaCl 0,85% vào các ồng nghiệm Thanh trùng 1 at, 15 phút

Môi trường phát hiện Salmonella trong nước thải

Môi trường làm giàu: Buffered pepton water (BPW)

Môi trường phát hiện E coli trong nước thải

Môi trường tăng sinh Brilliant Green Lactose Broth BGLB

Peptone 10g

Lactose 10g

Bile salt 20g

Pha 40 gram trong 1000ml nước cất Đặt ống Durham vào trong ống nghiệm chứa

9 ml môi trường tăng sinh BGLB

Môi trường tăng sinh EC broth

Môi trường chọn lọc phát hiện E coli: EMB agar:

Peptone 10g

Lactose 10g

Dipotasium phosphate 2g

Eosin Y 0,4g

25

Methylene blue 0,065g

Pha 40 g trong 1000 ml nước cất Hấp môi trường ở nhiệt độ 121C trong 15 phút

Môi trường thử sinh hóa

TSI (Triple Sugar Iron):

Pha 60 g trong 1000ml nước cất Hấp 121 C, 15 phút

LIM (Lysine- Indole- Motility)

Pha 50 g trong 1000 ml nước cất Hấp 121 C trong 15 phút

Môi trường phát hiện E coli 0157

Môi trường tăng sinh EC broth

Môi trường chọn lọc phát hiện E coli 0157: Sorbitol MacConkey

Xác định bằng phương pháp sinh học phân tử

Bảng 5 Danh sách, trình tự và gen đích của các mồi PCR sử dụng trong quá trình thực hiện

Salmonella

Salm3 GCTGCGCGCGAACGGCGAAG

invA Salm4 TCCCGGCAGAGTTCCCATT

Shigella

IpaH-F GCTGGAAAAACTCAGTGCCT

ipaH IpaH-R CCAGTCCGTAAATTCATTCT

Hoá chất dùng trong PCR bao gồm các loại sau:

- Enzym Taq ADN Polymerase 5 U/l (Qiagen, ĐH Quốc gia HN)

- dNTPs gồm: ATP, TTP, GTP, CTP (Pharmacia-Biotech)

- Thang ADN mẫu dùng trong điện di gen (Gibco)

- Agarose dùng trong điện di gen

- Ethidium bromide dùng để nhuộm gen

- Đệm TAE (Tris Acetate EDTA)

- Các loại mồi đã nêu trong bảng 5

2.4 Phương pháp tiến hành

2.4.1 Xác định vi sinh vật bằng phương pháp phân lập và định tên vi sinh vật

Xử lý mẫu cho phân tích vi sinh bằng kỹ thuật phân lập

Xử lý mẫu ở nhà máy sữa Hà Nội

Mẫu được lấy ở các tank kị khí, mỗi mẫu lấy vào 2 ống Falcon vô trùng Một ống xử

lý bằng máy siêu âm thời gian 15 phút để phá vỡ hạt, một ống không xử lý Các mẫu dùng làm vi sinh được làm ngay trong ngày Trong quá trình thao tác vi sinh mẫu đều được bảo quản trong điều kiện lạnh

Phân lập vi sinh vật

Để phân lập vi sinh vật các mẫu được đồng hóa cơ học và pha loãng bằng nước muối sinh lý (NaCl 0.85%) tới các nồng độ cần thiết Vi khuẩn được phân lập trực tiếp trên các môi trường LB Agar (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%, agar 1.6%), Thioglycollate Agar (pancreatic digest of casein 1.5%, yeast extract 0.5%, dextrose 0.55 %, NaCl 0.25%, L-cysteine 0.05%, sodium thioglycollate 0.5%, reazurin 0.0001%, agar 1.6%) với các thành phần môi trường của Difco, USA Các đĩa Petri được ủ trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí ở 30C Điều kiện kỵ khí được tạo ra trong bình kỵ khí chuyên dụng cùng với việc xử lý khí bằng BBLTM GasPakTM Anaerobic System Envelopes (BD, Ireland) theo khuyến cáo của hãng Điều kiện kỵ khí được

gián tiếp kiểm tra bằng khả năng mọc của chủng Clostridium perfringens trong bộ vi

sinh vật kiểm định của Viện Công nghiệp Thực phẩm (chủng này chỉ mọc trong môi trường kỵ khí) Nấm men và nấm mốc được phân lập trên môi trường Malt-Glucose 2Bx chứa 0.1% axit lactic và 2% aga Việc nuôi cấy nấm men được thực hiện ở 25C Các vi sinh vật có hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào khác biệt được phân lập Các vi sinh vật sau khi phân lập được làm sạch và bảo quản trong điều kiện giống như môi trường phân lập Các vi sinh vật có khả năng phát triển cả trong điều kiện yếm khí và kỵ khí sẽ được coi như yếm khí tùy tiện

27

Tách chiết ADN của các chủng nấm men đã phân lập dùng trong định tên

Cho 500µl 2x SSC vào mỗi ống, lấy đầy 1 vòng que cấy nấm men vào mỗi ống trên, lắc đều Đun 99C trong 10 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, hút bỏ phần dung dịch phía trên Rửa một lần bằng nước cất vô trùng, thêm 100µl hạt thủy tinh, thêm 100µl Phenol-Chloroform, cho thêm nước Votex trong 10 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút Phía trên là ADN của nấm men

Điện di

Sau phản ứng PCR 5l mẫu được trộn với 1l loading dye nạp lên 1.5% agarose gel trong 0.5TAE Điện di được thực hiện ở chế độ 120V cho tới khi băng mầu chuẩn dẫn đầu (Bromophenol Blue) đạt 2/3 gel Gel được nhuộm trong môi trường đệm 0.5TAE chứa 0.5 g/ml Ethidium Bromide trong vòng 20-30 phút Sau khi nhuộm gel được vớt ra và rửa qua bằng nước sau đó hiển thị dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 302 nm (tương đương chế độ “High” trên VWR Scientific Benchtop Ultraviolet

Transilluminator) Ảnh được lưu lại bằng máy ảnh kỹ thuật số

Tinh sạch ADN bằng QIAEX II từ Agarose Gel

Gel sau khi nhuộm Ethidium Bromide được đặt lên và hiển thị ở chế độ bức xạ thấp

Sử dụng dao mổ sạch, sắc cắt băng ADN từ gel Hạn chế tối đa thể tích của mẩu gel Dùng ống ly tâm loại 1.5 ml cho mẫu gel dưới 250 mg Xác định khối lượng của mẩu gel trong một ống không mầu

Bổ sung 3 thể tích của đệm QX1 đối với ADN có kích thước 100 bp tới 4kb Với ADN có kích thước ngoài khoảng trên thì dung theo công thức sau:

- Với ADN < 100 bp bổ sung 6 thể tích đệm QX1

- Với ADN < 4 kp bổ sung 3 thể tích đệm QX1 và 2 thể tích H2O

- Với gel nồng độ >2% hoặc gel Metaphor agarose bổ sung 6 thể tích đệm QX1

Đánh tan QIAEX II bằng vortex trong 30 giây Bổ sung QIAEX II vào mẫu theo công thức phía dưới và lắc đều

- Với lượng ADN ≤2 µg bổ sung 10 µl QIAEX II

- Với lượng ADN 2–10 µg DNA bổ sung 30 µl QIAEX II

- Cứ 10 µg DNA tiếp theo bổ sung thêm 30 µl QIAEX II

Ủ ở 50C trong 10 phút để làm tan agarose và ADN Cứ sau 2 phút lại lắc bằng vortex để giữ QIAEX II trong dạng huyền phù Kiểm tra mầu của dung dịch (phải có mầu vàng) Nếu dung dịch có mầu da cam hay hồng tím thì bổ sung 10 µl 3M sodium acetate, pH 5.0 và lắc đều Mầu phải chuyển sang vàng Mẫu sẽ phải ủ thêm ít nhất là

5 phút Ly tâm mẫu trong 30 giây và cẩn thận loại bỏ dung dịch bằng pipet

Rửa phần lắng bằng 500 l đệm QX1 Đánh tan phần lắng va ly tâm mẫu trong 30 giây sau đó loại bỏ phần dung dịch bằng pipet Trong bước này phần agarose còn sót

sẽ được loại bỏ

Hai lần rửa phần lắng bằng 500 µl đệm PE Đánh tan phần lắng va ly tâm mẫu trong

30 giây sau đó loại bỏ phần dung dịch bằng pipet Bước này sẽ loại bỏ lượng muối dư trong mẫu

Hong khô phần lắng trong 10-15 phút cho tới khi chuyển sang mầu trắng

Nếu lượng QIAEX II sử dụng là 30 l thời gian hong khô sẽ khoảng là 30 phút Không sử dụng cô chân không vì mẫu sẽ bị khô quá và ảnh hưởng tới hiệu suất thu hồi ADN

Bổ sung 20 l 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 hoặc H2O sau đó đánh tan bằng vortex để thu hồi ADN Ủ mẫu theo công thức sau:

Với ADN ≤4 kb ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

Với ADN 4-10 kb ủ ở 50C trong 5 phút

Với ADN >10 kb ủ ở 50C trong 10 phút

Ly tâm trong 30 giây và sau đó dùng pipet cẩn thận chuyển phần dung dịch sang ống mới Trong dung dịch bây giờ đã chứa ADN tinh sạch

Định tên vi sinh vật bằng đọc trình tự

Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc

sử dụng kit AmpliTaq (Amersham) theo hướng dẫn của hãng Máy đọc trình tự, model 377 của hãng Applied Biosystem được sử dụng Đầu tiên các chuỗi ADN được

so sánh với GeneBank thông qua giao diện tìm kiếm BLAST Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó so sánh bằng các phần mềm sử lý bằng phần mềm BioEdit

và so sánh bằng ClustalX, các thông số sửa khoảng cách (fixed gap) và thông số phạt cho khoảng cách trôi (floating gap penalty) sử dụng là 10 Sơ đồ huyết thống được dựng dựa trên độ khác biệt về di truyền theo Kimura sử dụng phương pháp nối gần (neighbor-joining) với phần mềm ClustalW Phân tích xác suất lặp (bootstrap) được

29

thực hiện dựa trên 1000 thử nghiệm ngẫu nhiên Sơ đồ huyết thống được hiển thị bằng phân mềm TreeView

2.4.2 Xác định vi sinh vật bằng kỹ thuật điện di DGGE

Tách chiết ADN từ bùn hoạt tính dùng trong kỹ thuật DGGE

Để tách chiết ADN từ bùn họat tính, kỹ thuật tách chiết bằng hóa chất sử dụng DNAzol kết hợp đồng thời với tác dụng cơ học (hạt thủy tinh) được áp dụng nhằm đảm bảo có thể thu được ADN từ các nhóm vi sinh vật khác nhau Bùn họat tính được

ly tâm và rửa 2 lần bằng nước muối sinh lý Khoảng 25 g phần lắng được trộn với 0.5 ml DNAzol và hạt thủy tinh Hỗn hợp được lắc ở 1400 vòng/phút trong 10 phút Sau khi ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút, 150 l dịch trong được hút ra và ADN được kết tủa bằng 75 l cồn tuyệt đối Dịch được đặt trong nước đá 5 phút và ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút Phần ADN kết tủa được rửa bằng cồn 70% sau

đó làm khô và hòa trong nước Dung dịch có thể sử dụng trực tiếp để làm khuôn cho PCR ADN từ các chủng vi sinh vật thuần khiết được thực hiện theo phương pháp phá

cơ học sử dụng hạt thủy tinh kết hợp với tách chiết bằng phenol-chloroform

Chia vào mỗi ống 24µl sau đó thêm 1 µl ADN khuôn cho mỗi phản ứng

Phương pháp điện di DGGE

Các dụng cụ dùng để điện di đều được rửa rất kỹ lưỡng, tráng bằng nước cất 1 lần, kiểm tra độ sạch của phiến kính bằng cách xịt cồn 90% lên phiến kính thủy tinh sao cho cồn chảy thành dòng nước không bị dính một vết bẩn trên phiến kính.Sau đó để khô dụng cụ để chuẩn bị điện di

Cách làm gel:

70% chất biến tính 9% gel 17.5 ml 40% chất biến tính 9% gel 17.5 ml Ammonium persulphate 20% 87.5 µl 87.5 µl

Rót khoảng 6l dung dịch 0,5TAE vào máy điện di DGGE Đặt nhiệt độ khoảng 60C, đun nóng cho đến khi nhiệt kế chỉ đến 60C Trong thời gian gia nhiệt tiến hành rót gen theo các nồng độ 20% đến 80% chất biến tính hoặc 30% đến 70% chất biến tính tùy theo mục đích của công việc Sau đó nhấc toàn bộ bản gen vào trong bể điện

di có chứa dung dịch 0,5TAE Nhỏ mẫu vào các giếng

Đặt chế độ điện di: Thời gian: 14-16 giờ

Nhiệt độ: 600C Hiệu điện thế 70V Gel sau khi chạy được nhuộm bằng Ethidium Bromide và hình ảnh được ghi lại bằng máy kỹ thuật số

2.4.3 Xác định vi sinh vật gây bệnh trong nước thải

Kiểm tra sinh hóa

Môi trường TSI: được dùng để phát hiện vi sinh vật gây bệnh gram âm dựa vào lên

men carbohydrate và sinh ra H2S TSI agar bao gồm 3 loại đường (dextrose, lactose và sucrose), phenol đỏ để phát hiện lên men cacbohydrate và ferrous ammonium sulfate

để xác định khả năng sinh khí H2S Lên men carbohydrate được chỉ ra bởi việc sinh ra khí và thay đổi màu của chỉ thị pH từ màu đỏ đến màu vàng Để thuận tiện cho việc phát hiện vi sinh vật chỉ lên men dextrose, nồng độ dextrose khoảng 1/10 nồng độ của lactose và sucrose Một phần nhỏ của axit được sinh ra trên phần nghiêng của ống khi lên men dextrose

Môi trường LIM: (Lysine Indole Motility) là môi trường màu tím, dùng để kiểm tra

phản ứng khử lysine, nhỏ một giot indol kiểm tra sự thay đổi màu để xác định phản ứng sinh indol, khả năng chuyển động

Chọn khuẩn lạc dùng que cấy đâm xiên cấy thẳng đứng, nuôi cấy 1 ngày ở 37C

Phản ứng khử lysine: Nếu ống vẫn màu tím ta có kết quả (+), nếu phía trên màu tím,

dưới màu vàng ta có kết quả (-)

Phản ứng sinh Indole: Nhỏ một giọt Indole vào ống, nếu xuất hiện màu đỏ ta có kết

quả (+), nếu không màu ta có kết quả (-)

Khả năng dịch chuyển: Nếu khuẩn lạc cấy lên đó mọc xung quanh ta có kết quả (+),

nếu mọc theo đường thẳng ta có kết quả (-)

Xác định Salmonella

Tăng sinh: 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng

nhất mẫu và ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ

Tăng sinh chọn lọc: Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0,1ml sang 10ml môi

trường tăng sinh Rappapport-Vassliadis Môi trường này chứa malachit green và

31

MgCl2 giúp ức chế các vi sinh vật thường có mặt trong đường ruột, nhưng không ảnh

hưởng đến sự sinh trưởng của hầu hết Salmonella Sau đó, chúng được ủ ở 42  0,2 C

trong 12-24 giờ

Phân lập và nhận diện: Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc

đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc

trưng cho Salmonella là MLCB hoặc môi trường SS Trên môi trường MLCB và SS khuẩn lạc Salmonella có màu đen Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở 37

C trong 22-24 giờ Sau khi ủ, chọn các khuẩn lạc có đặc điểm của Salmonella như

trên để thực hiện bước khẳng định bằng các bước thử nghiệm sinh hoá trên môi trường LIM và TSI hoặc bằng PCR

Xác định E coli

Phương pháp 1

Hút 1ml mẫu nước thải vào môi trường làm giàu (BGLB hoặc EC) có chứa ống Durham Nuôi 1 ngày ở nhiệt độ 37C Nếu trong ống durham sinh khí, lấy 1 vòng que cấy sau đó cấy theo kiểu phân lập trên bề mặt đĩa chứa môi trường EMB Nuôi 1 ngày ở nhiệt độ 37C Nếu trên đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc màu đen ánh kim có thể

mẫu nước thải có nhiễm E coli Cấy một số khuẩn lạc màu đen ánh kim sang môi trường TSI và LIM để khẳng định mẫu nước thải có nhiễm E coli hay không

Phương pháp 2:

ES coliform là một loại test thử phát hiện nhanh sự có mặt của E coli đối với các mẫu

nước, chỉ cần đổ khoảng 50 ml nước thải vào môi trường ES Coliform nuôi 24- 48 giờ

ở nhiệt độ 37C sau đó soi bằng đèn cực tím nếu thấy có phát sáng chứng tỏ mẫu bị

nhiễm E coli

Xác định Shigella

Tăng sinh: 25 g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng

nhất mẫu và ủ ở 37C trong 18 - 24 giờ

Tăng sinh chọn lọc: Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0,1 ml sang 10 ml môi

trường tăng sinh Rappapport-Vassliadis Nuôi ở nhiệt độ 42 C trong 22-24 giờ

Phân lập: Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa chọn

lọc cho Shigella là SS Trên môi trường SS khuẩn lạc Shigella không màu Tất cả các

đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở 37C trong 22 - 26 giờ Sau khi ủ, chọn các

khuẩn lạc có đặc điểm của Shigella như trên để thực hiện bước khẳng định như bằng

các bước thử nghiệm sinh hoá trên môi trường LIM và TSI hoặc bằng PCR

Xác định vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp sinh học phân tử

Tách chiết ADN: Để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn và giải phóng ADN, chúng tôi xử

lý dịch huyền phù tế bào vi khuẩn như sau: đun 100 C trong 15 phút Trường hợp không tiến hành phản ứng ngay, ADN khuôn mẫu này sẽ được bảo quản trong tủ lạnh

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Salmonella: 95C - 2 phút, 35 vòng (94C - 40 giây, 62C- 40 giây, 72C- 40 giây),

72C- 7 phút, 10C- ∞

Shigella: 95C - 2 phút, 35 vòng (94C - 40 giây, 56C- 40 giây, 72C- 40 giây), 72

C - 7 phút, 10C- ∞

Bảng 6 Số lượng vi sinh vật trong mẫu bùn kỵ khí nhà máy sữa Hà Nội (UASB 3)

Điều kiện nuôi cấy Môi trường Số lượng tế bào/ml

Kị khí Thioglycolate 1.4106

LB 1108 Hiếu khí Thioglycolate 4108

LB 1106 Nấm men Malt-Glucose 1.5103

Theo như những số liệu nhận được lượng vi sinh vật phát triển trong điều kiện hiếu khí đạt khoảng 4108 cfu/ml và trong môi trường kỵ khí đạt khoảng 1.4 108

cfu/ml Số lượng nấm men không cao và vào khoảng 1.5103 cfu/ml Đại đa số các chủng phân lập được trong môi trường kỵ khí đều có thể phát triển trên môi trường hiếu khí

Như vậy, số lượng vi sinh vật đánh giá được bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh không cao (không quá 5108 cfu/ml) Con số này quá nhỏ bé so với số lượng vi sinh vật có thể quan sát được trong bùn kỵ khí (khoảng 11011 tế bào/ml) Điều này đồng nghĩa với việc chỉ khoảng 0.5% số vi sinh vật trong bùn kỵ khí là nuôi cấy được Đây cũng là kết quả mà chúng tôi đã dự đoán và hoàn toàn phù hợp với những đánh giá trước đây về phương pháp nuôi cấy vi sinh vật Ngoài ra, khả năng rất lớn là những

nhóm vi sinh vật quan trọng nhất trong bùn kỵ khí sẽ không thể phát hiện được thông qua phương pháp nuôi cấy

Tuy nhiên những nhận định và kết quả trên đây không có nghĩa là phương pháp nuôi cấy hoàn toàn không có chỗ đứng trong nghiên cứu hệ vi sinh vật bùn kỵ khí Một số nhóm vi sinh vật tuy có số lượng nhỏ nhưng mang tính chất chỉ thị cho hệ sinh thái Một số nhóm ngoài ra có thể có những vai trò nhất định không thể thiếu được và chúng đóng vai trò giữ cân bằng hoặc là những tác nhân quyết định trong động học phát triển khi có những biến cố về thành phần và điều kiện môi trường Ngoài ra, một

số nhóm vi sinh vật tuy không đóng vai trò gì trong quá trình chuyển hóa vật chất trong nước thải nhưng lại là yếu tố xác định chất lượng của nước sau xử lý, đó là nhóm các vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật chỉ thị cho điều kiện vệ sinh môi trường

Để có thể có cái nhìn chính xác hơn về nhóm vi sinh vật nuôi cấy được chúng tôi tiến hành phân lập và định tên những vi sinh vật điển hình Sau đây là danh sách các chủng vi sinh vật phân lập được

Bảng 7 Danh sách các chủng vi sinh vật phân lập được từ hệ thống xử lý nước thải của nhà máy sữa Hà Nội vận hành theo nguyên lý UASB

Mẫu Điều kiện nuôi cấy Môi trường Các chủng phân lập được

UASB 2 Kỵ khí LB WWB1, WWB2

Kỵ khí Thioglycolate WWB3, WWB4,WWB5, WWB6, WWB7

Hiếu khí Malt-Glucose WWY1, WWY2, WWY3, WWY4, WWY5,

WWY6, WWY7, WWY12, WWY13, WWY14, WWY15, WWY16, WWY17, WWY18, WWY19, WWY20

UASB 3 Kỵ khí Thioglycolate WWB8, WWB9, WWB10, WWB 11, WWB

12

Hiếu khí LB WWB 13, WWB 14, WWB 15, WWB 16,

WWB 17, WWB18, WWB19, WWB20, WWB21, WWB22

Hiếu khí Malt-Glucose WWY12, WWY13, WWY14, WWY15,

WWY16, WWY17, WWY18, WWY19, WWY20

Bể hiếu khí Hiếu khí Malt-Glucose WWY18, WWY19, WWY20

35

Staphylococcus pasteuri WWB2 S pasteuri WWB2 (Gram)

Streptococcus bovis WWB1 Klebsiella pneumoniae WWB3 (Gram)

Hình 1 Hình ảnh một số loại vi khuẩn phân lập từ bùn kỵ khí nhà máy sữa Hà Nội

Hình 2 Một số chủng vi sinh vật nhân thật phân lập được từ bùn kỵ khí Chú thích:

Theo các hàng từ trên xuống dưới WWY4 – Prototheca sp (Tảo sinh sản dị dưỡng, không có khả năng quang hợp); WWY7 – Pichia/Candida jadinii 565/573 (98%),

Pichia galeiformis WWY9 Thanh chèn bên trái tương đương 10 m, thanh chèn bên

phải tương đương 4 m