Nghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh Hóa (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh HóaNghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh HóaNghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh HóaNghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh HóaNghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh HóaNghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh HóaNghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh HóaNghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss. Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh Hóa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG VĂN NÂNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ SẢN XUẤT

SINH KHỐI SỢI NẤM LIM XANH (Ganoderma lucium (Leyss Ex

Fr.) Karst) CÓ NGUỒN GỐC TẠI THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái nguyên, năm 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG VĂN NÂNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ SẢN XUẤT

Fr.) Karst) CÓ NGUỒN GỐC TẠI THANH HÓA

Nghành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: GS.TS Ngô Xuân Bình

Thái nguyên, năm 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Ngô Xuân Bình và Ths Nguyễn Thị Tình, Giáo viên hướng dẫn thực hiện luận văn này

Đồng thời, tác giả cũng xin chân thành cảm ơn Khoa Công nghệ Sinh học, Khoa Sau Đại học, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tác giả trong quá trình học tập và nghiên cứu Cảm ơn các thầy cô và đồng nghiệp đã trao đổi cùng tác giả những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để giúp cho luận văn được hoàn thiện hơn

Bên cạnh đó, sự quan tâm của gia đình, bạn bè là nguồn động viên không thể thiếu để giúp tác giả hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018

Học viên

Hoàng Văn Nâng

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

1.1 Mục tiêu nghiên cứu: 3

1.1.1 Mục tiêu chung 3

1.1.2 Mục tiêu cụ thể 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Phân loại 5

1.2 Nguồn gốc 5

1.3 Tác dụng của nấm Linh chi 6

1.4 Đặc điểm hình thái, phân loại nấm Lim xanh 14

1.4.1 Nguồn gốc và phân loại nấm Lim xanh 14

1.4.2 Đặc điểm thực vật và phân bố naams Lim xanh 14

1.5 Tổng quan về phân lập 15

1.6 Nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi trong môi trường lỏng 16

1.6.1 Nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng 16

1.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ sợi nấm Linh chi 18

1.7 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong và ngoài nước 19

1.7.1 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi ngoài nước 19

1.7.2 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong nước 19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 23 2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trong môi trường lỏng 28 2.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên giá thể rắn 30

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 32 3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phân lập giống từ mô thịt nấm Lim xanh Thanh Hóa 32 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng sinh trưởng hệ sợi nấm

từ quả thể nấm Lim xanh 34 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng sinh trưởng hệ sợi từ quả thể nấm Lim xanh 36 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ quả thể 38 3.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường đến khả năng phát triển hệ sợi

từ nấm Lim xanh 40 3.1.6 Kết quả kiểm tra giống, đánh giá chất lượng giống nấm Lim xanh đã phân lập 41 3.2 Kết quả nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên môi trường lỏng 44 3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng sản xuất sinh khối nấm Lim xanh 44 3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh 46 3.3 Kết quả nghiên cứu thành phần giá thể nhân tạo đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh 49

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu mùn cưa

gỗ lim đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh 49

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn phụ gia đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh 50

3.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đạm đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh sau 90 ngày nuôi cấy 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh

trưởng của sợi nấm được phân lập từ quả thể 32 Bảng 3 2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến sự sinh trưởng của

hệ sợi nấm Lim xanh 34 Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến

khả năng sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh 37 Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến sự sinh

trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh 39 Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường đến sự sinh

trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh 41 Bảng 3.6: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng

sản xuất sinh khối nấm Lim xanh 44 Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân

sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh 47 Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn gỗ lim đến năng

suất và chất lượng của nấm Lim xanh 49 Bảng 3.9: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn cám ngô đến năng

suất và chất lượng của nấm Lim xanh sau 90 ngày nuôi cấy 50 Bảng 3.10: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn 10% cám ngô và

hàm lượng đạm đến năng suất và chất lượng của nấm Lim xanh sau

90 ngày nuôi cấy 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và nuôi

trồng tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 15 Hình 2.1 : Quy trình phân lập giống nấm Lim xanh 24 Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh phân lập

từ quả thể nấm ở các loại môi trường khác nhau 33 Hình 3.2: Nấm lim xanh phát triển trên một số môi trường cơ bản trong 13

ngày 33 Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các điều

kiện pH khác nhau 35 Hình 3.4 Sự sinh trưởng của nấm Lim xanh trên 3 môi trường có pH lần lượt

là 4; 6,5; 8 trong 12 ngày 36 Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các môi

trường có bổ sung cao nấm men với tỉ lệ khác nhau 37 Hình 3.6: Sinh trưởng của hệ sợi nấm trong môi trường A1: 2 g nấm men: A2:

4 g nâm men; A3 6 g nấm men (thí nghiệm quan sát sau 6 ngày nuôi cấy) 38 Hình 3.7: Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến

sinh trưởng của hệ sợi nấm 39 Hình 3.8 Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên môi trường: A1: 2g pepton/lít mô

trường, A2: 4g pepton/lít môi trường, A3: 6g pepton/lít môi trường 40 Hình 3.9 Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trên các môi trường có bổ sung các

loại đường khác nhau 41 Hình 3.10: Sơ đồ quy trình kiểm tra giống nấm Lim xanh đã phân lập 42

Hình 3.11: Kết quả kiểm tra hình thái quả thể nấm Lim xanh được thu thập từ

Thanh Hóa và nấm Lim xanh được nuôi trồng tại trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên 43 Hình 3.12: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng môi trường lỏng đến khả năng sản

xuất sinh khối nấm Lim xanh 45 Hình 3.13 Sự sinh trưởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các môi trường

CD và PD trong 6 ngày 46 Hình 3.14: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân

sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh 48

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU Việt Nam là một trong 16 quốc gia được đánh giá có sự đa dạng tài

nguyên sinh học đứng đầu trên thế giới Theo kết quả điều tra, Việt Nam có 12.000 loài thực vật, hàng ngàn loài động vật và nấm lớn Trong đó đã ghi nhận được 5000 loài thực vật và nấm lớn, 52 loài tảo biển, 408 loài động vật

và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc

Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trường sống khác nhau, đa phần sống ở trên cạn, nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở môi trường trong nước Dựa theo tỷ lệ giữa số loài nấm với số loài thực vật ở cùng một môi trường, người ta ước tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài Hiện nay có khoảng 80.000 loài nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện

và định danh Giới nấm ngày càng có ý nghĩa to lớn trong nền kinh tế quốc dân, trong khoa học cũng như trong vòng tuần hoàn vật chất Nấm đã được sử dụng trong dân gian từ hàng ngàn năm nay và một số có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người

Thanh Hóa là tỉnh có diện tích rừng lớn, có khu bảo tồn Pù Hu, Quan Hóa, Mường Lát, Thanh Hóa, Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, Khu bảo tồn thiên nhiên rừng sến, đây là tỉnh được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi lớn giá trị kinh tế và giá trị trong nghiên cứu khoa học từ các loài động thực vật Trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm

Từ xưa loài người đã biết sử dụng nấm lớn để làm thuốc đặc biệt là Linh chi Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc cách đây 4.000 năm Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi với nhiều cách khác nhau Đến nay khoa học phát triển loài người đã chứng minh được các tác dụng hữu ích

trong điều trị ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu virus, suy nhược thần kinh

Nấm Lim xanh (tên khoa học là Ganoderma Lucidum) là một dược liệu

quý với nhiều tác dụng tốt như chữa suy nhược thần kinh, các bệnh tim mạch, điều hòa huyết áp, giảm lượng đường và cholesterol trong máu, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể [1]

Nấm Lim xanh thuộc họ nấm gỗ mọc trên thân hoặc gỗ mục đã được khẳng định là loại dược liệu có ích cho sức khỏe con người Nấm Lim xanh là một loại dược liệu mà con người từ thời xa xưa đã biết dùng làm thuốc Sách Thần nông bản thảo xếp nấm Lim xanh vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm và bản thảo cương mục coi nấm Lim xanh là loại thuốc quý, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày)

Điều làm lên giá trị dược liệu (nấm Lim xanh) là cấu trúc đặc biệt có chứa 119 khoáng tố vi lượng trong đó có một số khoáng tố như germanium, vanadium, crom, polysaccharides và triterpenoids Các thành phần khoáng chất này đã được khẳng định là nhân tố quan trọng trong các phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch Trong các thành phần trên polysaccharide và germanium là hai thành phần quan trọng của nấm lim Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về polysaccharide và germanium trong nấm Lim xanh [7]

Polysaccharide trong nấm là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa

dạng và phức tạp Hàm lượng, cấu trúc và thành phần hóa học của polysaccharide phụ thuộc vào loại nấm, điều kiện sinh thái

Germanium hữu cơ trong nấm là các polymer thiên nhiên có tăng cường

khả năng vận chuyển oxy của máu, ức chế khối u phát triển và ngăn chặn các khối u không cho chúng lây lan sang các tế bào lành bệnh xung quanh [7]

Với phương pháp nhân invitro bằng hệ thống nuôi cấy lỏng đã được

khẳng định có hiệu quả cao trong việc nhân nhanh số lượng tế bào trong thời gian ngắn Không chỉ trên thế giới đã được ứng dụng kỹ thuật này vào sản xuất nhân sinh khối để sản xuất các hoạt chất sinh học như: Hàn Quốc nhân sinh khối rễ sâm, ở Việt Nam đã sử dụng hệ thống nuôi cấy lỏng nhân sinh khối một số loài thực vật có hoạt tính sinh học như nhân sinh khối cây Thông

đỏ, sinh khối cây Lô Hội, Viện Sâm nhân sinh khối rễ sâm Hiện tại việc nghiên cứu nhân sinh khối bằng hệ thống nuôi cấy lỏng đang được nghiên cứu

áp dụng đối với một số loài như tam thất hoang, hoàng tinh…[10]

Để phát triển các sản phẩm nấm của Việt Nam thành các sản phẩm chức năng có giá trị và được thực hiện ở quy mô lớn thì ngoài việc nuôi trồng theo phương pháp truyền thống việc nhân nhanh sinh khối để tách các hoạt chất có giá trị là cần thiết Việc thu hoạt chất có giá trị từ sinh khối là công nghệ mới

đã được ứng dụng ở các nước có trình độ sản xuất nấm tiên tiến như: Nhật, Hàn Quốc, Đài Loan,…tuy nhiên công nghệ này chưa được nghiên cứu ở Việt Nam Bằng các nghiên cứu chúng tôi thấy phương pháp này có nhiều tính ưu việt như: Có khả năng kiểm soát được chất lượng, hàm lượng, thành phần hoạt chất do kiểm soát chặt chẽ được các điều kiện dinh dưỡng và môi trường

nuôi cấy vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình

phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh Hóa”

1.1 Mục tiêu nghiên cứu:

1.1.1 Mục tiêu chung

Nghiên cứu được quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim

xanh (Ganoderma lucium (Leyss Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh Hóa

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân loại

Nấm Linh Chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay:

Tên khoa học: Ganoderma lucidum

Linh chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có

hàng trăm các loài khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là: Cổ Linh chi và Linh chi [12]

Linh chi rất phong phú về chủng loại, ước tính trên toàn thế giới có 200 loài Linh chi Riêng Trung Quốc có 84 loài, trong đó có 12 loài được dùng làm thuốc như Xích Linh chi, Tử Linh chi, Hắc Linh chi [14],[16]

Theo sách bản thảo cương mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh y của Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành 6 loại:

Thanh chi hay Long chi: màu xanh, vị chua, tính bình, không độc

Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi: màu đỏ vị đắng, tính bình, không độc Hoàng chi hay Kim chi: màu vàng, vị ngọt, tính bình, không độc

Bạch chi hay Ngọc chi: màu trắng, vị cay, tính bình, không độc

Hắc chi hay Huyền chi: màu đen, vị mặn, tính bình, không độc

Tử chi hay Mộc chi: màu tím, vị ngọt, tính ôn, không độc

Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh chi đầu tiên được tiến hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏ láng của nấm và đã phát hiện các chất như: esgosterol, các enzyme phenoloxidase và peroxidase

Theo phân tích của G Bing Lin thì thành phần hoá học của Ganoderma

14%), monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%), sterol (0,14 - 0,16%), các nguyên tố vô cơ như: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg,

Mn, Zn, Bi…[12]

Hiện nay người ta đã tìm được các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi như: Hoạt chất Beta–D-glucan, D-6, polysaccharide, ganoderic acid, oleic acid, lucidenol và triterpenoid [12]

1.3 Tác dụng của nấm Linh chi

Vai trò dược lý của nấm Linh chi rất lớn nhờ sự có mặt của các hoạt chất sinh học Nấm Linh chi được sử dụng như một dược liệu quý, kết quả nghiên cứu dược lý học hiện đại cho thấy, nấm Lich chi có tác dụng trên hệ tuần hoàn [19],[21],[22] Tác dụng trên hệ miễn dịch và chống ung thư [25] Chế phẩm nấm Lim xanh làm gia tăng quá trình sản xuất Interleukin-1 & 2, có tác dụng hạn chế sự phát triển của nhiều loại mô có hại [22] Tác dụng phòng, chống bệnh tiểu đường [21], cholesterol và đường trong máu [19] Làm giảm đường huyết và điều chỉnh rối loạn lipid máu Nấm Linh chi có chất Polysaccharides làm khôi phục tế bào tiểu đảo tuyến tụy và từ đó thúc đẩy quá trình tiết insulin [12], Tác dụng ngăn chặn quá trình lão hóa, giúp cơ thể tráng kiện Trong thành phần nấm Linh chi có chứa Acid ganoderic (dẫn chất triterpenoid) có

tác dụng như một chất oxy hóa khử các gốc tự do trong cơ thể chống lão hóa

Ổn định và cải thiện chức năng sinh lý của màng tế bào, tăng cường năng lực tổng hợp DNA, RNA và protein [26] Nhóm steroid trong nấm Linh chi có tác dụng giải độc gan, bảo vệ gan ngưng tổng hợp cholesterol, ức chế nhiều loại

vi khuẩn gây bệnh nên có hiệu quả tốt đối với bệnh về gan, mật như: Viêm gan mãn tính, viêm gan cấp tính, xơ gan, gan nhiễm mỡ [12] Nấm Linh Chi giúp bài tiết các độc tố trong cơ thể, có tác dụng loại bỏ các sắc tố lạ trên da, làm cho da dẻ đẹp, hồng hào, chống lại các bệnh ngoài da như dị ứng, trứng cá [23]

Về giá trị sử dụng làm thuốc của nấm Linh chi

Trong các nghiên cứu lâm sàng cho rằng nấm Linh chi cần được nghiên cứu và xem xét trong việc (1) phòng ngừa và điều trị bệnh ung thư ở những người

có nguy cơ ung thư cao (2) sử dụng chất bổ trợ trong công tác phòng chống di căn hoặc tái phát ung thư (3) thuốc giảm đau của bệnh ung thư và (4) sử dụng bổ trợ với hóa trị liệu đồng thời giảm thiểu tác dụng phụ, (5) có khả năng ngăn chặn quá trình hình thành khối u, (6) điều hòa huyết áp, (7) ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, (8) các bệnh về mạch máu não, (9) điều chỉnh lượng đường trong máu, (10) sản sinh chất chống oxy hóa và chất chống lão hóa hiệu quả[21][22][20]

Về thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Cấu trúc đặc biệt của Nấm Linh chi gồm 119 khoáng tố vi lượng trong

đó có một số khoáng tố như polysaccharides, germanium, Vanadium, crom,

và Triterpenoids đã được nghiên cứu Các thành phần khoáng chất này đã được khẳng định là nhân tố quan trọng trong các phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch [17]

Polysaccgaride là một hợp chất hữu cơ có chứa trong thực vật: quả, củ hoặc thân cây Trong thực vật, polysaccharide tồn tại dưới hai dạng: dạng không tan và dạng hòa tan Polysaacharide có trong thành phần một số thực vật điển

hình như: nhân sâm, nấm linh chi, nấm hương,… hợp chất cao phân tử có chứa hàng trăm thậm chí hàng nghìn mắt xích monoscacchride trong mỗi phân tử [2]

Polysacharide là những polime được tạo ra từ thiên nhiên hoặc nó có

thể là sản phẩm của phản ứng trùng ngưng các andozo hoặc xentozo

Polysacharide tồn tại ở các loại mạch như mạch hở, mạch không nhánh hoặc có nhánh, mạch vòng hay uốn khúc

Polysacharide thường được phân loại thành hai loại là omopolysacchride và heteropolysacchride

Homopolysacchride được tạo thành từ một loại monosacchride như tinh bột, xenlluose, glycogen

Heteropolysacchride được thành từ hai loại monosacchride trở lên như pectit, aga, hemixenllulose…

Trong dược tính của nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng thì hoạt tính dược học của polysaccharide là quan trọng và được nghiên cứu nhiều nhất

Thành phần polysaccharide hoạt tính sinh học chủ yếu thuộc nhóm Glucan Các chất này trong nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc

β-từ tự nhiên, là loại chất có khả năng điều chỉnh đáp ứng sinh học Là tác nhân điều hòa hệ thống bảo vệ miễn dịch tự nhiên quan trọng nhất, β - Gluccan từ nấm không giống với các loại sản phẩm từ tự nhiên khác mà β- Gluccan từ nấm được tinh khiết duy trì tác dụng sinh học cho phép chúng có hiệu quả ở mức độ phân tử và tế bào [20]

Năm 1980, tại Nhật Bản β- Gluccan trong nấm Linh chi đã chứng minh được khả năng kích thích máu tương tự chủ yếu tố kích thích các bạch cầu hạt đơn nhân Các thí nghiệm đều cho thấy rằng, hiệu quả tác dụng vào tế bào ung thư rất tốt, có thể làm giảm 70-95% trọng lượng khối u so với chúng Tuy

vậy, kết quả cho khả năng kháng, tác động tích cực tới khối u khi sử dụng kết hợp với chất kháng chống ung thư, còn nếu sử dụng riêng lẻ thì không thể làm khối u biến mất Qua đó, β- Gluccan có thể làm giảm sự phát triển của khối u, ngăn chặn khối u di căn Trái ngược với vi sinh vật, tế bào khối u cũng như các tế bào vật chủ khác, β- Gluccan là một thành phần không thể thiếu là một thành phần bề mặt để kích hoạt thụ thể bổ sung bắt đầu gây độc tế bào và giết chết tế bào khối u Điều này chỉ xảy ra khi có mặt β- Gluccan [20],[28]

Các hoạt tính của Polysaccharide có tác dụng kháng virus và điều hòa miễn dịch là do có ligmin, các chất kháng sinh; Lentinan là một polysaccharide có tác dụng phục hồi tế bào Lympho T, tăng sản xuất interferol [8]

Hoạt tính tăng khả năng miễn dịch

Hoạt chất Polysaccharide còn được nghiên cứu trong nấm hương, kết quả nghiên cứu cho thấy có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào Lympho T, Lympho B từ đó góp phần tăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân bị bệnh gan, giúp bệnh gan nhiễm mỡ máu chóng hồi phục các tế bào bị tổn thương nhanh chóng hơn [20]

Polysaccharide JSL-18 có trong nấm hương là tăng hoạt tính đại thực bào, tăng tiết IL-6 (Interleakin-6) Bên cạnh đó, trong nấm hương còn chứa các chất như Lentinacin, dezoxy lentinacin, 5’ –GMP, 5’ –AMP có tác dụng chống đông máu Ngoài ra, còn có chất eritadenine có hiệu quả làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu [5]

Với nhiều tác dụng như vậy việc tách chiết Polysaccharide được quan tâm và nghiên cứu ở nhiều loài nấm trong đó có nấm Linh chi Các nghiên cứu cho thấy Polysaccharides trong nấm tồn tại như một thành phần cấu trúc của vách tế bào nấm và việc lựa chọn phương pháp trích ly phụ thuộc về cấu trúc tế bào Một số phương pháp trích ly thu polysaccharides thông thường

như: Chiết bằng dung môi, bằng sử dụng nước nóng, giải pháp kiềm và phlyethylene glycol; và các phương pháp sử dụng sóng siêu âm Ngoài ra

Polysaccharide còn chiết bằng nước, kết tủa bằng etanol với quy trình như

sau: Quả thể nấm T microcaspus tươi (1kg) rửa sạch bằng nước Sau đó đun sôi nấm quả thế trong 250ml nước cất trong 12 giờ Hỗn hợp dịch chiết được

để qua đêm tại 4 độ C và được lọc qua vải lọc Sau đó, ly tâm ở 8000 rpm trong 45 phút tại 6 độ C để thu nhận dịch chiết sạch tạp chất Thu nhận lấy phần dịch nổi (200ml) và kết tủa trong ethanol theo tỉ lệ (1:5, v/v) ở nhiệt độ phòng Để kết tủa qua đêm tại 4 độ C, sau đó ly tâm ở 6 độ C trong 1 giờ Phần kết tủa thu được rửa sạch với nước cất và thẩm tách qua ống thẩm tách trong 6 giờ để loại bỏ các vật liệu có trọng lượng phân tử thấp Phần còn lại đem sấy khô [2]

Germanium đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các chất

khoáng (489 µg/g) có trong nấm Linh chi Chất này tồn tại rất ít ở các loại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm,

lô hội và tỏi [18] Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu, nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến [19] Germanium

có tác dụng chống lại các vi khuẩn nhất định Tồn tại dưới dạng hữu cơ, nó đang được đánh giá cao, và đưa vào nghiên cứu điều trị ung thư Germanium

có khả năng cải thiện và tăng cường hệ miễn dịch, tăng cường quá trình cung cấp oxy cho cơ thể, tiêu diệt các gốc tự do gây hại Nó cũng có tác dụng bảo

vệ cơ thể, chống lại các tia bức xạ từ môi trường Germanium không trực tiếp tấn công vào các tế bào khối u, mà kích thích hệ thông miễn dịch của cơ thể,

tự sản sinh ra các chất, và có khả năng ức chế sự hình thành và phát triển của khối u và các bệnh thoái hóa khác Hàm lượng Germanium hữu cơ có trong

nấm Linh chi được đánh giá là cao hơn những loại thảo dược khác Vượt trên

cả Germanium có chứa trong nhân sâm từ 5 – 8 lần [18]

Germanium hữu cơ có tăng cường khả năng vận chuyển oxy của máu, ức

chế khối u phát triển và ngăn chặn các khối u không cho chúng lây lan sang các

tế bào lành bệnh xung quanh [9]

Polysaccharide trong nấm Linh chi tăng cường hệ thống miễn dịch, kìm

hãm và ức chế sự phát triển và di căn của khối u, điều hòa huyết áp, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch và các bệnh về mạch máu não, kích hoạt sản sinh insulin, điều chỉnh lượng đường trong máu, cũng như sản sinh chất chống oxy hóa và chất chống lão hóa hiệu quả Chiết xuất Polysaccharide được sử dụng làm thành phần trong một số loại thuốc chống ung thư, chống tiểu đường hay thuốc trợ tim, tốt cho tim mạch, vv…[18]

Triterpene có tác dụng làm giảm các tác hại do rượu, bia hay thuốc lá

gây ra cho gan, phổi nên do đó bảo vệ gan, phổi; giết chết tế bào ung thư; làm giảm đau; giảm viêm; làm giảm cholesterol; ngăn ngừa đông cứng mạch máu; tăng cường chức năng gan và tiêu hóa Ngành sản xuất dược phẩm Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam và một số nước tại khu vực Châu Âu đã sử dụng thành phần Triterpene này vào sản xuất các loại thuốc giảm đau, thuốc ngùa tim mạch, thuốc bổ gan, [19]

Yếu tố vi lượng selenium Ngăn ngừa ung thư và làm giảm đau cho bệnh

nhân ung thư Ngoài ra selenium còn có tác dụng chống lão hóa, làm quá trình lão hóa xảy ra chậm, giúp cho làn da sáng mịn, giảm tàn nhang và các đốm thâm rám trên da cũng như hạn chế sự xuất hiện của nếp nhăn Hiện một số công ty mỹ phẩm cũng đang nghiên cứu và đưa vào sản xuất thành công các loại mỹ phẩm, các loại sản phẩm chăm sóc sắc đẹp như kem dưỡng da, sữa rửa mặt, kem làm trắng da, sữa dưỡng thể, … có thành phần là selenium chiết

xuất từ nấm Linh chi [9]

1.4 Tổng quan về sản xuất sinh khối ở nấm linh chi

Hiện nay các công trình nghiên cứu tách chiết các hợp chất mới được thực hiện ở nấm Linh chi Năm 1976 Polysaccharide đã được tách chiết ở Nhật và được bằng sáng chế dùng để điều trị ung thư Năm 1982 công ty Teikoko Chemical Industry tách chiết gốc glucoprotein có trong nấm Linh chi làm chất ức chế neoplasm và được nhận bằng sáng chế của mỹ do có khả

năng chống ung thư [19]

Linh chi sinh khối được chứng minh có chứa các thành phần hoạt chất quý cao gấp nhiều lần so với Linh chi sản xuất bằng phương thức truyền thống Thành phần chống khối u của nấm Linh chi của công trình đạt 18%, có trường hợp đạt 20-36%, trong khi nấm Linh chi từ các nơi khác, tức sản phẩm nấm dưới dạng quả thể to như cái đĩa, chỉ đạt 5-6% Đó là các enzym, kháng sinh, protein, 17 loại acid min, polysacharid (1-3 beta-D-glucan) [10] Không những thế, Linh chi sinh khối còn hơn hẳn công nghệ sản xuất nấm quả thể như thời gian thu hoạch ngắn Đặc biệt, giá bán của linh chi sinh khối cao gấp đôi quả thể, 600.000 đồng/kg so với 300.000 đồng/kg Khi sử dụng, không cần loại bỏ bã như nấm quả thể Trong số tám sản phẩm của công trình, đáng chú ý có sản phẩm mang tên Sinh linh và Bào tử nấm Linh chi Bào tử nấm Linh chi lâu nay bị nhiều người cho là không tốt nên thậm chí cho rửa trôi bào tử Các nhà khoa học trong nhóm đề tài làm ngược lại Họ cho thu hồi

và sử dụng chúng như một trong những sản phẩm chính Điều thú vị là chính những bào tử này chứa hoạt chất germanium có tác dụng làm giảm đau cho bệnh nhân ung thư Đặc biệt, khả năng bảo vệ tế bào khi đột biến gene (khi tế bào lành chuyển sang tế bào ác tính, tế bào ung thư) của Linh chi sinh khối cao hơn linh chi ở dạng quả thể Trong khuôn khổ hợp tác với Hàn Quốc theo nghị định thư cấp chính phủ thuộc Trường đại học Khoa học Tự nhiên, sản

phẩm sinh khối vừa được cấp cho 30 bệnh nhân ung thư gan tại BV Ung thư Trung ương dùng thử trong ba tháng để đánh giá tác dụng hỗ trợ chữa ung thư của sản phẩm độc đáo này Ưu điểm nổi bật về công nghệ của Linh chi sinh khối mà nhóm đề tài thực hiện chính là ở chỗ công nghệ đơn giản trong khi sản phẩm có hoạt chất sinh học cao như nêu qua ở trên Không cần máy móc đắt tiền, các nhà khoa học có thể giúp bà con sản xuất sinh khối quanh năm và không phải theo thời vụ Các nước phát triển cũng đã và đang sản xuất Linh chi sinh khối và đúng là họ đi trước ta từ lâu Song công nghệ của họ phức tạp, đắt và vì thế, không phù hợp với hoàn cảnh hiện tại ở Việt Nam

Trung Quốc được coi là cái nôi phát hiện nấm Linh Chi Ngay từ đầu thế

kỷ 17 (1621), nấm Linh chi đã được biết đến, nuôi trồng và sử dụng như nguồn dược liệu quý Nấm Linh chi hay gặp ở nơi có khí hậu lạnh như Tứ Xuyên, Phúc Kiến, Quảng Đông Quốc gia này được coi là trung tâm lớn

nhất thế giới về nuôi trồng và sản xuất nấm Linh chi Hàng năm, trên thế giới

sản xuất 4300 tấn nấm Linh chi, riêng Trung Quốc chiếm 3000 tấn, còn lại là Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Mỹ, Malaysia, Việt Nam, Indonesia và Srilanka Đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Linh chi Trước những lợi ích to lớn từ Linh chi, nhiều cơ

sở nuôi trồng nấm Linh chi đã được xây dựng đặc biệt là Linh chi đã được nuôi trồng trên quy mô công nghiệp ở Mỹ Ngoài ra tại Mỹ, Viện nghiên cứu nấm Linh chi quốc tế đã được thành lập ở New York [21]

Nấm Linh chi, từ nhiều ngàn năm nay đã được trọng dụng ở Á Đông, hiện nay Linh chi là một trong những đề tài nghiên cứu và ứng dụng đang được quan tâm của ngành y dược Âu Mỹ [8] Nấm Linh chi được xếp vào nhóm thuốc bổ có khả năng giúp tăng lực, đây là một thực tế không thể chối cãi, sau khi sử dụng nấm Linh chi Điều này không chỉ căn cứ vào cảm giác

chủ quan của người dùng, mà dựa trên các tiêu chuẩn khoa học khách quan và theo kết quả của hàng trăm công trình nghiên cứu từ châu Á sang châu Âu [9] Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi Theo công trình nghiên cứu gần đây, thành phần chủ yếu của các loại Linh chi có: Acid amin, protid, steroid, polysaccharide, germanium (cao hơn lượng germanium trong Nhân sâm 5 - 8 lần), acid ganodenic [16]

1.4 Đặc điểm hình thái, phân loại nấm Lim xanh

1.4.1 Nguồn gốc và phân loại nấm Lim xanh

Trong đó nấm Lim xanh thuộc nhóm Hồng chi có tên khoa học là

gỗ Keo, Bồ Đề, Phượng Vĩ,… có cả những loài mọc trên thân gỗ lim đã mục, người ta gọi là nấm Lim xanh

1.4.2 Đặc điểm thực vật và phân bố naams Lim xanh

- Nấm Lim xanh là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thường ký sinh trên các cây gỗ lâu năm, một số loài cây chết mục, thường gặp chúng trên cây Lim Nấm thường có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong tự nhiên, nấm thường chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [12]

- Lim xanh có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm Cuống nấm biến

dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hoặc rất dài 20-25cm Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do quá trình lên tán mà thành

- Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng như láng vecni Kích thước tán biến động từ 2 - 30cm, dày 0,8 - 2,5cm

- Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt Nấm mềm, dai khi tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống [14]

Nấm Lim xanh được thu thập

từ Thanh Hóa

Nấm Lim xanh được nuôi trồng tại Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Hình 1.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và

nuôi trồng tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

1.5 Tổng quan về phân lập

Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thu Hằng và Lê Xuân Thám trong phân lập nấm Vân chi, có nhiều cách để phân lập tạo giống gốc nhưng hiệu quả nhất là phân lập từ quả thể Vì đây là phương pháp nhân giống vô tính, trong khi tách hệ sợi nấm thì không rõ có đúng là nấm cần phân lập hay nấm mốc, nấm dại khác Còn dùng bào tử nấm cũng không đơn giản vì đây là giai đoạn sinh sản hữu tính, nên nấm hình thành có thể thay đổi đặc tính Ngoài ra phương pháp phân lập từ quả thể hạn chế được hiện tượng bị lẫn hay nhiễm tạp các loại vi sinh vật khác do sử dụng trực tiếp các mô thịt nấm Nguyên tắc của phương pháp này là chọn tai nấm điển hình ở giai đoạn

trưởng thành để đánh giá chất lượng giống Mô thịt nấm tách ở những vị trí kín đáo, ít tiếp xúc với các nguồn bệnh nhất

Môi trường phân lập là môi trường dinh dưỡng bao gồm ba thành phần

cơ bản: Đường: 2 – 3 %, thạch: 2% và chất bổ sung: Nước chiết (lấy từ các nguồn tự nhiên như khoai tây, nước giá, cà rốt…) và hóa chất (chủ yếu là các chất khoáng N, P, K…) [11]

Khi có được giống thuần, cấy sợi nấm từ môi trường phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để giữ giống Môi trường giữ giống

có thể giống với môi trường phân lập Khi giữ giống, bảo quản ống nghiệm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 đến 10 độ C và mỗi tháng cấy lại một lần [3],[15]

1.6 Nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi trong môi trường lỏng

1.6.1 Nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng

Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật

Khái niệm: Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có sục khí để bổ sung thêm oxy hoặc nuôi tĩnh Giống vi sinh vật sau khi cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang phát triển qua pha lũy thừa (pha log) Trong pha lũy thừa, vi sinh vật phát triển nhanh chóng và đạt cực đại, lượng vi sinh vật ngày càng tăng lên nhưng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy nếu không được bổ sung thêm vào đó ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt độ tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường có thể trào

ra khỏi bình men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn

Vi sinh vật trong quá trình lên men phát triển theo 4 pha: pha tiềm phát (pha lag) pha lũy thừa (pha log), pha ổn định, pha suy vong

Pha tiềm phát: Khi cấy các tế bào sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi Trong giai đoạn

này vi sinh vật làm quen với môi trường để thích nghi dần với điều kiện môi trường mới

Pha log: Cuối pha tiềm phát các tế bào đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ, quần thể vi sinh vật chuyển sang lũy thừa, pha phát triển số lượng vi sinh vật mạnh nhất

Pha ổn định: Sau khi đồng hóa các chất dinh dưỡng hay sau khi tích lũy các sản phẩm trao đổi chất, sinh trưởng của vi sinh vật giảm xuống hay hoàn toàn ngừng lại Trong pha ổn định này sinh khối có thể còn tăng chậm hoặc không đổi

Pha suy tàn: Đặc trưng của pha này là các chất dinh dưỡng đã bị cạn kiệt Lượng chất dinh dưỡng trong môi trường bị suy giảm, có thể thiếu một số chất dinh dưỡng, trong khi chất thải từ vi sinh vật thải ra ngày càng tăng mà không được bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy, do đó các tế bào

vi sinh vật chết dần

Lên men bổ sung ứng dụng cho các trường hợp sau: Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định, nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi, cần bổ sung chất dinh dưỡng liên tục

Môi trường nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng

Môi trường dinh dưỡng cần cho nấm Linh chi và hệ sợi nấm Linh chi phát triển cần một số nguồn dinh dưỡng thiết yếu như sau:

Về nguồn Cacbon: Nấm Linh chi có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đường đa [4]

Về nguồn nitơ, nấm Linh chi có thể sử dụng ni tơ hữu cơ như protein, peptide, acid amin hay ure hoặc đạm vô cơ như các muối amon [4]

Tỷ lệ C : N trong môi trường ở giai đoan nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1 Nhưng tỷ lệ C : N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1 Theo

nghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thì

tỷ lệ C : N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1

Về nhu cầu yếu tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm Linh chi còn cần một

số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn [16]

Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cacbon, nito, chất khoáng…đáp ứng cho sự phát triển của hệ sợi nấm [16]

1.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ

s ợi nấm Linh chi

Nấm Linh chi thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quá trình nuôi hệ sợi nấm Linh chi nên bổ sung oxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí Bào tử nấm sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) khoảng 24 giờ, rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log) Cuối pha lag các bào

tử nấm đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh

mẽ Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng Nên phải cấp khí oxy bằng cách lắc ở quy mô phòng thí nghiệm và dùng thiết bị sục khí như khuấy, sục khí ở quy mô sản xuất để tăng hiệu suất lên men cao tạo sinh khối sợi nấm Linh chi Bào tử nấm Linh chi nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 22oC-26oC Trong điều kiện khô hạn ở 70oC bào tử đảm của nấm sẽ bị chết sau 5 giờ Nếu ở 80oC thì sẽ chết chỉ sau 10 phút Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Linh chi [1]

1.7 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong và ngoài nước

1.7.1 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi ngoài nước

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh Chi Theo công trình nghiên cứu, thành phần chủ yếu của các loại Linh Chi có: Acid amin, protid, steroid, polysaccharide, germanium, acid ganodenic [27]

Gần đây, các nghiên cứu tiếp tục thử nghiệm các kỹ thuật nuôi cấy chìm để nuôi cấy sợi nấm và thu hàm lượng polysaccharide Linh chi Kết quả cho thấy, sinh khối nấm Linh chi cho kết quả tốt nhất ở nuôi cấy chìm, đã thu được 12,4 g/L sinh khối nấm khô sau 48 ngày [28]

Theo tác giả Hyun Mi Kim (2006) đã nghiên cứu điều kiện tối ưu hóa môi

trường nuôi cấy chìm Ganoderma resinaceum để tăng cường sản xuất sinh khối

và exopolysaccharide (EPS) Sự tăng trưởng sợi nấm tối đa và sản xuất EPS trong môi trường có chứa 10g/l glucose, pepton 8g/l đậu nành và MnCl2 tại pH ban đầu 6,0 và nhiệt độ 31oC Năm loại EPS khác nhau với trọng lượng phân tử khác nhau, từ 53.000 đến 5.257.000 g/mol thu được ở một trong hai giai đoạn tủa với ethanol Nồng độ tối đa của sợi nấm sinh khối (42,2 g/l) và EPS (4,6 g/l) thu được vào ngày thứ 6 với hàm lượng đường bổ sung vào môi trường là 50g/l [24]

1.7.2 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong nước

Từ thập niên 80, nấm Linh chi mới thực sự nuôi trồng nhiều ở Việt Nam Ngoài ra, còn thấy 15 loài nấm Linh chi mọc hoang dại ở rừng Bắc Kạn, Thái Nguyên, Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Gia Lai, Đăk Lắc Tại hội nghị kết quả công tác chuyển giao công nghệ nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu, theo tài liệu đã được công bố tới nay có 32/61 tỉnh thành có cơ sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) Hiện nay có rất nhiều Viện, Trung tâm nghiên cứu về nấm Linh Chi ở cả Bắc

và Nam nhằm lựa chọn những chủng có năng suất cao, phẩm chất tốt, phù hợp với khí hậu và đặc biệt có thể phổ biến đại trà cho các cơ sơ nuôi trồng ở một số nơi để tận dụng nguồn nguyên liệu cellulose có sẵn, tăng thu nhập cho người lao động Nhưng sản lượng nấm và sản phẩm nấm đã qua chế biến không đáp ứng đủ nhu cầu do Việt Nam mới chỉ tập trung vào điều tra, sưu tập, nêu đặc điểm phân loại, điều kiện sinh thái, các hoạt chất chính có trong nấm và chưa quan tâm nhiều đến kỹ thuật nuôi trồng, trích ly các hoạt chất sinh học có giá trị trong nấm Linh chi và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng [11], [13]

Hiện nay, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, các Trung tâm, viện nghiên cứu, doanh nghiệp sản xuất nấm đã đi sâu vào nuôi trồng, sản xuất thực phẩm chức năng từ nấm Linh chi như: Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn đã đưa chương trình nấm quốc gia với mạng lưới lan rộng trong cả nước và kinh phí đầu tư xấp xỉ 70 tỷ đồng từ ngân sách nhà nước để hoàn thiện bộ giống nấm quốc gia và các quy trình sản xuất, chế biến nấm [11] Viện Di truyền là một trung tâm nghiên cứu nấm mạnh nhất cả nước, hiện tại viện đã phân lập và tạo ra nhiều giống nấm có giá trị cũng như làm chủ nhiều quy trình nuôi trồng Các giống nấm của viện đã được thương mại hóa trên toàn quốc

Hiện nay trong nước cũng rất quan tâm và có khá nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Nhóm nghiên cứu Viện Công nghệ thực phẩm của T.S Trương Thị Hòa

trong nghiên cứu “Trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi” đã đã xác

định được phương pháp trích ly các hoạt chất sinh học sử dụng cho công nghệ sản xuất rượu bổ Phương pháp trích ly bằng ethanol với tỷ lệ dung môi / nguyên liệu là 1/10 đạt hiệu suất cao (8,8%) khi chiết lần 1 bằng ethanol 960, lần 2 bằng ethanol 700, lần 3 bằng ethanol 450 Ngoài ra còn sử dụng enzyme

Novozyme 342 (hỗn hợp của enzyme cellulase và hemicellulase) đạt hiệu suất cao nhất (10,2%) ở điều kiên nhiệt độ 600C, nồng độ enzyme 0,21% trong 120 phút Ưu điểm của phương pháp trích lý bằng enzyme là cho hiệu suất trích ly cao, thời gian trích ly ngắn, nhiệt độ trích ly thấp, không ảnh hưởng tới một số hoạt chất sinh học mẫn cảm với nhiệt độ cao [9]

Theo kết quả của Nguyễn Thị Minh Tú trong nghiên cứu “Quy trình tách

chiết các hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” với dung môi là nước quá

trình chiết đạt tối ưu ở nhiệt độ 800C, thời gian chiết 7h, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 thì hàm lượng chất chiết thu hồi đạt 6,91% [12]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Linh chi (Lim xanh) thu thập từ tỉnh Thanh hóa

Vật liệu nghiên cứu là: Cuống nấm, mô thịt nấm Lim xanh thu nhập

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại

học Nông Lâm Thái Nguyên

- Nội dung 2: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trong môi

trường lỏng

- Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên giá

thể rắn

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thu nhận quả thể tươi, cho vào hộp đựng mẫu đã được chuẩn bị sẵn để

di chuyển về phòng thí nghiệm, xử lý quả thể với cồn 70o Bảo quản quả thể nấm ở nhiệt độ 5oC

* Phương pháp phân lập giống gốc

+ Dùng cồn 70 độ xử lý quả thể, nhằm mục đích loại bỏ một số vi sinh vật và nấm mốc Cắt quả thể thành những mảnh có kích thước từ 0.5 – 1cm để cấy vào môi trường nghiên cứu [25]

+ Nuôi trong điều kiện không có ánh sáng, nhiệt độ 22 – 28oC, độ ẩm 60-70% theo dõi sau 3 ngày sau cấy mẫu [25]

*Thí nghiệm 1 : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát sinh hệ sợi nấm từ mô thịt nấm

Môi trường khoai tây (PDA)

Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

Hình 2.1 : Quy trình phân lập giống nấm Lim xanh

Môi trường nghiên cứu

Mô thịt, cuống nấm Đ ổ môi trường ra đĩa petri vô

trùng để nguội

Loại bỏ những mẫu nhiễm khuẩn,nhiễm mốc, sợi phát triển yếu, chậm hơn so với những mẫu cấy cùng đợt

Nuôi s ợi trong điều kiện 22 o C –

28 o C ánh sáng mờ hoặc không

có ánh sáng

Kiểm tra chất lượng giống sau 2 ngày cấy,định kỳ kiểm tra 2 – 3 ngày 1 lần, thời gian 12 -15 ngày

Giống gốc đạt tiêu chuẩn

Loại bỏ bụi bẩn ở quả thể nấm bằng cồn 70 o

-

- Bước 1: Cân lấy 200g khoai tây đã được rửa sạch, gọt vỏ rồi cắt nhỏ thành hình khối khoảng 1cm

- Bước 2: Cho khoai vào nồi rồi thêm khoảng 800ml nước cất, đun sôi khoảng 10 - 15 phút

- Bước 3: lọc bỏ cặn

- Bước 4: Bổ sung đường, Agar, Pepton, rồi chuẩn lên 1 lít

- Bước 5: Chuẩn pH = 6.5

- Bước 6: Cho vào bình tam giác rồi hấp khử trùng (121oC trong 30 phút)

Môi trường ngô (CDA):

Môi trường PDA + nước dừa

Thành phần nguyên liệu: Nước dừa trưởng thành, khoai tây

1 Nước dừa già: 100 ml

* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ mô thịt trên môi trường PDA

pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của các loài nấm Mỗi loài nấm có thể sinh trưởng trong khoảng pH thích hợp khác nhau Vì vậy, việc nghiên cứu pH thích hợp cho nấm Lim xanh là cần thiết Thí nghiệm sau sẽ được tiến hành với các thang pH khác nhau như sau:

Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng phát triển hệ sợi nấm

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại Chỉ tiêu theo dõi: Khả năng phát triển của hệ sợi nấm từ mô thịt/ môi trường phân lập, sự phát triển của hệ sợi nấm, màu sắc hệ sợi nấm

* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ mô thịt

Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ mô thịt

(g/l)

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại

* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ mô thịt

Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hệ sợi nấm từ mô thịt

(g/l)

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại

* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của đường đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ mô thịt

Thí nghiệm gồm 1 nhân tố, bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD)

Nghiên cứu ảnh hưởng của loại đường đến khả năng phát triển hệ sợi nấm

Thí nghiệm 6 : Đánh giá sự thành công trong quá trình phân lập giống nấm lim xanh Thanh Hóa

Để đánh giá sự thành công của quá trình phân lập chúng tôi sử dụng phương pháp so sánh hình thái quả thể nấm và cây nấm

Phương pháp này như sau :

Hệ sợi nấm sau khi phân lập được (giống cấp 1 được đưa vào nuôi cấy trong môi trường hạt có chứa 200gam thóc bổ sung 0,5 gam cao nấm men, 0,5 gam pepton, 100mg vitamine B 1, sau đó cấy giống cấp 1, để 10 – 20 ngày khi hệ

sợi nấm ăn hết chai hạt thì tiến hành đưa môi trường hạt chuyển sang môi trường cọng, môi trường cọng là môi trường có chứa mùn cưa gỗ tạp (78kg)

bổ sung 5 kg vôi bột, 5 kg cám gạo, 2 kg đạm, 10 kg mùn cưa gỗ lim, tiến hành phối trộn nguyên liệu đóng bịch và hấp nguyên liệu, sau đó nguyên liệu được đưa vào phòng vô trùng làm giảm nhiệt độ an toàn cho hệ sợi nấm rồi tiến hành cấy giống, sau 30 – 40 ngày khi hệ sợi nấm ăn kín bịch tiến hành bỏ nút lọ để quả thể nấm phát triển, sau đó tiến hành so sánh hình thái, màu sắc quả thể, hình dáng mũ nấm, thân nấm,…

2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trong môi trường lỏng

Trong các thí nghiệm trong nội dung này chúng tôi sử dụng phương pháp nhân giống nấm dịch thể theo Yan – Chang wei (2003) [30] Các thí nghiệm được bố trí như sau:

* Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh

Thí nghiệm gồm 1 nhân tố, bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD)

Qui ước công thức như sau

Chỉnh pH= 6,5

G iống cấp 2

Lắc 100 vòng/phút trong 7-12 ngày

Chúng tôi xây dựng quy trình nuôi cấy sinh khối giống nấm lim xanh như sau:

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình nuôi sinh khối hệ sợi nấm Lim xanh

Pha môi trường PD ( thành phần môi trường được nêu rõ ở phụ lục 3) chuẩn

- Nuôi lắc ở các điều kiện: 100 vòng/ phút, nhiệt độ 23 o C trong 7 – 12 ngày

- Thu sinh khối nấm Lim xanh

Phương pháp xác định trọng lượng khô của sinh khối sợi nấm được sử dụng bằng phương pháp sấy đông cô

Trong quá trình nuôi giống nấm trong môi trường dịch thể, ban đầu hình thành các mảnh sợi nấm nhỏ liti, sau đó sợi nấm lớn lên liên kết lại với nhau tạo thành viên hình cầu có kích thước khác nhau, các thể hình cầu này được gọi là khuẩn lạc cầu Sau thời gian nuôi cấy tiến hành sử dụng phương pháp sấy đông cô để thu chất khô trong dung dịch nuôi cấy Khi ẩm độ 13% thì tiến hành cân khối lượng các bình nuôi cấy thu được

2.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên giá thể rắn

* Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu mùn cưa gỗ lim đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh

Thí nghiệm gồm 1 nhân tố, bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) Qui ước công thức như sau

* Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn phụ gia đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh

Trong thí nghiệm này gồm có 4 công thức Công thức đối chứng là công thức tối ưu nhất được chọn từ thí nghiệm 8

* Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đạm đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh

Từ thí nghiệm 10, chọn công thức cho năng suất và chất lượng tốt nhất

để làm công thức đối chứng cho thí nghiệm này