Xây dựng quy trình định lượng bacoside a3 trong dược liệu rau đắng biển

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin trong rau đắng biển 4 1.2 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có agly

HÀ NỘI – 2018

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Tuấn Hiệp

2 TS Trần Nguyên Hà

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2 Khoa CNCX – Viện Dược Liệu

HÀ NỘI – 2018

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành khóa luận này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản

thân, em còn may mắn nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ của mọi người xung

quanh Em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã dạy

dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy TS Nguyễn Tuấn

Hiệp, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, dạy bảo em trong

suốt quá trình nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn cô TS Trần Nguyên Hà,

người đã tạo điều kiện, và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị khoa Công Nghệ Chiết Xuất, Viện

Dược Liệu, đặc biệt là chị Đỗ Thị Thùy Linh, người đã luôn theo sát giúp đỡ em

Chân thành cảm ơn ban giám đốc Viện Dược Liệu đã cho em cơ hội thực tập tại

viện

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội,

các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho

em trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn động viên

khích lệ, trợ giúp cho em về mọi mặt để em có được kết quả ngày hôm nay

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Sinh viên Vương Hùng Mạnh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về loài Bacopa monnieri 2

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Bacopa monnieri 2

1.1.2 Bộ phận sử dụng 2

1.1.3 Thành phần hóa học 2

1.1.4 Tác dụng dược lý 5

1.2 Tổng quan về phương pháp HPLC 7

1.2.1 Nguyên tắc hoạt động 7

1.2.2 Cấu tạo HPLC 8

1.3 Phương pháp chiết xuất và phân tích định lượng bacosid và bacosid A3 10

1.3.1 Phương pháp chiết xuất 10

1.3.2 Phương pháp phân tích định lượng 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng và hóa chất, thiết bị 15

2.1.1 Đối tượng 15

2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất 15

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích 16

2.2.2 Thẩm định phương pháp 16

2.2.2.1 Tính thích hợp của hệ thống 16

2.2.2.2 Tính đặc hiệu 16

2.2.2.3 Đường chuẩn 17

2.2.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 17

2.2.2.5 Độ lặp lại 18

2.2.2.6 Độ đúng 18

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng 20

3.1.1 Quy trình chiết xuất Bacosid A3 trong rau đắng biển 20

3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 23

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 27

3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống 27

3.2.2 Tính đặc hiệu 28

3.2.3 Đường chuẩn 29

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 30

3.2.5 Độ lặp lại 31

3.2.6 Độ đúng 31

3.3 Ứng dụng phương pháp trong định lượng Bacosid A3 trong một số mẫu rau đắng biển 32

3.4 Bàn luận 33

3.4.1 Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu rau đắng biển ở Việt Nam 33

3.4.2 Quy trình chiết xuất Bacosid A3 trong rau đắng biển 34

3.4.3 Phương pháp định lượng và thẩm định phương pháp 34

3.4.4 Hàm lượng Bacosid A3 trong một số mẫu thực 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of official

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Realtive Standard Deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Nội dung Trang

1.1 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

jujubogenin trong rau đắng biển

4

1.2 Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

pseudojujubogenin trong rau đắng biển

4

1.3 Cấu trúc các flavonoid trong rau đắng biển 5 1.4 Quy trình chiết xuất Bacosid trong các tài liệu tham khảo 10 3.1 Kết quả định lượng Bacosid A3 khi chiết bột rau đắng biển với

MeOH và EtOH

20

3.3 Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống 27 3.4 Thời gian lưu mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn 28 3.5 Mối tương quan giữa diện tích peak và nồng độ Bacosid A3 29 3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 31 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 32 3.8 Hàm lượng Bacosid A3 trong một số mẫu dược liệu rau đắng biển 33

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Nội dung Trang

1.2 Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 8

3.3 Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử dịch chiết bã dược

liệu sau 3 giờ chiết Soxhlet với hệ pha động ACN và TFA 0,05%

3.8 Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn; (b) mẫu thử và (c) mẫu thử thêm

chuẩn với hệ pha động ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (32:68)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là một loại thảo dược vị đắng, tính mát, có tác

dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng Ngày nay, ngoài việc sử dung rau đắng biển như một loại thức ăn, rau đắng biển được sử dụng như một vị thuốc trong các thang thuốc sắc, dịch ép tươi, tán bột sau phơi khô Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam hiện nay đã có một số chế phẩm đông dược được sản xuất từ vị thuốc này như: hoạt huyết bổ máu Đại Bắc, thông huyết Tuệ Linh, chế phẩm phối hợp Ginkgo Giloba 6000 mg và Brahmi 3000 mg, … Các nghiên cứu trong và ngoài nước đã cho thấy tác dụng nổi bật của rau đắng biển trên hệ thần kinh giúp cải thiện trí nhớ, tăng cường khả năng nhận thức, học hỏi là nhờ vào hoạt chất Bacosid với 5 loại chính có trong rau đắng biển gồm: Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid II, Bacopasid X

và Bacopasaponin C Trong đó, Bacosid A3 là một hoạt chất chiếm hàm lượng tương đối

lớn (chiếm 0,14-0,85% (kl/kl) ở loài B.monnieri tại các vùng khác nhau ở Ấn Độ, đồng

thời chiếm 29,45% (kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A

Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng Bacosid trong rau đắng biển còn chưa được tiêu chuẩn hóa Hơn nữa, trong dược điển Việt Nam IV chưa đề cập đến dược liệu rau đắng biển cũng như các thành phần hóa học trong dược liệu này Do đó, việc xây dựng phương pháp xác định hàm lượng các Bacosid trong rau đắng biển là rất cần thiết

Theo Dược điển Mỹ (USP 38) và Dược điển Ấn Độ (IP 2010), chất chuẩn Bacosid A3 được sử dụng để xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng tổng các loại Bacosid chính chiếm hàm lượng chủ yếu trong rau đắng biển Trong khuôn khổ khóa luận này, do

bị giới hạn về thời gian, kinh tế nên chúng tôi chỉ có thể định lượng hàm lượng một thành phần Bacosid A3, bước đầu làm cơ sở để định lượng 4 Bacosid còn lại Vì vậy, đề tài:

“Xây dựng quy trình định lượng Bacosid A3 trong dược liệu rau đắng biển (Bacopa monnieri)” được thực hiện với mục tiêu:

 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Bacosid A3 trong rau đắng biển bằng phương pháp HPLC

 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng Bacosid A3 trong một

số mẫu rau đắng biển thu hái ở Việt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về loài Bacopa monnieri

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Bacopa monnieri

Vị trí phân loại của loài Bacopa monnieri trong hệ thống phân loại thực vật học [33]:

mọc đứng, không lông Lá mọc đối, không cuống, thuôn hình muỗm, dài 8 – 12 mm, rộng

3 – 5 mm, gân chính giữa hơi khó thấy Hoa lưỡng tính, mọc riêng lẻ ở nách lá, có cuống dài 1 cm Năm lá đài không đều, cao 5 – 6 mm, 5 cánh hoa có màu tím nhạt, dính nhau ở thành ống Bốn nhị, bầu không lông Quả nang, hình trứng, nằm trong đài, có mũi, nhắn,

có vòi tồn tại Hạt nhiều, rất nhỏ, mùa hoa tháng 4 – 6 [3], [4], [6] Rau đắng biển là loài cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, ven bờ ruộng, bãi cỏ, bờ mương, cây ra hoa quả hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt (Hình 1.1)

Phân bố: Cây được trồng nhiều ở khắp các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc

và miền Nam [3]

1.1.2 Bộ phận sử dụng

Thu hái phần trên mặt đất, dùng tươi hay phơi khô [3]

1.1.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chính có tác dụng dược lý của Bacopa monnieri gồm các

triterpen tự do, saponin, alkaloid, flavonoid và các phenylethanoid glycosid

Hình 1.1: Rau đắng biển - Bacopa

monnieri [33]

a Saponin triterpenoid

Thành phần hóa học chính có hoạt tính trong B monnieri chính là các saponin có

cấu trúc nhân dammaran với aglycon là jujubogenin và pseudojujubogenin (Bảng 1.1 và

1.2)

Nghiên cứu về thành phần hóa học đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt đồng thời của

2 saponin là Bacosid A và Bacosid B [9], [12] Sau đó, các thành phần hóa học chính có

tác dụng cải thiện trí nhớ của B.monnieri đã được phân lập và xác định công thức Các

thành phần đó là Bacosid A và Bacosid B được phân lập đồng thời cùng nhau, chỉ khác

nhau ở độ quay cực [11]

Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng Bacosid A và Bacosid B không hoàn toàn là đơn chất mà là hỗn hợp của các saponin [21] Trong đó, Bacosid A cũng là thành phần hóa học trong rau đắng biển được nghiên cứu nhiểu nhất Hàm lượng Bacosid

A trong các bộ phận của rau đắng biển là khác nhau với hàm lượng cao nhất ở thân (9,54 mg/g) và thấp nhất ở hoa (1,91 mg/g) [27] Tuy nhiên, các thông tin cụ thể về hoạt tính sinh học của từng Bacosid vẫn chưa được làm rõ [22] Bacosid A là hỗn hợp của 4 triglycosidic saponin: Bacosid A3, Bacopasid X (jujubogenin), Bacopasid II và Bacosaponin C (pseudojujubogenin) với khoảng hàm lượng lần lượt là 0,14-0,85%; 0,05-0,72%; 0,12-0,69% và 0,05-0,44% (kl/kl) khi thu hái tại các vùng khác nhau ở Ấn Độ [8], [13] Trong đó, Bacosid A3 có công thức phân tử là: C47H76O18, khối lượng mol: 929,11 g/mol, là một chất bột trắng vô định hình, có nhiệt độ nóng chảy từ 244-250oC, có tính phân cực mạnh và hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như: MeOH, EtOH [39] Bacosid B là một hỗn hợp các aglycon là các jujubogenin hoặc pseudojujubogenin như: bacopasid N1, bacopasid IV (jujubogenin), bacopasid N2, bacopasid V (pseudojujubogenin) [16] Quy trình chiết xuất Bacosid trong rau đắng biển của một số tài liệu tham khảo được trình bày ở bảng 1.4 Ngoài ra, D-manitol và một saponin là hersaponin cũng đã được Sastri và cộng sự phân lập năm 1959 [37]

Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin

trong rau đắng biển [46]

Jujubogenin

1 Bacosid A3

β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-{α-L-arabinofuranosyl-(1→2)}-O-(β-D- glucopyranosyl)

2 Bacopasid N1 β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl

3 Bacopasid IV β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinofuranosyl

4 Bacopasid X

(Bacopasaponin C

isomer)

(1→3)}- α-L-arabinofuranosyl

α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{β-D-glucopyranosyl-Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

pseudojujubogenin trong rau đắng biển [46]

Pseudojujubogenin

5 Bacopasaponin C β-D-glucopyranosyl-(1→3)-{

α-L-arabinofuranosyl-(1→2)}- α-L-arabinofuranosyl

6 Bacopasid N2 β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl

7 Bacopasid II α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{

β-D-glucopyranosyl-(1→3)}- β-D-glucopyranosyl

8 Bacopasid V β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinofuranosyl

b Flavonoid

Ngoài các saponin đã được phân lập và xác định cấu trúc, Flavonoid được tìm thấy trong rau đắng biển là Luteonin và Apigenin (Bảng 1.3) Một số nhà khoa học đã tiến hành định lượng Luteolin trong các bộ phận khác nhau của rau đắng biển được thu hái tại các vùng khác nhau tại Ấn Độ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và thu

được kết quả hàm lượng Luteolin trong lá B.monnieri thu hái tại vùng Bhayander,

Maharashtra là 0,1691 ± 0,0024 mg/ 500 g; trong khi hàm lượng Luteolin định lượng

trong thân B.monnieri thu hái tại vùng Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/ 500 g

[45] Ngoài ra, hàm lượng Luteolin và Apigenin được định lượng trong dịch chiết MeOH

của B.monnieri lần lượt là 0,22% và 0,45% [31]

Bảng 1.3: Cấu trúc các flavonoid trong rau đắng biển

c Các thành phần khác:

Ngoài ra, rau đắng biển còn chứa các alkaloid như Hydrocotylin, Brahmin,

Herpestin và các glycosid như Asiaticosid, Thanakunicid [32], [37]

1.1.4 Tác dụng dược lý

a Theo y học cổ truyền:

Rau đắng biển có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng Toàn cây rau đắng biển được dùng chữa suy nhược thần kinh, mất trương lực cơ, động kinh, thao cuồng, mất tiếng, khản tiếng, viêm phế quản cấp, ho, hen, chữa bí đái, viêm gan, thấp khớp, rắn cắn và bệnh ngoài da như da sưng dày lên như da voi, lở, nhọt độc, ghẻ Ngày 6-12 g dạng thuốc sắc, dùng ngoài không kể liều lượng Ngoài ra, rau đắng biển có thể được dùng như rau sống hoặc nấu chín ăn [3]

Dịch chiết Brahmin từ cây rau đắng biển và một số dược liệu khác được sử dụng trong nền y học cổ truyền Ayurvedic (Ấn Độ) hàng thế kỷ nay như một thuốc bổ não để tăng cường trí nhớ, khả năng học tập và sự tập trung, giảm lo âu, trầm cảm và động kinh, suy giảm nhận thức [34]

b Theo y học hiện đại:

Theo các nghiên cứu trên thế giới, rau đắng biển có một số tác dụng dược lý chính như sau:

 Tác dụng chống vi khuẩn: Tác dụng chống vi khuẩn của dịch chiết B.monnieri

trong các dung môi khác nhau đã được đánh giá bởi Sampathkumar và cộng sự năm 2008 Kết quả cho thấy dịch chiết trong Diethyl ether có tác dụng chống lại vi khuẩn Gram (+)

(Staphylococcus aureus, trong khi dịch chiết bằng Ethyl acetat chống được vi khuẩn Gram (-) (Proteus vulgaris) [36] Ngoài ra, dịch chiết cồn có tác dụng diệt các loại nấm như Aspergillus niger, Candida albicans [20]

 Tác dụng chống ung thư: Dịch chiết cồn của cây rau đắng biển có tác dụng ức chế

sự phát triển của tế bào nuôi cấy sarcoma-180 bằng cách tác động lên quá trình sao chép DNA [15]

 Tác dụng trên hệ tim mạch: Alkaloid Bahmin được chiết từ rau đắng biển với liều 0,5 mg/ kg có tác dụng hạ huyết áp ở mèo, với liều nhỏ hơn gây tăng huyết áp nhẹ do co

mạch và kích thích cơ tim Tổng các thành phần chiết xuất từ B.monnieri có tác dụng trợ

tim, co mạch, ức chế hệ thần kinh – cơ [23]

 Tác dụng trên hệ thần kinh:

+ Tác dụng chống lo âu, trầm cảm: Các thành phần bacosid A và B, bacosid I,

bacosid II, và bacopasaponin C đã được chứng minh là có hoạt tính chống trầm cảm trên

mô hình chuột bơi cưỡng bức và mô hình treo đuôi chuột trong nghiên cứu của Zhon và cộng sự năm 2007 [46] Ngoài ra, Hersaponin - một loại glycosid được phân lập từ

B.monnieri, đã được chứng minh là có tác dụng an thần, chống lo âu [23]

+ Tác dụng chống động kinh: Nghiên cứu lâm sàng được thực hiện bởi Dhanasekaran và cộng sự năm 2007 cho kết quả về hiệu quả của dịch chiết B.monnieri

trong việc làm giảm các triệu chứng của động kinh [14] Một thí nghiệm khác nghiên cứu

về động kinh thùy thái dương (một hội chứng động kinh thường gặp) cho thấy hiệu quả

điều trị của B.monnieri và Bacosid A trên chuột bị động kinh [24]

+ Tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng nhận thức và học hỏi: B.monnieri có tác

dụng cải thiện trí nhớ có thể là do khả năng làm tăng tuần hoàn não bằng cách ức chế quá

trình oxy hóa ở não, đồng thời tăng nồng độ serotonin ở não [44] Nghiên cứu việc sử dụng sản phẩm từ B.monnieri trong điều trị rối loạn khả năng tập trung ở trẻ em (ADHD –

Attention-deficit hyperactivity disorder) được tiến hành kiểm soát ở đại học Y dược BRD tại Gorakhpur, kết quả thu được cho thấy sự gia tăng đáng kể trong việc nhắc lại câu văn,

tư duy logic và học tập theo cặp trong cả 19 trẻ được sử dụng Bacopa [38]

 Tác dụng trên hệ nội tiết: Dịch chiết cồn của lá B.monnieri tăng nồng độ hormone

tuyến giáp T4 (tới 41%) ở chuột đực thông qua tác dụng cường giáp theo kết quả nghiên cứu của Kar và cộng sự năm 2002 [19]

 Tác dụng trên hệ hô hấp: Dịch chiết của B.monnieri đã được chứng minh có tác

dụng giãn phế quản trên chuột bị gây mê [10]

 Tác dụng trên hệ tiêu hóa: Dịch chiết của cây B.monnieri sạch có tác dụng bảo vệ

và chữa lành vết loét đường tiêu hóa trên nhiều mẫu động vật khác nhau Cơ chế tác dụng được cho là gia tăng các yếu tố bảo vệ niêm mạc (bài tiết chất nhày, tăng tuổi thọ của tế bào niêm mạc, chống oxy hóa,…), giảm các yếu tố tấn công (sự bài tiết acid, pepsin) [35]

Dịch chiết B.monnieri có khả năng chống loét đại tràng bằng cách ức chế sự phát triển của Helicobacter pylori, tăng nồng độ prostaglandin E và Prostaglandin I2 ở đại tràng [17] Ngoài ra, khi uống dịch chiết cồn của B.monnieri sẽ tạo ra tác dụng bảo vệ gan bằng

cách chống lại sự suy giảm các emzyme chống oxy hóa ở gan (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase) theo nghiên cứu của Sumathy và cộng sự năm 2001 [40]

1.2.1 Nguyên tắc hoạt động

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó, mẫu lỏng hoặc rắn được hòa tan thành dung dịch thích hợp rồi đưa đi qua cột sắc ký bởi pha động (chất lỏng) Tốc độ di chuyển khác nhau phụ thuộc vào các tương tác: chất tan – pha tĩnh, chất tan – pha động và pha động – pha tĩnh, do đó các thành phần khác nhau trong dung dịch

chất phân tích sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau dẫn đến sự phân tách Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và chuyển qua bộ phận xử lí số liệu [1], [5], [18]

1.2.2.2 Bơm sắc ký lỏng

Hệ thống bơm sắc ký phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không đổi Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm Máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar (407 atm), tốc độ dòng từ 0,1 – 9,999 ml/phút Hệ thống được điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp 2 chế độ vận hành của pha động bao gồm:

 Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

 Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại dung môi được đặt trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình chạy sắc

ký theo chương trình đã định trước (chương trình dung môi)

Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [25]

- Lò cột: đảm bảo nhiệt độ ổn định cho cột

 Cột bảo vệ:

- Cột được nhồi các hạt nhồi cột và pha tĩnh tương tự như cột phân tích, nhưng ngắn hơn và rẻ hơn, dài 7,5 mm và giá chỉ bằng 1/10 cột phân tích thông thường; đặt trước cột sắc kí để loại bớt tạp và gia tăng tuổi thọ của cột phân tích

1.2.2.5 Detector

Là một bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất phân tích mà

sử dụng detector phù hợp Một số loại detector hiện đang được sử dụng:

 Detector quang phổ: Detector được sử dụng phổ biến nhất, hoạt động dựa trên sự

đo lường quang phổ, bao gồm sự hấp thụ UV-VIS và sự phát huỳnh quang Cấu tạo của Detector loại này gồm: nguồn sáng, bộ lọc ánh sáng, cách tử, buồng đo, mảng Diod

- Detector hấp thụ UV-VIS: áp dụng cho những chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến Khi dùng detector này quang phổ thu được là đồ thị của độ hấp thụ biến thiên theo thời gian rửa giải Giới hạn phát hiện từ 100pg – 1ng chất phân tích Thiết bị có sử dụng thêm mảng diod trong quá trình đo phổ có thể ghi lại

toàn bộ phổ, sắc ký đồ 3 chiều biểu thị độ hấp thụ là một hàm theo bước sóng và thời gian rửa giải

- Detector huỳnh quang (RF): sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang (tính chọn lọc) Đối với những chất có bản chất không phát huỳnh quang, cần tạo dẫn xuất của chất phân tích có khả năng bắt huỳnh quang

 Detector chỉ số khúc xạ (RI): thường dùng để định lượng các hợp chất đường

 Detector điện hóa: Detector hoạt động dựa trên nguyên tắc đo điện thế, độ dẫn, điện phân,…

1.3 Phương pháp chiết xuất và phân tích định lượng bacosid và bacosid A3

1.3.1 Phương pháp chiết xuất

Quy trình chiết xuất Bacosid trong dược liệu rau đắng biển của một số tài liệu tham khảo được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.4: Quy trình chiết xuất Bacosid trong các tài liệu tham khảo

Tài liệu

tham

khảo

Quy trình chiết xuất

[24] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được phơi khô, nghiền thánh bột

+ Dung môi sử dụng: EtOH 90%, Aceton

+ Số lần chiết: 3 lần

[26] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được rửa với nước, phơi khô và nghiền thành

bột thô

+ Dung môi sử dụng: Hexan, Aceton, MeOH, n-Butanol, nước

[28] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được rửa với nước và sấy khô ở 50oC/ 12 giờ

+ Dung môi sử dụng: MeOH

[29] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được ngâm với nước trong 24 giờ và phơi khô

+ Dung môi sử dụng: EtOH 95%

[30] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được ngâm với nước trong 24 giờ và ép loại bỏ

nước, phơi khô

+ Dung môi sử dụng: EtOH 95%, MeOH

[41] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được nghiền thành bột, rây qua rây 355

+ Dung môi sử dụng: MeOH 70%

[43] + Xử lý mẫu: Rau đắng biển được nghiền thành bột mịn

+ Dung môi sử dụng: MeOH

Nhận xét: Các phương pháp chiết được sử dụng để chiết Bacosid trong rau đắng biển là

chiết ngâm, chiết hồi lưu, chiết Soxhlet hay chiết bằng sóng siêu âm Các dung môi sử dụng chiết Bacosid trong các tài liệu tham khảo chủ yếu là MeOH và EtOH Ngoài ra, các

nghiên cứu [24], [26] trong quá trình chiết có sử dụng thêm n-Butanol, Aceton hoặc

Hexan để loại bỏ chất béo và tạp

1.3.2 Phương pháp phân tích định lượng

Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng bacosid trong rau đắng biển Một số chương trình chạy sắc ký trong các tài liệu tham khảo được tổng kết như sau:

 Theo tác giả Navneet Kumar M [28]:

- Điều kiện sắc ký:

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5µm

+ Pha động: ACN : TFA 0,1% (35:65, tt/tt)

- Kết quả: Bacosid A3 chiếm 29,45% (kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A

 Dược điển Anh (BP 2016) đưa ra điều kiện [41]:

- Điều kiện sắc ký:

+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)

+ Pha động đẳng dòng (isocratic): ACN : Na2SO4 (từ Na2SO4 khan 0,71%, kl/tt) (315 :

685, tt/tt), điều chỉnh về pH = 2,3 bằng acid sulfuric

+ Dung môi pha mẫu: MeOH 70%

 Dược điển Ấn Độ (IP 2010) đưa ra điều kiện [42]:

- Điều kiện sắc ký:

+ Cột thép không gỉ C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)

+ Pha động (Gradient): ACN : đệm H PO (pH = 2,8) theo chương trình:

Thời gian (phút) Đệm H 3 PO 4 (%, tt/tt) ACN (%, tt/tt)

 Dược điển Mỹ (USP 38) đưa ra điều kiện [43]:

Nhận xét:

+ Đối tượng rau đắng biển được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột

+ Các chương trình sắc ký đều sử dụng thành phần pha động chính là ACN cùng một dung dịch đệm có pH vùng acid, và chủ yếu chạy với chế đồ đẳng dòng pha động

+ Các điều kiện sắc ký trong các tài liệu tham khảo hầu hết đều sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, thể tích tiêm mẫu 20µl, tốc độ dòng 1,0 – 1,5 ml/phút và bước sóng phát hiện là 205 nm

+ Bacosid A3 chiếm hàm lượng tương đối lớn (29,45%, kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A

+ Các tài liệu tham khảo chỉ công bố thời gian lưu của các Bacosid khác so với BA3 cho thấy có thể sử dụng BA3 làm căn cứ để xác định các thành phần khác trong dược liệu rau đắng biển

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và hóa chất, thiết bị

2.1.1 Đối tượng

Các mẫu dược liệu rau đắng biển (Bacopa monnieri) sử dụng trong nghiên cứu

được thu hái và phơi khô tại “Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung bộ - Viện dược liệu” Các mẫu này đều được giám định tên khoa học tại khoa tài nguyên của Viện Dược Liệu lưu giữ tại khoa Công Nghệ Chiết Xuất – Viện Dược Liệu

2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất

 Chất chuẩn:

+ Bacosid A3 Trung Quốc (98%)

+ Bacopasid I Trung Quốc

 Dung môi, hóa chất:

+ Acetonitril (≥ 99,9 %), loại HPLC, Fisher, Mỹ;

+ Methanol (≥ 99,8 %), loại HPLC, Merck, Đức;

+ Acid trifluouroacetic (≥ 99,9 %), loại HPLC, Fisher, Mỹ;

+ Ethanol, methanol, đạt tiêu chuẩn phân tích (P.A), Trung Quốc;

+ Nước cất 2 lần

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị

 Máy siêu âm Daihan, Hàn Quốc

 Cân hàm ẩm OHAUS, Switzerland

 Tủ sấy Memmert, Đức

 Cân phân tích 4 số AND, Nhật Bản

 Máy chiết béo Soxhlet 148 Velp, Italy

 Máy HPLC UFLC Shimadzu, Nhật Bản

 Các dụng cụ khác: Bình định mức, Micropipet 100-1000 µl, ống đong, cồn kế, …

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích

Dựa trên các tài liệu tham khảo về điều kiện chiết Bacosid trong rau đắng biển (Bảng 1.4), chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện chiết mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký

để xây dựng phương pháp phân tích

Khảo sát điều kiện chiết mẫu:

 Dung môi chiết: Khảo sát các dung môi: MeOH, EtOH 96o, EtOH 50o, nước Lựa chọn dung môi và nồng độ tại đó cho hiệu suất chiết cao nhất

 Thời gian chiết: Chiết mẫu với các thời gian khác nhau Lựa chọn thời gian chiết tại đó Bacosid A3 được chiết kiệt và tiết kiệm thời gian nhất

Lựa chọn điều kiện sắc ký:

 Cột sắc ký: Sử dụng cột sắc ký pha đảo có sẵn tại phòng thí nghiệm: Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

 Bước sóng phát hiện: Khảo sát bước sóng tối ưu với điều kiện phân tích

 Thể tích tiêm, tốc độ dòng, nhiệt độ cột: Khảo sát thể tích tiêm và tốc độ dòng tối

ưu cho peak sắc ký rõ nét, thời gian lưu hợp lý

 Pha động: Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động

2.2.2 Thẩm định phương pháp [7]

2.2.2.1 Tính thích hợp của hệ thống

Xác định bằng cách lặp lại 6 lần một mẫu chuẩn có nồng độ chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích peak của các lần sắc ký

Yêu cầu: Chênh lệch diện tích peak, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một

mẫu biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD không lớn hơn 2%

2.2.2.2 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các chất tương

tự, tạp chất,… Trong phép phân tích định lượng, đó là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác Sau khi chuẩn bị mẫu thử, phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký thu được peak sắc

ký, ta thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này Đánh giá tính đặc hiệu bằng cách tiến hành so sánh sắc ký đồ của hai mẫu: Mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn

Yêu cầu: Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn phải tương đồng nhau,

trong đó peak của Bacosid A3 phải tương tự nhau về thời gian lưu và chỉ khác nhau về diện tích peak Đồng thời, phổ tại các điểm trên peak của Bacosid A3 thuộc hai sắc ký đồ phải giống nhau về hình dạng và số đỉnh hấp thụ cực đại

2.2.2.3 Đường chuẩn

Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn Bacosid A3 pha trong MeOH: 25, 50, 100, 200,

250, 500 µg/ml, từ chuẩn Bacosid A3 1 mg/ml Tiến hành đo các mẫu dung dịch chuẩn đã chuẩn bị Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ (trục hoành x) Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính (y = ax + b) bằng Microsoft office Excel

Yêu cầu: Hệ số tương quan R: 0,995 ≤ R ≤ 1

Độ chệch giữa các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn ∆ i = Ct−Cc

Cc x 100 không vượt quá ± 15% Riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

2.2.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ

không đảm bảo đo của phương pháp Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Tiến hành phân tích dãy mẫu chuẩn có nồng độ thấp dần cho đến khi còn có thể xuất hiện tín hiệu của Bacosid A3 Sau đó xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N: signal to noise ratio) Trong đó, S là chiều cao tín hiệu Bacosid A3, N là nhiễu đường nền Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của peak, chiều rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của peak tại nửa chiều cao

Lấy giá trị LOD là nồng độ Bacosid A3 tại đó cho S/N = 3

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà

ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Tương tự như LOD, xác định LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Lấy giá trị LOQ là nồng độ Bacosid A3 tại đó S/N = 10 Có thể tính LOQ theo LOD bằng công thức: LOQ = 10/3 x LOD

2.2.2.5 Độ lặp lại

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu Tiến hành phân tích cùng một mẫu thử ít nhất 6 lần (mỗi lần bắt đầu từ giai đoạn cân mẫu) Xác định kết quả định lượng theo đường chuẩn đã xây dựng Xác định độ lặp lại thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD giữa giá trị của các lần định lượng

Công thức tính độ lệch chuẩn tương đối:

SD = √∑ (xi -x ̅)2

n-1

RSD% = CV% = SD

x ̅ x 100Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn;

n: số lần thí nghiệm;

xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ I;

x

̅: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm;

RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối;

CV%: Hệ số biến thiên

Yêu cầu: Theo AOAC, các mẫu phân tích có hàm lượng chất phân tích tử 0,1 – 1%

thì độ lệch chuẩn tương đối RSD không vượt quá 3,7%

Tiến hành sắc ký các dung dịch sau:

 Dung dịch thử

 Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm một lượng chính xác chất chuẩn ở các mức khác nhau so với lượng Bacosid A3 trong mẫu thực

Tính phần trăm thu hồi theo công thức:

R% =C(t+c)-C t

Cc x 100

Trong đó: R%: độ thu hồi;

Cc: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Ct: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Yêu cầu: Theo AOAC, mẫu phân tích có hàm lượng chất phân tích ≥ 0,1% thì độ

thu hồi yêu cầu nằm trong khoảng 95 – 105%

2.3 Phân tích mẫu thực

Xây dựng đường chuẩn Các mẫu thực được xác định hàm ẩm và định lượng theo quy trình xây dựng Mỗi mẫu làm lại 2 lần Tính kết quả dựa trên phương pháp xây dựng đường chuẩn

 Pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần

 Tiêm sắc ký và đo tín hiệu của Bacosid A3, ghi lại kết quả diện tích peak

 Sử dụng công cụ tính toán để biểu thị sự phụ thuộc của diện tích peak Bacosid A3 vào nồng độ chất phân tích Sx= aCx + b Trong đó: Sx là diện tích peak của nồng độ chất phân tích chuẩn Cx

 Xác định hàm ẩm: Dược liệu rau đắng biển khô được nghiền thành bột rồi đem rây qua rây 355 Cân chính xác khoảng 1,00 g bột dược liệu, dàn mỏng đều và sấy ở nhiệt độ

90oC cho đến khi khối lượng của khối bột không thay đổi trong khoảng thời gian 60 giây

và đọc kết quả trên máy xác định hàm ẩm

 Xác định hàm lượng Bacosid A3 trong mẫu dược liệu khô tuyệt đối

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng

3.1.1 Quy trình chiết xuất Bacosid A3 trong rau đắng biển

Dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành nghiền mẫu rau đắng biển khô, rây rồi xác định hàm ẩm của bột rau đắng biển thu được là 7,68%; sau đó thực hiện khảo sát điều kiện chiết xuất BA3 từ mẫu bột dược liệu rau đắng biển trên

 Phương pháp chiết: Chiết Soxhlet Sử dụng thiết bị chiết Soxhlet có sẵn ở phòng

thí nghiệm có khả năng chiết kiệt BA3 trong rau đắng biển

 Dung môi chiết: BA3 là một hợp chất phân cực, hòa tan tốt trong các dung môi

MeOH, EtOH, nước và hỗn hợp các dung môi này

- Với dung môi là nước có ưu điểm là rẻ, an toàn với môi trường và sức khỏe con người, tuy nhiên khi chiết rau đắng biển bằng dung môi nước, lượng BA3 giải phóng thấp và thời gian chiết kéo dài, vì vậy để đạt được mục đích của một quy trình là định lượng hoạt chất trong bột dược liệu thì việc lựa chọn dung môi nước để chiết là không phù hợp Do đó, chúng tôi không lựa chọn nước

- MeOH và EtOH là 2 dung môi thường được sử dụng nhất để chiết Bacosid trong các tài liệu tham khảo So với MeOH, EtOH có nhiều ưu điểm hơn, là dung môi thân thiện với môi trường, dễ kiếm và giá thành rẻ Sau khi chiết BA3 trong khoảng 2,0 g bột rau đắng biển với MeOH, EtOH trong vòng 2 giờ, đem dịch chiết đi định lượng thu được kết quả hàm lượng BA3 theo bảng sau:

Bảng 3.1: Kết quả định lượng Bacosid A3 khi chiết bột rau đắng biển với

MeOH và EtOH Nhận xét: Việc sử dụng dung môi chiết bằng MeOH hay EtOH cho kết quả hàm lượng

BA3 không chêch lệch nhau nhiều và lần lượt là 0,397% và 0,412% (kl/kl), do đó lựa chọn EtOH làm dung môi chiết mẫu rau đắng biển

- Tiến hành khảo sát chiết dược liệu tại các nồng độ EtOH: 30o, 40 o, 50 o, 60o,

70o, 80 o, 90 o, 96 o Sau khi chiết khoảng 2,0 g bột rau đắng biển trong vòng 2 giờ bằng dung môi cồn với các nồng độ khác nhau, dịch chiết được đem đi định lượng thu được kết quả hàm lượng BA3 như sau:

Hình 3.1: Kết quả khảo sát nồng độ cồn Nhận xét: Khi chiết dược liệu với các mức cồn cao độ (40o – 80o) đều cho hàm lượng BA3 cao và không có sự chênh lệch quá lớn, ưu tiên sử dụng cồn 50o do có thể vừa đảm bảo lượng BA3 được giải phóng cao và tiết kiệm lượng cồn sử dụng Vì vậy lựa chọn cồn

50o làm dung môi chiết

 Thời gian chiết: Cân 6 mẫu bột rau đắng biển, mỗi mẫu khoảng 2,0 g đem chiết

Soxhlet, khảo sát thời gian chiết dược liệu với 70 ml cồn 50o trong các khoảng thời gian khác nhau: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ ở nhiệt độ sôi của dung môi là 78,37oC Dịch chiết được đem đi định lượng thu được kết quả hàm lượng BA3 như sau:

Hình 3.2: Kết quả khảo sát thời gian chiết

0,2731

0,4727 0,4973 0,4838 0,4650 0,4900

0,4035

0,00,10,20,30,40,50,6