Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng immunoglobulin g trong sữa và sản phẩm sữa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Các phương pháp định lượng IgG đã phát triển từ rất lâu, nhưng để phù hợp với hàm lượng IgG ở trong sữa đang là vấn đề khó khăn do IgG là một kháng thể nên cần phải sử dụng phương pháp đ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH CẢNH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ

SẢN PHẨM SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐÌNH CẢNH

MÃ SINH VIÊN: 1301033 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ

SẢN PHẨM SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Trần Cao Sơn

2 TS Đặng Thị Ngọc Lan

Nơi thực hiên:

1 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2 Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Trần Cao Sơn và TS Đặng Thị Ngọc Lan, là những người tận tình dìu dắt trong quá trình nghiên cứu khoa học, cũng như trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong khoa Độc học và dị nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt TS Trần Cao Sơn và chị Nguyễn Thị Minh Hòa, đã giải đáp thắc mắc, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại Viện

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, đặc biệt là TS Đặng Thị Ngọc Lan đã giúp đỡ, quan tâm, tạo điều kiên thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này

Tôi cũng gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo và toàn thể các thầy cô tại các bộ môn đã chỉ dạy và giúp đỡ trong suốt thời gian học tập 5 năm tại trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình tôi đã luôn bênh cạnh ủng hộ, động viên để tôi có thể hoàn thành khóa luận của mình một cách tốt nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Lê Đình Cảnh

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Immunoglobulin G 2

1.1.1 Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G 2

1.1.2 Cấu trúc của immunoglobulin G 3

1.1.4 Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa 4

1.2 Các phương pháp định lượng IgG 5

1.2.1 Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch 5

1.2.2 Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách 7

1.3 Tổng quan về sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

1.3.1 Khái niệm 9

1.3.2 Nguyên tắc 9

1.3.3 Pha tĩnh sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao 10

1.3.4 Pha động trong sắc ký ái lực trên sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

1.3.5 Một số nghiên cứu về định lượng immunoglobulin G 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng 15

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.2.1 Thiết bị 15

2.2.2 Dụng cụ 15

2.2.3 Hóa chất, chất chuẩn 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và sản phẩm sữa 16

2.3.2 Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng 16

-2.3.3 Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị trường Việt Nam 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Pha dung dịch chuẩn 17

2.4.2 Pha các dung dịch đệm 17

2.4.3 Quy trình xử lý mẫu 18

2.4.4 Phương pháp phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 18

2.4.5 Thẩm định phương pháp [2] 19

2.4.6 Phương pháp xử lý kết quả 20

2.4.7 Phương pháp lấy mẫu 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và các sản phẩm sữa 21

3.1.1 Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng thiết bị HPLC 21

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 25

3.2 Thẩm định phương pháp xác định IgG bằng sắc ký lỏng 28

3.2.1 Độ đặc hiệu 28

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 29

3.2.3 Khoảng tuyến tính 31

3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 32

3.2.5 Độ lặp lại khác ngày 33

-3.3 Sơ bộ đánh giá hàm lượng IgG trong sữa và thành phẩm từ sữa trên thị trường Việt Nam 34

3.4 Bàn luận 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 42

-DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội các cộng

đồng phân tích chính thức)

liên kết với enzyme)

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di polyacrylamide với SDS)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG - 2 -

Bảng 1.2 Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG - 4 -

Bảng 1.3 Khả năng liên kết của protein với kháng thể - 12 -

Bảng 1.4: Một số nghiên cứu về định lượng IgG - 13 -

Bảng 2.1 Khối lượng cân chất chuẩn gốc IgG (10mg/g) - 17 -

Bảng 3.1 Khảo sát khối lượng cân mẫu - 27 -

Bảng 3.2: Tỉ lệ S/N ở nồng độ LOD 0,01 mg/g - 30 -

Bảng 3.3 Độ chệch của các nồng độ chuẩn - 31 -

Bảng 3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi - 33 -

Bảng 3.5 Độ lặp lại khác ngày - 34 -

Bảng 3.6 Kết quả định lượng mẫu thực - 35 -

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu tạo của IgG - 3 -

Hình 1.2 Phương pháp plasmon bề mặt - 7 -

Hình 1.3 Quá trình trong sắc ký ái lực - 10 -

Hình 1.4 Protein G được gắn trên Sepharose - 11 -

Hình 3.1 Khảo sát pH dung dịch nạp - 22 -

Hình 3.2 Thể tích nạp - 23 -

Hình 3.3 Khảo sát pH rửa - 24 -

Hình 3.4 Sắc ký đồ rửa lại khi khảo sát pH =3 - 24 -

Hình 3.5 Khảo sát thể tích rửa - 25 -

Hình 3.6 Sắc ký đồ thể hiện tính đặc hiệu - 28 -

Hình 3.7 Phổ hấp thụ IgG trong nghiên cứu - 29 -

Hình 3.8 Phổ hấp thụ IgG - 29 -

Hình 3.9 Phổ hấp thụ ở nồng độ 0,5mg/g - 29 -

Hình 3.10 Phổ hấp thụ ở nồng độ 1mg/g - 29 -

Hình 3.11 Sắc ký đồ của nồng độ LOD 0,01 mg/g - 30 -

Hình 3.12 Đồ thị khảo sát sự tuyến tính 32

-ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, sữa và sản phẩm sữa đang ngày càng trở nên thiết yếu vì giúp nâng cao và bảo vệ sức khỏe Các sản phẩm này gồm các yếu tố tăng trưởng, immunoglobulin, lactoperoxidase, lactoferrin, cytokine, nucleotid, vitamin, … [21-28] Trong đó, immunoglobulin (Igs) mà chiếm đa số là imunoglobulin G có nguồn chủ yếu từ sữa của loài động vật nhai lại [16] có vai trò giúp cơ thể tăng sức đề kháng Việc sử dụng các sản phẩm sữa có hàm lượng IgG cao đang là xu hướng của người tiêu dùng Hiện nay, Việt Nam vẫn chưa có tiêu chuẩn về hàm lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa vì vậy các

cơ quan kiểm tra đang tiến tới xây dựng tiêu chuẩn chung Vấn đề đặt ra là phương pháp định lượng IgG phù hợp để xây dựng các tiêu chuẩn

Các phương pháp định lượng IgG đã phát triển từ rất lâu, nhưng để phù hợp với hàm lượng IgG ở trong sữa đang là vấn đề khó khăn do IgG là một kháng thể nên cần phải sử dụng phương pháp đặc hiệu Chúng dễ bị biến tính do điều kiện nhiệt độ, bảo quản và quá trình sản xuất, cùng với đó là bất cập về mặt kinh tế, thời gian, hay quy mô tiến hành Việc

sử dụng phương pháp sắc ký để định lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa có tiềm năng giải quyết được các khó khăn trên

Xuất phát từ các nhu cầu trên chúng tôi đã xây dựng đề tài: “Nghiên cứu phương pháp

xác định hàm lượng IgG trong sữa và các sản phẩm sữa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”

với 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp và thẩm định phương pháp định lượng IgG trong sữa và các sản phẩm sữa

2 Áp dụng phương pháp định lượng hàm lượng một số mẫu sữa trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Immunoglobulin G

1.1.1 Giới thiệu về tính chất và chức năng Immunoglobulin G

Immunoglobulin G (IgG) là một trong số những kháng thể của cơ thể người và động vật IgG chiếm khoảng 80% tổng lượng kháng thể IgG chủ yếu xuất hiện trong huyết thanh, chiếm 75% của tất cả các Igs trong huyết thanh IgG có chủ yếu trong các khoang ngoài mạch máu, là lớp duy nhất của Igs có khả năng đi qua nhau thai, do đó việc miễn dịch được đảm bảo truyền từ mẹ sang con

Chức năng quan trọng nhất của IgG là giúp cơ thể miễn dịch, thông qua quá trình hoạt hóa bổ thể Chức năng khác của IgG là khả năng gắn các tế bào như các đại thực bào, các bạch cầu đơn nhân, các bạch cầu đa nhân trung tính một số tế bào lympho có các thụ thể Fc cho vùng Fc của IgG, giúp tế bào có thể tiếp nhận các kháng nguyên tốt hơn Chức năng của các phân lớp dưới của IgG được thể hiện ở Bảng 1.1

Bảng 1.1.Chức năng của các thứ lớp dưới của IgG

Khả năng hoạt hóa

bổ thể

Khả năng gắn thụ thể Fc trên các tế bào thực

bào

Thời gian bán hủy [12]

1.1.2 Cấu trúc của immunoglobulin G

IgG gồm 4 chuỗi polypeptit Hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L và hai chuỗi nặng kí hiệu là H, gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S) Tất cả các IgG là monomer (globulin miễn dịch 7S)

Chuỗi nhẹ: Trật tự axit amin của hai chuỗi nhẹ giống nhau và được chia làm hai vùng

Vùng có trật tự axit amin thay đổi gọi là vùng biến đổi (kí hiệu VL), nằm phía đầu amin (-NH2) của phân tử Vùng có trật tự không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu CL) nằm phía đầu carboxyl (-COOH) Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau

ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự lamda hoặc theo trật tự kappa Ngược lại, trật

tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau, kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra

Hình 1.1 Cấu tạo của IgG [9]

Chuỗi nặng: IgG được cấu thành bởi chuỗi nặng gamma Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng axit

amin: một vùng biến đổi và ba vùng cố định Vùng biến đổi (kí hiệu là VH) nằm phía đầu amin đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên (paratop) Vùng cố định nằm phía đầu carboxyl, chia làm 3 vùng nhỏ có kí hiệu CH1, CH2

và CH3 Giữa vùng CH1 và CH2 là vùng khớp nối có tác dụng như bản lề làm cho phân tử

có hình chữ Y và có thể điều chỉnh cho hai paratop gắn với epitop của kháng nguyên Hai cánh tay của chữ Y còn gọi là đoạn gắn kháng nguyên Fab (F: fragment, ab: antigen binding), là phần nhận biết kháng nguyên [13] Dưới tác dụng của papain, phân tử kháng

thể bị phân giải tại vùng bản lề thành 3 mảnh: hai mảnh nhỏ chứa toàn bộ chuỗi nhẹ và một nửa chuỗi nặng có đầu amin Một mảnh chính là Fab, mảnh còn lại của chuỗi nặng phía đầu carboxyl có thể kết tinh được gọi là mảnh Fc (Fragment crystalizable) Mảnh này có thể liên kết với đại thực bào, tế bào B và bổ thể Các phân lớp dưới IgG khác nhau về số lượng liên kết disulfid và chiều dài của vùng bản lề [24]

1.1.4 Nguồn cung cấp IgG từ sữa và thành phẩm từ sữa

IgG có thể được đưa vào cơ thể qua tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch, hoặc bổ sung qua đường

ăn uống bằng việc sử dụng các loại thực phẩm chức năng, sữa non và sữa công thức Trong sữa và sữa non của bò, immunoglobulin G (IgG; phân lớp dưới IgG1 và IgG2) là thành phần miễn dịch chính, mặc dù mức IgA thấp và IgM cũng có mặt [7, 8]

Bảng 1.2 Hàm lượng của các phân lớp dưới của IgG

mô tuyến vú [18]

1.2 Các phương pháp định lượng IgG

Có nhiều phương pháp để xác định nồng độ của IgG phù hợp với từng khoảng nồng độ

và nền mẫu khác nhau Nồng độ IgG có thể được xác định một cách đơn giản bằng đo quang [3] Các phép đo như vậy thường được áp dụng đối với nồng độ chuẩn tinh khiết tuân theo định luật Lamber - Beer Hai nhóm phương pháp cơ bản để phân tích IgG dựa trên tách hoặc miễn dịch

1.2.1 Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch

Các kỹ thuật này dựa trên sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể (hoặc protein gắn kết) Các nhóm phương pháp này có ưu điểm lã dễ phát hiện sự thay đổi cấu trúc của protein (bao gồm cả IgG) và có thể phát hiện các sản phẩm làm giả

1.2.1.1 Miễn dịch khuếch tán (Radial imminodifusion, RID)

Miễn dịch khuếch tán là kỹ thuật được Mancini sử dụng và mô tả đầu tiên [26] Kỹ thuật này sử dụng một kháng huyết thanh được hòa tan vào thạch đun lỏng, và hỗn hợp thạch-kháng huyết thanh được đổ rải đều lên một phiến kính đặt trên mặt phẳng ngang Sau khi thạch đông, người ta đục các lỗ tròn trên thạch và cho huyết thanh cần đo hoặc huyết thanh chứng vào Kháng nguyên, mà trong trường hợp này là immunoglobulin G, sẽ khuếch tán theo hướng ly tâm từ các lỗ ra vùng thạch có chứa kháng huyết thanh xung quanh Bởi vì nồng độ kháng thể (kháng huyết thanh trong thạch) cố định nên khi kháng nguyên trong lỗ khuếch tán thì nồng độ giảm dần cho đến khi có tỉ lệ thích hợp với nồng độ kháng thể trong thạch thì một vòng tủa sẽ hình thành Đối với mỗi mẻ người ta làm ba lỗ chứa kháng nguyên với nồng độ biết trước để vẽ thành đường chuẩn [5]

Giới hạn định lượng của RID là khoảng từ 50 mg/ml – 150 mg/ml [9] Do đó phương pháp này không phù hợp để định lượng IgG có hàm lượng thấp trong sữa

1.2.1.2 Phản ứng miễn dịch Elisa

Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản

ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm,

kí sinh

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu, thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm Phương pháp định lượng IgG bằng phương pháp Elisa có thể định lượng 1ng/ml [14] Tuy nhiên khoảng tuyến tính của phương pháp này khá nhỏ khi phân tích mẫu thực cần pha loãng rất nhiều lần, dẫn đến việc tốn thời gian, hoá chất và sai

số do pha loãng Mặc dù các bộ kit định lượng trên thị trường đã thương mại hóa nhưng giá thành vẫn còn rất cao, tốn kém chi phí vì chỉ được dùng được một lần

1.2.1.3 Phương pháp cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) (surface plasmon

resonance)

Cộng hưởng Plasmon bề mặt (SPR) là quá trình phát hiện bằng quang học xảy ra khi ánh sáng đi vào lăng kính được phủ lớp kim loại (vàng) mỏng Dưới điều kiện cố định (bước sóng, phân cực, góc tới), các điện tử tự do tại bề mặt hấp thụ photon ánh sáng và chuyển đổi chúng sang sóng plasmon bề mặt Sự suy giảm phản xạ của ánh sáng sẽ được nhìn thấy dưới điều kiện của SPR

Trong phương pháp định lượng IgG thì gắn trên bề mặt kim loại là các phối tử (kháng nguyên cố định), khi mẫu thực di chuyển qua thì IgG liên kết với kháng nguyên làm thay đổi chỉ số phản xạ Độ thay đổi này tỉ lệ với số lượng liên kết (hay nồng độ IgG) Quá trình được theo dõi trong một khoảng thời gian, để số lượng IgG trong mẫu liên kết toàn bộ với kháng nguyên trên bề mặt Các mẫu tiếp theo được chảy qua khi trên bề mặt khi các IgG liên kết với kháng nguyên đã được loại bỏ và IgG được rửa giải ra ngoài Quá trình thực

hiện với các mẫu có nồng độ IgG chuẩn từ đó nội suy cho các mẫu cần phần tích với nồng

độ IgG chưa xác định

Xét nghiệm miễn dịch dựa trên SPR có ưu điểm cho việc phân tích các protein sữa nhỏ Một xét nghiệm miễn dịch sinh học tự động sử dụng SPR quang học đã được sử dụng để định lượng IgG Khoảng định lượng của phương pháp này từ 0,08-25 µg/ml [29]

Hình 1.2 Phương pháp plasmon bề mặt

1.2.2 Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách

Cả hai phương pháp sắc ký lỏng và kỹ thuật điện di đều phù hợp để xác định và định lượng IgG trong nền mẫu phức tạp bao gồm sữa bò và sữa non Thông thường, casein được loại bỏ trước khi phân tích tách, do casein chiếm phần lớn protein trong sữa

1.2.2.1 Điện di gel

Điện di là kỹ thuật dùng để phân tách và đôi khi tinh chế các chất đặc biệt là các protein

và các acid nucleotide trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và hình dạng của chúng

Các phân tử protein và acid nucleic có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamid gel Trong đó gel của agarose và polyacrylamid được sử dụng phổ biến nhất Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp mẫu Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi trong một khoảng tương đối Khả năng di chuyển của các phân tử protein và acid nucleic trong điện trường là khác nhau tùy thuộc vào độ ion, cường độ điện trường, kích thước và hình dạng Sau khi tách hoàn thành, các dải protein có thể được phát hiện bằng cách xử lý gel với một chất phát hiện vết Coomassie Blue, liên kết đặc biệt với protein, mỗi dải đại diện cho một protein Định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị đo độ hấp thụ

và nội suy từ đường chuẩn được xây dựng trên các protein chuẩn [18] Nền gel sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) thường được sử dụng trong định lượng IgG Khi đó IgG được cắt thành các chuỗi nhẹ và nặng, xuất hiện dưới dạng các dải riêng biệt Do đó SDS-PAGE không thể phân biệt IgG ở giai đoạn ban đầu là trạng thái tự nhiên hay bị biến tính Khoảng định lượng của phương pháp này 0,2 mg/ml – 3,5 mg/ml [19] Kỹ thuật này không hay được dùng để định lượng IgG

1.2.2.2 Sắc ký rây phân tử (SEC)

Sắc ký rây phân tử là phương pháp chia tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng Trong trường hợp pha động là một dung môi hữu cơ, kỹ thuật được gọi

là sắc ký thấm qua gel, còn trường hợp pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel Mẫu được đưa vào cột chứa đầy gel hoặc một loại vật liệu xốp, và được pha động dẫn chạy qua cột

Khoảng kích thước lỗ của vật liệu nhồi trong cột sẽ xác định khoảng kích thước phân tử được chia tách qua quá trình sắc ký Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để có thể đi vào trong tất cả khoảng không gian của lỗ xốp và được rửa giải trong tổng thể tích thấm Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ xốp lớn nhất chỉ di chuyển được dọc theo cột qua các khoảng trống giữa các hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ lại, được rửa giải trong thể tích loại trừ (thể tích trống) Sự chia tách theo kích thước phân tử xảy ra giữa thể tích trống

và tổng thể tích thấm.Sau đó chất phân tích được định lượng bằng phương pháp đo quang

SEC đã thành công trong việc tách whey protein với IgG và định lượng trên cột Sepharose[6] Tuy nhiên, các vấn đề trong việc xác định IgG của SEC cũng đã được ghi nhận, đặc biệt trong trường hợp có casein, một protein chính trong sữa làm ảnh hưởng tới khả năng chia tách Phương pháp này cũng có khả năng xác định được nguồn gốc của IgG.

1.2.2.3 Sắc ký ái lực (Affinity chromatography AC)

Phương pháp này kết hợp giữa sự tách và tương tác của IgG với protein G hoặc A Các

loại protein này là protein mà bề mặt tế bào có liên kết đặc biệt (tuy nhiên không phải cơ chế miễn dịch) với IgG thông qua phần Fc (không bị biến tính bởi nhiệt) của phân tử IgG Trong quá trình rửa giải với đệm trung tính, các protein khác trong sữa sẽ đi qua cột, sau

đó IgG sẽ được rửa ra với đệm có pH thấp Phương pháp này phát hiện các protein bằng việc đo độ hấp thụ tại bước sóng ≈ 280 nm, pic protein xuất hiện tại thời gian rửa giải pH thấp sẽ chỉ là pic của một mình IgG Tuy nhiên, cần loại bỏ casein do casein có khả năng gây cản trở quá trình rửa giải IgG Phương pháp có khoảng tuyến tính từ 1-100 mg/g [3], phù hợp với việc phân tích sữa, sản phẩm từ sữa và sữa non

1.3 Tổng quan về sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng hiệu năng cao (High Perform Liquid Chromatography HPLC) là

kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ

di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rủa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Sắc ký ái lực là một kiểu sắc ký của HPLC [1]

1.3.2 Nguyên tắc

Các hợp chất sinh học, như enzyme và cơ chất hoặc kháng nguyên và kháng thể, sở hữu những đặc trưng nhận biết giữa chúng một cách chọn lọc để tạo thành các hợp chất phức Sắc ký ái lực là một phương pháp phân tách và tinh chế các chất vận dụng tính ái lực sinh học của chúng Tương tác giữa chúng thường có thể đảo ngược Một phân tử được cố định

(pha tĩnh) có ái lực với chất phân tích, sau đó chất phân tích được rửa giải nhờ gradient pha động[20]

Quy trình trong sắc ký ái lực gồm 4 bước sau:

(1) Cân bằng cột

Nhồi cột bằng pha tĩnh gồm phần chất mang đã cố định sẵn một phối tử phù hợp với mục tiêu phân tách trên bề mặt Cột được cần bằng nhờ dung môi chạy mẫu

(2) Thêm mẫu và hấp phụ với hợp chất mục tiêu (Hình a)

Mẫu được đưa vào cột và thành phần mục tiêu hấp phụ lên trên pha tĩnh

Hình 1.3 Quá trình trong sắc ký ái lực [27]

1.3.3 Pha tĩnh sắc ký ái lực trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.3.1 Các chất hỗ trợ ái lực (Các chất mang pha tĩnh)

Loại chất mang được sử dụng phổ biến gồm agarose hay những hạt gel tổng hợp đại phân tử (cấu tạo từ polyme) có tính ưa nước (ví dụ như polyvinyl alcohol polyacrylate, …) Theo nguyên tắc, chất mang được chọn không có phản ứng gì (bất hoạt) với mẫu và bền về mặt vật lý lẫn hóa học dưới những điều kiện sắc ký được thiết lập Cũng cần phải lưu ý rằng

nếu các hạt gel có cấu trúc xốp, sự phân tán lỗ xốp và diện tích bề mặt riêng của chúng sẽ ảnh hưởng đến lượng phối tử đang được cố định và lượng phối tử hữu hiệu (có hoạt động) trên bề mặt vật liệu nhồi [25]

Trong cột ái lực protein G thì chất mang là hạt Agrose liên kết chéo (Sepharose) Phương pháp cố định Protein G lên bề mặt chất mang cũng rất quan trọng Độ dài cánh tay nối rất quan trọng trong việc các phối tử bắt và liên kết với chất phân tích Trong cột Protein G thì

để tăng khả năng gắn với IgG đã sử dụng phương pháp kích hoạt N-hydroxysuccinimide, trên Sepharose là 12 phân tử 6-aminohexanoic acid Phương pháp khớp nối này mang lại hiệu năng cao cho cột

Qua trình gắn với protein G

Hình 1.4 Protein G được gắn trên Sepharose.[15]

1.3.3.2 Các phối tử

Protein G, một protein bề mặt tế bào từ Streptococci nhóm G, là một thụ thể Fc kiểu III ProteinG liên kết qua cơ chế không phải miễn dịch Protein G gắn kết đặc biệt với vùng Fc của IgG, nhưng nó liên kết mạnh hơn với một số IgG đa dòng (Bảng 1.3) và với IgG3 của người

Trong thí nghiệm này protein G được sản xuất từ E Coli GE Healthcare đưa ra một tái

tổ hợp, dạng protein G đó có vùng gắn kết tự nhiên với albumin đã được bị xóa di truyền,

do đó tránh các phản ứng không mong muốn với albumin Protein tái tổ hợp G chứa hai vùng rằng buộc Fc Protein G Sepharose là một sự lựa chọn tốt hơn cho việc thu thập các kháng thể chung vì nó gắn kết một phạm vi rộng hơn của IgG từ các loài sinh vật và liên

kết nhiều lớp IgG Thông thường protein G có liên kết mạnh hơn protein A và thể hiện gắn

ít nhất với albumin, kết quả là chế phẩm sạch hơn và năng suất cao hơn Sức kết dính protein

G với IgG phụ thuộc vào các nguồn và phân lớp của globulin miễn dịch Khả năng liên kết năng động phụ thuộc vào độ bền liên kết và trên một số các yếu tố khác, chẳng hạn như tốc

độ dòng chảy trong quá trình áp dụng mẫu Nhiều kháng thể cũng tương tác ái lực thấp với protein G thông qua vị trí Fab Protein G hầu như không có liên kết với IgM, IgA hoặc IgE

ở người, mặc dù một số chúng liên kết yếu với protein A Các phối tử protein G trong quá trình sử dụng luôn luôn có khả năng bị tách ra khỏi chất nền, đặc biệt trong điều kiện rửa giải khắc nghiệt Sự gắn bó nhiều điểm của protein G với Sepharose cho kết quả mức rò rỉ rất thấp trong một loạt các điều kiện rửa

Bảng 1.3 Khả năng liên kết của protein với kháng thể [27]

1.3.4 Pha động trong sắc ký ái lực trên sắc ký lỏng hiệu năng cao

Việc lựa chọn pha động trong sắc ký ái lực phụ thuộc vào khoảng pH cần sử dụng Protein G liên kết với IgG trong một khoảng pH rộng, cho nên việc lựa chọn dung môi phù hợp không khó Khoảng pH = 6 - 9 là điều kiện để protein gắn với IgG Để phá vỡ liên kết này chỉ cần pH của pha động giảm xuống khoảng pH từ 2,5 đến gần bằng 3, phụ thuộc vào mẫu phân tích

1.3.5 Một số nghiên cứu về định lượng immunoglobulin G

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu về định lượng IgG

lượng

Nồng độ IgG trong sữa

%(kl/kl)

Tài liệu tham khảo

rộng rãi như Elisa hay tới những phương pháp đang được triển khai nghiên cứu như SPR,

SEC , nhưng vẫn còn những bất cập mắc phải

Từ những ưu điểm đã được chỉ ra trong tổng quan về sắc ký ái lực và cột Protein G,

nên nghiên cứu đã lựa chọn làm phương pháp định lượng IgG trong sữa và sản phẩm sữa

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Hệ thống sắc ký HPLC Aliance 2965 của hãng Waters

- Máy ly tâm Mikro, Hittech

- Máy lắc ngang H260, IKA

- Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg XS105, Mettler Toledo

- Máy đo pH Mettler Toledo

- Chuẩn IgG (Sigma Cat No I5506, Sigma – Aldrich) (độ tính khiết 95%)

- Na2HPO4 (Merck) (hàm lượng ≥ 99%)

- NaCl (Merck) (hàm lượng ≥ 99,5%)

- Glycine (Merck) (hàm lượng ≥ 99,7%)

- NaOH (Merck) (hàm lượng ≥ 97,0%)

- HCl (Merck) (hàm lượng 37 - 38%)

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định IgG trong sữa và sản phẩm sữa

2.3.1.1 Khảo sát các điều kiện xác định IgG bằng máy HPLC

Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng:

- pH của dung dịch đệm để gắn IgG lên cột

- pH dung dịch đệm rửa giải

- Thể tích dung dịch đệm nạp

- Thể tích dung dịch đệm rửa giải

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa trên phương pháp tủa các protein và chất béo:

- Khảo sát các điều kiện ly tâm

- Tỉ lệ pha loãng của mẫu

2.4.1 Pha dung dịch chuẩn

2.4.1.1 Dung dịch chuẩn gốc IgG (10mg/g)

Cân chính xác 105,26 mg IgG gốc vào cốc 20ml, thêm dung môi NaCl 0,15M vào vừa

đủ 10,00 g lắc đều để hòa tan ở điều kiện 30°C trong 30 phút

2.4.1.2 Dung dịch chuẩn làm việc

Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn trên nền mẫu trắng có nồng độ từ 0,01 – 5 mg/g vào

lọ mẫu để tiến hành dựng đường chuẩn Thể tích các dung dịch cần sử dụng để pha dãy chuẩn được thể hiện trong bảng 2.1

Cân IgG chuẩn gốc vào cốc 20 ml với khối lượng lần lượt như bảng sau thêm dung dịch mẫu trắng đã được tách chiết vừa đủ 4,000 g, trộn đều sau đó lọc qua màng 0,45 µm, bỏ dịch lọc đầu

Bảng 2.1 Khối lượng cân chất chuẩn gốc IgG (10mg/g)

Nồng độ IgG chuẩn

(mg/g)

Khối lượng IgG chuẩn gốc

Các dung dịch đệm được tham khảo để phù hợp với cột và phương pháp ái lực [3]

Hòa tan 11,43 mL acid acetic băng vào xấp xỉ 900 ml nước Điều chỉnh pH của dung dịch bằng 0,2M CH3COONa (hòa tan 27,22 g CH3COONa.3H2O vào 1L nước) thêm nước vừa đủ 1L

2.4.2.2 Dung dịch đệm nạp

Đệm Na2HPO4: Hòa tan 8,90 g Na2HPO4 và 17,53g NaCl vào 900ml nước, điều chỉnh

pH bằng NaOH 4M và HCl 6M Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm

2.4.2.3 Dung dịch đệm rửa giải

Hòa tan 3,75 g glycine vào 900 ml điều chỉnh pH bằng HCl 6M, thêm nước vừa đủ 1L Sau đó lọc qua màng 0,45 µm

2.4.3 Quy trình xử lý mẫu

Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Mỗi mẫu lấy được đồng nhất, trộn đều trước khi cân hoặc hút Tạo mẫu trắng: Sử dụng sữa đậu nành làm mẫu trắng Phân tích lặp lại 10 lần, xác định mẫu trắng không cho tín hiệu thời gian lưu của chất phân tích

Quy trình chuẩn bị mẫu:

- Cân chính xác khoảng 2 g bột hoặc sữa dạng lỏng vào ống ly tâm 50mL

- Thêm dung dịch NaCl 0,15M cho đủ 10 g

- Lắc trên máy lắc ngang khoảng 60 phút cho tan hết

- Tủa casein: Đối với mỗi mẫu thêm dung dịch đệm tủa vừa đủ 20 g trộn đều

- Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 7 phút

- Hút dịch sau đó lọc qua màng 0,45 µm cho dịch lọc vào vial, bỏ các giọt dịch đầu

2.4.4 Phương pháp phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thiết bị HPLC/DAD để định lượng IgG

Điều kiện dung dịch đệm nạp: Lựa chọn pH tối ưu, thể tích dung dịch qua cột

Điều kiện dung dịch đệm rửa: Lựa chọn pH tối ưu, thể tích dung dịch qua cột

2.4.5 Thẩm định phương pháp [2]

2.4.5.1 Tính chọn lọc

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh sắc ký đồ của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn

Phương pháp sử dụng detector DAD (mảng diod) nên tính chọn lọc trong sắc ký lỏng thông qua xác định độ tinh khiết của pic, hay so sánh phổ của pic với thư viện có sẵn

2.4.5.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

2.4.5.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn trên nền mẫu trắng có nồng độ thay đổi từ 0,03 đến 5mg/g Sau đó vẽ đường phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực (pha trên nền mẫu trắng), nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Vẽ đường chuẩn phụ thuộc giữa diện tích pic của chất chuẩn với nồng độ chất chuẩn (trục hoành x)

2.4.5.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau là 0,05; 1 và 3 mg/g (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

𝑅𝑆𝐷% =𝑆

𝑥̅× 100

Trong đó:

xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

N : Số lần thử nghiệm

Cc 100 Trong đó:

R: Độ thu hồi (%)

C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

2.4.6 Phương pháp xử lý kết quả

Kết quả phân tích trên thiết bị được xử lý bằng phần mềm Empower 3 của Water Kết quả thẩm định phương pháp được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel

2.4.7 Phương pháp lấy mẫu

- Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên

- Tổng số mẫu nghiên cứu: 17 mẫu sữa và sản phẩm sữa

- Mẫu: Là các mẫu sữa được gửi về kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

N

i i

x