Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể chó phú quốc dựa trên trình tự HV1 thuộc vùng CR trên hệ gen ty thể

Trên cơ sở những nghiên cứu trước đây, nhu cầu tìm hiểu nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc cùng với những kiến thức, kỹ thuật đã được trang bị, đề tài đã được tiến hành với những nghiê

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM



THÁI KẾ QUÂN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHÓ PHÚ QUỐC DỰA TRÊN TRÌNH TỰ HV1 THUỘC VÙNG CR TRÊN HỆ GEN TY THỂ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2019

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM



THÁI KẾ QUÂN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHÓ PHÚ QUỐC DỰA TRÊN TRÌNH TỰ HV1 THUỘC VÙNG CR TRÊN HỆ GEN TY THỂ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Trần Hoàng Dũng

2 TS Chung Anh Dũng

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự định hướng, góp ý của hai Thầy hướng dẫn và sự giúp đỡ của các thành viên trong nhóm nghiên cứu Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào của người khác Các kết quả cũng đã được những người tham gia thực hiện đồng ý cho phép tôi sử dụng trong luận án Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu, kết quả trong luận án này

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019

Nghiên cứu sinh

Thái Kế Quân

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Sài Gòn đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt công việc học tập, nghiên cứu, hoàn thành luận án cũng như việc giảng dạy tại Trường

Công ty TNHH CNSH Khoa Thương đã tư vấn, hỗ trợ các thiết bị như máy

đo OD, máy PCR, và giải trình tự DNA, giúp tôi hoàn thành tốt các công việc của luận án

PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy, đã giúp đỡ tôi những lúc khó khăn, đã kết nối và động viên tôi bắt đầu với đề tài nghiên cứu này

Anh Lê Quốc Tuấn, chủ Trung tâm bảo tồn chó xoáy Phú Quốc – Trang trại Thanh Nga đã cung cấp nhiều thông tin về đặc điểm, tập tính chó lưng xoáy Phú Quốc, và tạo điều kiện cho chúng tôi thu mẫu lông chó lưng xoáy Phú Quốc

Các bạn, các em Trần Quốc Thắng Hoa, Nguyễn Thị Ái Nữ (bác sĩ thú y - Quận Bình Thạnh), Lại Kiều Oanh (bác sĩ thú y - Quận 1), Nguyễn Thị Như (Trạm Thú y Quận Bình Tân) đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc kết nối với chủ nuôi chó, và thu thập các mẫu lông chó lưng xoáy Phú Quốc ở khu vực Thành phố Hồ Chí Minh

Các đồng nghiệp, thành viên trong nhóm nghiên cứu: Nguyễn Thành Công, Nguyễn Văn Tú, Hoàng Thảo Thanh Tú, Trần Anh Hoàng, Quan Quốc Đăng,

Huỳnh Văn Hiếu đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận

án

Cảm ơn gia đình, cảm ơn Má, Huyền và các con đã luôn ở bên Quân

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019

Thái Kế Quân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xi

MỞ ĐẦU 1

1 Giới thiệu 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

2.1 Mục tiêu chung 2

2.2 Mục tiêu cụ thể 2

3 Những đóng góp mới của đề tài 3

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

5.1 Đối tượng nghiên cứu 4

5.2 Phạm vi nghiên cứu 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về chó lưng xoáy Phú Quốc 5

1.1.1 Giới thiệu về chó lưng xoáy Phú Quốc 5

1.1.2 Phân loại chó lưng xoáy Phú Quốc 5

1.1.3 Đặc điểm hình thái và tập tính của chó lưng xoáy Phú Quốc 6

1.1.4 Các nghiên cứu về nguồn gốc và di truyền chó lưng xoáy Phú Quốc 9

1.2 Đặc điểm di truyền của tính trạng xoáy lưng 11

1.3 Hệ gen ty thể của chó 13

1.3.1 Cấu trúc hệ gen ty thể của chó 13

1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm di truyền vùng CR trên hệ gen ty thể của chó 14

1.4 Các nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa, phát sinh chủng loại và đa dạng di truyền của chó 16

1.4.1 Các nghiên cứu khảo cổ 16

1.4.2 Các nghiên cứu di truyền hiện đại 20

1.4.2.1 Các chỉ thị phân tử được dùng trong nghiên cứu 20

1.4.2.2 Nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa của chó nhà 23

1.4.2.3 Nghiên cứu về đa dạng di truyền của các giống chó 27

1.5 Cơ sở dữ liệu DNA GenBank và dữ liệu vùng trình tự HV1 DNA ty thể 31

1.5.1 Cơ sở dữ liệu DNA GenBank 31

1.5.2 Dữ liệu về trình tự vùng HV1 DNA ty thể trên GenBank 32

1.6 Nhận định chung về vấn đề nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể chó lưng xoáy Phú Quốc 33

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Nội dung nghiên cứu 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu và công cụ định loại haplotype đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể 37

2.2.1.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự đoạn 582 cặp base vùng HV1DNA ty thể 37

2.2.1.2 Đánh số nucleotide và trình bày các đột biến 39

2.2.1.3 Xác định haplotype và hiệu chỉnh dữ liệu 39

2.2.1.4 Công cụ xác định haplotype vùng HV1 của DNA ty thể 40

2.2.1.5 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 41

2.2.2 Xác định trình tự nucleotide đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể của chó nhà Việt Nam và chó lưng xoáy Phú Quốc 41

2.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị sử dụng 41

2.2.2.2 Thu thập và xử lý mẫu 42

2.2.2.3 Tách chiết DNA tổng số từ lông chó 44

2.2.2.4 Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng quang phổ kế 46

2.2.2.5 Khuếch đại trình tự vùng HV1 bằng phản ứng PCR 47

2.2.2.6 Giải trình tự và biên tập trình tự 48

2.2.3 Đánh giá sự đa dạng di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc dựa trên đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể 49

2.2.3.1 Xác định độ đa dạng haplotype 49

2.2.3.2 Xác định độ đa dạng nucleotide 50

2.2.3.3 Xây dựng mạng lưới quan hệ của các haplotype 51

2.2.3.4 Xác định khoảng cách di truyền giữa hai quần thể 51

2.2.3.5 Phân tích phương sai phân tử (AMOVA) 52

2.2.4 Nhận định nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc 53

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể chó 54

3.1.1 Cơ sở dữ liệu đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể chó 54

3.1.2 Hiệu chỉnh dữ liệu 55

3.1.3 Công cụ xác định haplotype vùng HV1 của DNA ty thể 57

63 3.2 Xác định trình tự đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể chó nhà Việt Nam và chó lưng xoáy Phú Quốc 64

3.2.1 Xác định quy trình tách chiết DNA từ lông chó 64

3.2.1.1 Khảo sát các điều kiện cho quy trình tách chiết DNA 64

3.2.1.2 So sánh hiệu quả của quy trình tách chiết DNA từ lông chó 67

3.2.2 Tách chiết DNA từ lông chó 70

3.2.3 Khuếch đại vùng HV1 70

3.2.4 Đọc và biên tập trình tự nucleotide 72

3.2.5 Xác định haplotype của các mẫu chó lưng xoáy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam 73

3.3 Đa dạng di truyền vùng HV1 DNA ty thể chó lưng xoáy Phú Quốc 76

3.3.1 Sự đa dạng ở cấp độ nucleotide 76

3.3.2 Sự đa dạng ở cấp độ haplotype 79

3.3.3 Quan hệ di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc với các giống chó khác 86

3.3.3.1 Quan hệ di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc với các giống chó khác trên thế giới 86

3.3.3.2 Quan hệ di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam 89

3.3.3.3 Quan hệ di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam tại Kiên Giang 91

3.4 Nhận định về nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc 93

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 100

I Kết luận 100

II Kiến nghị 101

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 PHỤ LỤC PL-1

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Chó lưng xoáy Phú Quốc 6

Hình 1.2: Một số kiểu xoáy lưng ở chó lưng xoáy Phú Quốc 8

Hình 1.3: Cấu trúc hệ gen DNA ty thể của chó 14

Hình 1.4: Vị trí và thành phần vùng CR trong DNA ty thể chó 15

Hình 1.5: Vị trí của “điểm nóng” trong vùng HV1 16

Hình 1.6: Một vài cột mốc trong lịch sử tiến hóa của chó và của người 19

Hình 1.7: Các haplotype của DNA ty thể chó gom thành 6 haplogroup A, B, C, D, E, F trên cây tiến hóa 24

Hình 1.8: Vị trí khởi đầu và con đường di cư của chó 26

Hình 2.1: Quy trình thực hiện các nội dung nghiên cứu 36

Hình 2.2: Mô hình dữ liệu 37

Hình 2.3: Quy trình thu thập và lưu trữ dữ liệu 38

Hình 2.4: Sơ đồ hoạt động của công cụ xác định haplotype "Haplotype identifier” 41

Hình 2.5: Vị trí thu mẫu và số lượng mẫu thu được 43

Hình 2.6: Quy trình tách chiết DNA 46

Hình 2.7: Vị trí các mồi sử dụng trong phản ứng PCR và trong giải trình tự 48

Hình 2.8: Một đoạn đồ thị huỳnh quang – kết quả giải trình tự mẫu PQ101 49

Hình 3.1: Phân bố của các trình tự thuộc haplogroup B 61

Hình 3.2: Giao diện trang chủ hỗ trợ khai thác cơ sở dữ liệu 63

Hình 3.3: Giao diện công cụ Haplotype identifier 63

Hình 3.4: Khảo sát các điều kiện tách chiết DNA 65

Hình 3.5: Quy trình tách chiết DNA từ lông chó 67

Hình 3.6: So sánh hiệu quả một số quy trình tách chiết DNA 68

Hình 3.7: DNA tổng số tách chiết được của các mẫu từ PQ33 đến PQ42 70

Hình 3.8: Một số sản phẩm DNA được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR 71

Hình 3.9: Một đoạn kết quả giải trình tự mẫu VD22 73Hình 3.10: Các vị trí đa hình của chó lưng xoáy Phú Quốc 77Hình 3.11: Các vị trí đa hình của chó nhà Việt Nam 78Hình 3.12: Kết hợp cây phát sinh chủng loại và mạng lưới thể hiện mối quan

hệ của các haplotype 83Hình 3.13: Khoảng cách di truyền ước tính giữa một số giống chó trên thế giới 89Hình 3.14: Sự tương đồng haplotype giữa nhóm chó đất liền Kiên Giang và

nhóm chó trên đảo Phú Quốc 91Hình 3.15: Các sai khác nucleotide giữa các haplotype ở chó nhà Việt Nam

(màu xanh lục) và chó lưng xoáy Phú Quốc (màu đỏ) 94

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tương quan giữa kiểu gen và các kiểu hình xoáy lưng, u nang biểu

bì 12

Bảng 2.1: Nội dung và điều kiện khảo sát quy trình tách chiết DNA 45

Bảng 2.2: Các mồi sử dụng cho phản ứng khuếch đại vùng HV1 DNA ty thể 48

Bảng 2.3: Mẫu trình bày kết quả phân tích AMOVA 52

Bảng 3.1: Các loài/phân loài có trình tự DNA ty thể trong cơ sở dữ liệu 54

Bảng 3.2: Một số trường hợp trình tự công bố có thông tin sai lệch 56

Bảng 3.3: Bộ đột biến đặc trưng của các haplogroup 57

Bảng 3.4: Xác định haplotype của 50 trình tự bằng công cụ xác định haplotype và bằng cây phát sinh chủng loại 58

Bảng 3.5: So sánh việc định loại haplotype bằng Haplotype identifier và bằng xây dựng cây phát sinh chủng loại 62

Bảng 3.6: So sánh DNA thu được ở các nhiệt độ ủ mẫu khác nhau 64

Bảng 3.7: So sánh DNA thu được ở các thời gian ủ mẫu khác nhau 65

Bảng 3.8: So sánh DNA thu được khi tủa bằng muối NaOAc và NaCl 66

Bảng 3.9: Kết quả định loại haplotype chó lưng xoáy Phú Quốc 74

Bảng 3.10: Kết quả định loại haplotype chó nhà Việt nam 75

Bảng 3.11: Mức độ đa dạng nucleotide ở một số giống chó trên thế giới 79

Bảng 3.12: Số lượng các haplotype ở chó lưng xoáy Phú Quốc và chó nhà Việt Nam 80

Bảng 3.13: Mức độ đa dạng haplotype của một số giống chó trên thế giới 82

Bảng 3.14: Phân tích AMOVA giữa một số quần thể chó trên thế giới 87

Bảng 3.15: Phân tích AMOVA giữa các quần thể chó sống tại Việt Nam 90

Bảng 3.16: Phân tích AMOVA giữa các quần thể chó ở Kiên Giang 92

Bảng 3.17: Khoảng cách di truyền của các nhóm chó ở Kiên Giang và chó Thái Lan 93

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AMOVA Analysis of Molecular variance Phân tích phương sai phân

tử

cơ thể

CHD Canis mtDNA HV1 database Cơ sở dữ liệu trình tự HV1

DNA ty thể của chi Canis

COI Cytochrome c oxidase subunit I Tiểu phần 1 của enzyme

cytochrome c oxidase

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP deoxyribose nucleotide triphosphate Nucleotide tự do

FCI Federation Cynologique Internationale Tổ chức giống chó thế giới

haplogroup

Nhóm các haplotype cùng mang đa số các vị trí đa hình giống nhau

haplotype

Một đoạn trình tự nucleotide

có các vị trí đa hình đặc trưng, có khả năng di truyền cùng nhau

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

nucleotide

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi nhờ enzym

polymeraza rRNA ribosomal ribonucleic acid RNA ribôxôm

SNP Single Nucleotide Polymorphism Sự đa hình đơn nucleotide

MỞ ĐẦU

1 Giới thiệu

Chó lưng xoáy Phú Quốc là giống chó đặc hữu của Việt Nam, xuất hiện từ rất lâu trên đảo Phú Quốc, thuộc tỉnh Kiên Giang - Việt Nam Cùng với chó lưng xoáy Nam Phi và chó lưng xoáy Thái Lan, chó lưng xoáy Phú Quốc có kiểu hình đặc biệt hiếm có trên thế giới là có dải lông mọc ngược dọc theo sống lưng, được gọi là xoáy lưng Chó lưng xoáy Phú Quốc trung thành, có khả năng săn mồi tốt, thông minh, nhanh nhẹn nên rất được ưa chuộng tại Việt Nam Tuy nhiên, sự lai tạo vì mục đích thương mại nhằm tạo ra những con chó lưng xoáy Phú Quốc theo những tiêu chuẩn không có cơ sở khoa học đã ít nhiều làm mất đi nguồn gen của chó lưng xoáy Phú Quốc

Nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc cũng chưa được nghiên cứu rõ ràng

Đã có nhiều giả thuyết trái chiều về nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc Theo hai nhà khoa học Mỹ Merle Wood và Merle Hidinger thuộc Câu lạc bộ chó xoáy lưng Thái ở Hoa Kỳ (Thai Ridgeback Club of the United States – TRCUS) cho rằng xoáy lưng từng chỉ có ở giống chó lưng xoáy miền Đông Thái Lan và giống chó lưng xoáy Châu Phi Do đó, những cái xoáy lưng trên giống chó lưng xoáy Phú Quốc hiện nay chắc chắn bắt nguồn từ giống chó Thái Lan Theo họ, cách đây ít nhất 400 năm, những ngư dân Thái Lan đã vô tình trở thành các nhà tạo giống khi

họ tới đánh bắt hoặc buôn bán ở vùng biển Phú Quốc Tuy nhiên, những ý kiến chủ quan này được đưa ra không dựa trên một căn cứ khoa học nào

Với tốc độ đột biến cao gấp 10 – 25 lần so với DNA hệ gen trong nhân, nhiều biến dị DNA ty thể không chỉ xuất hiện giữa các giống, loài mà ngay cả giữa các

cá thể trong cùng một loài bởi cơ chế sửa sai không hiệu quả trong quá trình tái bản DNA Điều đó đã tạo sự khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể Sau khi toàn bộ trình tự hệ gen ty thể chó được công bố vào năm 1998, nhiều công trình nghiên cứu

đã được tiến hành trên vùng kiểm soát (Control Region – CR) nhằm xác định đa

dạng di truyền và mối quan hệ chủng loài của các quần thể chó trên thế giới Dựa vào thông tin từ vùng kiểm soát này, nguồn gốc và vị trí thuần hóa của chó nhà từ chó sói xám đã được khẳng định qua nhiều nghiên cứu khác nhau Đến nay, hàng nghìn trình tự vùng CR được đăng ký trên ngân hàng dữ liệu GenBank góp phần giúp hiểu rõ hơn về quá trình thuần hóa cũng như mối quan hệ di truyền giữa các giống chó nói riêng và với các nhóm động vật khác nói chung

Dữ liệu lưu trữ trong GenBank được cung cấp bởi các nhà khoa học khác nhau trên thế giới, không có một quy chuẩn chung, nên không có sự nhất quán cao, cũng như có nhiều sai sót trong việc xác định các đột biến Vì vậy, việc hiệu chỉnh, thống nhất các dữ liệu nhằm tạo ra bộ dữ liệu chuẩn về trình tự vùng CR ở chó là bước cần thiết làm cơ sở để tạo ra công cụ xác định nhanh haplotype, phục vụ cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc

Trên cơ sở những nghiên cứu trước đây, nhu cầu tìm hiểu nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc cùng với những kiến thức, kỹ thuật đã được trang bị, đề tài đã được tiến hành với những nghiên cứu sơ khởi trên 16 mẫu chó lưng xoáy Phú Quốc

và 9 mẫu chó nhà (chó cỏ) Việt Nam làm đối chứng Kết quả ban đầu cho thấy có

sự đa dạng di truyền cao trong vùng CR của nhóm chó lưng xoáy Phú Quốc khảo sát và đã có những manh mối ban đầu để suy đoán nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc

2 Mục tiêu của đề tài

2.1 Mục tiêu chung

Nhận định nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc dựa trên thông tin về đa dạng

di truyền trình tự HV1 thuộc vùng CR trên hệ gen ty thể của chó

2.2 Mục tiêu cụ thể

1 Xây dựng được bộ cơ sở dữ liệu và định loại haplotype vùng HV1 hệ gen

ty thể của chó bằng công cụ Haplotype Identifier đã được thiết kế

2 Xác định được sự đa dạng di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc dựa trên trình tự HV1 thuộc vùng CR trên hệ gen ty thể chó và mối quan hệ di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc với một số giống chó trên thế giới

3 Có được những chứng cứ khoa học giúp nhận định về nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc

3 Những đóng góp mới của đề tài

- Lần đầu tiên trên thế giới xây dựng được công cụ định loại haplotype trình

tự HV1 thuộc vùng CR trên hệ gen ty thể của các giống chó trên thế giới

- Đánh giá được sự đa dạng di truyền vùng CR thuộc DNA ty thể của chó lưng xoáy Phú Quốc

- Nhận định được nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc dựa vào các thông tin sinh học phân tử

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài đã khảo sát và xác định được sự đa dạng di truyền vùng trình tự HV1 thuộc vùng CR trên hệ gen ty thể của chó lưng xoáy Phú Quốc, cung cấp các dữ liệu

và căn cứ giúp suy đoán được nguồn gốc hình thành của chó lưng xoáy Phú Quốc

Đề tài cũng cung cấp được quy trình tách chiết DNA từ lông chó, có thể được ứng dụng trong các nghiên cứu khác về di truyền ở loài chó Công cụ xác định nhanh haplotype trình tự HV1 thuộc vùng CR trên hệ gen ty thể chó có thể được sử dụng trong cộng đồng nghiên cứu về vùng trình tự này từ khắp nơi trên thế giới

5 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

5.1 Đối tượng nghiên cứu

Đề tài thực hiện nghiên cứu trên vùng 582 cặp base thuộc vùng CR DNA ty thể của chó Tổng cộng 200 con chó bao gồm 100 con chó lưng xoáy Phú Quốc và

100 con chó nhà (chó cỏ) Việt Nam được khảo sát trong phạm vi đề tài

5.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu vùng trình tự 582 cặp base thuộc vùng CR trên

hệ gen ty thể chó trên 100 con chó lưng xoáy Phú Quốc và 100 con chó nhà Việt Nam Nghiên cứu không bao gồm thông tin trên toàn bộ hệ gen ty thể của chó hay các gen trên hệ gen trong nhân của chó Các giống chó trên thế giới được sử dụng trong việc xác định mối quan hệ di truyền với chó lưng xoáy Phú Quốc được chọn dựa trên thông tin về hành trình di cư của chó đã được công bố, và dựa trên sự sẵn

có của thông tin, không bao gồm tất cả các giống chó hiện hữu trên toàn thế giới

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chó lưng xoáy Phú Quốc

1.1.1 Giới thiệu về chó lưng xoáy Phú Quốc

Chó lưng xoáy sống tại đảo Phú Quốc thuộc vùng biển tỉnh Kiên Giang là một giống chó đặc trưng với nhiều đặc tính quý của Việt Nam Mặc dù được người dân thuần hoá và nuôi dưỡng từ lâu nhưng cho đến nay chúng vẫn còn giữ nét hoang dã của chó săn và nhiều đặc điểm khác biệt so với những giống chó khác Tinh khôn, lanh lợi, trung thành, sở hữu một hình thể đẹp cùng với dải lông mọc ngược chạy dọc trên sống lưng (xoáy lưng) đã giúp thương hiệu “chó lưng xoáy Phú Quốc” (Hình 1.1) ngày càng được nhiều người biết đến và yêu thích Trên thế giới hiện có ba giống chó có xoáy lưng, trong đó, chó lưng xoáy Rhodesian (Rhodesian Ridgeback) ở Nam Phi và chó lưng xoáy Thái Lan (Thai Ridgeback) đã được Tổ chức giống chó Thế giới (Federation Cynologique Internationale – FCI) công nhận trong danh sách các giống chó giống, riêng chó lưng xoáy Phú Quốc của Việt Nam vẫn chưa được chấp thuận Nhiều bằng chứng lịch sử đã được các nhà khoa học công bố nhằm chứng minh nguồn gốc đặc chủng của chó lưng xoáy Phú Quốc nhưng tính thuyết phục của các dẫn liệu này chưa cao, vẫn còn tồn tại nhiều quan điểm trái chiều xoay quanh nhận định chó lưng xoáy Phú Quốc bắt nguồn từ chó lưng xoáy Thái Lan Cho đến nay, nguồn gốc tiến hóa và mối quan hệ di truyền của giống chó này vẫn chưa được nghiên cứu một cách tường tận Như vậy, về mặt phân loại, chó lưng xoáy Phú Quốc được xếp vào phân loài Chó nhà nói chung

1.1.2 Phân loại chó lưng xoáy Phú Quốc

Phân họ: Chó (Caniae)

Giống: Chó (Canis Linnaeus, 1758)

Loài: Chó (Canis lupus Linnaeus, 1758)

Phân loài: Chó nhà (Canis lupus familiaris Linnaeus, 1758)

Hình 1.1: Chó lưng xoáy Phú Quốc

(Ảnh do nhóm nghiên cứu của tác giả chụp tại Trung tâm bảo tồn chó xoáy Phú

Quốc – Trang trại Thanh Nga, huyện Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang)

1.1.3 Đặc điểm hình thái và tập tính của chó lưng xoáy Phú Quốc

Bản tiêu chuẩn số 001/VN/20.09.2009 do Hiệp hội Những người Nuôi chó giống Việt Nam (Vietnam Kennel Association – VKA) công bố năm 2009 đã mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái của chó lưng xoáy Phú Quốc với hình dáng tổng thể của một loài chó săn đuổi mồi Chúng có cơ thể gọn gàng, săn chắc, cơ bắp nở nang, đặc biệt là những bắp cơ ở vùng đùi trước và đùi sau Chó đực cao khoảng 50 – 55 cm, nặng khoảng 15 – 20 kg còn chó cái cao khoảng 48 – 52 cm, nặng khoảng

12 – 18 kg [5] Các tiêu chuẩn này được đặt ra có lẽ là dựa trên những quan sát, tổng hợp và truyền miệng từ những người nuôi chó mà không dựa trên một chứng

cứ hoặc nghiên cứu khoa học nào Trong báo cáo nghiên cứu tại Đại học Cần Thơ

"Điều tra nghiên cứu bảo tồn gen động vật: chó lưng xoáy Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang", Nguyễn Hữu Chiếm và cộng sự (2004) đã tiến hành khảo sát 617 con chó lưng xoáy Phú Quốc đủ mọi lứa tuổi để thu thập các dữ liệu về ngoại hình, số đo, về phương thức chăn nuôi, quản lý, huấn luyện, các bệnh và sự thất thoát do buôn bán,

ăn thịt chó, dịch bệnh Kết quả khảo sát cho thấy chó lưng xoáy Phú Quốc có nhiều đặc tính quý và nổi bật so với các giống chó khác như thông minh, nhanh nhẹn, có khả năng đi săn và giữ nhà tốt Chó lưng xoáy Phú Quốc rất thân thiện với con người nên không những thích hợp nuôi để đi săn mà còn nuôi làm bạn trong gia đình

Cũng theo Nguyễn Hữu Chiếm, chó lưng xoáy Phú Quốc có lông ngắn, cứng

và ôm sát vào thân mình, dài không quá 2 cm Màu lông thuần nhất, bao gồm màu đen, nâu, vàng, vện, xám và một số màu khác, trong đó màu đen và vàng phổ biến nhất, chiếm tỷ lệ 60% Chó lưng xoáy Phú Quốc có vùng lông ở lưng rất khác biệt

so với những giống chó khác, mà người ta hay gọi là xoáy lưng Đó là một dải lông

mọc ngược dọc theo sống lưng, có màu sậm hơn và nhìn nổi rõ trên lưng (Hình 1.2) Xoáy lưng có nhiều hình dạng khác nhau như hình kim, hình mũi tên, yên ngựa, cây đàn, chiếc lá Xoáy lưng có thể đối xứng qua xương sống hoặc đôi khi không đối xứng, có độ rộng không vượt quá độ rộng của lưng Một đặc điểm ngoại hình khác của chó lưng xoáy Phú Quốc là đuôi có lông ngắn vót cần câu, thường xuyên ở tư

thế cong với độ cong từ ½ đến ¾ vòng tròn

Hình 1.2: Một số kiểu xoáy lưng ở chó lưng xoáy Phú Quốc

(Hình do tác giả chụp tại Trung tâm bảo tồn chó xoáy Phú Quốc – Trang trại

Thanh Nga, huyện Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang)

Cân nặng của chó lưng xoáy Phú Quốc cũng có khác biệt đáng kể so với hai giống chó lưng xoáy khác trên thế giới là chó lưng xoáy Thái Lan và chó lưng xoáy Rhodesia Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Chiếm và cộng sự (2004), trọng lượng trung bình của chó lưng xoáy Phú Quốc đực là 15,96 kg, chó cái là 14,23 kg Trong khi đó, giống chó lưng xoáy Thái Lan nặng hơn, với trọng lượng trung bình ở chó đực và chó cái tương ứng là 23 và 20 kg Chó lưng xoáy Nam Phi có trọng lượng lớn hơn cả: 38 kg ở con đực và 31 kg ở con cái

Chó cái Phú Quốc đa số lên giống lần đầu lúc 12 tháng tuổi, nhưng cũng có trường hợp chó cái lên giống từ lúc 6 tháng tuổi Một điểm khá đặc biệt là chó lưng xoáy Phú Quốc vẫn còn giữ được tính hoang dã từ chó sói Khi chó đến thời kỳ đẻ thường tìm nơi để đào hang, như gốc cây, bên vồng đất, bên hông nhà Có một số đi vào rừng xa hoặc bên bờ suối để đẻ, đến khi con lớn thì dẫn về nhà hoặc chủ nhà tìm bắt về

Các đặc điểm hình thái và tập tính của chó lưng xoáy Phú Quốc của nghiên cứu trên đã cung cấp các thông tin cần thiết cho việc nhận diện chó lưng xoáy Phú Quốc cũng như là việc nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyền của giống chó này

1.1.4 Các nghiên cứu về nguồn gốc và di truyền chó lưng xoáy Phú Quốc

Ở Việt Nam đã bắt đầu có những nghiên cứu về di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc Quan Quốc Đăng và cộng sự (2016) nghiên cứu trên 29 con chó lưng xoáy Phú Quốc và bước đầu ghi nhận được mối liên hệ giữa một số đặc tính kiểu hình của chó lưng xoáy Phú Quốc như giữa cân nặng với chiều cao, vòng ngực và vòng eo [59] Đối tượng chó lưng xoáy Phú Quốc mang haplotype hiếm E1 và E4 cũng đã được đánh giá về mối liên hệ giữa haplotype và tỷ lệ chiều cao/chiều dài thân [60] Tuy nhiên, mối liên hệ này được tính chỉ dựa trên 5 con chó lưng xoáy Phú Quốc mang haplotype hiếm E1 và E4 nên kết quả chưa mang tính thuyết phục cao Ở mức độ di truyền, tính trạng xoáy lưng đặc biệt của chó lưng xoáy Phú Quốc cũng đã bước đầu được nghiên cứu Bằng kỹ thuật real-time PCR với trình tự DNA mục tiêu trên nhiễm sắc thể số 18 ở chó, Quan Quốc Đăng và cộng sự (2017) cho thấy tần suất gen đồng hợp (R/R) và dị hợp (R/r) quy định kiểu hình xoáy lưng tuy xuất hiện tương đối cân bằng trong quần thể chó lưng xoáy Phú Quốc, nhưng có xu thế gia tăng kiểu gen đồng hợp trội R/R và giảm tỷ lệ kiểu gen đồng hợp lặn r/r, gây nên tình trạng mất cân bằng về di truyền trong quần thể chó lưng xoáy Phú Quốc [3]

Nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc thì hầu như chưa được nghiên cứu Từ những nghiên cứu sơ bộ trên chó lưng xoáy Phú Quốc, Trần Hoàng Dũng và cộng

sự (2017) lần đầu tiên trên thế giới đã giải toàn bộ hệ gen ty thể của chó lưng xoáy

Phú Quốc mang haplotype E4 hiếm Nghiên cứu cho thấy có mối quan hệ di truyền giữa chó lưng xoáy Phú Quốc mang haplotype E4 với giống chó Pungsan ở Triều Tiên [2] Từ điển bách khoa của Viện hàn lâm khoa học xã hội Việt Nam, tuy không

đề cập trực tiếp đến chó lưng xoáy Phú Quốc, giới thiệu rằng có loài chó dingo sống

ở đảo Phú Quốc [6], có lẽ muốn nói đến nguồn gốc chó dingo của giống chó lưng xoáy Phú Quốc này Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của Oskarsson và cộng sự (2012) lại cho thấy chó dingo có nguồn gốc từ châu Á rồi mới di cư sang châu Úc [54] Kết quả này được nghiên cứu trên các dữ liệu di truyền, có sức thuyết phục hơn so với thông tin được ghi lại trên từ điển bách khoa Thực tế hiện nay, do chưa

có nhiều nghiên cứu di truyền về nguồn gốc tiến hóa và mối quan hệ di truyền giữa hai giống chó này nên không thể kết luận chắc chắn rằng chó lưng xoáy Phú Quốc

có nguồn gốc từ chó dingo

Cho đến tháng 01/2018, FCI chỉ mới công nhận chó lưng xoáy Rhodesian Nam Phi và chó lưng xoáy Thái Lan, còn chó lưng xoáy Phú Quốc của Việt Nam vẫn chưa được công nhận Thông tin về nguồn gốc giống chó này chủ yếu là từ các báo chí phổ thông Báo Tuổi Trẻ (ngày 03/08/2011) đã cũng có dẫn một số nguồn tin bàn về nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc Theo thông tin từ bài báo, Merle Wood và Merle Hidinger thuộc Câu lạc bộ chó lưng xoáy Thái ở Hoa Kỳ (Thai Ridgeback Club of the United States – TRCUS) giả thiết rằng xoáy lưng từng chỉ có

ở chó lưng xoáy miền Đông Thái Lan và chó lưng xoáy Nam Phi Do cách ly một khoảng địa lý khá xa cũng như kích thước chó lưng xoáy Nam Phi lớn hơn rất nhiều

so với chó lưng xoáy Phú Quốc nên họ cho rằng chó lưng xoáy Phú Quốc có nguồn gốc từ chó lưng xoáy Thái Lan và chính những ngư dân người Thái đã mang chó lưng xoáy Thái Lan đến đảo Phú Quốc cách đây khoảng 400 năm trước Tuy nhiên, Giáo sư Dư Thanh Khiêm, Viện trưởng Viện Giáo dục Woluwe SaintPierre ở Brussel (Bỉ) cho biết tất cả các cuộc hành trình của người Thái Lan đều được mô tả

trong cuốn sách “Abrégé de l’histoire Générale des Voyages”, bởi Jean-Francoise

de la Harpe, xác nhận rằng không thấy bất kỳ ghi chép nào về việc ngư dân Thái Lan đã từng đặt chân đến đảo Phú Quốc

Báo Thanh niên (bài đăng ngày14/05/2013) cung cấp thông tin rằng cuốn

“Nguyễn Phúc tộc đế phả tường giải đồ”, là cuốn sách gia truyền ghi chép và lý

giải tất cả những chuyện liên quan đến hoàng tộc, hiện vẫn còn lưu giữ trong gia đình ông Nguyễn Phúc Ưng Viên (cháu cố của vua Minh Mệnh) có đề cập đến 4 con chó lưng xoáy Phú Quốc được vua Gia Long nuôi vào cuối thế kỷ 18 đầu thế kỷ

19 Những con chó lưng xoáy này luôn kề cận bên ông suốt những năm bôn tẩu, từ miền biển lên miền núi, từ nơi bình an đến chốn hiểm nghèo và đã cứu ông thoát chết hai lần trước khi lên ngôi Bài báo cũng nhắc lại một giai đoạn vua Gia Long sang Xiêm (Thái Lan ngày nay) trú ngụ trong lúc sa cơ Một giả thuyết cho rằng ông đã mang theo chó lưng xoáy Thái Lan khi trở về Việt Nam và chó Thái Lan đã giao phối với những giống chó Việt Nam để tạo nên giống Phú Quốc ngày nay Giả thuyết này không hợp lý bởi vì khi sang Thái Lan, ông đã mang theo 4 con chó lưng xoáy Phú Quốc đi cùng Một giả thuyết cho rằng có thể chính những con chó lưng xoáy Phú Quốc được vua Gia Long mang từ Việt Nam sang đã giao phối với những con chó bản địa để tạo nên giống chó lưng xoáy Thái Lan như hiện tại Lập luận trên hợp lý hơn so với việc ngư dân người Thái Lan vượt biển mang chó Thái đến đảo Phú Quốc

Tuy nhiên, tất cả dẫn liệu trên chỉ là những suy luận, phỏng đoán dựa vào các tàng thư còn lưu giữ nên không có tính thuyết phục cao Do vậy, cần phải tiến hành các nghiên cứu di truyền phân tử một cách hệ thống, logic và khoa học để có thể xác định chính xác nguồn gốc tiến hóa cũng như mối quan hệ di truyền giữa chó lưng xoáy Phú Quốc với các giống chó khác trên thế giới, góp phần bảo tồn nguồn gen của giống chó đặc trưng của nước ta

1.2 Đặc điểm di truyền của tính trạng xoáy lƣng

Một kiểu hình đặc biệt của chó lưng xoáy Phú Quốc là có xoáy lưng Salmon-Hillbertz và cộng sự [28] nghiên cứu đặc tính lưng có xoáy trên hai giống chó lưng xoáy Thái Lan, chó lưng xoáy Nam Phi và đã xác định rằng tính trạng có xoáy lưng được quy định bởi allele trội R (Ridge – có xoáy) nằm trên nhiễm sắc thể

số 18, là dạng đột biến lặp đoạn của allele lặn r quy định tính trạng không có xoáy

lưng Chó mang kiểu gen đồng hợp trội RR hay dị hợp Rr đều giống nhau ở kiểu hình có xoáy lưng

Đột biến allele trội R cũng liên quan đến bệnh u nang biểu bì (dermoid sinus) làm suy giảm khả năng sống sót của chó Chó lưng xoáy mang hai allele R (đồng hợp trội RR) có nguy cơ rất lớn phát triển bệnh u nang biểu bì [28] Đây là dạng ống thần kinh đóng không hoàn toàn, gây ra sự phân lớp không hoàn chỉnh giữa các lớp mô trong quá trình phát triển Chó bị u nang biểu bì sẽ bị xuất hiện một ống thông giữa bề mặt da và tủy sống gây nên các áp-xe và nhiễm trùng Ống thông càng nông thì mức độ nguy hiểm càng thấp và dễ dàng được chữa trị bằng phẫu thuật tách bỏ [1], [24] Trong nhiều trường hợp, ống thông kéo dài đến tận cột sống, bệnh u nang biểu bì sẽ rất nguy hiểm và thường dẫn đến cái chết Trong số 15 con chó lưng xoáy Nam Phi và chó lưng xoáy Thái Lan bị u nang biểu bì, nhóm nghiên cứu xác định có đến 13 con có mang kiểu gen đồng hợp trội RR, 2 con mang kiểu gen dị hợp Rr Chó không có lưng xoáy thì không bị u nang biểu bì [27] Như vậy,

có sự tương quan rất lớn giữa kiểu gen đồng hợp trội RR với kiểu hình mắc bệnh u nang biểu bì Sự tương ứng giữa các kiểu gen với kiểu hình có xoáy lưng và u nang biểu bì được tóm tắt trong bảng sau

Bảng 1.1: Tương quan giữa kiểu gen và các kiểu hình xoáy lưng, u nang biểu bì

Kiểu gen Xoáy lƣng Mắc bệnh u nang biểu bì

cơ chế hình thành tính trạng xoáy lưng ở chó vẫn chưa được nghiên cứu tường tận Tuy nhiên, sự xuất hiện đồng thời cả hiện tượng lông mọc không định hướng và đóng ống thần kinh không hoàn toàn cũng đã từng được ghi nhận ở chuột [97] Sự rối loạn trong quá trình điều hòa các gen liên quan đến sự hình thành nang lông ở chuột cũng đồng thời làm quá trình đóng ống thần kinh không diễn ra bình thường

Có lẽ cơ chế này ở chó lưng xoáy cũng tương tự như ở chuột Sự tăng lên về số lượng của các gen thuộc allele R trong tế bào đã làm rối loạn sự biểu hiện, hoạt động của các gen FGF trong quá trình phát triển của phôi làm thay đổi hình dạng nang lông đã gây nên hiện tượng lông mọc ngược và làm tăng nguy cơ bị u nang biểu bì ở chó lưng xoáy

1.3 Hệ gen ty thể của chó

1.3.1 Cấu trúc hệ gen ty thể của chó

Giống như ở động vật có vú nói chung, hệ gen ty thể (mtDNA) của chó nhà

(Canis lupus familiaris) có dạng vòng, chiếm khoảng 1 – 5% DNA của tế bào với

kích thước khoảng 15,7 – 19,5 kb, bao gồm 37 gen, trong đó có 13 gen mã hóa protein, 2 gen mã hóa cho 12S rRNA và 16S rRNA, 22 gen mã hóa cho tRNA (Hình 1.3) [37] Ngoài ra, trên DNA ty thể còn có vùng CR dài khoảng 1.270 cặp base (15.458 – 16.727) có chức năng kiểm soát Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong DNA ty thể và cũng là vùng liên quan đến sự khởi đầu tái bản DNA ty thể Vùng này chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng lẫn chuỗi nhẹ [37]

Do có kích thước nhỏ nên DNA ty thể có mật độ gen dày và không có các

intron (ngoại trừ Cnidarians có thêm một gen ngoại lệ, tương đồng với gen MutS ở

vi khuẩn) Ở một số loài, tất cả các mạch mang mã của gen đều nằm trên cùng một mạch của DNA ty thể, một số khác phân bố ở cả hai mạch Chúng có hệ thống phiên mã và dịch mã tách biệt với các phần còn lại của tế bào chất [16]

Hình 1.3: Cấu trúc hệ gen DNA ty thể của chó

(Tác giả vẽ dựa trên thông tin về vị trí các gen trên DNA ty thể đã được công

bố[37])

1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm di truyền vùng CR trên hệ gen ty thể của chó

Với tốc độ đột biến cao gấp 10 – 25 lần so với DNA hệ gen trong nhân, nhiều biến dị DNA ty thể không chỉ xuất hiện giữa các giống, loài mà ngay cả giữa các cá thể trong cùng một loài bởi cơ chế sửa sai không hiệu quả trong quá trình tái bản DNA [56] Điều đó đã tạo sự khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể Phần lớn các biến thể đó được xuất hiện là do các điểm đa hình đơn nucleotide (SNP) Các SNP phản ánh sự khác biệt giữa hai trình tự nucleotide ở mức độ một cặp base [44] Chỉ cần một đột biến thay thế nucleotide xảy ra ở một vị trí đã tạo nên một biến thể trình tự nucleotide khác với trình tự gốc ban đầu Những tập hợp SNP khác nhau sẽ hình thành nên các kiểu haplotype riêng biệt, góp phần hình thành tính đa dạng di truyền của loài hoặc giữa các loài với nhau Bên cạnh đó, DNA ty thể tồn tại ở dạng đơn bội, hầu như không có hiện tượng tái tổ hợp, và được di truyền theo dòng mẹ đã

tạo cơ sở cho các nhà khoa học sử dụng nó như một công cụ phân tử hữu ích giúp xác định nguồn gốc tiến hoá, tìm hiểu mối quan hệ di truyền, đánh giá tính đa dạng

di truyền cũng như ứng dụng trong các lĩnh vực nghiên cứu nhân chủng học, nghiên cứu pháp y, điều tra hình sự,… [44], [70]

Hình 1.4: Vị trí và thành phần vùng CR trong DNA ty thể chó

Vùng CR được cấu thành từ ba vùng nhỏ (Hình 1.4):

Vùng siêu biến 1 (Hypervariable region 1 – HV1): nằm ở đầu 5’ của

vùng CR, dài khoảng 672 cặp base Đây là một vùng rất đa hình, được sử dụng để phân tích, xác định haplotype tương tự như vùng HV1 của người [12] Đây cũng là một mối quan tâm của pháp y vì HV1 có thể được khuếch đại và định haplotype từ các mẫu DNA bị thoái biến nghiêm trọng [73] Himmelberger và cộng sự (2008) cho thấy 32 đột biến xuất hiện ở vùng HV1 thì 1/3 trong số đó tập trung ở đoạn 60 cặp base hay còn gọi là đoạn “hotspot” hoặc “điểm nóng” (15.595 – 15.654) (Hình 1.5) “Điểm nóng” được dùng làm phương tiện sàng lọc sơ bộ các mẫu và rất phù hợp trong các trường hợp DNA bị các tác nhân gây suy thoái hoặc nhiễm bẩn [11], [29]

Hình 1.5: Vị trí của “điểm nóng” trong vùng HV1

Vùng siêu biến 2 (Hypervariable region 2 – HV2): nằm ở đầu 3’ của vùng CR, dài khoảng 350 cặp base, có tốc độ tiến hóa chậm hơn HV1 từ 10 – 20 lần Đây là vùng bảo thủ nhất có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ [67]

Một đoạn trình tự lặp lại (Variable number tandem repeat – VNTR): nằm giữa HV1 và HV2 với 10 nucleotide lặp lại (5’-GTACACGT(A/G)C-3’) khoảng 30 lần (16.130 – 16.430) Số lần lặp lại tùy vào mỗi cá thể nên trình tự này gây ra khó khăn trong quá trình nghiên cứu và thường được loại đi khi phân tích di truyền vùng

CR [73]

1.4 Các nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa, phát sinh chủng loại và đa dạng di truyền của chó

1.4.1 Các nghiên cứu khảo cổ

Nguồn gốc của các loài được thuần hóa hiếm khi được ghi chép rõ ràng Số lượng, thời điểm và địa điểm của những sự kiện khởi đầu quá trình này có lẽ khó được xác định do những ghi nhận khảo cổ học không liền mạch [94], [95] Vấn đề khó khăn này được minh họa rõ nét với trường hợp của chó nhà Dữ liệu khảo cổ học có được cho phép kết luận nguồn gốc của chó nhà có thể xuất phát từ một hoặc

nhiều con chó sói xám, hoặc chó rừng lông vàng Canis aureus [95] Tuy nhiên, tiêu

chuẩn duy nhất được sử dụng để phân biệt chó và chó sói ở những khu vực khảo cổ

là hình dạng xương Hầu hết các loài chó hiện nay đều có hình thái khác biệt với cả chó sói và chó rừng vàng Sự khác biệt này thường được dùng để phân biệt giữa các loài ở thực địa Do đó, chỉ những loài có hình thái khác biệt nhau mới có thể phân biệt được, và giai đoạn khởi đầu của quá trình thuần hóa của chó, khi mà những

khác biệt về kiểu hình còn rất ít, nên không được xác định Thậm chí đối với hàng trăm giống chó hiện diện ngày nay, vốn chỉ xuất hiện trong vài trăm năm trở lại đây, thì thời điểm xuất hiện và hình thành giống mới cũng không được xác định [68]

Mặc dù có nhiều bản vẽ hoặc bản viết từ thời cổ đại thể hiện sự tồn tại của một số giống chó, nhưng khởi nguồn của các giống chó này vẫn hầu như không thể được biết cặn kẽ Những mẫu chó hóa thạch lâu đời nhất có thể phân biệt được với chó sói thể hiện ở hộp sọ với phần mũi to và ngắn, và kích thước cuống não lớn Dựa trên kích thước hộp sọ, những con chó đầu tiên được xác định là lớn hơn hay bằng chó sói Dựa theo các mẫu hóa thạch, khoảng chừng 14000 năm trước đã có sự

đa dạng về kích thước của các giống chó Tchernov và Valla (1997) công bố tìm thấy những hóa thạch của chó thu thập tại một khu mộ cổ ở bắc Israel, được xác định có niên đại khoảng 11.000 năm trước đây, là con chó trưởng thành có khối lượng nhỏ, khoảng 11 kg, trong khi những con khác có trọng lượng lên đến 16,7 kg [86] Sự xuất hiện của con chó có kích thước nhỏ vào thời kỳ này tương ứng với sự thay đổi điều kiện sống của người từ văn hóa săn bắt - hái lượm sang trồng trọt Có

lẽ việc trồng trọt cần phải định cư, ít gặp thú dữ nên các con chó có kích thước nhỏ, chiếm ít không gian sống hơn trở nên thích hợp hơn với con người Các giống chó khác nhau với các đặc điểm khác nhau cũng dần được thể hiện qua các bản vẽ ở từng thời kỳ (Hình 1.6) Các bản vẽ được xác định của người Ai cập cổ đại từ 6500 trước đã thể hiện hình ảnh giống chó đua với chân dài và chân mảnh, và với nhiều màu lông khác nhau Nhiều đồ trang sức được xác định khoảng từ 4000 đến 3000 năm trước công nguyên có khắc hình các giống chó khác nhau, ngoài chó săn còn

có các con chó lông xù, kích thước nhỏ Thời kỳ này, loài người bắt đầu thiết lập cuộc sống ở các đô thị (người Sumer, ở phía Nam Lưỡng Hà, Iraq ngày nay) nên có

lẽ cần các giống chó khác nhau đảm nhận các công việc khác nhau như tham gia săn bắn, canh giữ nông trại, diệt chuột gây hại mùa màng hoặc chỉ để làm cảnh…

Khoảng 1400 trước đây, bắt đầu có những ý tưởng đầu tiên về bảo tồn giống Người Salish ở Bắc Mỹ nuôi được giống chó có lông dài và dày để lấy lông làm nguyên liệu để may chăn giữ ấm Nhận thức được giá trị kinh tế của giống chó này,

họ đã giữ chúng ở điều kiện cô lập tuyệt đối, thường nuôi trên các đảo hoặc trong hang để tránh việc giao phối với các giống chó có lông thông thường khác

Với việc thành lập các câu lạc bộ những người chơi chó giống nào cuối thế

kỷ 19 - đầu thế kỷ 20, các luật lệ về lai giống chó được đặt ra Các tiêu chuẩn nhận diện các giống chó được đặt ra thành văn bản Những tiêu chuẩn của mỗi giống chó được ghi nhận và đặt ra bao gồm kích thước đặc trưng, hình dạng, màu lông, và đôi khi bao gồm cả tập tính nữa Những luật lệ này có hai tác động quan trọng lên việc hình thành và phát triển các giống chó: (1) Chúng tạo điều kiện hợp lệ cho việc ra đời một giống chó mới, vì những thay đổi nhỏ trong kiểu hình sẽ hình thành một bộ tiêu chuẩn mới để hình thành một giống chó mới; (2) về mặt di truyền, luật quy định

để một chó con được đăng ký thuộc một giống chó nào đó thì bố mẹ chúng đều là những con chó đã được đăng ký và chứng nhận thuộc giống chó đó

Cho đến nay đã có rất nhiều giống chó khác nhau ra đời với kích thước khác nhau (giống này có thể có kích thước gấp 50 lần giống kia), hình dáng thân khác nhau, hình dáng đầu khác nhau và có tập tính khác nhau

Hình 1.6: Một vài cột mốc trong lịch sử tiến hóa của chó và của người

(tác giả Việt hóa và giản lược từ hình ảnh gốc trong cuốn The genetics of the Dog [68])

1.4.2 Các nghiên cứu di truyền hiện đại

1.4.2.1 Các chỉ thị phân tử được dùng trong nghiên cứu

Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các chỉ thị phân tử (marker) như RNA ribosome, DNA ty thể, DNA lạp thể, các đoạn trình tự lặp lại (STR - short tandem repeat, VNTR, …), nhiễm sắc thể giới tính Y,… ngày càng được nghiên cứu sâu, trở thành công cụ đắc lực giúp tìm hiểu nguồn gốc tiến hoá và mối quan hệ di truyền, xây dựng cây phát sinh chủng loài, giúp hiểu rõ hơn về quá trình hình thành và phát triển của sinh giới [21], [22] Việc phát hiện ra đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể cũng đã mở ra một hướng nghiên cứu đầy triển vọng DNA

ty thể được sử dụng để phân tích các mối quan hệ tiến hoá và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài theo dòng mẹ [37], [56]

Ở chó, nhiều chỉ thị phân tử khác nhau đã được sử dụng để tìm hiểu về đa dạng di truyền và nguồn gốc của các giống chó Tanabe và cộng sự khảo sát sự đa hình của gen mã hóa các protein máu ở chó vùng Đông Á để tìm hiểu mối quan hệ

di truyền giữa các giống chó này [85] Dữ liệu phân tích cho thấy rằng từ thời kỳ đồ

đá mới (thời Jomon từ 14.000 đến 400 trước công nguyên (TrCN)) các con chó đầu tiên từ phía Nam và phía Bắc của châu Á đã xâm nhập vào Nhật Bản sau đó lan khắp Nhật Bản Đến thời Yayoi (từ 300 đến 250 TrCN) và thời Kofun (250 TrCN đến 580 SCN) những dòng chó khác đã xâm nhập vào Nhật Bản qua bán đảo Triều Tiên, tại đây chúng giao phối với chó bản địa để tạo nên sự đa dạng của các giống chó Nhật Bản ngày nay Tuy nhiên, do tốc độ đột biến của các trình tự này rất thấp, các gen này thích hợp để nghiên cứu mối quan hệ giữa các giống chó có mối quan

hệ di truyền xa nhau, còn giữa các giống chó có mối quan hệ di truyền gần gũi, hầu như có rất ít sự sai khác trong trình tự các gen này Sự đa hình của trình tự lặp lại (GAAA)n [23] trên DNA trong nhân của 11 giống chó bản địa ở Đông Á cho thấy các giống chó Sapsaree và Jindo (Hàn Quốc) có mối quan hệ di truyền gần gũi và gần với chó Eskimo, gợi ý rằng các giống chó Hàn Quốc này có nguồn gốc từ vùng Viễn Đông [38] Sự đa hình của các siêu tiểu vệ tinh AHT121, AHTh171, AHTk211, AHTk253, AHTh260, CXX279, FH2054, INRA21, REN162C04 và

REN54P11 trên DNA trong nhân cũng cho thấy mối quan hệ di truyền gần gũi giữa chó Donggyeong và chó Jindo (Hàn Quốc) [46] Nghiên cứu của Kang và cộng sự cũng chứng minh sự gần gũi về mặt di truyền giữa 5 giống chó bản địa Hàn Quốc dựa trên sự đa hình của 14 siêu tiểu vệ tinh PEZ8, FCH2164, FCH2132, FCH2131, FCH2152, FCH2004, FCH2161, FCH2175, FCH2258, FCH2360, FCH2016, FCH2097, PEZ3, FCH2201 Nghiên cứu cũng cho thấy rằng sự đa hình của các chỉ thị phân tử này thích hợp cho việc xác định mối quan hệ huyết thống giữa các cá thể chó khảo sát [36] Sự đa dạng di truyền của DNA nằm trên nhiễm sắc thể thường trong các nghiên cứu trước đây thường không cung cấp đủ thông tin để tìm hiểu về nguồn gốc của các giống chó hoặc mối quan hệ giữa các giống chó có khoảng cách

di truyền xa nhau [38], [46], [85], mà chủ yếu để xác định quan hệ huyết thống giữa các cá thể chó [7], [19], [35], [36]

Sự đa dạng di truyền của nhiễm sắc thể giới tính Y cung cấp nhiều thông tin hơn trong việc tìm hiểu nguồn gốc hình thành loài chó Bằng cách khảo sát và so sánh sự đa dạng di truyền của nhiễm sắc thể Y trong quần thể chó sói ở Ý và ở chó, Iacolina và cộng sự đã chứng minh về khả năng giao phối giữa chó sói cái và chó đực trong quá trình sống [33] Ding và cộng sự đã khảo sát sự đa dạng di truyền của vùng trình tự dài 14437 cặp base trên nhiễm sắc thể Y của 151 con chó trên thế giới

để xác định được địa điểm bắt đầu hình thành loài chó nhà hiện nay nằm ở phía Nam sông Dương Tử [18]

Trong thực tế, cũng như trong các nghiên cứu về nguồn gốc loài người và nhiều loài động vật khác, việc sử dụng chỉ thị phân tử là DNA ty thể trong các nghiên cứu về nguồn gốc loài chó có nhiều ưu thế [17] Một trong những ưu thế đó

là DNA ty thể tồn tại với số lượng lớn, có thể lên đến vài ngàn phân tử trong mỗi tế bào nên DNA ty thể vẫn có thể được thu thập được từ những mẫu vật tồn tại từ lâu đời trong khi DNA hệ gen đã bị phân hủy hết Thậm chí từ một mẫu xương của sinh vật giống với chó tồn tại cách đây 33600 năm, người ta đã tách chiết và giải trình tự được hầu như nguyên vẹn (98,6%) DNA ty thể (mã số GenBank KF661079) Ngoài một số ít công trình sử dụng trình tự gen CytB, gen tRNA-Thr, gen tRNA-Pro [47],

COI [48] để khảo sát tính đa dạng di truyền làm cơ sở xác định nguồn gốc của chó Ngao Tây Tạng, hầu hết nghiên cứu trên DNA ty thể ở chó chủ yếu tập trung vào vùng CR (Control region – vùng kiểm soát) của DNA ty thể Trình tự HV2 của vùng CR cũng được sử dụng nghiên cứu [92] nhưng do tốc độ đột biến quá chậm so với HV1, các nghiên cứu đa dạng trên vùng CR thường chỉ nghiên cứu trên đại diện

là vùng HV1 Baute xác định đoạn trình tự 60 cặp base từ nucleotide 15595 đến

15654 là vùng có mức độ đa hình cao trong DNA ty thể, chứa đến 1/3 tổng số các vị trí đa hình trên toàn bộ vùng HV1 [11] Mở rộng vùng trình tự này, Vila và cộng sự khảo sát đoạn 261 cặp base thuộc vùng HV1 của DNA ty thể [93], [95] để khảo sát mối quan hệ di truyền giữa chó nhà và chó sói nhằm xác định nguồn gốc của chó nhà Masuda và cộng sự thì chọn đoạn trình tự 215 cặp base (từ nucleotide 15465 đến 15679) của vùng HV1 DNA ty thể để khảo sát sự đa dạng di truyền của những con chó thời Jomon ở Nhật Bản (16500 đến 2800 trước) [49] Kế thừa thông tin về

sự đa dạng di truyền trong vùng HV1 của các nghiên cứu trước đó, Savolainen đã

mở rộng vùng khảo sát lên đến 582 cặp base (từ nucleotide 15458 đến 16039) [74] Đoạn trình tự 582 cặp base này nhanh chóng được chấp nhận là trình tự đại diện cho toàn bộ vùng CR và được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu liên quan đến nguồn gốc của chó nhà nói chung [55] hay của các giống chó khác nhau như chó vùng Madagasca [9], chó bản địa Hoa Kỳ [91], các giống chó ở Bồ Đào Nha [90], ở Thổ Nhĩ Kỳ [42] hay chó Ngao Tây Tạng [63]… Hàng ngàn đoạn 582 cặp base đã được giải trình tự và công bố trên GenBank

Việc mở rộng vùng trình tự khảo sát cũng mang lại nhiều thông tin hơn trong nghiên cứu về nguồn gốc hình thành loài chó Pang và cộng sự đã nghiên cứu trên toàn bộ hệ gene ty thể của 169 con chó [55], Wang và cộng sự thậm chí đã nghiên cứu trên toàn bộ hệ gene của 46 con chó cùng 12 con chó sói để tìm hiểu về nguồn gốc tiến hóa, thời điểm và địa điểm thuần hóa của chó [96] Dữ liệu thu thập được trên toàn bộ hệ gene là các chứng cứ di truyền vững chắc cho phép khẳng định thêm các nhận định về địa điểm thuần hóa của chó, tương tự như những nghiên cứu dựa trên nhiễm sắc thể Y hay DNA ty thể trước đó Dù cung cấp nhiều thông tin hơn,

việc giải trình tự toàn bộ hệ gen DNA ty thể (khoảng 16727 cặp base) hay toàn hệ gen chó (khoảng 2,8 tỉ cặp base) rất tốn kém là một trở ngại lớn trong các nghiên cứu Vì vậy, hiện nay, không có nhiều nghiên cứu sử dụng các đối tượng DNA này

1.4.2.2 Nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa của chó nhà

Sau khi toàn bộ trình tự hệ gen ty thể chó được công bố vào năm 1998 [37], nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành trên vùng CR nhằm xác định đa dạng di truyền và mối quan hệ chủng loài của các quần thể chó trên thế giới [29], [98] Từ đó đến nay, hàng nghìn trình tự vùng CR được đăng ký trên ngân hàng dữ liệu GenBank góp phần giúp hiểu rõ hơn về quá trình thuần hóa cũng như mối quan

hệ di truyền giữa các giống chó nói riêng và với các nhóm động vật khác nói chung Trình tự nucleotide vùng HV1 thuộc vùng CR ở DNA ty thể của chó rất đa dạng với nhiều đột biến DNA khác nhau, bao gồm cả đột biến mất hoặc thêm các nucleotide Mỗi trình tự nucleotide riêng biệt này được gọi là một haplotype Bằng cách xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên đoạn trình tự 582 cặp base vùng HV1 của 654 cá thể chó đại diện cho hầu hết các giống chó trên toàn thế giới, Savolainen và cộng sự (2002) nhận thấy các haplotype này cùng với các haplotype của chó sói phân bố thành 6 nhóm và được đặt tên lần lượt là các haplogroup A, haplogroup B, haplogroup C, haplogroup D, haplogroup E và haplogroup F [74] (Hình 1.7) Nghiên cứu của Pang và cộng sự (2009) cũng ghi nhận tương tự khi khảo sát trên số lượng mẫu lớn hơn, lên đến 1543 cá thể chó [55] Điều đó cho thấy

sự khác biệt về hình thái của các giống chó trên thế giới không phải là kết quả của quá trình thuần hóa chó sói ở từng khu vực địa lý khác nhau mà do quá trình di cư

và quá trình giao phối giữa các giống với nhau Cũng theo kết quả khảo sát, có 72,34% chó trên thế giới thuộc haplogroup A; 97,40% chó thuộc haplogroup A, B hoặc C Cả 3 haplogroup A, B và C phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, riêng haplogroup C không có ở châu Mỹ Ngược lại, haplogroup D, E và F được xác định

là các nhóm hiếm bởi vì chưa có đến 3% số cá thể chó trên thế giới tìm thấy thuộc những nhóm này; trong đó, haplogroup E và F chỉ chiếm khoảng 1 – 2% Thay vì phân bố rộng khắp các khu vực địa lý như các haplogroup A, B và C, các haplotype

thuộc haplogroup D, E và F chỉ được phát hiện ở những vùng tương đối hạn hẹp; chẳng hạn như haplogroup D được tìm thấy ở Thổ Nhĩ Kỳ, Tây Ban Nha và vùng Scandinavi [40]; haplogroup E được tìm thấy ở Siberia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Indonesia, Thái Lan và Việt Nam [40], [54], [55] còn haplogroup F được tìm thấy ở Nhật Bản [55]

Hình 1.7: Các haplotype của DNA ty thể chó gom thành 6 haplogroup A, B, C, D,

E, F trên cây tiến hóa

Tên các haplotype đã được lược bỏ Các nhóm A, B, C được đóng khung tô màu xanh để dễ phân biệt với các nhóm xem kẽ là D, E, F Nhóm coy là các haplotype của chó sói đồng cỏ (coyote) được sử dụng làm nhóm ngoại (Nguồn: Pang và cs.,

2009 [55])

Giả thuyết chó nhà có nguồn gốc từ chó sói xám đã được thừa nhận từ các nghiên cứu khảo cổ học cũng như về di truyền học Tuy nhiên, thời điểm và địa điểm thuần hóa của chó nhà vẫn còn nhiều tranh cãi với nhiều giả thuyết khác nhau Nhiều DNA marker khác nhau, bao gồm cả DNA ty thể đã được chọn làm nguồn nguyên liệu để khai thác thông tin làm rõ các giả thuyết này Shannon và cộng sự nghiên cứu DNA trong nhân và DNA ty thể của 4676 con chó thuộc 38 quốc gia và nhận định rằng chó nhà có nguồn gốc từ Trung Á [76] Vila và cộng sự (1997) đã tiến hành phân tích đoạn trình tự 261 cặp base vùng HV1 của 162 con chó sói tại 27 quốc gia trên thế giới và 140 con chó nhà đại diện cho 67 giống Kết quả nghiên cứu cho thấy chó nhà và chó sói có 26 haplotype khác nhau, trong đó có 12 vị trí đa hình giống nhau Điều này giúp tác giả đưa ra giả thuyết chó nhà có nguồn gốc từ chó sói cách đây hơn 100.000 năm [95] Tuy nhiên, Savolainen và cộng sự (2002) lại bác bỏ giả thuyết trên, nhóm nghiên cứu đã dựa vào đoạn trình tự 582 cặp base vùng HV1 (từ nucleotide 15458 đến nucleotide 16039 của DNA ty thể) của 654 con chó nhà đại diện cho các giống chó lớn trên thế giới và nhận thấy rằng chó nhà khu vực Đông Á có nguồn gốc từ một ổ gen duy nhất từ chó sói cách đây khoảng 15.000 năm [74] Theo Pang và cộng sự (2009), các nghiên cứu trước đó của Vila và cộng

sự (1997) [95], Savolainen và cộng sự (2002) [74] đã thất bại trong việc xác định thời gian, nguồn gốc của chó nhà vì số lượng mẫu nghiên cứu ít nên chưa thể đánh giá và đưa ra kết luận chính xác ở mức độ toàn cầu Kết quả nghiên cứu toàn bộ hệ gen ty thể của 169 con chó và vùng CR của 1543 con chó khắp cựu lục địa cho thấy chó nhà được thuần hóa từ cách đây khoảng 16300 năm từ khoảng vài trăm con sói cái [55] Nghiên cứu gần đây của Wang và cộng sự (2016) dường như đã tiến gần hơn đến việc xác minh nguồn gốc của chó nhà Bằng việc phân tích toàn bộ hệ gen của chó, nhóm tác giả cũng ghi nhận về thời điểm chó nhà được thuần hóa tương tự như các nghiên cứu trước đây, và bản đồ di cư của chó cũng dần được định rõ Theo

đó, chó nhà được thuần hóa ở vùng Đông Nam Á cách đây khoảng 33000 năm Đến khoảng 15000 trước, một nhóm chó đã bắt đầu di cư đến Trung Đông, châu Phi và tiến đến châu Âu khoảng chừng 10000 năm trước Tại vùng Trung Đông, một nhóm

chó đã di cư ngược lại về phía đông, giao phối cùng với nhóm chó châu Á địa phương tạo nên quần thể pha trộn di truyền ở phía Bắc Trung Hoa trước khi di cư đến tân lục địa (Hình 1.8) [96] Nghiên cứu cũng để lại nhiều câu hỏi mở cần được giải đáp về quá trình di cư của chó trong nội vùng châu Phi cũng như trong tân lục địa

Hình 1.8: Vị trí khởi đầu và con đường di cư của chó

(theo nguồnWang và cs (2016) [96])

Oskarsson và cộng sự đã khảo sát sự phân bố của haplotype A29 vốn được xem là haplotype khởi thủy của chó dingo và các haplotype cổ Arc1 và Arc2 (thuộc vùng HV1, dài 263 nucleotide từ vị trí 15458 đến 15720) của chó vùng Polynesia [72] (Đa đảo) trên 674 mẫu chó ở vùng Đông Nam Á và 232 mẫu chó dingo Kết quả phân tích cho thấy từ trước thời kỳ đồ đá, chó từ trong đất liền vùng Đông Nam

Á, di cư sang Indonesia rồi từ đó tiếp tục di cư rồi phân hóa thành chó dingo châu

Úc và chó ở vùng Polynesia ngày nay Khảo sát cho thấy tất cả 232 cá thể chó dingo châu Úc đều mang haplotype A29 hoặc khác A29 một nucleotide [54]

Một nghiên cứu của Ardalan và cộng sự (2015) [9] trên vùng HV1 của 329 con chó khu vực châu Phi (trong đó có 139 con sống ở vùng Madagascar) cho thấy chó xuất hiện ở vùng Madagascar không phải từ những người thổ dân đầu tiên nói ngôn ngữ Nam Đảo (Austronesia), mà có mặt ở Madagascar cùng với việc di cư của con người ở những giai đoạn sau này