Nghiên cứu các phản ứng định hướng trong tổng hợp valacyclovir hydroclorid

Vì vậy, để góp phần nghiên cứu tổng hợp valacyclovir hydroclorid quy mô phòng thí nghiệm, tiến xa hơn là nâng quy mô và đưa vào sản xuất nguyên liệu này tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến h

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

ThS Nguyễn Văn Giang

Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghiệp Dược

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp, tôi đã gặp rất nhiều khó khăn Nhờ có sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè mà tôi đã hoàn thành khóa luận Hôm nay, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến họ

Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới người thầy của

tôi – Ths Nguyễn Văn Giang, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, thầy đã luôn động viên, cổ vũ và khích lệ tinh thần nghiên cứu khoa học, cũng như dìu dắt, giúp đỡ tôi mỗi khi tôi gặp khó khăn trong quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Hải, người thầy đã luôn quan tâm

sát sao và luôn giải đáp những thắc mắc của tôi trong khi nghiên cứu Tôi vô cùng biết

ơn PGS TS Nguyễn Đình Luyện cùng các thầy cô thuộc bộ môn Công nghiệp Dược,

cũng như các thầy cô trong Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi được học tập và hoàn thành khoá luận

Tôi xin được cảm ơn các anh, các chị, các bạn và các em cùng nghiên cứu tại tổ Tổng hợp hóa dược, bộ môn Công nghiệp Dược đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian

thực hiện đề tài Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới anh Nguyễn Minh Tuấn và anh Nguyễn Gia Anh Tuấn, sinh viên lớp M1K67, hai người đã luôn ủng hộ, giúp đỡ

tôi trong suốt quãng thời gian vừa qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ tôi, người đã luôn yêu thương, ủng hộ tôi trên con đường mà tôi đã chọn

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những tình cảm, sự quan tâm, giúp đỡ

mà thầy cô, gia đình và bạn bè đã dành cho tôi

Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Văn Thị Hồng Nhung

1.3.3 Phương pháp sử dụng chất bảo vệ là di-tert-butylpyrocarbonat (Boc2O) 121.3.4 Phương pháp sử dụng chất bảo vệ là fluorenylmethyloxycarbonyl clorid (Fmoc-Cl) 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

3.1.1 Tổng hợp acid 2-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-3-methylbutanoic (1) 19

3.1.2 Tổng hợp ester 2-((2-amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)methoxy)

3.1.3 Phản ứng thủy phân tạo valacyclovir hydroclorid (3) 26

3.2.3 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 293.2.4 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) 29

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EDC.HCl N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid hydroclorid

FDA The Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm và Dược

HSV 1 Herpes simplex virus 1

HSV 2 Herpes simplex virus 2

m/z Tỷ số giữa khối lượng và điện tích của các ion

ppm Part per milion (Một phần một triệu)

Rf Retention factor (Hệ số lưu giữ)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Bookmark not defined

Bookmark not defined

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bệnh do nhiễm virus Herpes không chỉ gây ra nhiều ảnh hưởng xấu tới sức khỏe

cũng như thẩm mỹ cho bệnh nhân mà còn có thể gây nguy hiểm tới tính mạng người

bệnh suy giảm miễn dịch [28] Do các loại virus Herpes dễ bị lây nhiễm từ người sang

người và có khả năng gây bệnh tiềm ẩn nên trong những năm gần đây, các bệnh do virus này gây ra vẫn rất phổ biến ở Việt Nam [23], [28]

Để điều trị và dự phòng các bệnh do virus Herpes gây ra, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra các thuốc chống virus Herpes Đó là các dẫn xuất của nucleotid, có tác

dụng ức chế ADN polymerase và ngăn cản sự nhân đôi của virus [5] Trong số đó, acyclovir là một trong những thuốc được sử dụng phổ biến Tuy nhiên, acyclovir có sinh khả dụng đường uống thấp (15-20%), thời gian bán thải ngắn, nên để duy trì nồng độ điều trị của thuốc thì liều dùng với người lớn thường là 200-800 mg/lần x 5 lần/ngày, đợt điều trị 5-7 ngày [13] Số lần dùng thuốc nhiều khiến bệnh nhân khó tuân thủ điều trị Để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra valacyclovir, một tiền thuốc của acyclovir Valacyclovir có sinh khả dụng đường uống khoảng 50-55%, cao hơn gấp 3-5 lần so với acyclovir, từ đó hạn chế được số lần dùng thuốc trong một ngày, giúp bệnh nhân dễ tuân thủ điều trị và đảm bảo hiệu quả trong điều trị và dự phòng [14], [22]

Năm 1995, FDA phê duyệt và cho phép lưu hành valacyclovir hydroclorid với tên biệt dược là Valtrex Hiện nay, valacyclovir hydroclorid đã được sử dụng phổ biến ở Việt Nam Tuy nhiên, có rất ít các nghiên cứu về tổng hợp về valacyclovir hydroclorid

ở nước ta Vì vậy, để góp phần nghiên cứu tổng hợp valacyclovir hydroclorid quy mô phòng thí nghiệm, tiến xa hơn là nâng quy mô và đưa vào sản xuất nguyên liệu này tại

Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu các phản ứng định hướng trong

tổng hợp valacyclovir hydroclorid”

Với mục tiêu sau:

Tổng hợp được các chất trung gian trong quy trình tổng hợp valacyclovir hydroclorid từ acyclovir

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Các thuốc chống virus Herpes

Họ virus Herpes bao gồm hơn 100 loại virus được chia thành 3 nhóm nhỏ là α, β và

γ Tuy nhiên trong đó, chỉ có 8 loại Herpes được biết đến là gây bệnh cho người, còn lại chỉ gây bệnh cho động vật Tất cả các loại Herpes đều là loại nhiễm trùng tiềm ẩn suốt đời Virus Herpes thường gây bệnh da bọc nước, trong đó có một số loại chính gây bệnh

ở người sau [3]:

Bảng 1.1 Một số loại virus Herpes

Herpes simplex virus 1 HSV 1 Bệnh ở da và niêm mạc, thực quản, thần kinh

Herpes simplex virus 2 HSV 2 Bệnh ở đường sinh dục, tiết niệu, trực tràng

Varicella zoster virus VZV Bệnh thủy đậu và zona

Các thuốc kháng virus thường can thiệp vào quá trình sao chép của virus, làm gián đoạn quá trình này và làm cho virus không thể tiếp tục phát triển Trong đó, các thuốc

kháng virus Herpes (thường là dẫn xuất của các nucleotid) có tác dụng ức chế ADN

polymerase, từ đó ngăn cản sự nhân đôi của virus [5] Một số loại thuốc kháng virus

Herpes được sử dụng hiện nay: Acyclovir, Valacyclovir, Foscarnet, Idoxuridin…

- Acyclovir là dẫn xuất guanosin, có tác dụng đặc hiệu trên các virus Herpes (HSV 1,

HSV 2, VZV, EBV) Thuốc thường được sử dụng để dự phòng và điều trị các bệnh do

virus Herpes gây ra Có thể dùng đường uống, tiêm, hoặc tại chỗ Sinh khả dụng đường

3

uống từ 15-30% và thức ăn không ảnh hưởng tới hấp thu thuốc Thuốc được thải trừ qua thận, thời gian bán thải là 3-4 h Một số tác dụng không mong muốn (TDKMM) đường uống là: buồn nôn, nôn, tiêu chảy, nhức đầu, đau bụng, ban da [5] Một số thuốc khác

có cùng bản chất là dẫn xuất guanosin như acyclovir là valacyclovir, ganciclovir, famciclovir, penciclovir Ganciclovir và penciclovir đều có sinh khả dụng rất kém, penciclovir thường được dùng để điều trị tại chỗ còn ganciclovir vì có thời gian bán thải dài (8-9 h) nên vẫn được sử dụng theo đường uống [4], [8], [18]

- Foscarnet là dẫn xuất pyrophosphat, có tác dụng ức chế các loại virus Herpes, kể

cả chủng kháng acyclovir và HIV Thuốc chủ yếu được dùng để điều trị viêm võng mạc

do CMV ở người suy giảm miễn dịch và các bệnh do HSV đã kháng acyclovir Do hấp thu kém qua đường tiêu hóa nên foscarnet phải dùng đường tiêm tĩnh mạch Thuốc thải trừ qua đường nước tiểu, thời gian bán thải 4-8 h TDKMM đường tiêm: sốt, buồn nôn, nôn, thiếu máu, giảm bạch cầu, viêm loét đường tiết niệu, sinh dục Liều thấp độc với thận, hạ calci huyết, tăng creatinin huyết Liều cao, truyền tĩnh mạch nhanh ở người mất nước, suy thận có thể bị hoạt tử ống thận cấp, viêm thận kẽ, sỏi thận [5], [22]

- Idoxuridin là dẫn xuất thymidin, có tác dụng trên virus Herpes Thuốc chủ yếu

dùng điều trị viêm giác mạc, miệng, sinh dục do HSV và bệnh Zona Thuốc có độc tính cao nên không được sử dụng theo đường toàn thân Sorivudin là dẫn xuất pyrimidin có tác dụng trên các HSV 1, EBV, VZV Tác dụng của sorivudin mạnh hơn acyclovir nhưng không có tác dụng trên HSV 2 và CMV [5]

Trong số các thuốc trên, acyclovir được sử dụng phổ biến nhất do có tác dụng đặc hiệu

trên nhiều loại Herpes, ít tác dụng không mong muốn, tiện sử dụng vì có thể dùng cả theo

đường uống và đường bôi ngoài da Tuy nhiên như đã nói ở trên, acyclovir có sinh khả dụng đường uống thấp nên số lần dùng thuốc nhiều lần, khiến bệnh nhân khó tuân thủ điều trị Valacyclovir đã được nghiên cứu để khắc phục nhược điểm này [15], [16]

1.2 Tổng quan về valacyclovir hydroclorid

1.2.1 Cấu trúc hóa học

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo valacyclovir hydroclorid

- Tên khoa học: 2-[(2-amino-6-oxo-3H-purin-9-yl)methoxy]ethyl

Một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm [24]

USP 40 đã quy định một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho valacyclovir hydroclorid như sau:

 Định tính:

- Đo phổ IR và so sánh với phổ chuẩn

5

- So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn khi thực hiện phép định lượng bằng HPLC

- Định tính ion clorid

 Định lượng: Sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với các điều kiện sau:

- Hệ dung môi pha động: methanol : nước : acid percloric (1:19:0,1)

- Pha tĩnh: Cột 4 mm x 15 cm chứa silicagel L66 kích thước hạt 5 µm

- Các thông số trong quá trình triển khai sắc kí:

Bảng 1.2 Các tạp hữu cơ trong tiêu chuẩn của USP 40

Thuốc được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa, có sinh khả dụng đường uống khoảng

55% (gấp 3-5 lần so với acyclovir), không bị ảnh hưởng bởi thức ăn Sau khi uống từ

30-100 phút, thuốc đạt nồng độ tối đa trong máu và ở dưới ngưỡng điều trị sau 3 h

Thuốc liên kết với protein huyết tương thấp (khoảng 15%) và phân bố rộng rãi trong cơ

thể [7], [15], [16]

Chuyển hóa và thải trừ

Valacyclovir được chuyển hóa qua gan và ruột bước đầu thành acyclovir và L-valin

Cả valacyclovir và acyclovir đều không chuyển hóa bởi enzym cytochrom P450 Thuốc

được chuyển hóa qua gan và thải trừ chủ yếu qua thận, thời gian bán thải khoảng 3 h,

được loại trừ chủ yếu trong nước tiểu Đối với bệnh nhân xơ gan, có hoặc không có cổ

trướng, thời gian bán thải của thuốc không bị ảnh hưởng [7], [16].

1.2.5 Cơ chế tác dụng, chỉ định, liều dùng

Cơ chế tác dụng

Valacyclovir là tiền thuốc của acyclovir – một thuốc kháng virus thuộc nhóm các

chất ức chế men sao chép ngược Valacyclovir là ester của acyclovir với L-valin, có cấu

trúc tương tự guanosin và được chuyển hóa nhanh chóng và gần như hoàn toàn thành

acyclovir và L-valin bởi enzym valacyclovir hydrolase [5], [22] Khi vào cơ thể,

acyclovir dưới tác dụng của enzym thymidin kinase, enzym GMP kinase và enzym

phosphotransferase, sẽ tạo thành acyclovir triphosphat là dạng có hoạt tính và được vận

chuyển vào nhân tế bào [5]

Trong quá trình nhân lên của ADN của virus ở nhân tế bào, acyclovir triphosphat

cạnh tranh với 2’-deoxyguanosin monophosphat, làm cho ADN polymerase của virus

thay vì gắn với 2’-deoxyguanosin monophosphat để tạo thành ADN virus thì lại gắn với

acyclovir triphosphat Nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của ADN của virus tách pyrophosphat

từ acyclovir triphosphat thành acyclovir monophosphat Vì acyclovir monophosphat

không có nhóm hydroxyl 3’ nên không thể gắn thêm nucleotid khác, do vậy không thể

tiếp tục kéo dài chuỗi Ngoài ra, enzym exonuclease kết hợp hợp phần acyclovir

7

monophosphat với ADN polymerase của virus nên không thể loại bỏ hợp phần này khỏi chuỗi ADN của virus Vì vậy, acyclovir ức chế sự nhân đôi của virus và ngăn chặn sự phát triển của virus [5], [10], [12]

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của acyclovir trong cơ thể

Do acyclovir nhạy cảm với enzym thymidin kinase của virus Herpes hơn enzym

thymidin kinase của người khoảng 200 lần, nên sự phosphoryl hóa của acyclovir chủ yếu là do enzym của virus Vì vậy acyclovir được kích hoạt và tập trung nhiều hơn ở tế bào nhiễm virus, nồng độ acyclovir triphosphat trong tế bào nhiễm virus cao gấp 50-100 lần so với tế bào lành Mặt khác, acyclovir triphosphat nhạy cảm với ADN polymerase của virus hơn của tế bào vật chủ nên độc tính của acyclovir triphosphat với tế bào lành ít hơn tế bào bị nhiễm virus [5]

Chỉ định

Valacyclovir hydroclorid được chỉ định để dự phòng và điều trị các bệnh do nhiễm HVS 1 và HVS 2 ở da, niêm mạc, thần kinh và sinh dục Điều trị bệnh zona do VZV như zona mắt, phổi, thần kinh, bệnh thủy đậu Dự phòng và điều trị nhiễm virus ở bệnh nhân nhiễm HIV, người suy giảm miễn dịch, trong phẫu thuật cấy ghép cơ quan [5],[20]

Liều dùng và đường dùng

Theo khuyến cáo của FDA, liều dùng của valacyclovir cho người trưởng thành bị

nhiễm virus Herpes Simplex là 1000 mg x 2 lần/ngày trong 3-10 ngày, nên uống thuốc

khi có dấu hiệu sớm (ngứa, rát) của bệnh [12], [20]

Đối với bệnh nhân trưởng thành nhiễm virus Herpes sinh dục, liều dùng giai đoạn

ban đầu là 1000 mg x 2 lần/ngày trong 7 đến 10 ngày Điều trị đạt hiệu quả nhất khi sử dụng thuốc trong vòng 48 h sau khi xuất hiện các triệu chứng nhiễm virus Liều khuyến cáo cho các đợt tái phát là 500 mg x 2 lần/ngày trong 3 ngày [19], [20], [21]

Đối với bệnh nhân trưởng thành nhiễm HIV, liều dùng là 500 mg x 2 lần/ngày trong

1 tháng [29]

Không cần điều chỉnh liều đối với bệnh nhân cao tuổi và bệnh nhân suy gan nhưng cần điều chỉnh liều với bệnh nhân suy giảm chức năng thận [5], [20] Liều điều chỉnh cho bệnh nhân suy thận được thể hiện ở Bảng 1.3 [5]

Bảng 1.3 Liều dùng đã được điều chỉnh cho bệnh nhân suy thận

Chỉ định

Độ thanh thải creatinin (ml/phút)

≥ 50 (Liều bình thường)

12 h

Hai liều

1000 mg, cách nhau

12 h

Hai liều

500 mg, cách nhau

12 h

500 mg một liều duy nhất

1.2.6 Tác dụng không mong muốn và thận trọng

Valacyclovir thường ít có tác dụng không mong muốn Một số tác dụng không mong muốn có thể gặp:

- Nhức đầu, chóng mặt, cảm giác mệt mỏi, trầm cảm

- Buồn nôn, đau dạ dày, đau khớp, đau bụng kinh, phát ban nhẹ, nghẹt mũi, hắt xì, đau họng, tiêu chảy

- Ho, tức ngực, thiểu niệu, khó thở, táo bón, sốt, vàng mắt hoặc vàng da [5]

Các thuốc lợi tiểu sẽ làm tăng thải trừ acyclovir, giảm tác dụng của acyclovir Tuy nhiên trong một số nghiên cứu chỉ ra rẳng không có tương tác đáng kể về mặt lân sàng giữa valacyclovir với các thuốc lợi tiểu thiazid, một số thuốc kháng aicd có chứa Al và

Mg, cimetidin, digoxin, probenecid hoặc phối hợp giữa cimetidine và probenecid [20], [25]

Các thuốc có ảnh hưởng tới thận, khi kết hợp với valacyclovir có thể làm tăng nguy

cơ độc trên thận Vì vậy, cần tránh sử dụng valacyclovir với những thuốc có độc tính trên thận như ketoconazol, amphotericin B, tenofovir, lamivudin [25]

1.3 Các phương pháp tổng hợp valacyclovir hydroclorid

Các phương pháp tổng hợp valacyclovir hydroclorid đã được công bố đều thực hiện theo 3 bước được mô tả như Hình 1.4

- Bước 1: sử dụng một chất bảo vệ để bảo vệ nhóm amin của L-valin

- Bước 2: ester hóa hợp phần L-valin với acyclovir hoặc hợp phần acyclovir

- Bước 3: tách nhóm bảo vệ, acid hóa, thu được valacyclovir hydroclorid (3) [11], [27]

Hình 1.4 Sơ đồ tổng quát phương pháp tổng hợp valacyclovir hydroclorid

Qua các tài liệu đã công bố, chúng tôi đã nghiên cứu một số nhóm chất được sử dụng làm chất bảo vệ nhóm amin của L-valin trong tổng hợp valacyclovir hydroclorid, đó là

benzyl cloroformat, ethyl acetoacetat, di-tert-butylpyrocarbonat, anhydrid phthalic và

fluorenylmethyloxycarbonyl clorid Chúng tôi đã nghiên cứu các phương pháp và phân tích ưu, nhược điểm của chúng để lựa chọn hướng tổng hợp phù hợp và hiệu quả nhất

1.3.1 Phương pháp sử dụng chất bảo vệ là benzyl cloroformat

Năm 1990, Beauchamp và cộng sự lần đầu tiên tổng hợp valacyclovir hydroclorid theo hướng sử dụng nhóm bảo vệ là benzyl cloroformat [6] 10 năm sau, Carter và cộng

sự cũng đã sử dụng nhóm bảo vệ này để tổng hợp thành công valacyclovir hydroclorid [9] Hình 1.5 mô tả quy trình tổng hợp của Beauchamp

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp valacyclovir hydroclorid sử dụng Cbz-Cl

Trong đó, -Cbz là:

Mô tả quy trình tổng hợp của Beauchamp:

Ngưng tụ L-valin với benzyl cloroformat tạo thành Cbz-L-valin (1a) Sau đó ester hóa chất 1a với acyclovir trong môi trường DMF sử dụng tác nhân DCC và xúc tác

DMAP ở nhiệt độ 60℃ trong khoảng 12 h thu được ester 2-[(2-amino-

l,6-dihydro-6-oxo-9H-purin-9-yl)methoxy]ethyl N-[(benzyloxy)carbonyl] L-valinat

(N-Cbz-valacyclovir) (2a), hiệu suất phản ứng là 92,1% Khử hóa nhóm bảo vệ bằng H2, xúc tác Pd/C 5% trong hỗn hợp dung môi methanol và THF Tiếp tục tiến hành acid hóa bằng

11

acid clorohydric 0,5M rồi tiếp tục khuấy trong 24 h Xử lý phản ứng thu được sản phẩm

valacyclovir hydroclorid (3), hiệu suất đạt 60,0% [6]

Nhận xét: Hiệu suất toàn quá trình trên là 55,3% Cả hai phương pháp tổng hợp của

Beauchamp và Carter đều sử dụng H2, Pd/C 5% để khử nhóm bảo vệ Trong quá trình

khử nhóm bảo vệ đó sinh ra sản phẩm phụ là đồng phân quang học

D-N-Cbz-valacyclovir, tạp Pd và Al Tạp kim loại này khó loại bỏ bằng các phương pháp thông thường, phải sử dụng sắc kí cột và kết tinh lại nhiều lần để thu được sản phẩm có độ tinh khiết như mong muốn Phản ứng có thời gian thực hiện kéo dài, điều kiện phản ứng phức tạp, khó tổng hợp theo quy mô lớn [9], [15], [26]

1.3.2 Phương pháp sử dụng chất bảo vệ là ethyl acetoacetat

Phương pháp này do Montoro và cộng sự nghiên cứu và đăng kí bằng sáng chế vào năm 2003 [17] Phương pháp được mô tả như Hình 1.6

Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp valacyclovir hydroclorid sử dụng ethyl acetoacetat

Mô tả quy trình:

Ngưng tụ L-valin với ethyl acetoacetat trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 80℃ trong

3 h thu được chất 1b, hiệu suất phản ứng là 92,5% Sau đó cho acyclovir phản ứng với

4-toluensulfonyl clorid (tosyl clorid) trong dung môi pyridin và sục khí nitơ trong

khoảng 1,5 h tạo thành 4-omega-tosyl acyclovir (Y), hiệu suất là 87,9% Ester hóa hợp phần Y và 1b trong DMF ở nhiệt độ 80℃ trong 3 h thu được chất 2b với hiệu suất

80,0% Hòa tan 2b trong hỗn hợp dung môi methanol và THF, sau đó thủy phân bằng acid clorohydric 15% và tiếp tục khuấy trong 2 h Xử lý phản ứng thu được chất 3, hiệu

suất 78,0% [17]

Nhận xét: Hiệu suất toàn quá trình 54,8% Phản ứng tạo hợp phần Y dễ sinh ra tạp

chất là acid p-toluensulfonic, làm hao phí nguyên liệu, giảm hiệu suất phản ứng và khó

tách ra khỏi sản phẩm.Ngoài ra, tosyl clorid và dung môi pyridin có độc tính cao, khó bảo quản và đắt tiền

Năm 2005, Etinger và cộng sự đã sử dụng nhóm bảo vệ là Boc2O để tổng hợp valacyclovir hydroclorid theo quy trình Hình 1.7 [11]

Trong đó, -Boc là:

Mô tả quy trình:

Phản ứng của L-valin và Boc2O trong môi trường kiềm trong khoảng 12 h thu được

sản phẩm là N-Boc-valin (1c) Tiếp tục ester hóa chất 1c và acyclovir trong DMF sử

dụng tác nhân là DCC và xúc tác DMAP tạo thành chất 2c, với hiệu suất là 75,0% Dùng

acid clorohydric 5N ở nhiệt độ 25℃ để loại nhóm bảo vệ -Boc và tạo thành valacyclovir hydroclorid, hiệu suất phản ứng là 62,0% [11]

Nhận xét: Hiệu suất toàn quá trình 46,5% Điều kiện phản ứng đơn giản nhưng thời

gian phản ứng kéo dài, nguyên liệu Boc2O đắt tiền

13

1.3.4 Phương pháp sử dụng chất bảo vệ là fluorenylmethyloxycarbonyl clorid (Fmoc-Cl)

Năm 2007, Yan Mei và cộng sự đã nghiên cứu một nhóm chất bảo vệ mới trong quá trình tổng hợp valacyclovir là Fmoc-Cl [30]

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp valacyclovir hydroclorid sử dụng Fmoc-Cl

Trong đó, -Fmoc là:

Mô tả quy trình:

Thực hiện phản ứng ngưng tụ L-valin và Fmoc-Cl thu được Fmoc-L-valin (1d)

Ester hóa chất 1d với acyclovir, sử dụng tác nhân là

N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid hydroclorid (EDC) và DMAP trong dung môi TEA và DMF Phản ứng được thực hiện trong 4 h ở 0℃, sau đó được tiếp tục trong 12 h ở 25℃ Xử lý phản ứng

thu được ester 2d, hiệu suất là 97,0% Thủy phân loại nhóm bảo vệ bằng acid clorohydric đặc, thu được sản phẩm 3, hiệu suất phản ứng là 98,0% [30]

Nhận xét: Hiệu suất toàn quá trình là 95,1% Tác nhân EDC của phản ứng ester đắt

tiền, không sẵn có trong phòng thí nghiệm

1.3.5 Phương pháp sử dụng chất bảo vệ là anhydrid phthalic

Keshava và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp này và công bố vào năm 2013 Phương pháp sử dụng chất bảo vệ là anhydrid phthalic đã khắc phục được những hạn

chế của phương pháp sử dụng benzyl cloroformat như khó loại bỏ tạp chất, nguyên liệu đắt tiền [15] Phương pháp được mô tả trong Hình 1.9

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp valacyclovir hydroclorid sử dụng anhydrid phthalic

Mô tả quy trình:

Cho L-valin ngưng tụ với anhydrid phthalic ở nhiệt độ 170-175℃ tạo thành acid (1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-3-methylbutanoic (1e), hiệu suất 95% Ester hóa acid 1e với

2-acyclovir trong môi trường DMF với tác nhân DCC và xúc tác DMAP trong khoảng 5

h thu được ester

2-((2-amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)methoxy)ethyl-2-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-3-methylbutanoat (2e), hiệu suất 86% Loại bỏ nhóm bảo vệ bằng

methylamin 40%, sau đó acid hóa bằng acid clorohydric đặc ở nhiệt độ 0-5℃ thu được valacyclovir hydroclorid, hiệu suất 70% [15]

Nhận xét: Hiệu suất toàn quá trình 60,2%, nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm Điều kiện

phản ứng xảy ra dễ dàng và an toàn, thời gian phản ứng ngắn, dễ dàng xử lý, tinh chế sản phẩm và có thể nâng cấp quy mô [15]

Từ những phân tích trên, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sử dụng chất bảo vệ

nhóm amin của L-valin là anhydrid phthalic để tổng hợp các chất trung gian và

valacyclovir hydroclorid Đây là phương pháp có hiệu suất toàn quá trình cao, nguyên liệu

rẻ tiền, dễ kiếm và phản ứng dễ xảy ra ở điều kiện thường

15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Để thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ, thiết bị, dung môi

và hóa chất của Phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (xem Bảng 2.1 và Bảng 2.2) Ngoài ra, một số trang thiết

bị để xác định cấu trúc sẽ được nêu ở phần phương pháp nghiên cứu

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất

24 Nước cất Việt Nam

Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ, thiết bị

2 Bình cầu loại 1,2,3 cổ dung tích 50 ml, 100ml Đức

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp valacyclovir hydroclorid

2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến các phản ứng

3 Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc của các hợp chất trung gian tổng hợp được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

: acid acetic : nước (10:1:1) (hệ C); quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn

tử ngoại

 Sử dụng phương pháp lọc, kết tinh lại để tinh chế sản phẩm

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được

 Phương pháp SKLM với các điều kiện như đã trình bày ở Mục 2.3.1 Dựa vào đặc điểm hình ảnh trên sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Dựa vào khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

2.3.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

Cấu trúc của các hợp chất trung gian và sản phẩm cuối được xác định bằng các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và 13C (13C-NMR)

Phổ khối lượng (MS):

Được ghi tại phòng thí nghiệm Vật liệu hóa học, Khoa Hóa học, Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy LTQ Orbitrap XLTM (Mỹ) và tại Viện Thực phẩm chức năng trên máy Bruker EVOQ Qube, với chế độ đo ESI, dung môi

methanol

Phổ hồng ngoại (IR):

Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén kali bromid trong vùng 4000-400 cm-1

Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng dung môi DMSO-d 6, chất chuẩn nội là tetramethylsilan (TMS)

Sau khi phản ứng kết thúc, để bình phản ứng ở nhiệt độ phòng đến khi bình phản ứng còn 30-35℃ Thêm 10 ml petroleum ether vào hỗn hợp phản ứng, khuấy trong 15 phút

để kết tủa sản phẩm Để bình phản ứng qua đêm, lọc lấy tủa, rửa tủa bằng petroleum

ether, sấy khô, thu được sản phẩm màu trắng là acid 1

Kết quả:

- Khối lượng sản phẩm: 2,27 g

- Hiệu suất: 92,6% (theo tài liệu [15] là 95%)

- Nhiệt độ nóng chảy: 103,1-104,0℃ (theo tài liệu [15] là 103-104℃)

- Sắc kí lớp mỏng: Rf = 0,6 (hệ dung môi A); 0,5 (hệ dung môi B); 0,3 (hệ dung môi C)

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng:

 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm, trong khi giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác như cách tiến hành ban đầu Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất phản ứng

(℃)

Cảm quan sản phẩm

Hiệu suất (%)

Nhận xét: Dựa trên kết quả ở Bảng 3.1, chúng tôi rút ra kết luận rằng: Khi tăng nhiệt

độ thì hiệu suất phản ứng càng cao Ở nhiệt độ khoảng 140-160℃, chất lượng sản phẩm không tinh khiết có thể do anhydrid phthalic còn dư lẫn vào Khi nhiệt độ tăng trên 175℃ sản phẩm chuyển dần sang màu vàng nhạt của tạp chất Vì vậy chúng tôi chọn nhiệt độ phản ứng là 170-175℃ để đảm bảo chất lượng sản phẩm

 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol giữa L-valin và anhydrid phthalic đến hiệu suất, trong khi giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác như cách tiến hành ban đầu Kết quả được thể

Nhận xét: Anhydrid phthalic có nhiệt độ nóng chảy là 131℃ nên ở nhiệt độ cao là

170-175℃ có thể xảy ra hiện tượng thăng hoa, vì vậy để phản ứng xảy ra với hiệu suất cao, số mol của anhydrid phthalic phải lớn hơn L-valin Tuy nhiên, ở tỉ lệ cao như 1:1,5 hay 1:1,7, lượng anhydrid phthalic dư nhiều làm cho sản phẩm không đạt độ tinh khiết Vì vậy, chúng tôi chọn tỉ lệ mol L-valin : anhydrid phthalic là 1 : 1,2 để phản ứng có hiệu suất cao và sản phẩm tinh khiết nhất

 Ảnh hưởng của thời gian duy trì phản ứng tới hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm, trong khi giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác như cách tiến hành ban đầu Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.3

Hiệu suất (%)

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy khi tăng thời gian phản ứng thì hiệu suất phản

ứng càng tăng, nhưng khi thời gian trên 10 phút thì sản phẩm chuyển dần sang màu vàng nhạt của tạp chất Vì vậy, chúng tôi chọn thời gian phản ứng là 10 phút để đạt hiệu suất cao và đảm bảo chất lượng sản phẩm

Qua các khảo sát về các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, chúng tôi quyết định thực hiện phản ứng với tỉ lệ mol L-valin : anhydrid phthalic là 1:1,2 ở nhiệt độ 170-175℃ trong

10 phút để thu được sản phẩm có hiệu suất và độ tinh khiết tốt nhất

3.1.2 Tổng hợp ester (1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-3-methylbutanoat (2)

2-((2-amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)methoxy)ethyl-2-a) Sử dụng tác nhân DCC

Sơ đồ tổng hợp:

Cách tiến hành:

Hòa tan hoàn toàn DCC (1,66 g, 8,0 mmol) trong 10 ml DMF, sau đó rót từ từ hỗn hợp

vừa thu được vào hỗn hợp acid 1 (2,00 g, 8,0 mmol) trong 4 ml DMF Khuấy bình phản

ứng trong 45 phút ở nhiệt độ 15-20℃ Tiếp tục thêm acyclovir (1,20 g, 5,3 mmol) và DMAP (0,08 g, 0,6 mmol) vào bình phản ứng rồi khuấy liên tục 4 h ở nhiệt độ 15-20℃ Theo dõi phản ứng bằng sắc kí lớp mỏng, sau khi phản ứng kết thúc, lọc lấy dịch và thêm 10 ml nước cất vào dịch lọc, tiếp tục khuấy 20 phút ở nhiệt độ 15-20℃, thu được

kết tủa là sản phẩm thô Lọc lấy chất rắn, sấy khô sau đó kết tinh lại trong methanol

Lọc và sấy khô ở 40℃ thu được chất rắn màu trắng là sản phẩm ester 2

Kết quả:

- Khối lượng sản phẩm: 2,07 g

- Hiệu suất toàn quá trình 86,2% (theo tài liệu [15] hiệu suất toàn quá trình là 86,2%)

- Nhiệt độ nóng chảy: 197,2-198,0℃ (theo tài liệu [15] là 197-198℃)

- Sắc kí lớp mỏng: Rf = 0,7 (hệ dung môi A); 0,6 (hệ dung môi B); 0,45 (hệ dung môi C)

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng:

 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol giữa acid 1 và tác nhân DCC đến hiệu suất, trong khi giữ

nguyên các điều kiện phản ứng khác như cách tiến hành ban đầu Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.4

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol acid 1 : DCC đến hiệu suất phản ứng

Nhận xét: Từ kết quả khảo sát ở bảng trên, chúng tôi thấy rằng khi tỉ lệ mol giữa

DCC và chất 1 tăng lên thì hiệu suất phản ứng cũng tăng lên Nhưng khi tỉ lệ mol tăng

từ 1,01,5 thì hiệu suất tăng lên không đáng kể, nên tỉ lệ mol tối ưu giữa chất 1 và DCC

chúng tôi lựa chọn là 1:1,0

 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol giữa acyclovir với acid 1 tới hiệu suất, trong khi giữ nguyên

các điều kiện phản ứng khác như cách tiến hành ban đầu Kết quả được thể hiện qua Bảng 3.5

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol acyclovir : acid 1 đến hiệu suất phản ứng

23

Nhận xét: Chúng tôi thấy rằng khi tỉ lệ mol chất 1 và acyclovir tăng lên thì hiệu suất

càng tăng Tuy nhiên khi tỉ lệ này lớn hơn 1,5 thì hiệu suất sản phẩm thô tăng không đáng kể, mà hiệu suất kết tinh lại giảm nên hiệu suất phản ứng giảm Vì vậy chúng tôi

lựa chọn tỉ lệ mol giữa acyclovir và chất 1 là 1:1,5

 Ảnh hưởng của dung môi kết tinh lại đến hiệu suất tinh chế, trong khi giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác như cách tiến hành ban đầu Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.6

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dung môi kết tinh lại đến hiệu suất tinh chế

Nhận xét: Theo kết quả trên, chúng tôi thấy rằng dung môi ethanol cho hiệu suất kết

tinh cao nhất nhưng sản phẩm sau tinh chế lại lẫn tạp chất Bảng 3.6 cho thấy methanol

là dung môi kết tinh lại cho sản phẩm đạt độ tinh khiết và có hiệu suất kết tinh tốt, vì vậy chúng tôi chọn methanol thay vì methanol 75% như trong tài liệu [15] để làm dung môi kết tinh lại

 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng, trong khi giữ nguyên các điều kiện phản ứng khác như cách tiến hành ban đầu Kết quả được thể hiện qua Bảng 3.7

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng

Nhận xét: Từ Bảng 3.7 ta thấy khi tăng thời gian phản ứng thì hiệu suất phản ứng cũng

tăng, khi kéo dài phản ứng đến 5 h trở lên thì hiệu suất tăng không đáng kể và có thể sinh

ra các tạp chất, làm cho nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm có sự sai lệch Vì vậy chúng tôi chọn thời gian phản ứng là 4 h

Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, chúng tôi quyết định thực hiện

phản ứng với tỉ lệ mol acyclovir : acid 1 : DCC là 1:1,5:1,5 trong 4 h và sử dụng methanol

là dung môi kết tinh lại

ở nhiệt độ 25℃

Theo dõi phản ứng bằng sắc kí lớp mỏng, sau khi phản ứng kết thúc, thêm 10 ml nước cất vào hỗn hợp phản ứng thấy xuất hiện kết tủa màu trắng Lọc kết tủa và kết tinh lại trong dung môi methanol Lọc thu sản phẩm rồi sấy ở nhiệt độ 40℃ trong tủ sấy, thu

được chất rắn màu trắng là ester 2