Tổng hợp một số n hydroxyheptanamid mang khung 1 (triazol 4 yl) methylindolin 2 0n hướng tác dụng kháng ung thư

Một trong số đó là các dẫn chất của acid hydroxamic, mà điển hình là SAHA, là chất ức chế HDAC HDACi đầu tiên đã được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T [12

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

NCS Đỗ Thị Mai Dung PGS.TS Phan Thị Phương Dung

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa Dược

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày đề tài này, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới những người đã giúp đỡ, làm chỗ dựa về mặt tinh thần cho tôi trong suốt thời gian qua

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với những người thầy, người cô

đáng kính của tôi: GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung, DS

Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô

không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận mà đã luôn

có những chỉ dẫn chính xác, kịp thời và động viên tôi những lúc khó khăn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm

nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, đặc biệt là anh Dương Tiến Anh, anh Nguyễn

Minh Tuấn, em Phạm Nguyễn Khánh Linh, em Lê Công Trực, em Cao Viết Phương và bạn Nguyễn Minh Đức đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ và khích lệ tôi trong

suốt quá trình nghiên cứu

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Đào Cẩm Hiếu

HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

8

1.2.1 Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt 8

1.3 HOẠT TÍNH CỦA VÒNG 1,2,3-TRIAZOL 11

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ HÓA HỌC CLICK 14 1.4.1 Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic 14

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được 19

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance) AcOH : Acid acetic

ADN : Acid desoxyribonucleic

AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người

COX : Cyclooxygenase

CuAAC : Coper acetylen azid cycloaddition

d : Vạch đôi trong phổ NMR (Doublet)

DCM : Dicloromethan

dd : Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ NMR (Doublet of doublet)

DMF : Dimethylformamid

DMSO : Dimethylsulfoxid

DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa

EC50 : Nồng độ/liều lượng chất gây ra các ảnh hưởng sinh học khác nhau cho

50% đối tượng thí nghiệm (effective concentration) EMA : Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency)

ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

FBS : Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

FDA : Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (U.S Food and Drug Administration)

H (%) : Hiệu suất

HAT : Histon acetyltransferase

HCT116 : Dòng tế bào ung thư ruột kết người

HDAC : Histon deacetylase

HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50 : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)

IR : Hồng ngoại (Infrared)

J : Hằng số ghép cặp trong phổ NMR

KDAC : Lysin deacetylase

KRIBB : Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc

(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) LBH-589 : Panobinostat

m : Đa vạch trong phổ NMR (Multiplet)

MeCN : Acetonitril

MeOH : Methanol

MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu

MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

NCI-H23 : Dòng tế bào ung thư phổi

NST : Nhiễm sắc thể

PC-3 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người

PTCL : U lympho tế bào T thể ngoại vi

PXD-101 : Belinostat

Rf : Hệ số lưu giữ trong TLC

RPMI : Dòng tế bào đa u tủy xương

s : Vạch đơn trong phổ NMR (Singlet)

SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic

SRG, CAP : Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group, capping group) SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng người

U937 : Dòng tế bào ung thư não

ZBG : Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)

δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

n : Dao động hóa trị trong phổ IR

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester 32

Bảng 3.2: Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to

nc) của các dẫn chất VIa-d 33

Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.8: Cấu trúc các dẫn chất trong nghiên cứu của Salmi-Smail và cộng sự 9

Hình 1.17: Hai dẫn chất có hoạt tính mạnh nhất do Ferreira và cộng sự tổng hợp 13

Hình 1.20: Cấu trúc chung các chất do GS.TS Nguyễn Hải Nam và cộng sự tổng hợp 14

Hình 3.4: Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tính tế bào của các dẫn chất VIc, VId

và SAHA trên các dòng tế bào SW620, PC-3, AsPC-1 và NCI-H23 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới [40] Những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu về sự tham gia của các cấu trúc khác thường của protein histon trong quá trình phát triển ung thư Đặc biệt, việc acetyl hóa lysin cuối chuỗi histon 3 và histon 4 đã trở thành một trong những nghiên cứu đáng giá nhất [36] Mức độ acetyl hóa là kết quả của sự cân bằng hoạt động của enzym histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ

ra rằng sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [16, 21, 36] Ức chế HDAC trở thành một đích đầy triển vọng được hướng tới bởi các thuốc chống ung thư thế hệ mới Một trong số đó là các dẫn chất của acid hydroxamic, mà điển hình là SAHA, là chất ức chế HDAC (HDACi) đầu tiên đã được FDA cấp phép lưu hành năm

2006 cho điều trị u da tế bào lympho T [12] Tiếp nối thành công đó, belinostat (Beleodaq®) và panobinostat (Farydax®) cũng đã được FDA phê duyệt trong điều trị ung thư [6, 42]

Với mục tiêu tổng hợp các dẫn chất chống ung thư mới tác dụng tại đích đạt kết quả điều trị tốt, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng

đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC Trong số đó, nhóm đã sử dụng khung benzothiazol [32] hoặc khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol [17, 31] thay cho vòng phenyl trong cấu trúc của SAHA để làm nhóm khóa hoạt động và đạt được kết quả khả quan, trong đó có những chất đã thể hiện tác dụng ức chế HDAC tốt hơn SAHA từ vài lần đến vài chục lần [31, 32]

Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp một số N-

hydroxyheptanamid mang khung 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư” với hai mục tiêu:

1, Tổng hợp 4 dẫn chất mang khung N-hydroxy-7-(4-((3-(hydroxyimino)-2- oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)heptanamid

2, Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASES (HDAC) VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi) 1.1.1 Khái niệm và phân loại histon deacetylase (HDAC)

Acetyl hóa và deacetyl hóa histon là quá trình mà lysin, acid amin cuối trong đầu

N của histon, phần nhô ra khỏi lõi nucleosom, bị acetyl hoặc deacetyl như một phần quá trình quy định gen Hai quá trình này được xúc tác đặc hiệu bởi enzym histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT)

Nucleosom là đơn vị cơ bản của NST, gồm một đoạn ADN chứa 146 cặp nucleotid quấn quanh lõi gồm 8 protein histon (1 tetramer H3/H4 và 1 dimer H2A/H2B) [25, 28] HDAC deacetyl hóa lysin ở đầu N của histon, làm tăng tương tác ion giữa histon tích điện dương và ADN tích điện âm, dẫn đến NST đóng xoắn, ngăn cản quá trình dịch mã do giảm khả năng tiếp cận của bộ máy phiên mã [18] Các HDAC còn được gọi là lysin deacetylase (KDAC) để thể hiện ảnh hưởng rộng rãi của

nó, không chỉ với các histon mà còn với các protein khác [7] Ngược lại, HAT acetyl hóa lysin đầu N, dẫn đến NST tháo xoắn và quá trình phiên mã xảy ra bình thường (xem hình 1.1)

Hình 1.1: Vai trò HDAC và HAT trong thay đổi cấu trúc NST

Hiện nay, có 18 HDAC đã được phát hiện trên cơ thể người, chia làm 4 nhóm [9,

36, 44] (xem hình 1.2) HDAC nhóm I, II, IV phụ thuộc Zn2+, có trung tâm hoạt động dạng túi, ở đáy túi có một ion Zn2+ có khả năng tạo phức chelat với cơ chất [9] Bởi vậy các nhóm HDAC này có thể bị ức chế bởi các chất có khả năng tạo chelat, ví dụ như acid hydroxamic, và trở thành đích cho các thuốc chống ung thư

Hình 1.2: Phân loại các HDAC

1.1.2 Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC và cơ chế deacetyl hóa

Vùng hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV gồm 2 phần chính:

+ Kênh enzym: có dạng hình túi, với thành túi dạng ống hẹp hơi cong nhẹ và đáy túi rộng [14] Bề mặt kênh được bao phủ bởi các acid amin thân dầu và có chứa nhân thơm (Pro, Phe, Tyr, His) Đây là nơi chứa cơ chất và có khả năng tạo liên kết Van der Waals với cơ chất Đáy kênh có một phân tử nước, giúp vận chuyển nhóm acetyl trong quá trình deacetyl hóa Ở đó còn có một lỗ nhỏ dẫn vào một khoang bên trong Vai trò của khoang này chưa được xác định chắc chắn nhưng được dự đoán là nơi tiếp nhận các sản phẩm acetat sau phản ứng và đưa ra ngoài enzym, tránh trường hợp kênh enzym bị che chắn và lấp đầy gây cản trở hoạt động enzym [14]

+ Ion kẽm: là coenzym, nằm ở gần cuối kênh enzym Khi không có cơ chất, ion

Zn2+ liên kết phối trí với 3 acid amin (2 Asp, 1 His) và một phân tử nước Trong quá trình deacetyl histon, ion này có khả năng tạo thêm 1 liên kết phối trí với oxy trong nhóm carbonyl của acetyl, xúc tác cho quá trình xảy ra [14, 29]

Như vậy, dựa theo cấu tạo enzym, những chất HDACi có chiều dài phần cầu nối

từ 5-6 carbon, phù hợp với chiều sâu kênh và có khả năng liên kết mạnh với ion Zn2+

thì sẽ thu được hoạt tính tốt [39] (xem hình 1.3)

Hình 1.3: Phức hợp HDAC - SAHA

1.1.3 Các chất ức chế HDAC (HDACi)

Thuật ngữ HDACi được dùng để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC nhóm I,

II và IV Đã có hàng loạt nghiên cứu chứng minh rằng HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, chu trình biệt hóa, chu trình chết theo chương trình [15, 27, 36] Vì vậy, hiện nay HDAC trở thành một mục tiêu phân tử rất hấp dẫn của nhiều thuốc điều trị ung thư mới, trong đó có các HDACi

1.1.3.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

Dựa trên cấu trúc 3D được xác định của HDAC bằng chụp tinh thể tia X, rất nhiều HDACi được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng Chúng được chia thành 6 nhóm: các acid hydroxamic, các acid carboxylic mạch ngắn, các peptid vòng, các aminobenzamid, các ceton và các chất có cấu trúc khác [34] (hình 1.4)

Các acid hydroxamic có ưu điểm là ức chế HDAC ở nồng độ rất thấp (cỡ nM) và cấu trúc đơn giản, dễ tổng hợp Tuy nhiên, mỗi nhóm có một số hạn chế riêng, ví dụ các acid hydroxamic bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC, các benzamid và các acid carboxylic mạch ngắn có hiệu lực hạn chế, các ceton bị khử hóa trong huyết tương, trong khi các peptid vòng có cấu trúc quá phức tạp và điều kiện tổng hợp khó khăn [19]

Hình 1.4: Phân loại các chất ức chế HDAC 1.1.3.2 Cấu trúc của các HDACi

Các HDACi đều có một số đặc điểm chung về cấu trúc, thường chia thành 3 phần chính (xem hình 1.5):

− Nhóm nhận diện bề mặt (surface recognition domain) hay nhóm khóa hoạt động (capping group, CAP): là một hệ thống vòng (aryl hoặc peptid), nằm trên bề mặt enzym

− Vùng cầu nối sơ nước (linker): tạo liên kết Van der Waals với bề mặt kênh, giúp

cố định cơ chất

− Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group, ZBG): có khả năng tạo chelat với coenzym Zn2+ ở đáy túi enzym, quyết định hiệu lực của chất ức chế HDAC Nhóm có thể là acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton

Hình 1.5: Cấu trúc của SAHA 1.1.3.3 Liên quan cấu trúc tác dụng của HDACi

Dựa trên cấu trúc HDAC đã được xác định [14], người ta thấy rằng các HDACi

có cấu trúc càng phù hợp với kênh enzym sẽ có hiệu lực càng mạnh

a Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt (CAP)

Các HDACi hiệu quả, như SAHA và trapoxin, đều có một nhóm CAP sơ nước để gắn với miệng kênh [48] Sundarapandian và cộng sự trong một nghiên cứu vào năm

2010 [41] cũng chỉ ra rằng việc mất đi nhóm CAP sơ nước làm giảm đáng kể hoạt tính của các HDACi Sự có mặt của nhóm phenyl hay các nhóm chức và cấu trúc giàu mật

độ electron ở nhóm nhận diện bề mặt đều góp phần làm tăng hoạt tính [20]

Cửa vào trung tâm hoạt động enzym được cấu tạo bởi vài vòng protein, xoắn cuộn tạo các rãnh, khe trên bề mặt, khác nhau với mỗi loại HDAC Bởi vậy, cấu trúc nhóm CAP không chỉ ảnh hưởng đến hoạt tính mà còn ảnh hưởng đến tính chọn lọc của các HDACi HDAC I có đường kính miệng kênh khoảng 11 Å, thuận tiện cho các chất có nhóm CAP cồng kềnh gắn vào, ví dụ như các cyclopeptid thiên nhiên Trong khi đó bề mặt kênh HDAC II lại có nhiều nếp gấp, cản trở việc liên kết với các cyclopeptid này [11]

b Ảnh hưởng của vùng cầu nối (linker)

Kênh enzym của HDAC có dạng túi hẹp sâu khoảng 11 Å với bề mặt sơ nước Kết quả docking đã chỉ ra rằng linker có chiều dài 4-6C là tối ưu nhất cho các HADCi [1, 48] Juvale cùng cộng sự năm 2006 đã công bố kết quả nghiên cứu cho thấy sự có mặt một nhóm thế trên cầu nối ở vị trí sát với nhóm phenyl trong nhóm nhận diện bề mặt sẽ góp phần làm tăng hoạt tính Ngược lại, khi có nhóm thế trên cầu nối nằm sát nhóm kết thúc gắn kẽm thì lại gây bất lợi cho hoạt tính [20]

Vùng cầu nối và nhóm nhận diện bề mặt có thể gắn với nhau bằng một số liên kết như peptid hoặc ceton, góp phần làm tăng khả năng phân cực và cải thiện dược động học cho các HDACi Marson và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu năm 2007 cho thấy có thể thay thế liên kết peptid này bằng nhóm ether, tạo ra các aryloxyalkanoic acid hydroxyamic, ổn định hơn trong cơ thể sống và khả năng ức chế HDAC không hề kém cạnh [27]

c Ảnh hưởng của nhóm kết thúc gắn kẽm

Năm 2005, khi nghiên cứu cấu trúc của vùng chứa ion Zn2+ trong HDAC, Vanommeslaeghe K và cộng sự thấy rằng, vùng này chứa 1 gốc Tyr, 2 nhóm His-Asp [45] Từ đó, tác giả đã đưa ra cấu trúc của nhóm kết thúc gắn với kẽm trong phân tử HDACi gồm 5 phần (hình 1.6):

+ Phần A: mang đôi electron tự do, có khả năng tạo liên kết hydro với H trong nhóm OH của tyrosin, đồng thời tạo liên kết chelat với ion Zn2+ Tuy nhiên A cũng có thể là hydro (nhận điện tử từ oxy ở nhóm OH của tyrosin tạo liên kết hydro)

+ Phần B: nối ZBG với vùng cầu nối, do đó B phải tạo ít nhất 3 liên kết

+ Phần C: chứa hydro linh động, tạo liên kết hydro với His132

+ Phần D: là nhóm cho proton cho His131, tạo liên kết tĩnh điện với His131 và liên kết chelat mạnh với Zn2+

+ Phần L: vùng cầu nối

Các ZBG là các acid hydroxamic có khả năng liên kết mạnh với Zn2+, làm tăng hoạt tính của chất Tuy nhiên, cũng vì vậy mà các acid hydroxamic không có khả năng chọn lọc cao với các HDAC khác nhau [19]

Hình 1.6: Cấu trúc của nhóm kết thúc gắn với kẽm trong phân tử HDACi

d Ảnh hưởng của các yếu tố khác

− Năng lượng solvat hóa của phân tử tăng, hoạt tính ức chế HDAC giảm [50]

− Các phân tử thân dầu thường có hoạt tính tốt, tuy nhiên kích thước phân tử quá lớn sẽ bất lợi với hoạt tính [20] Khi phân tử thuốc quá thân dầu hoặc chứa quá nhiều vòng 6 cạnh sẽ tạo hiệu ứng không gian, do vậy hoạt tính của chất sẽ giảm [4] Những chất có tính thân dầu - thân nước cân bằng thường có lợi cho hoạt tính của các chất ức chế HDAC-6 [23]

− Phân tử có xu hướng cầu hóa sẽ làm thu nhỏ vùng cho dung môi thâm nhập do các nhóm thân nước bị che khuất Cấu trúc phân tử càng có xu hướng “mở”, hoạt tính ức chế HDAC sẽ tăng [46]

− Phân tử ở dạng gấp khúc là điều kiện tiên quyết cho tác dụng ức chế chọn lọc HD1-A (tương đồng HDAC nhóm II) Ngược lại, khi phân tử ở dạng thẳng lại cho tác dụng ức chế chọn lọc trên HD1-B (tương đồng HDAC nhóm I) [33]

1.2 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG TỔNG HỢP CÁC ACID

HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Năm 1976, Tsuji và cộng sự phân lập ra các dẫn chất hydroxamic tự nhiên từ streptomyces hygroscopicus, là triclosan A (TSA), vốn là các chất có tác dụng chống nấm [43] Sau đó, năm 1990, Yoshida cùng cộng sự đã chứng minh tác dụng rất tốt của các dẫn chất này trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend và ức chế chu trình tế bào bình thường cả ở pha G1 và G2 [49] Tiếp đó, SAHA, một dẫn chất hydroxamic ức chế HDAC được tổng hợp, nghiên cứu và cuối cùng được FDA phê duyệt năm 2006 trong điều trị u lympho đa tế bào T sau khi trải qua các pha trong thử nghiệm lâm sàng [12] Tuy nhiên, như đã nhận xét, cả TSA và SAHA đều kém ổn định trong cơ thể và tác dụng không chọn lọc [19] Bởi vậy, nhiều dẫn chất hydroxamic dựa trên cấu trúc của TSA và SAHA đã được tổng hợp nhằm khắc phục các vấn đề trên, dựa trên hai hướng, đó là thay đổi nhóm nhận diện bề mặt

và vùng cầu nối

1.2.1 Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt

Thay thế nhóm CAP của SAHA bằng nhóm phenylisoxazol, Kozikowski cùng cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất và công bố kết quả nghiên cứu của mình năm 2008 (xem hình 1.7) Theo đó, dẫn chất 1a có nhóm khóa hoạt động là 5-(3-aminophenyl)-

isoxazol-3-yl có tác dụng ức chế HDAC tốt nhất, tốt hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm Đồng phân thế amino ở vị trí orthor cũng có khả năng ức chế tương tự như SAHA [24]

Cũng dựa trên cấu trúc của SAHA, Salmi-Smail cùng cộng sự đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất có nhóm thế trên nhân thơm của phenyl (xem hình 1.8) Kết quả đáp

ứng liều - khả năng ức chế phân bào được công bố vào năm 2010 cho thấy, các chất 2a

và 2c cho kết quả tốt hơn so với SAHA, trong khi 2b hay 2d thì hầu như không có đáp

ứng hoặc rất yếu Cụ thể, EC50 (𝜇𝑀) của 2a (0,12) thấp hơn so với của SAHA (0,82) khoảng 7 lần trên dòng tế bào U937, cho thấy tính chọn lọc hơn trên bệnh bạch cầu [38]

Hình 1.8: Cấu trúc các dẫn chất trong nghiên cứu của Salmi-Smail và cộng sự

Theo hướng nghiên cứu này, tại bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội, NCS Đào Thị Kim Oanh và cộng sự đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất mang nhóm khóa hoạt động benzothiazol với các nhóm thế khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều chất cho hoạt tính trên một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm mạnh gấp vài chục đến vài trăm lần SAHA [1] (xem hình 1.9)

a R= -H

b R= -CH3

c R= -OCH3

d R= -OC2H5

Hình 1.9: Cấu trúc các chất mang khung benzothiazol

Mới đây nhất, vào năm 2017, Wang và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu của mình Khi sử dụng thienopyrimidin trong nhóm nhận diện bề mặt, nhóm nghiên

cứu đã thu được hợp chất 5 có khả năng ức chế HDAC rất tốt, ức chế mạnh mẽ khả

năng phân bào của tế bào ung thư cả hai dòng RPMI 8226 (IC50 = 0,97 ± 0,072 μM) và HCT 116 (IC50 = 1,01 ± 0,033 μM) Đáng chú ý hơn, 5 còn có khả năng tăng mức độ

acetyl hóa histon H3 ngay ở nồng độ thấp (0,3 μM) [47] (xem hình 1.10)

3a-h, m = 4 4a-h, m = 6

e R= -SO2CH3

f R= -NO2

g R= -Cl

h R= -CF3

Hình 1 . 10: Cấu trúc chất trong nghiên cứu của Wang và cộng sự

1.2.2 Thay đổi vùng cầu nối

Không chỉ dừng lại ở việc thay đổi nhóm nhận diện bề mặt, các nhà khoa học còn thay đổi cả phần cầu nối của các chất ức chế HDAC nhằm tăng hoạt tính và tăng tính chọn lọc của chúng

Dựa trên nghiên cứu cấu trúc TSA, các nhà khoa học tại công ty Novartis (Thụy Sỹ) đã tổng hợp các dẫn chất cinnamic hydroxamic acid, thay thế phần cầu nối là mạch nhánh không no của TSA bằng acid cinnamic Một trong số đó là LBH-589

(panobinostat, 6, xem hình 1.11), một chất ức chế HDAC không chọn lọc, đã trải qua các thử nghiệm lâm sàng và được FDA và EMA phê duyệt trong điều trị đa u tủy xương [6]

Hình 1 . 11: Cấu trúc của Panobinostat

Cũng mang cấu trúc phần linker tương tự, PXD-101 (belinostat) (7) (xem hình

1.12, biệt dược Beleodaq) do nhóm nghiên cứu công ty Toco Target phát triển cũng đã được phê duyệt bởi FDA năm 2014 trong điều trị u lympho T ngoại vi (PTCL)

Hình 1.12: Cấu trúc của Belinostat

Năm 2002, Mai cùng cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC, được gọi là 3-(4-aroyl-1H-2-pyrrolyl)-N-hydroxy- 2-propenamides (APHAs)

Các dẫn chất này sử dụng một vòng azol trong phần cầu nối (xem hình 1.13) Trong

các chất tổng hợp dược, dẫn chất 8 có hoạt tính mạnh nhất, gấp vài chục lần so với cả

SAHA và TSA [26]

Hình 1.13: Cấu trúc 8 trong nghiên cứu của Mai và cộng sự

Trong nghiên cứu của NCS Đào Thị Kim Oanh và cộng sự, nhóm nghiên cứu cũng thay đổi độ dài vùng cầu nối từ 4-6 carbon Kết quả cho thấy, vùng cầu nối có độ dài 6 carbon là cho hoạt tính mạnh nhất (mục 1.2.1, hình 1.9)

Bên cạnh đó, thay đổi phần liên kết giữa nhóm nhận diện bề mặt và phần linker cũng mang lại nhiều thành tựu Không chỉ giới hạn sử dụng liên kết amid hay ceton, Marson và cộng sự năm 2007 đã công bố nghiên cứu của mình khi sử dụng O làm nhóm liên kết, tạo ra các aryloxyalkanoic N-hydroxyamid Các dẫn chất này đã trở thành một trong các chất có cấu trúc đơn giản có hiệu lực ức chế HDAC mạnh nhất được biết đến Điều này cho thấy, để thu được tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ nanomol, việc buộc phải có nhóm carbonyl (như ở TSA, SAHA) hay một cầu nối rắn chắc là hoàn toàn không cần thiết [27] (xem hình 1.14)

Hình 1.14: Cấu trúc chung các dẫn chất do Marson và cộng sự tổng hợp

1.3 Kết hợp dị vòng 1,2,3-triazol trong nhóm nhận diện bề mặt

Các dẫn chất 1,2,3-triazol đã thể hiện nhiều đặc tính sinh học quan trọng như kháng khuẩn, kháng nấm, diệt virut, kháng β-lactamase, chống động kinh, điều trị tâm

thần phân liệt, giảm sốt, chống dị ứng, co giật, diệt Tripanocida, diệt Leishmania, ức

chế enzym anhydrase và protease, chống Alzheimer, ức chế COX, ức chế sản xuất

NO, diệt Mycobacteria và Vibrio cholera, điều trị bệnh bạch cầu, HIV, rắn cắn, ung

thư vú [10],… Dưới đây là một số ví dụ điển hình:

1.3.1 Chống nấm

Trên thực tế, hiện nay các thuốc chống nấm hàng đầu đang sử dụng là các thuốc

có chứa dị vòng 1,2,4-triazol như fluconazol, itraconazol, voriconazol,… Năm 2009, Aher cùng cộng sự đã tiến hành thay thế vòng một trong 2 vòng 1,2,4-triazol của fluconazol bằng vòng 1,2,3-triazol [52] Kết quả đã tạo ra nhiều hợp chất có khả năng

chống lại nấm Candida tốt hơn so với cả fluconazol và amphotericin B Ví dụ, hợp

chất 13 đã làm giảm 94,7% nấm trên chuột ở liều thấp 0,001mg/ml (xem hình 1.15)

Hình 1.15: Cấu tạo chất 13 trong nghiên cứu của Nilkanth và cộng sự

1.3.2 Tác dụng trên vi khuẩn lao

Rất nhiều báo cáo chỉ ra rằng các dẫn chất 1,2,3-triazol có khả năng chống lại

Mycobacterium tubeculosis, vi khuẩn gây ra bệnh lao Nhiều chất thể hiện khả năng

chống vi khuẩn lao rất mạnh, kể cả đối với các typ đã kháng với các thuốc điều trị hiện

tại Dưới đây là cấu trúc của 14, một chất có khả năng chống lại vi khuẩn lao với MIC

0,002-0,006 μg/ml [3] (xem hình 1.16)

Hình 1.16: Một dẫn chất 1,2,3-triazol có hoạt tính chống vi khuẩn lao

1.3.3 Chống Trypanosoma cruzi

T.cuzi là một loài kí sinh trùng gây bệnh Chaga do một loài bọ xít hút máu người

truyền nhiễm Bệnh phổ biến ở các nước châu Phi, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Năm 2008, Ferreira và cộng sự công bố kết quả nghiên cứu của mình khi lần đầu tiên kết hợp vòng triazol với naphtoquinon và kiểm tra chất tạo thành với

máu của người bị nhiễm kí sinh trùng Kết quả, các chất thu được (15) đều có hoạt tính

mạnh hơn so với dẫn chất quinon đang được sử dụng trong điều trị [8] (xem hình 1.17)

Hình 1.17: Hai dẫn chất có hoạt tính mạnh nhất do Ferreira và cộng sự tổng hợp

Những dẫn chất triazol - naphthoquinon trở thành chất dẫn đường hấp dẫn để thiết kế tổng hợp các chất có tác dụng điều trị bệnh Chaga

1.3.4 Điều trị đái tháo đường

Zhou và đồng nghiệp đã thiết kế tổng hợp một dãy các chất chứa nhóm triazol và

đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase của các chất trên Bacillus

tốt hơn so với nojirimycin (17), một chất ức chế α-glucosidase tự nhiên tìm thấy trong

thực vật (IC50 1,67 μM) [51] (xem hình 1.18)

Hình 1.18: Một chất do Zhou tổng hợp (16) và nojirimycin (17) 1.3.5 Kháng tế bào ung thư

Gần đây, nhiều dẫn chất triazol đã được thiết kế và tổng hợp có tác dụng chống lại một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm Các nhà khoa học tập trung vào các dẫn chất là hợp phần của 1,2,3-triazol với các β-lactam, triterpenoid hay chalcon Các HDACi cũng không nằm ngoài xu hướng này Việc sử dụng nhóm triazol có thể phục

Năm 2008, Chen và cộng sự đã tổng hợp một lượng lớn các dẫn chất có công

thức chung 18 [5] (xem hình 1.19):

Hình 1.19: Công thức chung dẫn chất do Chen và cộng sự tổng hợp

Các dẫn chất 18 có cấu trúc của SAHA thay thế nhóm amid bằng vòng 1,2,3-

triazol Kết quả khi tính toán khả năng ức chế HDAC trên cùng một thử nghiệm cho

thấy, 18a và 18b đều có hoạt tính mạnh hơn SAHA, trong đó 18b có hoạt tính mạnh

gấp SAHA hơn 30 lần Kết quả này cho thấy, các HDACi sử dụng vòng 1,2,3-triazol thay thế cho nhóm amid/ceton để nối phần CAP với cầu nối có hoạt tính tốt hơn nhiều lần so với SAHA [5]

Năm 2013, GS.TS Nguyễn Hải Nam và cộng sự đã tổng hợp các acid

hydroxamic có công thức chung 19 [30] có khả năng ức chế mạnh HDAC và tế bào

ung thư (xem hình 1.20) Chúng tôi đề xuất việc tiến hành kết hợp một nhóm 1,2,3-

triazol vào cấu trúc của 19 trong đề tài này với mong muốn tổng hợp được các chất có

hoạt tính tốt hơn

Hình 1.20: Cấu trúc chung các chất do GS.TS Nguyễn Hải Nam và cộng sự tổng hợp

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ HÓA HỌC CLICK

1.4.1 Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic

Dưới đây, khóa luận xin trình bày một số phương pháp phổ biến tổng hợp acid hydroxamic đi từ nguyên liệu ester và acid carboxylic hay sử dụng trong các nghiên cứu về các chất ức chế HDAC

19

1.4.1.1 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester

Đây là phương pháp được sử dụng khá phổ biến, trong nhiều nghiên cứu như nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Hải Nam và cộng sự [30], hay Feng và cộng sự [13] Các nhóm nghiên cứu đều tổng hợp acid hydroxamic từ methyl/ethyl ester phản ứng với hydroxylamin hydroclodrid trong dung môi MeOH ở môi trường kiềm Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 0-5°C với hiệu suất khá cao (xem sơ đồ 1.1)

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp acid hydroxamic trong nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Hải

Nam và cộng sự

Ở một số trường hợp, điều kiện phản ứng và dung môi phản ứng có thể thay đổi phụ thuộc vào bản chất của ester tham gia Cụ thể, trong nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic mang cầu nối chứa vòng triazol giữa methyl ester với hydroxylamin của Chen và cộng sự, dung môi phản ứng lại là hỗn hợp MeOH : THF (1:1) ở nhiệt độ phòng [5] Hiệu suất phản ứng vẫn đạt trên 80% Hay trong nghiên cứu của Wang cũng dùng hỗn hợp dung môi MeOH - THF [47]

1.4.1.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic

Phản ứng giữa ester và hydroxylamin đôi khi xảy ra rất chậm Sử dụng tác nhân hoạt hóa và hydroxyamin có nhóm bảo vệ OH có thể làm tăng khả năng phản ứng vào

NH2 Reddy và cộng sự [35] đã sử dụng ethylcloroformat hoạt hóa acid carboxylic ở

0oC và phản ứng với hydroxylamin tại nhiệt độ phòng, pH trung tính để tạo acid hydroxamic (xem sơ đồ 1.2):

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic

1.4.2 Phản ứng Click tạo vòng 1,2,3-triazol

Theo Sharpless và cộng sự, phản ứng Click (click reaction) là “những phản ứng lưỡng cực, phạm vi rộng, hiệu suất cao, cho các sản phẩm phụ không độc hại, có thể được loại bỏ bằng những phương pháp đơn giản như kết tinh hoặc chưng cất và có tính chọn lọc lập thể” [22] Điều kiện phản ứng xảy ra đơn giản (không nhạy cảm với oxy,

− Muối Cu(II) (CuSO4) và một chất khử (natri ascorbat) để tạo Cu(I)

− Một số muối Cu(II) hoặc phức chất Cu(OAc)2 (do phản ứng trực tiếp với alkyn tạo Cu(I))

− Kim loại đồng được oxy hóa thành Cu(I)

Một số dung môi phản ứng:

− Dung môi không phân cực: toluen, cloroform, dicloromethan

− Dung môi phân cực yếu: tetrahydrofuran, pyridin, dioxan

− Dung môi phân cực: aceton, MeCN, DMF, DMSO, alcol

lưỡng cực Huisgen

Phản ứng CuAAC

Đồng phân 1,5

Với xúc tác Cu(0) hoặc Cu(II) có kèm chất khử natri ascorbat, có thể sử dụng hệ dung môi nước với một dung môi phân cực Ngược lại, với xúc tác Cu(I) thường sử dụng các dung môi khan

Từ những kết quả nghiên cứu về HDAC, các chất ức chế HDAC cũng như về hóa học Click đã tạo nền tảng cho khóa luận tiếp cận hướng nghiên cứu thiết kế, tổng hợp một số N-hydroxyheptanamid mang khung 1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on với vòng 1,2,3-triazol là cầu nối Khóa luận hy vọng tìm ra các dẫn chất hydroxamic mới

có tác dụng ức chế HDAC với hoạt tính kháng tế bào ung thư vượt trội

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Dung môi, hoá chất dùng phân tích, kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn HPLC

Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Sigma- Aldrich hoặc Merck Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất

kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

Các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid (DMF),

acetonitril (MeCN), dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), acid acetic (AcOH), aceton, ethyl acetat, K2CO3, KI, NaCl, Na2SO4, NaOH, HCl, CuI, FeCl3…

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

− Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

− Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại

− Bình chạy sắc ký Camag

− Bản mỏng silicagel GF 250 của Whatman® để chạy sắc ký lớp mỏng

− Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm

− Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

− Máy cất quay chân không Buchi R-200

− Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm

− Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy

− Máy Cary 660 FTIR để xác định phổ IR

− Máy khối phổ LC-MSD Trap SL để ghi phổ MS, đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

− Máy cộng hưởng từ B ruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

+ Phản ứng N-alkyl hoá với tác nhân propargyl bromid

+ Phản ứng Click 1,2,3-triazol với tác nhân là dẫn chất của azid, xúc tác CuI + Một số phản ứng cơ bản khác

− Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), UV 254/365 nm

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC (xác định thời điểm kết thúc phản ứng, độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế) và xác định nhiệt độ nóng chảy

2.3.1.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ về độ tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phổ sau đây:

− Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Cary 660 FTIR tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400

cm-1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không

để loại bỏ hơi ẩm Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1

− Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LC - MSD Trap SL đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(-)-MS, dung môi MeOH

− Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất

chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d6

2.3.2 Thử tác dụng sinh học

2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC

Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Enzym HDAC-2 được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience)

Kết quả độ hấp thụ được đưa vào phần mềm excel tính toán thu được phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC Phần trăm này chuyển sang phần mềm GraphPad prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) để tính toán IC50 Độ lệch chuẩn tương đối không quá 10%

2.3.2.2 Thử độc tính tế bào

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được tiến

hành tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Các dòng tế bào thử nghiệm gồm: PC-3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt), SW620 (tế bào ung thư đại tràng) AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ) và NCI-H23 (ung thư phổi) Các dòng tế bào

ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Thử độc tính tế bào theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB)

* Nguyên tắc thử

Dựa trên khả năng gắn thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong

tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từ đó suy ra số lượng

tế bào

* Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp Probits

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận (VIa-d) được thực hiện theo Sơ đồ

chung dưới đây:

c: R = 5-Br

d: R = 5-CH3

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ tổng hợp chung

3.1.1.1 Tổng hợp nguyên liệu ethyl 7-azidoheptanoat (II)

Hợp chất II được tổng hợp từ ethyl 7-bromoheptanoat (I) bằng phản ứng thế

nucleophin với NaN3 theo sơ đồ 3.2:

− Hòa tan 1,42 g (6,0 mmol) chất I và 0,59 g (9,0 mmol) NaN3 vào 20,0 ml MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml

− Khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12 h

• Xử lý phản ứng:

− Cất quay chân không ở 60°C loại dung môi

− Phân tán cắn thu được vào 50 ml DCM

− Lọc bỏ tủa NaN3 và NaBr không tan

− Cất quay chân không ở 40°C loại dung môi

− Bảo quản sản phẩm trong ngăn mát tủ lạnh ở 0-5°C, đậy nút kín

• Kết quả:

− Cảm quan: chất lỏng, màu vàng nhạt

3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-7-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)heptanamid (VIa)

a Tổng hợp chất IVa

Tổng hợp chất 1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVa) từ nguyên liệu isatin (IIIa) qua phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI theo sơ đồ 3.3 sau:

Sơ đồ 3.3: Sơ đồ tổng hợp chất IVa

• Tiến hành phản ứng:

− Hòa tan 0,29 g (2,0 mmol) chất IIIa vào 3 ml DMF khan trong bình cầu sạch

đáy tròn dung tích 50 ml; thêm 0,28 g (2,0 mmol) K2CO3

− Khuấy hỗn hợp trong bình ở 80°C trong 1 h Thêm 0,33 g (2,0 mmol) KI vào hỗn hợp, khuấy thêm 15 phút

− Thêm từ từ 0,29 g (2,4 mmol) propargyl bromid vào bình phản ứng

− Tiếp tục tiến hành phản ứng trong 3 h ở 60°C

− Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM : MeOH = 100:1

nc

• Xử lý phản ứng:

− Làm lạnh bình phản ứng

− Trung hòa hỗn hợp phản ứng bằng HCl 5% lạnh đến pH~4

− Thêm vào 40 ml nước cất lạnh để tạo tủa

− Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

− Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60°C

Điều chế chất ethyl 7-(4-((2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-

yl)heptanoat (Va) từ chất IVa thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là

CuI Phản ứng theo sơ đồ 3.4 sau:

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ tổng hợp chất Va

• Tiến hành phản ứng:

− Hòa tan 0,19 g (1,0 mmol) chất IVa và 0,24 g (1,2 mmol) chất II vào 4,0 ml

MeCN trong bình cầu sạch dung tích 50 ml Thêm 0,19 g (1,0 mmol) CuI

− Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 50°C trong 3 h

− Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM : MeOH = 10:1

• Xử lý phản ứng:

− Cất quay chân không ở 60ºC loại dung môi MeCN

− Phân tán cắn vào 30 ml DCM, gia nhiệt đến 40ºC để hòa tan hết chất Va và còn

CuI không tan lắng ở đáy bình

− Lọc loại bỏ CuI, làm khan dịch lọc bằng Na2SO4

− Cất quay loại dung môi thu hợp chất chất Va

− Hòa tan cắn vào một lượng MeCN tối thiểu, thêm từ từ nước cất vào đến khi thấy tủa không tăng nữa thì dừng Để lạnh để ổn định tủa

− Gạn, lọc lấy tủa, rửa tủa với nhiều lần nước cất

− Sấy khô tủa ở 60ºC

− Phân tán 0,23 g (0,6 mmol) chất Va và 0,42 g (6,0 mmol) NH2OH.HCl vào 5,0

ml MeOH trong bình cầu sạch dung tích 50 ml

− Làm lạnh bình phản ứng đến -5ºC bằng hỗn hợp đá muối

− Khuấy phân tán hỗn hợp trong bình phản ứng

− Chuẩn bị dung dịch NaOH bão hòa trong nước đã được làm lạnh rồi nhỏ từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng đến pH = 12

− Tiếp tục cho phản ứng thêm 30 phút ở -5ºC

sau:

− Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl3 5% và TLC, tiến trình thực hiện như

+ Lấy 0,05 ml dịch từ bình phản ứng cho vào khay sứ, acid hóa bằng dung dịch HCl 5% Nhỏ 1 giọt thuốc thử FeCl3 5% vào hỗn hợp trên, nếu thấy xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ đã có sản phẩm acid hydroxamic

+ Acid hóa 0,05 ml dịch lấy từ bình phản ứng bằng dung dịch HCl 5% trong vial, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm Tiến hành TLC với pha động

DCM : MeOH = 5:2, chấm chứng sản phẩm trong ethyl acetat với chất Va

trong DMF Phản ứng kết thúc khi thấy vết ester Va đã mất đi hoàn toàn

• Xử lý phản ứng:

− Trung tính hóa hỗn hợp trong bình phản ứng bằng HCl lạnh 5%

− Thêm vào 20 ml nước cất lạnh

− Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

− Nhiệt độ nóng chảy tºnc = 185,2-186,4°C và Rf = 0,51 (xem thêm bảng 3.2)

− Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5, và 3.6

3.1.1.3 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-7-(4-((5-cloro-3-(hydroxyimino)-2- oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)heptanamid (Vb)

Dẫn chất VIb được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ đồ 3.6:

Sơ đồ 3.6: Sơ đồ tổng hợp dẫn chất VIb

Điều chế chất ethyl 7-(4-((5-cloro-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-

1-yl)heptanoat (Vb) từ chất IVb thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác là CuI

triazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (VIb) được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic

giữa chất Vb và hydroxylamin hydroclorid

− Nhiệt độ nóng chảy tºnc = 185,3-186,7°C và Rf = 0,52 (xem thêm bảng 3.2)

− Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

3.1.1.4 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-7-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2- oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)heptanamid (VIb)

Dẫn chất VIc được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.7:

Sơ đồ 3.7: Sơ đồ tổng hợp dẫn chất VIc

Tác nhân và điều kiện: i: Propargyl bromide, K2CO3, KI, DMF, 50°C, 3h

Điều chế chất ethyl 7-(4-((5-bromo-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-

triazol-1-yl)heptanoat (Vc) từ chất IVc thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng

c Tổng hợp chất VIc

Dẫn chất 7-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-

triazol-1-yl)-N-hydroxyheptanamid (VIc) được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic

giữa chất Vc và hydroxylamin hydroclorid

− Nhiệt độ nóng chảy tºnc = 190,5-191,3°C và Rf = 0,55 (xem thêm bảng 3.2)

− Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-7-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methyl-2- oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)heptanamid (VId)

Dẫn chất VIc được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.8:

Sơ đồ 3.8: Sơ đồ tổng hợp dẫn chất VId