Nghiên cứu bào chế gel chứa phức hợp phytosome quercetin

Với mong muốn đưa quercetin vào các chế phẩm chăm sóc da, đặc biệt làm tăng khả năng thấm cũng như lưu giữ hoạt chất trong da, làm tăng hiệu quả chống già hóa da, chúng tôi thực hiện đề

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.Vũ Thị Thu Giang -

người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn ThS.Nguyễn Hồng Trang về những chỉ bảo và

định hướng của cô cho đề tài

Tôi xin cảm ơn đến tất cả các thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Bào chế,

bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này

Nhân đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết, đặc biệt là chị gái Đặng Thị Tú Anh đã luôn động viên, giúp đỡ, cổ vũ và sát cánh bên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Đặng Thị Vân Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về quercetin 2

1.1.1 Công thức cấu tạo của quercetin 2

1.1.2 Tính chất vật lý 2

1.1.3 Tính chất hóa học 3

1.1.4 Tác dụng dược lý 3

1.1.5 Tác dụng 3

1.1.6 Liều dùng 4

1.2 Tổng quan về phytosome 4

1.2.1 Khái niệm về phytosome 4

1.2.2 Thành phần cấu tạo của phytosome 4

1.2.3 Ưu nhược điểm 5

1.2.4 Phương pháp bào chế phytosome 6

1.2.5 Đánh giá phytosome 6

1.2.6 Ứng dụng phytosome vào mỹ phẩm 7

1.3 Tổng quan về gel 8

1.3.1 Định nghĩa 8

1.3.2 Phân loại tá dược tạo gel 8

1.3.3 Một số đặc điểm của tá dược gel thân nước 8

1.3.4 Ứng dụng của phytosome trong bào chế gel thuốc 10

1.3.5 Một số chế phẩm gel chứa phytosome trên thị trường 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 13

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi nghiên cứu 13

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp bào chế 14

2.3.2 Phương pháp đánh giá 15

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng của quercetin 21

3.1.1 Phương pháp đo độ hấp thụ quang 21

3.1.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21

3.2 Bào chế và đánh giá hỗn dịch phytosome quercetin 22

3.3 Nghiên cứu bào chế gel phytosome quercetin 24

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược tạo gel 24

3.3.2 Khảo sát cách phối hợp Carbopol 934 29

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tá dược giữ ẩm 30

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng chất bảo quản đến đặc tính gel 34

3.4 Đánh giá đặc tính gel tạo thành 35

3.4.1 Hình thức 35

3.4.2 Độ nhớt 36

3.4.3 Đặc tính tiểu phân 36

3.4.4 Đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất của gel chứa hỗn dịch phytosome quercetin và gel chứa quercetin tự do 37

3.4.5 Đánh giá khả năng giải phóng quercetin qua da lưng chuột nhắt trắng 38

3.4.6 Đánh giá khả năng lưu giữ hoạt chất trong da chuột 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

( High-performance Liquid Chromatography)

(Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin)

Hiệp hội Quốc tế về Hóa học cơ bản và Hóa học ứng dụng

(International Union of Pure and Applied Chemistry)

(Polydispersity Index)

(Scanning Electron Microscope)

(Transmission Electron Microscopy)

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Một số chế phẩm gel chứa phytosome trên thị trường 12

Bảng 2.1 Nguyên liệu 13

Bảng 3.1 Nồng độ quercetin và mật độ quang tương ứng tại bước sóng 370 nm 21

Bảng 3.2 Nồng độ quercetin và diện tích pic tương ứng tại bước sóng 370 nm 21

Bảng 3.3 Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin 22

Bảng 3.4 Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin sau 1 tuần, 2 tuần bảo quản 23

Bảng 3.5 Lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin (µg/cm2) (n=3) 23

Bảng 3.6 Kí hiệu các công thức gel với hai tá dược Carbopol934 và NaCMC 25

Bảng 3.7 Đặc tính gel được bào chế với tá dược khác nhau 25

Bảng 3.8 Hàm lượng quercetin trong các công thức (%) 26

Bảng 3.9 Đánh giá các đặc tính của tiểu phân trong gel và giá trị pH của gel sau một tuần bảo quản 27

Bảng 3.10 Lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin và các mẫu gel (µg/cm2) (n=3) 28

Bảng 3.11 Đặc tính tiểu phân phytosome trong gel với hai cách bào chế (n=3) 29

Bảng 3.12 Khảo sát đặc tính gel từ ba tá dược giữ ẩm (n=3) 31

Bảng 3.13 Lượng quercetin giải phóng từ gel với tá dược giữ ẩm khác nhau (µg/cm2) (n=3) 32

Bảng 3.14 Lượng quercetin giải phóng từ gel với các nồng độ glycecrin khác nhau (µg/ml) (n=3) 33

Bảng 3.15 Đặc tính phytosome trong gel với các nồng độ khác nhau của nipagin 34

Bảng 3.16 Độ nhớt của gel ngay sau bào chế và sau 2 tuần bảo quản (Pa.s) 36

Bảng 3.17 KTTP, PDI, Zeta của 3 mẫu sau 1 thời gian bảo quản (n=3) 36

Bảng 3.18 Đánh giá pH, hàm lượng quercetin (%) sau một thời gian bảo quản (n=3) 36 Bảng 3.19 Lượng quercetin giải phóng từ gel phytosome quercetin và gel quercetin tự do qua màng cellulose acetat 0,45 µm(µg/cm2) (n=3) 37

Bảng 3.20 Lượng quercetin thấm qua da lưng chuột nhắt (µg/cm2) (n=3) 38

Bảng 3.21 Lượng quercetin lưu giữ trong da chuột nhắt (µg/cm2) (n=3) 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức hóa học của quercetin 2 Hình 1.2 Cấu tạo của phytosome 4 Hình 3.1 Đường chuẩn định lượng quercetin trong methanol bằng phương pháp đo độ

hấp thụ quang UV-VIS 21

Hình 3.2 Đường chuẩn định lượng của quercetin bằng phương pháp HPLC 22 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn lượng quercetin giải phóng từ HD phytosome quercetin 24 Hình 3.4 Đồ thị KTTP, PDI của phytosome quercertin trong các mẫu gel ngay sau bào

chế so với hỗn dịch 26

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn KTTP và PDI của phytosome quercetin sau 1 tuần bảo quản

so với hỗn dịch ban đầu 27

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng quercetin từ các mẫu gel 28 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI với hai cách phối hợp Carbopol 934 khác nhau

phytosome quercetin và gel quercetin 37

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn lượng quercetin giải phóng qua da lưng chuột nhắt của

mẫu gel phytosome và gel quercetin 38

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn lượng quercetin lưu giữtrong da chuột của mẫu gel

phytosome và mẫu gel quercetin 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lão hóa da là quá trình suy giảm chức năng và làm mất đi cấu trúc tổng thể của làn da, dưới tác động của các yếu tố bên trong như: tuổi tác, chế độ ăn uống, stress… và các yếu tố bên ngoài như tia cực tím, môi trường… Đây là một trong những vấn đề đang rất được quan tâm khi mà xã hội ngày càng phát triển và nhu cầu làm đẹp theo đó ngày càng tăng lên Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm với tác dụng ngăn ngừa

sự già hóa da Tuy nhiên, hiện nay, con người có xu hướng thiên về sử dụng những dược chất có nguồn gốc tự nhiên hơn là những dược chất có nguồn gốc tổng hợp để đảm bảo giảm tối đa các tác dụng không mong muốn và đạt độ an toàn cao Một trong những chất

có nguồn gốc tự nhiên đang được sử dụng phổ biến là quercetin – hoạt chất thuộc nhóm flavonoid

Quercetin là đã được chứng minh với nhiều tác dụng dược lý như chống ung thư,

dị ứng, bảo vệ tim mạch…đặc biệt là khả năng chống oxi hóa vượt trội so với các flavonoid khác Tuy nhiên, cấu trúc phân tử cồng kềnh, tính tan và thấm kém là nguyên nhân hạn chế hiệu quả tác dụng của quercetin khi được đưa vào các dạng bào chế khác Một trong những hướng nghiên cứu để khắc phục nhược điểm này là ứng dụng bào chế phytosome Trong đó, hoạt chất được liên kết với phospholipid tạo thành cấu trúc tiểu phân hình cầu có tính lưỡng cực, nhờ đó vừa cải thiện độ tan, vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua màng lipid kép Với mong muốn đưa quercetin vào các chế phẩm chăm sóc da, đặc biệt làm tăng khả năng thấm cũng như lưu giữ hoạt chất trong da, làm tăng hiệu quả

chống già hóa da, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế gel chứa phức hợp phytosome quercetin” với 2 mục tiêu:

1 Nghiên cứu bào chế được gel phytosome quercetin hàm lượng 0,1%

2 Đánh giá được một số đặc tính của gel tạo thành

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về quercetin

Quercetin là một hợp chất nhóm flavonoid, có màu vàng nhạt đến màu vàng Nó có mặt trong rau quả, trái cây và ngũ cốc Trong tự nhiên, quercetin được tìm thấy cả dạng

tự do và dạng glycosid Ngoài ra quercetin còn được bán tổng hợp bằng cách thủy phân rutin [11]

1.1.1 Công thức cấu tạo của quercetin

Hình 1.1 Công thức hóa học của quercetin

 Ít tan trong nước

 Cực đại hấp thụ vùng tử ngoại của quercetin ở bước sóng 258 nm và 370

nm trong methanol

̵ Phản ứng cyanidin: trong môi trường HCl, quercetin bị khử bởi Mg tạo thành dẫn chất màu cyanidin clorid [17]

̵ Phản ứng với dung dịch FeCl3: thêm vài giọt dung dịch FeCl3 vào dung dịch quercetin trong ethanol, lắc sẽ xuất hiện màu xanh

̵ Phản ứng azo hóa và diazo hóa: thường sử dụng để phát hiện flavonoid trên sắc

kí đồ Thuốc thử là các amin thơm như acid sulfanilic, benzidin, p – nitroanilin [17]

1.1.4 Tác dụng dược lý

̵ Chống oxy hóa: quercetin là một trong những flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong việc bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do oxy hóa với cơ chế có thể là thu thập gốc tự do, ức chế sự peroxi hóa lipid và tạo phức chelat với ion kim loại [17], [30] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã chứng minh quercetin bảo vệ cơ thể khỏi tác dụng oxy hóa quang học của tia UVA, UVB theo cơ chế làm giảm enzym chống oxi hóa do phơi nhiễm UVA, UVB gây ra, giảm lượng melondialdehyd, chống viêm…[30], [32]

̵ Chống viêm: do quercetin ức chế quá trình sản xuất leukotrien và prostaglandin,

ức chế tế bào lympho, đại thực bào [26]

̵ Chống dị ứng: quercetin ức chế mạnh sự giải phóng histamin từ tế bào ưa base[1]

̵ Ức chế quá trình sinh tổng hợp chất màu melanin trên da: quercetin ức chế hoạt động của enzym tyrosinase – là enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp chất màu melanin Do đó hoạt chất này được sử dụng khá phổ biến trong mỹ phẩm

và dược phẩm để điều trị các bệnh về da và làm đẹp [7]

1.1.5 Tác dụng

Quercetin được dùng để phòng và điều trị các bệnh dị ứng, ung thư (tuyến tiền liệt,

vú, dạ dày, ruột kết…), các biến chứng của bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch, bệnh gút, bệnh về mắt (bệnh về đục thủy tinh thể và thoái hóa điểm vàng) [17]

1.1.6 Liều dùng

̵ Mỗi ngày từ nguồn rau và quả cung cấp 15 – 40 mg quercetin

̵ Đối với mục đích điều trị dị ứng, chống viêm và một số bệnh khác, liều dùng từ

250 – 500 mg × 3 lần/ngày tùy vào tình trạng sức khỏe của bệnh nhân Ví dụ đối với bệnh dị ứng liều là 250 – 600 mg mỗi ngày, với bệnh mề đay mãn tính liều là 200 – 400

mg ngày chia 3 lần [17]

1.2 Tổng quan về phytosome

1.2.1 Khái niệm về phytosome

Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc hoạt chất dược liệu chuẩn hóa gắn với phosphopilid ở mức độ phân tử Nó có cấu trúc tương tự như màng tế bào, tương hợp sinh học cao và được vận chuyển vào nội bào một cách dễ dàng [22]

1.2.2 Thành phần cấu tạo của phytosome

Cấu tạo của phytosome gồm có hai phần: hoạt chất từ dược liệu thường ít tan trong nước và phospholipid

Hình 1.2 Cấu tạo của phytosome

khiết cao hơn và tương đối ổn định về mặt hóa học do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa no, giúp màng lipid bền vững hơn và hạn chế hiện tượng hỏng màng

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của HSPC 1.2.3 Ưu nhược điểm

Ưu điểm

Phytosome có các ưu điểm sau [8], [22], [28]

̵ Phytosome dễ tan trong cả dung môi thân dầu và thân nước, do đó làm tăng hấp thu dược chất, tăng sinh khả dụng đường uống, giảm liều dùng và tăng hiệu quả trong điều trị

̵ Phytosome được hình thành từ hoạt chất dược liệu và phosphopilid Phospholipid

có độc tính thấp, tương hợp sinh học tốt và có khả năng phân hủy sinh học Hoạt chất dược liệu ít tác dụng phụ hơn so với các hoạt chất tổng hợp hóa học, do đó thành phần của phytosome tương đối an toàn Đồng thời, hoạt chất liên kết với phospholipid bằng liên kết hóa học nên phytosome có tính ổn định hơn so với các dạng bào chế khác

̵ Hiệu quả nạp thuốc cao

̵ Hướng hoạt chất tới mô đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển vào nội bào

̵ Phosphatidyl không chỉ là chất mang thuốc mà còn có khả năng bảo vệ gan và có giá trị dinh dưỡng

̵ Đặc biệt, phytosome được sử dụng khá phổ biến trong lĩnh vực mỹ phẩm do có khả năng làm tăng tính thấm của dược chất qua da vì đặc tính thân dầu của phytosome giúp hoạt chất dễ dàng vượt qua lớp màng sinh học giàu lipid

Nhược điểm

Đa số các phương pháp bào chế phytosome thường sử dụng dung môi hữu cơ độc hại như methanol, dicloromethan… ảnh hưởng tới sức khỏe con người và môi trường [19], [27], [33]

1.2.4 Phương pháp bào chế phytosome

Trong quy mô phòng thí nghiệm, phytosome thường được bào chế theo hai phương pháp đó là kết tủa do thay đổi dung môi và bốc hơi dung môi

̵ Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi [26]

Tiến hành: phối hợp phospholipid (tổng hợp hoặc tự nhiên) và hoạt chất polyphenol

có nguồn gốc từ dược liệu với tỷ lệ dao động từ 0,5 – 2,0 trong môi trường phản ứng là dung môi aprotic như: dioxan, methylen chlorid, aceton…Khuấy từ hồi lưu trong một thời gian thích hợp Sau khi tạo thành phytosome, tiến hành phân lập phức hợp bào chế được bằng cách kết tủa do thay đổi dung môi khác không hòa tan phức hợp hoặc áp dụng phương pháp phun sấy

̵ Phương pháp bốc hơi dung môi

Tiến hành: phospholipid, hoạt chất và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp sau đó đưa vào cốc có mỏ hoặc bình đáy tròn của máy cất quay, tiến hành khuấy trộn trong khoảng thời gian thích hợp để hình thành liên kết trong phức hợp Kết thúc quá trình này, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách bốc hơi, và thu được lớp màng phytosome Từ lớp màng phytosome này có thể hydrat hóa trực tiếp trong bình cất quay tương tự như phương pháp Bangham tạo hỗn dịch phytosome thô, hoặc cũng có thể lấy phức hợp phytosome ra dưới dạng bột khô và tiến hành hydrat hóa ngoài bình cất quay [19]

1.2.5 Đánh giá phytosome

 Trong các nghiên cứu, phytosome thường được đánh giá các đặc tính như:

̵ Cấu trúc: được xác định nhờ kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoặc kính hiển vi điện tử quét (SEM) SEM cung cấp ảnh chụp hiển vi của bề mặt phytosome ở mức độ phóng đại phù hợp TEM cung cấp được hình ảnh cấu trúc bên trong của các tiểu phân phức hợp hoạt chất – phospholipid Các nghiên cứu vể hình thái bề mặt cho thấy thường các tiểu phân phytosome có hình cầu [28]

̵ Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân: xác định bởi phương pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS) và phổ tương quan photon (PSC) Trong đó, PSC có thể xác nhận được cấu trúc, kích thước của tiểu phân sau khi hydrat hóa [28]

̵ Độ ổn định của phytosome: đánh giá bằng cách xem xét kích thước tiểu phân và cấu trúc của phytosome sau một thời gian bảo quản

 Đánh giá hiệu suất phytosome hóa hay hiệu quả nạp thuốc (EE%)

̵ Trong các nghiên cứu trước đây, hiệu suất phytosome hóa được tính bằng cách

ly tâm để loại bỏ phần dược chất tự do lắng xuống, định lượng dược chất đã tạo phức ở phần dịch còn lại [27]

̵ Tuy nhiên, trong một vài nghiên cứu về phytosome cao bạch quả, hiệu suất phytosome hóa được thực hiện theo nguyên tắc sử dụng một dung môi hòa tan chọn lọc phức hợp phytosome của dược chất tự do – phosphoplipid, với dạng tự do không tan sẽ được loại bỏ bằng cách lọc [25]

1.2.6 Ứng dụng phytosome vào mỹ phẩm

Hiện nay, không chỉ được áp dụng trong nghiên cứu bào chế dược phẩm, công nghệ bào chế hiện đại còn được áp dụng ngày càng nhiều trong nghiên cứu bào chế và sản xuất mỹ phẩm, chế phẩm chăm sóc da Các dạng bào chế như liposome, niosome, dendrimer, nhũ tương nano hoặc nano lipid rắn, và cả phytosome đã và đang được phát triển đưa vào mỹ phẩm [10]

Sự già hóa da do hai nguyên nhân nội tại và bên ngoài cùng với các dấu hiệu như

có nếp nhăn, da mỏng, mất độ đàn hồi, sắc tố không đều, đốm nâu xuất hiện Rất nhiều thảo dược đã được đưa vào các chế phẩm ngăn ngừa già hóa da như quercetin, sylimarin,

aloe vera… nhưng sự hấp thu kém của các loại chế phẩm này làm giảm giá trị các thảo

dược Khi đưa chúng vào dạng bào chế phytosome – là phức hợp của hoạt chất với phospholipid sẽ làm tăng hiệu quả so với hoạt chất tinh khiết Trước hết, phospholipid bên cạnh việc hoạt động như một chất mang còn là thành phần thiết yếu của màng tế bào nên cũng đóng góp trong việc nuôi dưỡng da Các phytosome cho thấy sự cải thiện hấp thu tại chỗ của các phân tử hoạt chất cồng kềnh, cải thiện các chức năng của da như tái tạo collagen, cân bằng enzym mà không làm tổn thương lớp biểu bì [9] Phytosome còn tăng cường sự phân phối hoạt chất đến các mô da, tỷ lệ hấp thu từ phức hợp cao hơn đáng kể với việc đi qua lớp biểu bì thấm sâu vào trong da Phytosome có thể được xem như một ứng dụng kép khi vừa chứa hoạt chất có tác dụng lại cải thiện được hiệu quả của các hoạt chất [13] Trong tương lai, công nghệ phytosome còn có thể được phát triển hơn nữa khi ứng dụng vào các hệ trị liệu qua da [9]

Phytosome là một hệ phân phối thuốc mở ra cơ hội mới cho việc sử dụng các thành

phần hoạt tính trong lĩnh vực mỹ phẩm Phytosome G biloba đã được nghiên cứu để điều trị sự già hóa da kết hợp với lưu thông mao mạch bên ngoài Trong đó, cao từ G

biloba được sử dụng bằng đường uống để cải thiện tuần hoàn ngoại vi và phức hợp với

phospholipid của chúng dùng để cải thiện vi tuần hoàn da khi bôi tại chỗ [21]

Tác dụng của silymarin đã được chứng minh tăng hơn 6 lần khi sử dụng ở dạng phytosome silymarin trong các mô hình thử nghiệm qua da [13]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng sử dụng phức hợp hoạt chất – phospholipid có giá trị trong mỹ phẩm chăm sóc da cũng như tác dụng toàn thân khi dùng qua da

1.3 Tổng quan về gel

Các dạng thuốc dùng ngoài da được chia làm hai loại theo vị trí tác dụng: các thuốc dùng với tác dụng tại chỗ và tác dụng toàn thân Với tác dụng toàn thân, yêu cầu phải thiết kế công thức để dược chất, tá dược và các thành phần phụ khác phải có khả năng thấm sâu qua da vào tuần hoàn chung Tác dụng tại chỗ bao gồm bên trong hoặc trên bề mặt da, một số thuốc có tác dụng trên lớp sừng (biểu bì), một số khác lại gây ra tác dụng trên lớp trung bì hoặc hạ bì [29]

1.3.1 Định nghĩa

Dược điển Việt Nam V định nghĩa gel bôi da và niêm mạc là những chế phẩm thể chất mềm, sử dụng tá dược tạo gel thích hợp [3]

1.3.2 Phân loại tá dược tạo gel

Gel được chia làm 2 loại như sau [3]:

̵ Gel thân dầu (oleogels): trong thành phần sử dụng tá dược tạo gel, bao gồm dầu parafin phối hợp với tá dược thân dầu khác, có thêm keo silic, xà phòng nhôm hoặc xà phòng kẽm

̵ Gel thân nước (hydrogels): thành phần bao gồm nước, glycerin, propylen glycol,

có thêm các tá dược tạo gel như polysaccarid (tinh bột, tinh bột biến tính, acid alginic

và natri alginat), dẫn chất cellulose, polymer của acid acrylic (carbomer, carbome copolymer, carbomer interpolymer, methyl acrylat) và các chất vô cơ (magie – nhôm silicat)

1.3.3 Một số đặc điểm của tá dược gel thân nước

̵ Gel polysaccarid [2], [31]

Bao gồm các gel chế từ tinh bột, tinh bột biến tính, thạch, alginat, pectin Hiện nay,

sử dụng chủ yếu là natri alginat, ít dùng tá dược tá dược tinh bột, thạch, pectin Tuy nhiên tinh bột biến tính vẫn còn đang được sử dụng Với tá dược điều chế từ alginat

thường dùng các muối kiềm của acid alginic, được chiết từ rong biển, vì vậy dễ kiếm và giá thành rẻ, nồng độ sử dụng từ 5% đến 10% Khi dùng gel alginat cần chú ý độ nhớt

bị thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như pH, các muối kim loại… do đó thể chất của gel cũng bị thay đổi Các alginat bền vững trong khoảng pH từ 4 – 10

̵ Gel dẫn chất cellulose :

Ngày nay các dẫn chất của cellulose được sử dụng làm tá dược trong kĩ thuật bào chế các dạng thuốc rất phong phú Thường dùng các dẫn chất thân nước, trương nở trong nước tạo thành hệ keo như: methyl cellulose (MC), carboxymethyl cellulose (CMC), natri carboxy methyl cellulose (NaCMC), hydroxy propyl methyl cellulose (HPMC), hydroxy propyl cellulose (HPC), hydroxy propyl cellulose (HPC), hydroxy ethyl cellulose (HEC) Các tá dược này có ưu điểm là khá bền vững, có thể tiệt khuẩn mà không bị biến đổi về thể chất và có thể điều chỉnh pH bằng các dung dịch đệm Tuy nhiên các tá dược này dễ bị nhiễm khuẩn nên trong công thức bào chế thường cho thêm các chất bảo quản Nồng độ MC và CMC thường dùng từ 2% - 5%, NaCMC từ 2% - 7% Còn HPMC do tạo gel có độ trong tốt nên thường được dùng trong các chế phẩm dùng cho nhãn khoa [2]

̵ Gel carbomer (carbopol, carboxypolymethylen, carbovinyl polymer)

Tá dược này là sản phẩm trùng điệp cao phân tử của acid acrylic Các tá dược này

có dạng bột trắng không tan hoặc ít tan trong nước nhưng trương nở trong nước tạo gel,

có pH acid (dịch keo 1% có pH khoảng 3) Tùy thuộc cấu trúc phân tử mà có nhiều loại carbopol khác nhau Khi sử dụng carbopol thường dùng nồng độ nhỏ hơn 1% Thường được trung hòa bởi kiềm, có thể sử dụng natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd, phổ biến

là mono, di, triethanolamin Các gel này có độ nhớt cao hơn, đặc hơn và thích hợp hơn với dạng thuốc mỡ [2], [31]

Ưu điểm của carbomer: cho gel có thể chất đẹp, tạo được gel có độ nhớt cao ở nồng

độ thấp, khả năng tương thích với nhiều thành phần có hoạt tính nên dễ dàng kết hợp đưa vào chế phẩm, ổn định nhiệt tốt, khoảng độ nhớt rộng và chế độ chảy đặc trưng [20] Carbomer cũng đã được nghiên cứu và chứng minh có thể giúp tăng cường tính thấm qua màng tế bào biểu mô niêm mạc (ruột, mũi) Bằng cách kết hợp với ion Ca2+ tạo thành phức hợp làm nới lỏng hàng rào niêm mạc, kích hoạt mở các mối nối chặt chẽ của các mô niêm mạc dẫn đến mở rộng khe liên kết giữa các tế bào, giúp dược chất dễ dàng thấm qua màng sinh học Từ đó, carbomer được ứng dụng nhiều trong dược phẩm nhằm

tăng cường khả năng thấm của các dược chất thân nước Tất cả các polyacrylat đều cho thấy không có độc tính cấp khi tiếp xúc với niêm mạc Từ đó có thể đảm bảo độ an toàn cho chế phẩm [16], [18]

1.3.4 Ứng dụng của phytosome trong bào chế gel thuốc

Hiện nay, dạng gel được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thuốc và mỹ phẩm với mục đích kéo dài thời gian lưu thuốc tại vị trí bôi, giúp duy trì mức độ giải phóng thuốc trong một khoảng thời gian nhất định Tuy độ nhớt của gel được tạo ra nhờ các tá dược tạo gel nhưng chính mạng lưới polymer lại gây cản trở việc giải phóng các phân tử dược chất, làm chúng khó khuếch tán nhanh ra khỏi gel để gây tác dụng Chính vì vậy, để đảm bảo dược chất được giải phóng tốt và theo ý muốn cũng như làm tăng khả năng khuếch tán phân tử dược chất cần áp dụng nhiều biện pháp Một trong những biện pháp phổ biến hiện nay là tạo dẫn chất có kích thước micro hoặc nano; hoặc đưa hoạt chất vào liposome, phytosome; lợi dụng sự tương tác lẫn nhau giữa dược chất và polymer [14]

Rudra Pratap Singh và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về lawson – một loài thực vật

có chứa flavonoid với tính năng bảo vệ gan, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống oxy hóa và chống ung thư Lawson cũng có sinh khả dụng thấp vì tan kém trong nước đồng thời nhanh chóng bị thải trừ khỏi cơ thể Vì vậy, tác giả đã nghiên cứu ứng dụng bào chế phức hợp phytosome của lawson với lecithin đậu nành theo các tỷ lệ mol 1:1; 1:2; 2:1; 2:2 bằng các phương pháp khác nhau Sau đó, đưa phức hợp phytosome lawson từ công thức tối ưu nhất vào gel để ứng dụng dạng thuốc dùng qua da với tá dược tạo gel là Carbopol 934 Kết quả cho thấy phức hợp phytosome lawson cho hoạt tính kháng nấm cao hơn so với dạng chế phẩm chứa hoạt chất tinh khiết

và chế phẩm chứa ketoconazol chuẩn sau 3 ngày Đồng thời, nghiên cứu tính thấm và khả năng lưu giữ hoạt chất trên da chuột của gel chứa 2% khối lượng phức hợp phytosome lawson cho kết quả là có 92,91% hoạt chất thấm qua da sau 6 giờ, khả năng chống viêm tăng lên đáng kể so với gel chứa hoạt chất tinh khiết sau 4 giờ (p < 0,001) [33]

Julie Mariam Joshua và cộng sự (2018) đã nghiên cứu về chế phẩm chứa nước dừa, dịch chiết cây lô hội, dịch chiết hạt nho, vitamin E và dầu jojoba với mục đích ngăn ngừa lão hóa cho da Trong đó, dịch chiết hạt nho có chứa polyphenol chủ yếu ở dạng flavonoid có chất chống oxy hóa mạnh Các dạng bào chế thông thường như kem và gel

chứa các hoạt chất này cho thấy tác dụng chống lão hóa kém Do đó, tác giả đã tạo phức hợp phytosome bằng cách cho các thảo dược kết hợp với phosphatidylcholin Chín công thức khác nhau bao gồm kem chống lão hóa, gel, gel chứa phytosome với tỷ lệ các thành phần khác nhau đã được bào chế để so sánh Kết quả cho thấy gel phytosome là công thức tốt nhất để điều trị nếp nhăn và khắc phục nhược điểm trên da, đồng thời nó cũng cho khả năng thấm qua da tốt nhất Giá trị IC50 của kem, gel, gel chứa phytosome lần lượt là 70,5 µg/ml; 65,0 µg/ml; 47,0 µg/ml với giá trị IC50 càng thấp hoạt tính chống oxy hóa càng cao Công thức tối ưu nhất cũng được đánh giá so sánh với với gel được bán trên thị trường và kết quả cũng cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của gel phytosome cao hơn đáng kể Công thức tối ưu nhất đạt độ ổn định trong 45 ngày [15]

Rajashekar K và cộng sự (2018) đã nghiên cứu bào chế gel chứa phytosome

Woodfordia fruticosa với mục đích làm tăng sinh khả dụng và điều trị với tác dụng

kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa, giảm đau và chữa lành vết thương Thành

phần của dịch chiết Woodfordia fruticosa bao gồm quercetin-3-rhamnosid,

naringenin-7-glucosid, kaempferol-3-glucosid, acid ellagic và myricetin-3-galactosid Gel phytosome được bào chế với tá dược tạo gel là Carbopol 934, HPMC K4M, HPMC K100M Kết quả nghiên cứu cho thấy với công thức tỷ lệ dược chất: lecithin đậu nành

là 1:3 cho hiệu suất phytosome hóa lớn nhất là 89,15% Đồng thời, mẫu gel chứa 0,5% Carbopol 934 cho phần trăm giải phóng hoạt chất cao nhất là 69,3%, cao hơn nhiều so với gel chứa hoạt chất tự do là 48,3% Hoạt tính chống oxy hóa, ức chế gốc tự do của

phytosome Woodfordia fruticosa, gel chứa phytosome và hoạt chất tự do lần lượt là

56,3%; 52,1%; 49,1% [24]

Từ các nghiên cứu trên, có thể thấy xu hướng nghiên cứu gel chứa phức hợp phytosome đang ngày càng được phát triển, là dạng bào chế phù hợp cho đường dùng qua da, có triển vọng trong cải thiện khả năng thấm và hiệu quả tác dụng của hoạt chất

có nguồn gốc từ thảo dược

1.3.5 Một số chế phẩm gel chứa phytosome trên thị trường

Bảng 1.1 Một số chế phẩm gel chứa phytosome trên thị trường

Light legs gel Escin sitosterol phytosome -

một saponin triterpen

Quercevita Quercetin với phospholipid

chiết xuất từ hướng dương

phytosome

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Gel phytosome – quercetin

2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi nghiên cứu

Các nguyên vật liệu sử dụng, nguồn gốc và tiêu chuẩn được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu

phân tích

6 Phosphatidyl cholin đậu nành đã

18 Quercetin chuẩn đối chiếu, số kiểm

soát: QT10411106, hàm lượng 95,7%

Viện kiểm nghiệm thuốc

TP Hồ Chí Minh

Phân tích kiểm nghiệm

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

̵ Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RCT basic (Đức)

̵ Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern-Anh)

̵ Thiết bị siêu âm Qsonica Model CL - 334

̵ Máy đo quang phổ UV-Vis Hitachi U - 5100 (Nhật Bản)

̵ Hệ thống máy sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent

̵ Máy thử tính thấm Hanson Research (Mỹ)

̵ Cân phân tích Satorius BP121S, tủ sấy, sinh hàn, tủ lạnh, cân kĩ thuật, các dụng

cụ thủy tinh

2.2 Nội dung nghiên cứu

̵ Bào chế gel chứa phức hợp phytosome quercetin hàm lượng 0,1%

̵ Đánh giá một số đặc tính của gel chứa phytosome quercetin

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.2.1 Bào chế phytosome quercetin

Phytosome quercetin được bào chế theo phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi [5], [6]

̵ Cân và hòa tan quercetin, HSPC và cholesterol (tỷ lệ 1:1:0,2) vào ethanol tuyệt đối, khuấy từ hồi lưu ở nhiệt độ 80oC, tốc độ vòng 500 vòng/phút trong 16 giờ để tạo thành phức hợp

̵ Kết tủa phytosome quercetin bằng cách bơm nhanh từng đợt cách nhau 10 phút

1 thể tích pha ethanol thích hợp vào trong dung dịch NaCMC nồng độ 0,2 mg/ml ở nhiệt

2.3.1.2 Bào chế hệ gel chứa hỗn dịch phytosome quercetin

Gel chứa hỗn dịch phytosome quercetin được bào chế qua các bước sau:

̵ Hỗn dịch phytosome quercetin được điều chỉnh về nhiệt độ phòng (25oC)

̵ Cân các tá dược tạo gel, giữ ẩm, bảo quản

̵ Ngâm tá dược tạo gel vào nước để trương nở hoàn toàn Trường hợp sử dụng tá dược Carbopol 934 được trung hòa bằng triethanolamin

̵ Hòa tan chất bảo quản vào tá dược polyol giữ ẩm, rồi phối hợp vào hỗn dịch phytosome quercetin

̵ Phân tán đều hỗn dịch phytosome quercetin vào tá dược tạo gel đã ngâm trương

nở

̵ Bổ sung thêm nước vừa đủ thu được gel có hàm lượng 0,1% quercetin

̵ Khuấy từ nhẹ nhàng, liên tục 1 chiều đến khi tạo thành hỗn hợp gel mịn màng, đồng nhất

̵ Bảo quản trong lọ thủy tinh, đậy kín, tại nhiệt độ phòng

2.3.2 Phương pháp đánh giá

2.3.2.1 Định lượng quercetin

Quercetin được định lượng bằng hai phương pháp

 Phương pháp đo độ hấp thụ quang

Pha loãng quercetin trong methanol đến nồng độ thích hợp rồi đo quang tại bước sóng

370 nm

 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Điều kiện tiến hành sắc kí:

̵ Cột sắc kí: cột Apollo C18, kích thước cột 4,6 × 250 mm, đường kính hạt nhồi 5 µm; bảo vệ cột Apollo C18 (4,6 × 12,5 mm, 5 µm)

̵ Pha động: hỗn hợp dung môi acid phosphoric 0,2% : methanol (40 : 60 v/v)

̵ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

̵ Thể tích tiêm mẫu: 50 µl

̵ Detector: UV bước sóng 370 nm

Pha mẫu chuẩn và mẫu thử:

̵ Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 22,4 mg quercetin dihydrat (tương đương 20

mg quercetin) cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml methanol lắc siêu âm cho tan, thêm methanol vừa đủ cho tới vạch, lắc đều Hút chính xác 1,0 ml dung dịch vừa pha, cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ tới vạch, lắc đều Lọc dung dịch thu được qua màng lọc 0,45 µm

̵ Mẫu thử: Pha mẫu thử có nồng độ tương đương với nồng độ mẫu chuẩn Lọc mẫu thử qua màng lọc 0,45 µm

Hàm lượng quercetin trong chế phẩm được xác định bằng công thức:

Ct = 𝑆𝑡

𝑆𝑐 × Cc × k

Trong đó:

Ct: nồng độ quercetin trong hỗn dịch phytosome quercetin (µg/ml)

St: diện tích pic mẫu thử (mAU.s)

Sc: diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s)

k: hệ số pha loãng

2.3.2.2 Đánh giá hiệu suất bào chế hỗn dịch phytosome quercetin

Nguyên tắc: sử dụng ethylacetat là dung môi hòa tan tốt quercetin tự do, hòa tan kém phytosome quercetin Dùng ethylacetat để hòa tan quercetin tự do trong bột sản phẩm, phytosome quercetin không tan được loại bằng phương pháp lọc

Tiến hành:

̵ Loại hoàn toàn nước trong hỗn dịch bằng cách sấy trong tủ sấy chân không ở

50oC, 48 giờ, thu lấy bột

̵ Nghiền và rây bột qua rây 0,25 mm

̵ Cân chính xác một lượng bột phức hợp vào bình định mức 10 ml

̵ Thêm ethyacetat đến vạch, siêu âm 10 phút

̵ Điều chỉnh về nhiệt độ 25oC Bổ sung thể tích vừa đủ Lắc đều

̵ Lọc qua màng 0,2 µm để loại phần không tan, lấy dịch lọc

̵ Hút chính xác 1 ml dịch lọc Đem sấy ở tủ sấy chân không ở 40oC, 1 giờ để loại hết dung môi

̵ Hòa tan cắn vào methanol rồi định lượng bằng phương pháp HPLC đã được trình bày ở mục 2.3.2.1

Khi đó hiệu suất phytosome hóa được tính theo công thức:

H(%) = 100 – 𝑆𝑡 × 𝐶 𝑐 × 𝑘

𝑆 𝑐 × 10 6 × 𝑚𝑡𝑑 × 𝑃 × 100

Trong đó:

H : hiệu suất phytosome hóa (%)

St, Sc: lần lượt là diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.s)

2.3.2.3 Đánh giá đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin

 Hình thức

Đánh giá bằng cảm quan: hỗn dịch phytosome quercetin phải đồng nhất, có màu vàng xanh

 Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân

̵ Nguyên tắc: KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ laser Chiếu 1 chùm tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân được hứng lên 1 màn chắn Phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ ta có thể đánh giá được chuyển động Brown và đánh giá kích thước hạt nhờ phương trình Stock – Einstein

̵ Tiến hành: pha loãng hỗn dịch phytosome quercetin đến nồng độ thích hợp với nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,2 µm, tiến hành đo KTTP và chỉ

số đa phân tán bằng hệ thống thiết bị Zetasizer ZS 90 (để tốc độ đếm trong khoảng 200 – 400 kcps)

̵ Điều kiện đo:

+ Sử dụng cuvet nhựa trong suốt

+ Hệ số khúc xạ ánh sáng d = 1,3310

+ Nhiệt độ: 25oC

 Thế Zeta

̵ Nguyên tắc xác định thế Zeta: khi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển

về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỉ lệ với thế Zeta Tốc độ này được xác định dựa vào phân tích chuyển động của tiểu phân thông qua ánh sang tán xạ Thế Zeta được xác định dựa vào độ nhớt môi trường và định luật Smoluchowski – Huckel

̵ Tiến hành: tương tự phương pháp xác định kích thước tiểu phân

 Lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin

Lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin trên một đơn vị diện tích theo thời gian được tiến hành như sau:

̵ Điều kiện thử:

 Thiết bị: hệ thống giải phóng qua màng Hanson Research

 Màng giải phóng: màng cellulose acetat 0,45 µm

 Môi trường giải phóng: đệm phosphat pH = 6,8

 Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút

 Nhiệt độ: 32 ± 0,5 oC

 Mẫu thử: 0,3 ml hỗn dịch phytosome quercetin

̵ Tiến hành:

Lấy mẫu tại các thời điểm thứ t = 2; 4; 6; 12; 16; 20 giờ Thể tích mỗi lần lấy mẫu

là 1 ml Lấy mẫu đồng thời với bổ sung môi trường giải phóng vào ngăn nhận với thể tích tương ứng Mẫu lấy ra được pha loãng đến nồng độ thích hợp

̵ Xác định hàm lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin Sau từng khoảng thời gian thứ t = 2; 4; 6; 12; 16; 20 giờ lượng quercetin giải phóng từ hỗn dịch phytosome quercetin trên một đơn vị diện tích được định lượng bằng phương pháp HPLC và tính theo công thức:

1,767 × (7 × 𝑆𝑡+ ∑ 𝑆𝑖

𝑡 −1 1

) × 𝑘 × 𝐶𝑐

𝑆𝑐Trong đó

Sc: diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s)

- Thiết bị đo: Discovery Hybrid Rheometer (TA Instrument), với mô hình côn đĩa

có đường kính côn 4 cm và góc côn 4o

- Thể tích mẫu đo: 1,4 ml

- Mẫu được quét ở tần số 1 Hz, tại ứng suất 1 Pa ở 32 ± 1oC

- Mẫu được để ổn định 3 phút để điều chỉnh nhiệt độ của mẫu trước khi đo

- Thời gian đo: 120 giây

 Định lượng dược chất trong gel

Cách tiến hành:

Cân chính xác 0,1 g gel phân tán vào methanol, pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi định lượng hàm lượng hoạt chất quercetin bằng phương pháp HPLC đã được trình bày trong mục 2.3.2.1

 Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế Zeta của hệ gel

Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế Zeta của phytosome quercetin trong gel được xác định như sau:

Cân khoảng 1,0 g gel, pha loãng bằng 15 ml nước cất hai lần, khuấy trộn hòa tan các tá dược tạo gel rồi xác định KTTP bằng máy Zetasizer ZS 90 (để tốc độ đếm trong khoảng 200 – 400 kcps)

 Khả năng giải phóng quercetin từ gel bào chế

- Khả năng giải phóng quercetin từ gel được đánh giá tương tự như phương pháp đánh giá khả năng giải phóng hoạt chất từ hỗn dịch phytosome quercetin được mô tả trong mục 2.3.2.3 Trong đó, màng giải phóng hoạt chất bao gồm màng cellulose acetat 0,45 µm và da lưng chuột nhắt trắng nhưng thay 0,3 ml hỗn dịch phytosome quercetin bằng 0,5 g gel chứa phytosome quercertin với hàm lượng quercetin tương ứng

- Cách xử lý da chuột như sau:

Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, được cạo bỏ nhẹ nhàng lớp lông ở lưng sao cho không làm tổn thương lớp biểu bì, đảm bảo tính nguyên vẹn của da Bóc tách sạch vùng lớp

mỡ dưới da, rửa bằng nước muối sinh lý Ngay sau đó tiến hành đánh giá khả năng thấm quercetin qua da tương tự như mục 2.3.2.3

 Khả năng hấp thụ quercetin trong da chuột

- Khả năng hấp phụ quercetin trong da được xác định như sau:

Sau khi kết thúc quá trình đánh giá khả năng thấm quercetin qua da, phần da chuột được lấy ra, rửa sạch, dùng kéo cắt nhỏ miếng da cho vào cốc có mỏ 50 ml, thêm vào chính xác 5 ml methanol, tiến hành siêu âm 2 lần, mỗi lần 30 phút Ly tâm dịch sau siêu

âm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy phần dịch trong, lọc qua màng 0,45

µm Tiến hành chạy sắc kí như mục 2.3.2.1 Dựa vào kết quả pic thu được để tính lượng hoạt chất lưu giữ trên da trên một đơn vị diện tích