Đánh giá khả năng sống sót trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang nhỏ giọt alginat tinh bột bao chitosan chứa lactobacillus acidophilus

Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng .... Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang calc

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THANH

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HÓA MÔ PHỎNG CỦA VI NANG NHỎ GIỌT ALGINAT – TINH BỘT BAO CHITOSAN CHỨA

Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận đã được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh - Bộ môn Công nghiệp Dược Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp

đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS

Đàm Thanh Xuân và DS Nguyễn Thị Ngọc, những người thầy đã luôn tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong

bộ môn Công nghiệp Dƣợc và Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia đã tạo mọi

điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo

trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè

đã luôn động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập và cuộc sống

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Đỗ Thị Thanh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về probiotic 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến 2

1.1.3 Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic 3

1.2 Loài Lactobacillus acidophilus 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy 4

1.2.2 Vai trò 4

1.2.3 Các chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus hiện nay 5

1.3 Tổng quan về vi nang hóa 6

1.3.1 Định nghĩa 6

1.3.2 Đặc điểm của vi nang 6

1.3.3 Ưu điểm của vi nang 7

1.3.4 Nhược điểm của vi nang 7

1.3.5 Phương pháp vi nang hóa 7

1.3.6 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ 8

1.4 Một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotic 8

1.4.1 Alginat 8

1.4.2 Tinh bột 10

1.4.3 Chitosan 11

1.5 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang calci alginat phối hợp với tinh bột và chitosan 12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 14

2.1.1 Chủng vi sinh vật 14

2.1.2 Hóa chất 14

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 15

2.1.5 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp 2 giai đoạn 16

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 16

2.3.2 Phương pháp nhân giống 17

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy 17

2.3.4 Phương pháp tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan 2 giai đoạn 17

2.3.5 Phương pháp đông khô 18

2.3.6 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV 18

2.3.7 Phương pháp xác định hàm ẩm 19

2.3.8 Phương pháp xác định hoạt độ nước của vi nang 20

2.3.9 Phương pháp xác định hình ảnh và kích thước vi nang 20

2.3.10 Phương pháp định tính chitosan trên vi nang bằng đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) 20

2.3.11 Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 21

3.1 Tạo vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp 2 giai đoạn 21

3.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng 21

3.2.1 Định tính chitosan trên vi nang Alg-TB bao chitosan sau khi thử nghiệm trong dịch dạ dày mô phỏng 34

3.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang Alg-TB bao chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Alg : Alginat

ATCC : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ

(American Type Culture Collection)

CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units)

Chi : Chitosan

FAO : Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

(Food and Agriculture Organization of the United Nations) kl/tt : Khối lượng/thể tích

LAB : Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium)

MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe)

MT : Môi trường

SGF : Dịch dạ dày mô phỏng (Simulated Gastric Fluid)

SIF : Dịch ruột mô phỏng (Simulated Intestinal Fluid)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Hoạt độ nước của vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô và trong quá trình bảo quản 26 Bảng 3.2 Độ ẩm của vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô và trong quá trình bảo quản 27

Bảng 3.3 Số lượng tế bào L acidophilus trong vi nang Alg-TB bao chitosan sau

đông khô và trong quá trình bảo quản 29 Bảng 3.4 Số lượng VSV sống sót trong vi nang sau đông khô, trong dịch acid sau khi ủ ở SGF và trong vi nang sau khi ủ ở SIF 37 Bảng 3.5 Số lượng VSV sống sót ban đầu và sau khi ủ trong dịch tiêu hóa mô phỏng của chế phẩm Antibio Pro 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 4

Hình 1.2 Cấu trúc của alginat 9

Hình 1.3 Sự hình thành và cấu trúc của calci alginat 10

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử chitin và chitosan 11

Hình 3.1 Vi nang Alg-TB bao Chi quan sát bằng camera thường 22

Hình 3.2 Vi nang Alg-TB bao Chi dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10X 22

Hình 3.3 Hình ảnh so sánh phổ IR của chitosan nguyên liệu (CS) với vi nang được tạo thành theo phương pháp 2 giai đoạn 24

Hình 3.4 Hoạt độ nước của vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô và trong quá trình bảo quản 26

Hình 3.5 Độ ẩm trung bình các mẫu vi nang Alg-TB bao Chi sau đông khô và trong quá trình bảo quản 28

Hình 3.6 Số lượng VSV trung bình trong các mẫu vi nang Alg-TB bao chitosan sau đông khô và trong quá trình bảo quản 30

Hình 3.7 Hình ảnh so sánh phổ IR của chitosan nguyên liệu với vi nang M1, M2 và M3 33

Hình 3.8 Vi nang trước và sau khi ủ 2 giờ trong SGF (có bổ sung pepsin) 36

Hình 3.9 Vi nang sau khi ủ 2 giờ trong SGF (có bổ sung pepsin) và sau khi ủ 1 giờ trong SIF (có bổ sung pancreatin) 36

Hình 3.10 Số lượng VSV được giải phóng sau khi ủ trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang Alg-TB bao chitosan và chế phẩm Antibio Pro 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được biết đến là một vi khuẩn có lợi, được

sử dụng nhiều làm nguyên liệu trong các chế phẩm probiotic Khi đưa vào cơ thể con người, probiotic mang lại tác dụng kích thích tiêu hóa, ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường

ruột, tăng cường miễn dịch, giảm cholesterol máu,… [36] Lactobacillus acidophilus

phải đạt được số lượng đầy đủ sau khi uống để có thể phát huy tác dụng có lợi của nó Tuy nhiên, trong quá trình chế biến và bảo quản, vi khuẩn dễ bị các yếu tố môi trường bên ngoài như độ ẩm, nhiệt độ, áp suất, pH, hydrogen peroxid, oxy hòa tan,… tác động gây giảm số lượng vi khuẩn sống sót [29] Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tăng cường khả năng chống chịu của vi khuẩn trước các điều kiện bất lợi của môi trường Phương pháp tạo vi nang calci alginat – tinh bột đông khô là phương pháp đơn giản, được sử dụng phổ biến hiện nay, có khả năng bao gói được lượng lớn vi khuẩn, cải thiện số lượng VK sau đông khô, bảo vệ VK trong thời gian bảo quản và khi đi qua môi trường khắc nghiệt của đường tiêu hóa [35] Việc bổ sung thêm chitosan bao bên ngoài giúp tạo lớp áo bảo vệ vi nang tốt hơn dưới tác động của acid dạ dày [41] Phương pháp này có ưu điểm an toàn, không độc, bào chế đơn giản, vi nang tạo thành

có độ đồng đều cao

Xuất phát từ những lí do trên, đề tài “Đánh giá khả năng sống sót trong dịch

tiêu hóa mô phỏng của vi nang nhỏ giọt alginat – tinh bột bao chitosan chứa

Lactobacillus acidophilus” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Tạo vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus

theo phương pháp 2 giai đoạn

2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng

và các chất góp phần vào sự cân bằng vi sinh vật đường ruột” [15] Đến năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [27] Định nghĩa về probiotic này cũng được Hiệp hội khoa học quốc tế

về Probiotics và Prebiotics (ISAPP) áp dụng và được sử dụng trong hầu hết các ấn phẩm khoa học

Đối với chế phẩm probiotic, hiệu quả phụ thuộc vào liều lượng và khả năng tồn tại trong quá trình vận chuyển qua các điều kiện có tính acid của dạ dày, không bị thủy phân bởi enzym và muối mật trong ruột non [26], [36] Tuy nhiên, trong quá trình chế biến, bảo quản và sử dụng, probiotic bị ảnh hưởng bởi nhiều điều kiện bất lợi của quá trình sản xuất, của môi trường bên ngoài cũng như môi trường trong đường tiêu hóa [24] Vì vậy, để mang lại hiệu quả, vi sinh vật phải ổn định trong chế phẩm trong suốt quá trình bảo quản, duy trì số lượng sống sót ở mức tối thiểu là 107-109 CFU/g [14]

1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến

Các tính chất quan trọng nhất của chủng giống để sử dụng sản xuất probiotic bao gồm: đề kháng với acid dạ dày (pH 1-4), kháng acid mật, bám dính chất nhầy và/hoặc tế bào biểu mô ở người và các dòng tế bào, hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn hoặc nấm gây bệnh bám dính vào bề mặt, hoạt tính hydrolase muối mật, tăng cường khả năng tồn tại của các chế phẩm sinh học [51]

Hiện nay, chiếm thành phần đông đảo nhất trong số các probiotic là các vi

khuẩn thuộc hai chi Lactobacillus và Bifidobacterium Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột Trong đó, một số loài tiêu biểu bao gồm L acidophilus, L gasseri, L

rhamnosus, B longum, B bifidum [36]

Ngoài ra, các đại diện của các chi Enterococcus, Streptococus, Pediococcus,

Leuconostoc, Bacillus cũng được sử dụng nhưng ít hơn Bên cạnh những vi khuẩn còn

có nấm men Saccharomyces cũng được xếp vào nhóm vi sinh vật probiotic [51], [39]

1.1.3 Các thế hệ bào chế của chế phẩm probiotic

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, số lượng vi sinh vật còn sống có khả năng vận chuyển đến cơ quan đích để gây ra tác dụng có lợi là rất thấp Nhiều yếu tố bất lợi như acid, nồng độ oxy,… đã ảnh hưởng đến sự tồn tại của VSV trước khi chúng đến được

vị trí tác dụng [5] Vì vậy, để bảo vệ VSV, các nhà sản xuất đã nghiên cứu và đưa ra thị trường các chế phẩm probiotic ngày càng cải thiện Trong đó:

Thế hệ 1: Không bao, dạng bào chế gồm bột và cốm, đơn loài Nhược điểm của dạng bào chế này là vi khuẩn hầu như không thể sống sót khi đi qua dạ dày

Thế hệ 2: Không bao, dạng bào chế nang cứng, đơn và đa loài Vi khuẩn được đưa vào dưới dạng bột đóng trong nang cứng, vẫn chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường bên ngoài tác động khiến suy giảm số lượng VSV

Thế hệ 3: Bao tan trong ruột Vi khuẩn chứa trong nang có lớp bảo vệ chỉ tan trong ruột, hầu hết probiotic được xử lý với một polyme acrylic acid Tác nhân bảo vệ này chỉ được cho phép sử dụng trong dược phẩm, không thích hợp cho thực phẩm bổ sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ

Thế hệ 4: Vi nang hóa, tan trong ruột Phương pháp này sử dụng chất tạo màng

là các polyme có nguồn gốc tự nhiên để giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi môi trường xung quanh như acid cao, pH thấp, muối mật hoặc sốc nhiệt

Thế hệ 5: Bao kép, giải phóng VSV ở ruột Lớp bao thứ nhất – lớp trong cùng

là hệ thống peptid/protein, phóng thích vi khuẩn căn cứ vào độ pH của môi trường Nó bảo vệ vi khuẩn trong suốt quá trình tiêu hóa, giúp vi khuẩn vẫn còn sống khi đến ruột

và trong điều kiện tốt vi khuẩn sẽ định cư và tăng sinh Lớp bao thứ hai, với hệ thống polysaccharid và hydrocolloid, giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại tác động của độ ẩm, nhiệt độ, áp suất… Lớp này làm tăng độ ổn định của vi khuẩn trong suốt quá trình sản xuất và thời hạn sử dụng của sản phẩm

1.2 Loài Lactobacillus acidophilus

1.2.1 Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy

Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, nhóm

vi khuẩn lactic (LAB), tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật, được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm probiotic [4]

Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn hình que, Gram dương, kích thước

thường là 0,6-0,9 × 1,5-6,0 𝜇𝑚, tồn tại đơn lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm tính Nhiệt độ tối

ưu cho sự phát triển là 37ºC, tối đa trong khoảng 43-48ºC, không phát triển trong khoảng 20-22ºC, có khả năng chịu được điều kiện pH khoảng 5,0 đến 6,0 trong 24-36 giờ, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic [28]

Khả năng sống sót của L acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ,

pH, nồng độ acid lactic và acid acetic, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản) Trong đó, nồng độ oxy hòa tan có vai trò đáng

kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L acidophilus Nhược điểm này khiến số lượng L acidophilus sống sót bị giảm đáng kể sau một thời gian bảo quản [38], [42]

Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

1.2.2 Vai trò

Lactobacillus acidophilus đem lại nhiều tác động có lợi đối với sức khỏe vật

chủ Tính chất bám dính và khả năng liên kết với nhau của L acidophilus chính là cơ chế hữu hiệu để hạn chế vi khuẩn có hại Khi L acidophilus vào trong cơ thể, chúng

định cư ở ruột, cạnh tranh vị trí bám trên thành ruột với vi khuẩn có hại, làm giảm số

lượng vi khuẩn gây hại ở ruột non L acidophilus có thể sinh ra acid lactic, tạo môi

trường acid yếu, môi trường này là điều kiện thuận lợi cho hệ lên men đường ruột

nhưng lại bất lợi cho các vi sinh vật gây bệnh [28] Ngoài ra, chúng còn có thể sản xuất được các chất diệt khuẩn như lactocidin, bacteriocin giúp ngăn cản sự xâm nhập

và ức chế tăng sinh các vi khuẩn gây bệnh Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị đã

làm giảm một lượng lớn VSV có lợi trong đường ruột, do đó, bổ sung L acidophilus

làm cân bằng hệ VSV đường ruột, giúp cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy đặc biệt là tiêu chảy do kháng sinh [40] Một số nghiên cứu đã chỉ

ra tác dụng của L acidophilus trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Helicobacter pylori, một trong những nguyên nhân gây ra bệnh viêm loét dạ dày tá

tràng [59] Ngoài ra, L acidophilus còn có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, giúp

làm giảm 6-10% nguy cơ mắc các bệnh mạch vành [17]

1.2.3 Các chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus hiện nay

Hiện nay, L acidophilus được sử dụng rộng rãi làm chế phẩm probiotic đơn lẻ

hoặc phối hợp, giúp điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa, hỗ trợ tiêu hóa cho các đối tượng kém ăn, chậm phát triển như:

Chế phẩm men vi sinh Antibio Pro (Han Wha, Hàn Quốc) bào chế dưới dạng

bột pha hỗn dịch uống Mỗi gói chứa 75 mg L acidophilus tương đương với 108

CFU/g (theo thông tin ghi trên nhãn), hỗ trợ điều trị viêm ruột non, tiêu chảy do nhiễm khuẩn, rối loạn tiêu hóa do ngộ độc thức ăn, do dùng kháng sinh và hóa trị liệu dài ngày, dự phòng các biến chứng đường tiêu hóa

Chế phẩm Bifina là men vi sinh của Nhật Bản với công thức 3 trong 1: có chứa

2 lợi khuẩn chính trong đường ruột là: Bifidobacterium, Lactobaccillus và chất xơ hòa

tan (đường oligosaccharid) là thức ăn cho lợi khuẩn, giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, là nền tảng cho hệ tiêu hóa và hệ miễn dịch khỏe mạnh Dạng bào chế của chế phẩm là viên nang liền mạch, không vết nối, có màng kép kháng được acid dạ dày

và lớp màng siêu bảo vệ giúp đưa lợi khuẩn sống đi qua được môi trường acid dạ dày khắc nghiệt, xuống đến ruột non và đại tràng

Nhìn chung, các chế phẩm trên thị trường hiện nay rất đa dạng Trong đó, các chế phẩm được bào chế dưới dạng thuốc bột, cốm pha hỗn dịch, viên nang cứng có nhược điểm là dễ bị các yếu tố môi trường bên ngoài cũng như môi trường đường tiêu hóa tác động khiến số lượng bị suy giảm Để khắc phục nhược điểm đó, phương pháp

vi nang hóa, bao thêm các lớp bảo vệ đã và đang được nghiên cứu sâu rộng hơn, mang đến hiệu quả bảo vệ và tăng cường khả năng tồn tại của VSV trong chế phẩm

1.3 Tổng quan về vi nang hóa

1.3.1 Định nghĩa

Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, kích thước từ 0,1 µm tới 5 mm (thông thường từ 100 đến 500 µm) Dược chất (hoặc dược chất và tá dược) được bao bởi các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp [7]

Phương pháp vi nang hóa có thể được định nghĩa là một quá trình bẫy một chất (hoạt chất) trong một chất khác (vật liệu tường), tạo ra các hạt có đường kính từ vài

nm đến vài mm [60] Vi nang hóa probiotic là một trong những phương pháp cố định

tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay Trong đó, chất được bẫy là các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống; vật liệu tạo màng (tạo gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose,… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon, polyethylen glycon,… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống [7]

1.3.2 Đặc điểm của vi nang

Vi nang có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu giúp tế bào được cách ly với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào vi sinh vật, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như acid cao, pH thấp, muối mật, sốc nhiệt, và chỉ giải phóng tế bào tại nơi mong muốn [35] Ngoài ra vi nang hóa cũng giúp ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào trong quá trình lên men [18]

Vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào vi sinh vật Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải phóng vi sinh vật khi cần thiết Lớp màng phải có độ bền cơ học tương đối để có thể bảo vệ được các vi sinh vật sống bên trong, tuy nhiên lại không nên quá vững chắc gây ảnh hưởng đến sự giải phóng vi sinh vật khi cần thiết [8], [35]

Kích thước hạt vi nang cũng là một đặc điểm quan trọng Giữa kích thước hạt,

độ bền vững và khả năng giải phóng tế bào có mối quan hệ với nhau Kích thước hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ vi sinh vật càng cao nhưng giải phóng vi sinh vật chậm và khó khăn Ngược lại, kích thước hạt nhỏ thì độ bền cơ học của hạt thấp, khả năng chứa và bảo vệ vi sinh vật giảm nhưng khả năng giải phóng

vi sinh vật thì nhanh và dễ dàng hơn

Vi sinh vật được giải phóng theo các cơ chế như: gãy vỡ màng, hòa tan màng hoặc khuếch tán qua màng,… [8], [35]

1.3.3 Ưu điểm của vi nang

Vi nang giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi các yếu tố bất lợi của môi trường như nhiệt

độ, độ ẩm cao, oxy và điều kiện acid ở dạ dày [5], [29] Ngoài ra, vi nang làm ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt của các chất ức chế có trong môi trường lên men do đó làm tăng độ ổn định và kéo dài khả năng tồn tại của vi khuẩn Trong vi nang, khả năng tồn tại của vi khuẩn được tăng lên, tạo điều kiện để điều khiển tế bào và cho phép kiểm soát liều lượng Vi nang cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của VSV, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [35], [46]

Vi nang hóa dự kiến sẽ kéo dài thời hạn sử dụng của các chế phẩm sinh học ở nhiệt độ phòng, tăng khả năng chịu nhiệt, chịu nén, chịu biến dạng và chịu acid [49] Với ưu điểm có thể bảo vệ được vi sinh vật và protein khỏi ảnh hưởng bởi các tác nhân bên ngoài môi trường, vi nang hóa được ứng dụng nhiều trong việc bao gói vi sinh vật

để tạo chế phẩm probiotic

1.3.4 Nhược điểm của vi nang

Tế bào vi sinh vật sản sinh ra nhiều enzym trong quá trình trao đổi chất của nó,

có những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp bao gói và cả chính tế bào Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật thích hợp (có thể biến đổi hoặc xử lý giống) để hạn chế tế bào tạo ra các enzym không mong muốn và tăng hoạt tính của các enzym mong muốn

Phần lớn các vật liệu sử dụng trong quá trình tạo vi nang như thạch, gelatin… đều là những nguồn dinh dưỡng mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được Điều này dẫn đến

vi sinh vật được bao gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm đáng

kể [49]

1.3.5 Phương pháp vi nang hóa

Có nhiều phương pháp để bao gói probiotic trong vi nang đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công bố Việc lựa chọn phương pháp chế tạo vi nang phụ thuộc vào điều kiện thực tế như độ tan, tính tương đồng, kích thước vi nang… [7]

Các phương pháp vi nang hóa có thể được phân loại như sau:

 Phương pháp hóa lý: đông tụ (đơn giản, phức hợp): các polyme không tương thích, bốc hơi dung môi, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn…

 Phương pháp vật lý: ly tâm, bao tầng sôi, xát hạt tầng sôi, máy quay tròn, nồi bao viên thông thường, phun sấy…

 Phương pháp hóa học: polyme hóa (tương tác các polyme, polyme hóa bề mặt…)

1.3.6 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ

Phương pháp nhỏ giọt đông tụ là một kỹ thuật ion hóa cố định gel Phương pháp này bao gồm việc chuẩn bị một dung dịch chất keo thân nước (thường sử dụng các polyme có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm gellan…), bổ sung VSV rồi được đùn (nhỏ giọt) qua một hệ thống kim,

để rơi tự do vào một dung dịch hóa rắn, hình thành nên các hạt vi nang Bản chất của quá trình này là khi nhỏ dung dịch keo thân nước vào dung dịch hóa rắn, trong đó có các cation hóa trị cao khiến cho dung dịch keo thay đổi cấu trúc, xảy ra hiện tượng đông tụ, hóa rắn tạo vi nang [54]

Kích cỡ và hình dạng của vi nang thu được phụ thuộc vào đường kính của kim, khoảng cách giữa đầu kim và dung dịch hóa rắn, tốc độ nhỏ giọt, nồng độ alginat và trọng lượng phân tử của natri alginat [48]

Phương pháp này có ưu điểm là quy trình thực hiện đơn giản, tiết kiệm chi phí, quá trình thực hiện không gây ảnh hưởng nhiều đến sự sống sót của vi khuẩn như một

số phương pháp khác Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là khả năng bao gói còn thấp [53]

1.4 Một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotic

1-4-Alginat được chiết xuất từ rong biển nâu, với ưu điểm không độc, tương đồng sinh học cao, giá thành rẻ nên alginat có tính thương mại nhất trong ngành thực phẩm, được sử dụng rộng rãi, an toàn để bao gói các chất đại phân tử, tế bào [30]

Hình 1.2 Cấu trúc của alginat

b Đặc điểm của alginat ứng dụng trong bào chế vi nang

Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị

II như Ca2+

, Ba2+, Sr2+… Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại khối M là các dải hẹp và khối G là các dải gấp khúc Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị ở nồng độ thích hợp, các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian trống, tạo nên cấu trúc “hộp trứng” [32] Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian 3 chiều, xảy ra hiện tượng đông rắn [19], [30] Quá trình gel hóa này giúp cho tế bào được nhốt trong các mạng lưới alginat mà vẫn duy trì chức năng sinh học [31] Khi tạo vi nang calci alginat bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ, nhỏ dung dịch natri alginat vào dung dịch Ca2+, ban đầu calci alginat sẽ hình thành vào tạo nên sự hóa rắn bề mặt Tiếp theo, ion Ca2+

sẽ thấm dần vào lớp alginat, tạo gel và cứng dần [16]

Hình 1.3 Sự hình thành và cấu trúc của calci alginat

Ưu điểm của vi nang calci alginat: (1) calci alginat không độc khi sử dụng theo đường uống và có tác dụng bảo vệ niêm mạc của đường tiêu hóa trên; (2) cấu trúc của calci alginat là màng gel bán thẩm thấu, lớp màng có độ ổn định cao, giúp làm lá chắn chống lại các tác nhân bất lợi bên ngoài môi trường và giải phóng vi sinh vật một cách

có kiểm soát; (3) sự trương nở của calci alginat phụ thuộc vào pH, do đó có thể bảo vệ

vi sinh vật khỏi tác động của acid dạ dày [19], [30]; (4) quá trình vi nang hóa VK bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến VK sống Nhờ những ưu điểm trên, alginat là một trong những nguyên liệu phù hợp trong việc bào chế vi nang

1.4.2 Tinh bột

Tinh bột là một polysaccharid được cấu tạo từ amylose và amylopectin Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ α-D glucose Các gốc glucose trong amylose kết hợp với nhau qua liên kết α-1,4-glucosid Amylopectin có cấu trúc phân nhánh, ngoài liên kết α-1,4-glucosid còn có các liên kết α-1,6-glucosid ở điểm phân nhánh Tỉ lệ amylose/amylopectin trong đa số tinh bột là 1⁄4 [50]

Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, có tính tương hợp sinh học Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch, được sử dụng làm tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể được phân hủy bởi α-amylase [21]

Tinh bột là một tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế làm giảm lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào trong mẫu [43] Khi tạo vi nang calci alginat, tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện thể chất của vi nang sau đông khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện khả năng sống sót trong quá trình đông khô và bảo quản [11], [21], [41]

1.4.3 Chitosan

a Nguồn gốc

Chitosan là một polyaminosaccharid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của N-acetylglucosamin và dẫn xuất đường glucose [55] Khi mức độ deacetyl hóa của chitin đạt khoảng 50% (tùy thuộc vào nguồn gốc của polyme), nó có khả năng tan được trong dung dịch có tính acid và được gọi là chitosan [37]

pH ˂ 6,5 do trong môi trường acid, những nhóm amin (các tiểu đơn vị glucosamin) của chitosan nhận proton tạo thành dạng polysaccharid tích điện dương tan được Chitosan không tan trong môi trường trung tính và kiềm [55]

Với ưu điểm là độc tính thấp, tương hợp sinh học cao với tế bào vi khuẩn và tự phân hủy được nên chitosan thường được dùng làm chất mang trong công nghệ dược phẩm

Trong bào chế vi nang probiotic, chitosan có vai trò cung cấp một lớp bao phủ hiệu quả, hạn chế các tác động bất lợi của acid dạ dày, đảm bảo VSV có thể đi qua đường tiêu hóa đến ruột già mà vẫn đủ số lượng VSV cần thiết phát huy tác dụng [16]

1.5 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang calci alginat phối hợp với tinh bột và chitosan

Vi nang hóa là một trong những phương pháp hiện đại nhất có tác dụng đáng kể đối với sự sống còn của probiotic Với những lợi ích vượt trội đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cả trong nước và trên thế giới

Trên thế giới

Khosravi Zanjani và cộng sự đã tiến hành bao gói vi khuẩn L casei và B

bifidum trong vi nang calci alginat – tinh bột, bao lớp chitosan bên ngoài, dẫn đến số

lượng tế bào sau khi thử nghiệm trên đường tiêu hóa mô phỏng (cùng với pepsin và pancreatin) cao hơn so với các tế bào tự do Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, calci alginat dễ

bị phân hủy khi có các ion đơn dòng dư thừa, các chất liên kết Ca2+ như phosphat, citrat và các điều kiện khắc nghiệt như pH thấp Do đó, vi nang đã được bao lớp chitosan để tạo ra tác dụng bảo vệ tốt hơn [41]

Năm 2016, Iyer C và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu vi nang calci alginat –

tinh bột bao chitosan chứa L casei, đánh giá khả năng giải phóng và bảo vệ của

probiotic khi đi qua môi trường mô phỏng dạ dày – ruột Kết quả vi nang tạo ra sự bảo

vệ probiotic tốt tại dạ dày, tối đa hóa số lượng VSV tại ruột và không có sự giải phóng VSV đáng kể tại dạ dày sau 24 giờ ủ [33]

Paulraj Kanmani và cộng sự đã tạo vi nang alginat bao chitosan để bao gói

Enterococcus faecium MC13 với mục đích tăng cường sự tồn tại và giữ cho các tế bào

probiotic sống sót khi tiếp xúc với các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa Kết quả vi nang duy trì sự tồn tại cao hơn các tế bào probiotic ở -20°C trong 6 tháng Các

tế bào được bảo vệ khi tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng (pH 2,0) và dịch ruột mô phỏng (pH 7,5), sự sống còn tăng đáng kể khi so sánh với các tế bào tự do Khi thử

nghiệm in vivo, các vi nang bị vỡ và các tế bào probiotic được phóng thích trực tiếp

vào đường ruột của chuột [47]

Chandramouli V và cộng sự (2003) đã sử dụng vi nang calci alginat để bao gói

L acidophilus Thử nghiệm tại pH thấp (pH 2,0) và nồng độ mật cao (1,0% mật) trong

điều kiện bao gói tối ưu (alginat 1,8% (kl/tt), 109

CFU/ml, 30 phút ngâm trong CaCl2 0,1 M và kích thước vi nang 450 µm) Kết quả có sự gia tăng đáng kể số lượng tế bào sống sót so với các tế bào tự do trong điều kiện tương tự [22]

Tại Việt Nam

Tác giả Đàm Thanh Xuân và cộng sự (2016) đã tiến hành tạo vi nang L

acidophilus bổ sung thêm chitosan, glycerol, tinh bột theo phương pháp nhỏ giọt đông

tụ Đánh giá khả năng bảo vệ của vi nang ở môi trường pH 1,2 trong 1 giờ Kết quả cho thấy vi nang sử dụng các thành phần alginat, tinh bột, chitosan đều giúp khả năng

sống sót của L acidophilus trong môi trường acid dạ dày và trong thời gian bảo quản

tốt hơn [11] Trong một nghiên cứu khác (2017), tác giả đã tiến hành tạo vi nang alginat - tinh bột theo phương pháp đông tụ từ nhũ tương, bao chitosan với nồng độ

0,4% và 1,0% để bảo vệ vi khuẩn L acidophilus Kết quả nghiên cứu cho thấy: Trong

môi trường acid pH 2,0 vi nang bao chitosan bảo vệ VSV tốt hơn vi nang không bao, sau 90 phút mật độ vi khuẩn sống sót còn 108 CFU /g Bao chitosan không ảnh hưởng nhiều đến khả năng giải phóng vi sinh vật trong môi trường kiềm: Sau 2 giờ ủ trong đệm phosphat pH 7.4 vi nang bao 0,4% chitosan giải phóng được 88% vi khuẩn, tương đương với vi nang không bao; vi nang bao 1,0% chitosan giải phóng VSV chậm hơn [10]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương)

2.1.2 Hóa chất

Bảng 0.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Glucose Trung Quốc Natri acetat Trung Quốc Pepton Ấn Độ Natri citrat Trung Quốc Cao thịt Merck -Đức Natri alginat Ấn Độ

Cao nấm men Merck -Đức Calci clorid Trung Quốc

KH2PO4 Trung Quốc Acid acetic băng Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc Chitosan Đức

MnSO4.4H2O Trung Quốc Thạch (Agar) Việt Nam Natri clorid Trung Quốc Pepsin Anh

Triamoni citrat Trung Quốc Pancreatin Ấn Độ

Tinh bột sắn Việt Nam

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

pH

5 g

2 g 0,2 g 0.05 g

1000 ml 6,8-7,0

b Môi trường MRS thạch (MT 2):

MT 2 = MT 1 + thạch 2% (20 g thạch/1.000 ml môi trường)

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ

 Thiết bị

Bảng 0.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Cân kỹ thuật Đức (Satorious) Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP)

Kính lúp soi nổi Nhật (Nikon) Tủ ấm CO2 Nhật (Sanyo)

Máy đo hàm ẩm Mỹ (Ohaus) Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo)

Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd) Tủ lạnh bảo quản Hàn Quốc (LG) Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc (KWF) Tủ sấy Hàn Quốc (Daihan) Máy ly tâm Đức (Satorious) Thiết bị đông khô Đức (Christ Alpha) Máy lắc (Votex) Trung Quốc (IKA) Máy đo phổ IR Nhật (Jasco)

2.1.5 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

- Dung dịch alginat 3% (kl/tt): cân 3,00 g natri alginat, phân tán đều trong 100 ml nước cất Đem hấp tiệt trùng ở 115ºC trong 20 phút cho alginat đồng nhất

- Dung dịch acid acetic 0,5% (kl/tt): cân 0,50 g acid acetic băng, pha loãng với nước vừa đủ 100 ml

- Dung dịch chitosan 0,5% (kl/tt) trong acid acetic 0,5% (kl/tt), pH 5,5-6,0: cân 0,50 g chitosan, hòa tan vào khoảng 90 ml acid acetic 0,5% Điều chỉnh pH 5,5-6,0 bằng NaOH 1 M và HCl 1 M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml

- Dung dịch natri citrat 2% (kl/tt): cân 2,00 g natri citrat, hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml

- Dung dịch calci clorid (CaCl2) 2% (kl/tt): cân 2,00 g CaCl2, hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml

- Dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt): cân 0,90 g NaCl, hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp 2 giai đoạn

 Tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan chứa Lactobacillus acidophilus

theo phương pháp 2 giai đoạn

 Đánh giá thể chất của vi nang sau đông khô

 Định tính sự có mặt của chitosan trong vi nang sau đông khô

 Đánh giá độ ổn định của vi nang trong quá trình bảo quản

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang calci alginat - tinh bột bao chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng

 Định tính chitosan trên vi nang Alg-TB bao chitosan sau khi thử nghiệm trong

dịch dạ dày mô phỏng

 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang Alg-TB bao chitosan trong dịch tiêu hóa mô phỏng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn

2.3.1.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được gói kín bằng giấy bạc hoặc đựng trong bình nón, đậy kín bằng nút bông, sau đó tiệt trùng trong nồi hấp tiệt khuẩn ở 115ºC trong 20 phút

2.3.1.2 Phương pháp Tyndall tiệt khuẩn tinh bột

Cân một lượng tinh bột nhất định cho vào bình nón, đậy kín bằng nút bông, đun cách thủy ở 70-80ºC trong 1 giờ, ủ bình trong tủ ấm ở điều kiện 37ºC trong 24 giờ Lặp lại thao tác trong 3 ngày liên tục

2.3.2 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan, phân tán hết các thành phần Phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10 ml MRS lỏng Đậy kín bằng nắp ống nghiệm Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37-40°C Cấy giống vào những ống nghiệm trên Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37±1°C

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan, phân tán hết các thành phần Đong 100 ml môi trường vào bình nón dung tích phù hợp Đậy kín bằng nút bông không thấm nước Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37-40°C Cấy giống từ ống nghiệm vào những bình nón trên, mỗi bình 1 ống giống 10 ml Ủ các bình nón đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37±1°C

2.3.4 Phương pháp tạo vi nang calci alginat – tinh bột bao chitosan 2 giai đoạn

 Sinh khối VSV:

Nuôi cấy tế bào ở tủ ấm CO2 5%, nhiệt độ 37ºC trong 24 giờ (phương pháp nêu

ở mục 2.3.3) Dịch nuôi cấy VSV cho vào ống ly tâm đã hấp tiệt khuẩn, ly tâm với tốc

độ 4.000 vòng/phút trong 10 phút Bỏ dịch trong, thu lấy phần sinh khối bằng máy lắc (Vortex)

 Tạo hỗn dịch polyme:

Hỗn dịch natri alginat – tinh bột chứa VSV: Pha dung dịch natri alginat 3% (cách pha như đã nêu ở mục 2.1.5), hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, để nguội Phân tán tinh bột đã tiệt khuẩn (theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.1.2), sấy khô với nồng độ 10% (kl/tt) và sinh khối vào dung dịch natri alginat, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 20 phút

 Chuẩn bị dung dịch calci clorid và dung dịch chitosan:

Pha dung dịch CaCl2 2%, dung dịch NaCl 0,9% và dung dịch chitosan 0,5% trong dung dịch acid acetic 0,5% (cách pha như được nêu ở mục 2.1.5), hấp tiệt khuẩn

ở 115°C trong 20 phút, để nguội

 Tạo vi nang calci aginat – tinh bột bao chitosan 2 giai đoạn

Giai đoạn 1:

Hỗn dịch gel chứa VSV được nhỏ qua một pipet pasteur, kích thước đầu pipet

cỡ 2 mm xuống dung dịch calci clorid 2% tạo thành các hạt hình cầu Để yên 30 phút cho hạt ổn định, sử dụng lưới vớt hạt đã tiệt trùng để thu vi nang, rửa hạt 3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% đã hấp tiệt trùng và làm nguội

Giai đoạn 2:

Tiến hành bao chitosan cho vi nang bằng cách ngâm toàn bộ lượng vi nang đã rửa sạch ở trên vào dung dịch chitosan 0,5% trong acid acetic 0,5% pH 5,5-6,0 (phương pháp nêu ở mục 2.1.5) đã tiệt trùng trong nồi hấp ở 1150C trong 20 phút, để nguội Ngâm vi nang 30 phút, sau đó vớt lấy hạt, rửa vi nang 3 lần bằng dung dịch natri clorid 0,9%

Toàn bộ quá trình tạo vi nang tiến hành trong tủ vô trùng

2.3.5 Phương pháp đông khô

Tiền đông: vi nang được đựng trong đĩa petri hoặc lọ thủy tinh đã rửa sạch và

tiệt khuẩn, sau đó đông lạnh vi nang trong tủ lạnh sâu ở -70oC trong 24h cho đông rắn hoàn toàn

Làm khô: các mẫu sau khi tiền đông ở tủ lạnh sâu được làm khô trong không

gian lạnh của máy đông khô ở nhiệt độ khoảng -50oC, áp suất 0,100 mbar trong 24h

Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, chuyển các mẫu nguyên liệu từ đĩa petri vào lọ thủy tinh kín, bảo quản ở nhiệt độ khoảng 2-8oC, độ ẩm tương đối 30%

2.3.6 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV

 Chuẩn bị

Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS thạch (đã nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan các thành phần tan trong nước, chuyển dung dịch trên vào bình nón thích hợp, phân tán thạch vào dung dịch Đậy kín bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn ở 115oC trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn

và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2 mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín

Chuẩn bị các ống nghiệm sạch mỗi ống chứa 9 ml nước cất, đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115oC trong 20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37-40oC

 Xác định số lượng VSV trong 1,00 g vi nang

Thao tác phá hạt vi nang: Chuẩn bị bình nón chứa 100 ml dung dịch natri citrat 2%, hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội Cân chính xác 1,00 g hạt vi nang cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 20 phút ở nhiệt độ phòng đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất

Hút chính xác 1,00 ml dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào, pha loãng vào ống nghiệm thứ nhất chứa 9 ml nước cất đã tiệt trùng, lắc đều Sau đó lại hút chính xác 1,00 ml dịch đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ pha loãng cuối cùng Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,20 ml dịch trong các ống của 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 37±1°C Sau 48 giờ đếm

số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa petri và lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc trong các đĩa ở cùng nồng độ pha loãng

Số lượng VSV có trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu được tính theo công thức:

X: số VSV có trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu (CFU/g hoặc CFU/ml)

An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa petri cấy ở nồng độ pha loãng 10nm: khối lượng mẫu cân để xác định số lượng VSV (g)

V: thể tích dịch cấy trải lên mỗi đĩa petri (ml) [2]

Lặp lại thí nghiệm 3 lần, tính kết quả trung bình

2.3.8 Phương pháp xác định hoạt độ nước của vi nang

Chuẩn bị khoảng 0,50 g vi nang, đóng kín trong lọ thủy tinh có nắp cao su, bọc nắp nhôm Tiến hành đo hoạt độ nước vi nang trên máy đo hoạt độ nước Hygrolab (Thụy Sỹ) tại Viện Công nghiệp Thực phẩm

2.3.9 Phương pháp xác định hình ảnh và kích thước vi nang

Chụp bằng kính lúp soi nổi có kết nối máy tính và máy ảnh

Cho mẫu vi nang lên phiến kính, đặt vào vùng đặt mẫu của kính Chỉnh độ phóng đại, vi trường cho hình ảnh rõ nét Chụp lại hình ảnh soi được bằng phần mềm

có sẵn trong máy tính Đo kích thước 10 vi nang và tính kết quả trung bình

2.3.10 Phương pháp định tính chitosan trên vi nang bằng đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR)

Vi nang sau khi đông khô được nghiền mịn và trộn đều với bột KBr trong cối

mã não theo tỉ lệ 1/200 Hỗn hợp bột được ép thành viên mỏng bằng bơm thủy lực, sau

đó đo phổ IR bằng máy Jasco Quá trình tiến hành tại phòng thí nghiệm của Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia

2.3.11 Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV trong môi

trường dịch tiêu hóa mô phỏng

Chuẩn bị môi trường dịch tiêu hóa mô phỏng theo Dược điển Việt Nam V [1]

- Dịch dạ dày mô phỏng (SGF): Hòa tan 2,00 g NaCl vào 900 ml nước, điều

chỉnh pH 3,0 bằng HCl 0,1 N, thêm nước vừa đủ 1000 ml, đem hấp tiệt khuẩn ở 115ºC trong 20 phút Hòa tan thêm 3,20 g pepsin (có nguồn gốc từ niêm mạc dạ dày với hoạt tính từ 800 đến 2500 đơn vị mỗi mg protein) vào dung dịch trên

- Dịch ruột mô phỏng (SIF): Hòa trộn 250 ml dung dịch chứa 6,80 g KH2PO4,

77 ml dung dịch NaOH 0,2 M và 500 ml nước, thêm nước vừa đủ 1000 ml, đem hấp tiệt khuẩn ở 115ºC trong 20 phút Bổ sung thêm 10 g pancreatin, trộn đều

Cho mẫu vi nang đã đông khô vào bình nón chứa dung dịch dạ dày mô phỏng (SGF) pH 3,0 đã hấp tiệt khuẩn để nguội Ủ vi nang 2 giờ trong máy lắc ở 37ºC, tốc độ

75 vòng/phút Sau 2 giờ, chuyển vi nang sang môi trường dịch ruột mô phỏng (SIF)

pH 6,8 đã được hấp tiệt khuẩn, tiếp tục lắc ở 37ºC, tốc độ 75 vòng/phút trong 1 giờ Sau 1 giờ, hút chính xác 1,00 ml dịch trên tiến pha loãng liên tục (phương pháp đã nêu

ở mục 2.3.6) để xác định số lượng VSV được giải phóng

Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy kết quả trung bình