MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINHCỦA BA GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HEO VÀ BÒ

TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh của một số loài vi khuẩn phân lập từ vật nuôi” được tiến hành tại phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản và Môi Trường Sức K

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI -THÚ Y

**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINHCỦA BA GIỐNG VI

KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HEO VÀ BÒ

Họ và tên sinh viên : NGUYỄN THỊ HẢI LINH MSSV : 05142037

Ngành : Dược thú y

Niên khóa : 2005 – 2010

Tháng 08/ 2010

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI -THÚ Y

**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA 3 GIỐNG VI

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI -THÚ Y

**************

NGUYỄN THỊ HẢI LINH

MỨC ĐỘ MẪN CẢM VỚI KHÁNG SINHCỦA 3 GIỐNG VI

KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HEO VÀ BÒ

Khóa luận được đệ trình để áp ứng yêu cầu cấp bằng bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS VÕ THỊ TRÀ AN

Tháng 08/ 2010

PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Nguyễn Thị Hải Linh

Tên khóa luận : “Mức độ mẫn cảm với kháng sinh của 3 giống vi khuẩn phân lập từ heo và bò”

Sinh viên đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn

và các ý kiến đóng góp của hội đồng chấm bảo vệ luận văn tốt nghiệp ngày

Giáo viên hướng dẫn

LỜI CẢM ƠN

 Xin tỏ lòng biết ơn:

Con xin tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, Người đã sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ và động viên con trong suốt thời gian qua

 Lời cảm ơn sâu sắc:

- TS Võ Thị Trà An, Người giáo viên đã tận tình, hướng dẫn và động viên tôi trong cuộc sống cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

- Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM

- Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y, cùng toàn thể quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian thực tập

 Xin cảm ơn:

Đến tất cả các bạn lớp Dược Thú Y 31 đã chia sẽ cùng tôi những vui buồn trong học tập, luôn bên cạnh động viên, trợ giúp tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp

Nguyễn Thị Hải Linh

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài “Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh của một số loài vi khuẩn

phân lập từ vật nuôi” được tiến hành tại phòng thực hành Kiểm Nghiệm Thú Sản và

Môi Trường Sức Khỏe Vật Nuôi, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, thời gian từ 10/2009 đến 6/2010

Qua phân lập 22 mẫu sữa bò và 15 mẫu dịch mũi heo chúng tôi thu được một

số kết quả

Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus spp trong mẫu sữa bò là 90,91%, còn trong mẫu dịch mũi heo là 80% Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp trong mẫu

sữa bò là 36,36% và trong mẫu dịch mũi heo là 40%

Thực hiện kháng sinh đồ trên 32 chủng Staphylococcus spp, 14 chủng Streptococcus spp và 20 chủng Salmonella cho thấy Staphylococcus spp có mức độ

nhạy cảm cao nhất với kháng sinh vancomycin, ciprofloxacin, rifamycin,

gentamicin, cephalothin Streptococcus spp có mức độ nhạy cảm cao với kháng sinh doxycycline, penicillin, rifamycin, chloramphenicol Salmonella có mức độ nhạy

cảm cao với kháng sinh nitrofurantoin, cefepime, cefotaxime, ciprofloxacin

Kháng sinh tetracycline đã không còn hiệu quả (trong phòng thí nghiệm) với

Salmonella

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt luận văn vi

Mục lục vii

Danh sách các từ viết tắt v

Danh sách các bảng vi

Danh sách các hình vii

Danh sách các sơ đồ xi

Danh sách các biểu đồ xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Sơ lược về vi khuẩn 3

2.1.1 Salmonella 3

2.1.2 Staphylococcus 5

2.1.3 Streptococcus 8

2.2 Những kiến thức cơ bản về kháng sinh 11

2.2.1 Khái niệm 11

2.2.2 Phân loại 11

2.3 Đề kháng kháng sinh 12

2.4 Biện pháp hạn chế sự đề kháng 15

2.5 Biện pháp kiểm soát đề kháng kháng sinh 15

2.6 Các phương pháp khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh 16

2.6.1 Phương pháp định tính 16

2.6.2 Phương pháp định lượng 17

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 18

3.1 Thời gian và địa điểm 20

3.1.1 Thời gian 20

3.1.2 Địa điểm 20

3.2 Nội dung nghiên cứu 20

3.3 Vật liệu 20

3.3.1 Đối tượng khảo sát 20

3.3.2 Môi trường, hoá chất dùng để phân lập vi khuẩn 20

3.4 Phương pháp tiến hành 21

3.4.1 Cách lấy mẫu và thực hiện 21

3.4.2 Phân lập, định danh vi khuẩn 23

3.4.3 Đọc kết quả, thử sinh hoá 26

3.4.4 Phương pháp kháng sinh đồ 26

3.5 Chỉ tiêu khảo sát 28

3.6 Xử lý số liệu 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn trong mẫu sữa và mẫu dịch mũi 29

4.1.1 Loài vi khuẩn phân lập được trong 22 mẫu sữa bò 29

4.1.2 Loài vi khuẩn phân lập được trong 15 mẫu dịch mũi heo 29

4.1.3 Mức độ tương đồng giữa kết quả nghiên cứu với kết quả kiểm chứng của APUA tại Đại học Tuft, Hoa Kỳ 30

4.2 Khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với một số loại kháng sinh 31

4.2.1 Xác định độ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn Salmonella 31

4.2.2 Xác định độ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn Staphylococcus spp 35

4.2.3 Xác định độ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn Streptococcus spp 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

BHI : Brain Heart Infusion

NA : Nutrient Agar XLD : Xylose Lysine Desoxycholate EMB : Eosin Methylene Blue

MHA : Mueller Hinton Agar MHB : Mueller Hinton Broth BGA : Brilliant Green Agar

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Phản ứng sinh hóa của một số loài vi khuẩn 5

Bảng 2.2 Đặc tính phân biệt giữa các loài Staphylococcus và Micrococcus 7

Bảng 2.3 Các đặc điểm khác nhau của các loài Streptococci động vật 10

Bảng 4.1 Loài vi khuẩn phân lập được trong 22 mẫu sữa 30

Bảng 4.2 Loài vi khuẩn phân lập được trong 15 mẫu dịch mũi 31

Bảng 4.3 Mức độ tương đồng giữa kết quả nghiên cứu với kết quả kiểm chứng của APUA 30

Bảng 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Salmonella 32

Bảng 4.5 Tính nhạy cảm với kháng sinh của Staphylococcus spp theo nguồn gốc phân lập 41

Bảng 4.6 Tính nhạy cảm với kháng sinh của Streptococcus spp theo nguồn gốc phân lập 45

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Vi khuẩn Staphylococcus 6

Hình 2.2 Vi khuẩn Streptococci 9

Hình 3.1 Đĩa giấy tẩm các loại kháng sinh 22

Hình 3.2 Cách lấy mẫu sữa bò 23

Hình 3.3 Mẫu được cấy trên môi trường thạch máu 25

Hình 3.3 Các đĩa kháng sinh được đặt đều trên 2 đĩa petri chứa môi trường MHA 29 Hình 4.1 Vòng vô khuẩn của vi khuẩn Salmonella với 12 loại kháng sinh trên 2 đĩa MHA sau khi ủ 370C/ 24 giờ 32

Hình 4.2 Vòng vô khuẩn của vi khuẩn Staphylococcus spp với 13 loại kháng sinh trên 2 đĩa MHA sau khi ủ 370C/ 24 giờ 37

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Qui trình tiến hành giữ gốc Salmonella 24

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập vi khuẩn 26

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ định danh cầu khuẩn Gram (+) 27

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn Salmonella với từng loại kháng sinh 33 Biểu đồ 4.2 Mức độ đề kháng của vi khuẩn Salmonella với từng loại kháng sinh 35 Biểu đồ 4.3 Mức độ nhạy cảm trung gian của vi khuẩn Salmonella với từng loại

APUA (the Alliance for Prudent Use of Antibiotic) là một tổ chức nghiên cứu về vấn đề đề kháng kháng sinh Một trong những mục tiêu của APUA là xây dựng và phát triển các dữ liệu về mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh có thể

là nơi tồn trữ các gen kháng kháng sinh Nghiên cứu mang tên “Reservoirs of Antibiotic Resistance International Surveillance Project" (tạm dịch, đề án khảo sát

nguồn lưu trữ đề kháng kháng sinh toàn cầu) được thực hiện tại một số nước, trong

đó có Việt nam Trong nghiên cứu này, E coli, Salmonella sp., Enterococcus/Streptococcus , Pseudomonas sp., Aeromonas or Vibrio, Acinetobacter sp and Stenotrophomonas là những vi khuẩn phân lập từ môi trường

chăn nuôi hoặc vật nuôi không có biểu hiện bệnh (lâm sàng) được kiểm tra về mức

độ mẫn cảm với một số kháng sinh thông dụng trong nhân y và thú y

Được sự chấp thuận của Khoa CNTY, Bộ môn Nội Dược, dưới sự hướng dẫn

trực tiếp của TS Võ Thị Trà An, chúng tôi tiến hành đề tài “KHẢO SÁT KHÁNG SINH ĐỒ CỦA 3 GIỐNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ THỊT HEO, DỊCH MŨI HEO VÀ SỮA BÒ TƯƠI” như một phần trong nghiên cứu nêu trên

Lấy mẫu, phân lập, định danh và giữ gốc các chủng vi khuẩn thu được

Khảo sát mức độ mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thu được

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Sơ lược về vi khuẩn

Vi sinh vật sống ở khắp nơi trên trái đất từ đỉnh núi cao đến tận đáy biển sâu, trong không khí, trong đất, trong hầm mỏ, trong sông ngòi, ao hồ, trên da, trong từng bộ phận của cơ thể người, động vật, thực vật, trong các sản phẩm lương thực, thực phẩm, vật liệu, hàng hóa Ngay cả trong những nơi mà điều kiện sống tưởng từng như hết sức khắc nghiệt vẫn thấy sự phát triển của vi sinh vật ví dụ như vi

khuẩn Pseudomonas bathycetes sống được ở đáy đại dương, vi khuẩn Streptococcus faecalis lại có thể phát triển tốt ở môi trường có pH = 10 – 11 Hầu hết vi khuẩn có

kích thước nhỏ, thường chỉ khoảng 0,5-5 µm, mặc dù có loài có đường kính 0,3mm Hiện nay, nhiều vi khuẩn gây bệnh rất phát triển, chúng lây lan khắp nơi gây bệnh cho con người và động vật Chính vì thế, mà vi khuẩn ngày càng phát triển gây nhiều bệnh cho con người và vật nuôi Đây là mối đe dọa cho cả cộng đồng thế giới

Sự phát triển của vi khuẩn ngày càng nhiều làm cho con người phải sử dụng nhiều loại kháng sinh để tiêu diệt chúng Chính vì sử dụng nhiều kháng sinh nên kháng sinh ngày này đã bị đề kháng rất nhiều đây là mối đe dọa của toàn thế giới về vấn đề

đề kháng của kháng sinh

2.1.1 Salmonella

Trước năm 1983, người ta chia Salmonella ra làm 34 nhóm nhỏ A, B, C, D,

E, F,… Các nhóm khác nhau chủ yếu dựa vào kháng nguyên O và H Từ năm 1983

dựa vào phương pháp nghiên cứu mã di truyền ADN Salmonella chia ra làm 6 giống phụ: Theo Le Monir và cộng sự (1987) chia thành 2 loài chính: S enterica (gây bệnh), và S bongori (không hay ít gây bệnh) Theo phân loại Bergey 1994 Salmonella chỉ có 1 loài S Choleraesuis gồm nhiều dưới loài, mỗi dưới loài có

nhiều serovar được xác định bằng các thành phần cấu trúc kháng nguyên (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

 Hình thái

Salmonella là trực khuẩn ngắn gram âm, hai đầu tròn, kích thước 0,7 – 1,5 x

2 - 5µ, không giáp mô, không bào tử, có chiêm mao quanh cơ thể (trừ Salmonella

Gallinarum)

 Đặc điểm nuôi cấy

Đây là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, nhiệt độ thích hợp 370C, pH: 7,2 – 7,6, dễ mọc trên môi trường dinh dưỡng thông thường, trên môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) có khuẩn lạc đen, tròn, ướt và hơi lồi (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

Trên môi trường thạch máu không gây dung huyết, thạch gelatine không gây tan chảy, trên môi trường canh làm cho môi trường đục và nếu để lâu lắng cặn Đối với môi trường EMB cho khuẩn lạc trắng ngà, MC (MacConkey) khuẩn lạc trắng, TSI thạch nghiêng không lên men lactose, lên men đường glucose với đặc điểm đỏ/vàng (kiềm/acid) có sinh H2S tùy loài Trên môi trường BGA cho khuẩn lạc hồng và làm môi trường chuyển sang đỏ

 Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi glucose, mannit, sorbitol, arabinose, và

không có khả năng lên men đường lactose, salicin, raffinose

Phản ứng oxidase âm tính, catalase dương tính, indol và VP âm tính, MR và citrate dương tính, lysine và ornithindecarboxydase dương tính, urease âm tính (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

Bảng 2.1 Phản ứng sinh hóa của một số loài vi khuẩn

Salmonella có sẵn trong đường ruột người và gia súc với lượng ít (5% - 10%

số thú), gây bệnh cho gia súc và người Đặc biệt ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng do sự hiện diện của vi khuẩn này trong các sản phẩm động vật Trong phòng thí nghiệm thì gây bệnh cho chuột bạch

2.1.2 Staphylococcus

Hiện nay có ít nhất 28 loài, trong đó có 19 loài có trong bảng phân loại của

Bergey, còn 9 loài mới nhất được miêu tả gần đây Giống Staphylococcus là quan

trọng nhất trong số những loài trên

 Đặc điểm chung

Staphylococcus là loại cầu khuẩn Gram (+), có xu hướng được xếp thành

những cụm không điều nhau hoặc giống như dạng chùm nho Đường kính trung bình của cầu khuẩn là 1µm Không hình thành bào tử, không di động, hình thành sắc tố không tan trong nước

Hình 2.1 Vi khuẩn Staphylococcus

(Chụp ngày 7/11/2009) Chúng là những vi khuẩn kỵ khí (lên men) không bắt buộc Tăng trưởng mạnh trên thạch máu (Blood Agar - BA) và thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar – NA)

Staphylococcus gây bệnh bao gồm S aureus, S intermedius và S hyicus Hầu hết các giống đều có coagulase (+) ngoại trừ hai loài có coagulase (-) phổ biến là S epidermidis và S saprophyticus là những vi khuẩn hội sinh sẵn có trong môi

trường Chúng gây nhiễm cơ hội trên người và đôi khi trên thú mặc dù chúng thường được coi là những vi khuẩn không gây bệnh

Bảng 2.2 Đặc tính phân biệt giữa các loài Staphylococcus và Micrococcus

Glucose Lên men Lên mem Lên men Lên men - Ôxi hoá

(Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên,2001)

Đặc điểm khuẩn lạc: khuẩn lạc mọc trong vòng 24 giờ, sau 48 giờ những khuẩn lạc có đường kính có thể lên đến 4mm Khuẩn lạc có dạng tròn, trơn, bóng và

trên BA có xu hướng lớn và mờ đục Khuẩn lạc Staphylococcus trên chó có màu

trắng hoặc không màu khác với ở trên trâu bò là những khuẩn lạc có màu vàng Sự thay đổi màu của khuẩn lạc có thể xảy ra khi bổ sung thêm sữa, chất béo hay glycerol, monoacetate vào môi trường (Quinn, 1998)

Dung huyết tố của Staphylococcus là các loại alpha, bêta, gamma, và đenta có

thể được sản sinh đơn lẻ, kết hợp hoặc không có Các loại dung huyết tố khác nhau

về đặc tính kháng nguyên, sinh hóa và tác động của chúng trên những tế bào hồng cầu của các động vật khác nhau (Quinn, 1998)

 Đặc tính sinh hóa

Đây là vi khuẩn lên men không sinh hơi một số loại đường (glucose, maltose…), phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, Indol âm, H2S âm tính Cấu trúc kháng nguyên gồm có kháng nguyên thân O (có 2 loại: peptidoglucan

và protein A) và acid teichoic

 Eptidoglucan là một polysaccharit của thành tế bào giúp giữ vững thành tế bào và kích thích monocyte sản xuất interleukin-1 lôi cuốn thực bào thực hiện quá trình thực bào Peptidoglucan kích thích cả 2 loại miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể

 Protein A (chỉ có ở chủng Staphylococcus aureus), loại protein này được tạo ra trong thành tế bào, chúng kích thích tạo kháng thể kết hợp

bổ thể

 Ngoài ra, acid teichoic trong thành tế bào cũng đóng vai trò là một kháng nguyên

 Khả năng gây bệnh

Vi khuẩn có khả năng tồn tại trên cơ thể động vật Khi sức đề kháng yếu hay

do sự nhiễm trùng trên da với vi khuẩn có độc lực mạnh gây hiện tượng sưng mủ trên da hay niêm mạc, gây ung nhọt, áp xe Viêm vú ở bò và cừu Nhiễm độc do độc

tố đường ruột trên người Sự xâm nhập của vi khuẩn vào nang lông gây hoại tử da

Khả năng gây bệnh của S aureus là do sự phối hợp giữa các chất ngoại bào

(enzyme và độc tố ) Vi khuẩn có thể gây nhiễm trùng máu và có thể đưa đến các hiện tượng nhiễm trùng khác như viêm phổi, viêm thận cấp, viêm màng não, viêm khớp ở ngựa, viêm tuyến sữa ở trâu bò và người, viêm tuỷ xương và các xoang trong cơ thể Như vậy từ nhiễm trùng cục bộ nếu không được điều trị, với vi khuẩn

có độc lực cao có thể đưa đến tử vong

Trong phòng thí nghiệm có thể dùng thỏ và chuột bạch Để thử độc tố đường ruột người ta dùng khỉ

2.1.3 Streptococcus

Streptococcus được mô tả đầu tiên bởi Billorth vào năm 1874 từ vết thương

nhiễm trùng Năm 1879 Pasteur đã tìm thấy trong máu của bệnh nhân bị nhiễm

trùng hậu sản

Giống Streptococcus thuộc họ Streptococcaceae gồm những vi khuẩn dạng

cầu, bắt màu Gram dương, kích thước 0,5 – 1µ, sắp xếp thành đôi hoặc chuỗi

Không có bào tử, phần lớn không tạo nha bào và lên men đường lactose tạo acid lactic

Hình 2.2 Vi khuẩn Streptococci

(Chụp ngày 7/11/2009)

Bảng 2.3 Các đặc điểm khác nhau của các loài Streptococci động vật

Loài vi khuẩn Nhóm

Lance-Dung huyết

V: phản ứng cho kết quả thay đổi

(+): Đa số các dòng cho kết quả dương tính

Tre: Đường Trehalose, Sor: Sorbitol, Man: Mannitol, Sac: Saccharose, Lac: Lactose, Ra: Raffinose, In: Inulin

(Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

Vi khuẩn thuộc loại yếm khí tùy nghi, mọc ở nhiệt độ từ 150C – 450C nhưng thích hợp phát triển ở 370C Vi khuẩn tương đối khó nuôi cấy nên cần môi trường giàu chất dinh dưỡng như thạch máu, thạch huyết thanh Đặc biệt, nếu bổ sung vào môi trường nuôi cấy NaN3 và 5 – 10% CO2 vi khuẩn sẽ phát triển rất tốt

Trên môi trường thạch huyết thanh tạo khóm nhỏ li ti, dẹt, trong suốt dạng sương, để lâu có màu nâu hơi xám Trên môi trường thạch máu tạo 3 dạng khóm dung huyết α β γ Trên môi trường canh – huyết thanh vi khuẩn kết chuỗi dần dần tạo dạng hạt hay dạng bông rồi lắng xuống đáy, môi trường ở bên trên trở nên trong

Khả năng đề kháng của vi khuẩn này kém hơn Staphylococcus, đa số bị diệt ở

500C trong 30 – 60 phút Bằng tiệt trùng Pasteur có thể diệt hầu hết Streptococci có

trong sữa Vi khuẩn dễ bị tiêu diệt bởi những chất sát trùng thông thường như: acid phenic, formol, xút…

Đặc tính sinh hóa thay đổi theo từng loài, phần lớn lên men đường lactose tạo acid lactic và cho phản ứng catalase dương

Kháng nguyên thân O gồm 2 thành phần chính: polysaccharit và protein M

 Polysaccharit của thành tế bào giúp giữ vững thành tế bào và kích thích monocyte sản xuất interleukin-1 lôi cuốn thực bào thực hiện quá trình thực bào

 Protein M ở bên ngoài kháng nguyên polysaccharit có vai trò trong sự hình thành loại khuẩn lạc liên quan đến sự bám dính vào màng niêm mạc

Vi khuẩn gây bệnh viêm vú, viêm tử cung ở bò, ngựa, cừu; viêm khớp ở heo; viêm phổi ở người…

2.2 Những kiến thức cơ bản về kháng sinh

2.2.2 Phân loại

Theo Võ Thị Trà An (2007), có nhiều cách phân nhóm kháng sinh:

2.2.2.1 Phân nhóm dựa vào cấu trúc hóa học

(1) Beta-lactam: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin…

(3) Polypeptide: colistin, bacitracin, polymyxin…

(4) Tetracycline: tetracycline, oxytetracycline, chlotetracycline, doxycycline… (5) Phenicol: chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol…

(6) Macrolide: erythromycin, spiramycin, tylosin…

(7) Kháng sinh gần gũi với macrolide:lincomycin, virginiamycin…

(8) Sulfonamide: sulfaguanidin, sulfacetamid, sulfamethoxazole…

(9) Diaminopyrimidine: trimethoprim, diaveridin…

(10) Quinolone: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin…

(11) Nitrofuran: nitrofurazone, furazolidon, furaltadon

(12) Các nhóm khác: glycopeptide, pleuromutilin, polyetherionophore

2.2.2.2 Phân loại dựa theo cơ chế tác động

- Kháng sinh tác động lên thành tế bào vi khuẩn: bacitracin, vancomycin, penicillin

- Kháng sinh tác động lên màng tế bào chất: polymycin, colistin

- Kháng sinh tác động lên sự tổng hợp acid nucleic:quinolon, sulfonamide, trimethoprim

- Kháng sinh tác động đến quá trình tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn: tetracyclin, streptomycin, erythromycin

2.2.2.3 Phân loại dựa theo cơ chế kháng khuẩn

- Nhóm kháng sinh tĩnh khuẩn: tetracyclin, macrolid, phenicol

- Nhóm kháng sinh sát khuẩn: quinolon, aminosid, polypeptide, beta – lactam, sulfamid + diaminopyrimidin

2.3 Đề kháng kháng sinh

Mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho người và thú đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế, nhưng đồng thời đã tạo một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn Việc dùng kháng sinh sẽ luôn tạo ra một sự đề kháng với chính

nó ở một mức độ nhất định trong quần thể vi khuẩn Bằng chứng rõ ràng nhất là khi kiểm tra các chủng vi khuẩn thời tiền kháng sinh, các nhà khoa học không phát hiện

kháng thường gặp ở các chủng vi khuẩn đương thời Áp lực chọn lọc đối với sự đề kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho động vật, kháng sinh dùng với mục đích kích thích tăng trọng trong thức ăn gia súc

Hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng cho toàn xã hội Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm hạn chế khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết kháng sinh dùng trong lâm sàng Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng với kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền lại cho những vi khuẩn gây bệnh khác

Đề kháng với kháng sinh được phân loại gồm đề kháng tự nhiên (insitrinsic resistance) và đề kháng thu nhận (acquired resistance) Vi khuẩn đề kháng tự nhiên với kháng sinh do chúng không có cơ chế tế bào cần thiết cho kháng sinh tác động

Ví dụ, Enterobacteriaceae kháng vancomycin, vi khuẩn G+ kháng polymyxin B

Đề kháng thu nhận có thể xảy ra do đột biến nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn hoặc

do vi khuẩn nhận các vật liệu di truyền (gene) liên quan đến kháng thuốc từ vi khuẩn khác Do vi khuẩn có chu kỳ phát triển từ vài giây đến vài phút nên chúng rất linh hoạt trong biến đổi để phù hợp với những thay đổi của môi trường sống Đề kháng do đột biến nhiễm sắc thể nhìn chung xảy ra từ từ và là một tiến trình tích lũy Một đột biến điểm có thể không dẫn đến sự đề kháng kiểu hình nhưng một đột biến điểm tiếp theo có thể làm thay đổi mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn (đề kháng với quinolone) Tần số xuất hiện đề kháng do đột biến trong phòng thí nghiệm (invitro) là khoảng 1/108 tế bào đối với streptomycin, nalidixic acid và rifampin; ở tần suất thấp hơn với erythromycin và dường như không xảy ra với vancomycin và polymycin Tuy nhiên trên thực tế lâm sàng (invivo), các kiểu đột biến này không đáng kể do hệ thống phòng vệ của cơ thể tiêu diệt đa số các chủng

vi khuẩn đề kháng dạng này

Trong khi đó, đề kháng thu nhận các gene có khả năng di chuyển thường đạt mức đề kháng cao và thuộc dạng “tất cả hoặc không có gì” (all or none) Gene kháng thuốc truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận có thể hiện được kiểu hình (all) hoặc không thể hiện được tính trạng kháng thuốc (none) ở vi khuẩn nhận Đề kháng do trao đổi thông tin di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự lan tràn đề kháng với kháng sinh Do vi khuẩn không có màng nhân, gene kháng thuốc có khả năng di chuyển dễ dàng hơn từ chromosome đến các vật liệu di truyền khác trong tế bào như plasmid Giữa các vi khuẩn khác nhau, gene kháng thuốc có thể được trao đổi qua 3 cách; (1) Tải nạp là quá trình DNA được thực khuẩn thể (phage) sát nhập

và chuyển cho một vi khuẩn khác; (2) Biến đổi hay còn gọi là chuyển dạng (transformation) là quá trình một đoạn DNA trần (có nguồn gốc từ một đoạn tế bào

vi khuẩn chết) đi vào một tế bào vi khuẩn và gắn vào các yếu tố di truyền của vi khuẩn đó nhờ tương đồng nhiễm sắc thể (crossover); (3) Tiếp hợp (conjugation) là quá trình tế bào vi khuẩn cho (donor) tổng hợp lông giới tính (sex pili) và gắn vào tế bào vi khuẩn nhận (recipient) Từ cầu nối này, một bản sao (copy) gen kháng thuốc nằm trên plasmid được chuyển cho vi khuẩn nhận Trong quá trình tải nạp, vi khuẩn cần có điểm tiếp nhận phù hợp với phage trên bề mặt của chúng Trong quá trình biến đổi, DNA phải chèn vào đoạn gen nhờ tương đồng về di truyền Như vậy với

cả hai tiến trình này, vi khuẩn phải tương đồng về di truyền để sự tái tổ hợp có thể xảy ra Dạng trao đổi này chỉ có thể xảy ra ở các loài vi khuẩn có mối liên hệ về di truyền Trong khi đó, tiến trình tiếp hợp không có giới hạn này

Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn đã được nghiên cứu và ghi nhận với các

cơ chế chủ yếu sau: (1) sản xuất enzyme làm vô hoạt kháng sinh; (2) tạo ra enzyme thay thế cho enzyme mà kháng sinh tác động vào; (3) đột biến ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; (4) sửa đổi điểm tiếp nhận để giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; (5) giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào

vi khuẩn; (6) đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào giảm; (7) tạo quá nhiều điểm gắn kết kháng sinh

Dường như chúng ta không thể hoàn toàn loại bỏ được hiện tượng đề kháng với kháng sinh một khi chúng xuất hiện Ngoài sự linh hoạt do đặc tính sinh học, vi khuẩn còn có khả năng bảo tồn sự đề kháng một khi gene kháng thuốc nằm trên nhiễm sắc thể của nó Ngược lại, khi yếu tố di truyền liên quan đến đề kháng nằm trên plasmid, nhất là plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn khác của cùng hay khác loài Từ đó sự kháng kháng sinh gia tăng dần lên trong quần thể vi khuẩn (Võ Thị Trà An, 2007)

2.4 Biện pháp hạn chế sự đề kháng: (1) không sử dụng kháng sinh khi không có

nhiễm trùng; sử dụng với mục đích phòng nhiễm trùng chỉ khi chứng minh được hiệu quả của nó; (2) không sử dụng kháng sinh có phổ rộng, kháng sinh thế hệ mới trong khi kháng sinh có phổ hẹp, kháng sinh cũ vẫn có hiệu quả; (3) thường xuyên nắm bắt thông tin về tình hình dịch tễ và khả năng nhạy cảm kháng sinh của hệ vi khuẩn; (4) sử dụng đúng liều lượng, đường cấp và liệu trình; (5) không tự ý kết hợp kháng sinh khi không cần thiết Nếu kết hợp kháng sinh với mục đích ngăn đề kháng, các kháng sinh thành phần phải sử dụng nguyên liều lượng (Võ Thị Trà An, 2007)

2.5 Biện pháp kiểm soát đề kháng kháng sinh: (1) giảm sử dụng kháng sinh bằng

cách cấm dần việc sử dụng kháng sinh như chất kích thích tăng trọng, thay vào đó là các chế phẩm sinh học hoặc các chất kích thích có nguồn gốc thực vật; thay thế việc phòng bệnh bằng kháng sinh bằng việc phòng bệnh bằng vaccine; tăng cường biện pháp vệ sinh môi trường để hạn chế mầm bệnh (2) Có qui định về việc sử dụng kháng sinh trong bệnh viện, nhà thuốc như phân loại các kháng sinh được kê toa tự

do, nhóm dùng cho các mục đích đặc biệt, nhóm dự phòng (3) Cách li bệnh nhân với các nhiễm trùng có tính lây lan hoặc có thể mang vi khuẩn đề kháng (4) Thông tin về lượng kháng sinh sử dụng, số liệu về nhạy cảm kháng sinh, tần suất về đề kháng của vi khuẩn phải được công bố và cập nhật trên các phương tiện thông tin chuyên ngành (5) Giáo dục nhân viên y tế, thú y, người sản xuất và phân phối thuốc, người chăn nuôi, và người tiêu dùng về việc sử dụng kháng sinh có hiệu quả

2.6 Các phương pháp khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh 2.6.1 Phương pháp định tính

Có một vài phương pháp phòng thí nghiệm đo lường sự mẫn cảm của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh, tuy nhiên phương pháp khuếch tán trên thạch được sử dụng nhiều nhất Phương pháp được đề nghị bởi National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1990, MA-A4) là phương pháp khuếch tán trên thạch Kirby-Bauer (Quinn, 1998)

 Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng

Phương pháp khuếch tán trên thạch yều cầu phải dàn đều vi khuẩn cần kiểm tra trên bề mặt đĩa thạch và đặt những đĩa giấy kháng sinh với nồng độ quy định, lên

bề mặt thạch trước khi ủ bệnh Nếu vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh thì một vòng

vô khuẩn sẽ xuất hiện xung quanh đĩa giấy sau khi ủ ấm Một trong những lý do cho việc tiêu chuẩn hóa chặt chẽ các bước tiến hành phản ứng là do có rất nhiều yếu tố

có thể ảnh hưởng đến độ lớn của vòng vô khuẩn và chúng bao gồm :

(1) Độ đục của huyễn dịch vi khuẩn đây là yếu tố rất quan trọng và độ đục của huyễn dịch vi khuẩn cần phải được kiểm tra tương đương với độ đục Mac Farland 0,5 Mục đích là để có được những vệt dày đặc vi khuẩn phát triển liên quan đến những khuẩn lạc riêng lẻ tương ứng Bên cạnh đó, mức độ mẫn cảm của một vi khuẩn đối với một kháng sinh có sự khác nhau trong từng loài và từng chủng phân lập từ nguồn bệnh

(2) Môi trường phản ứng: Mueller-Hinton hoặc các môi trường tương tự (Isosensitest agar, Oxoid) thường được chọn cho những phản ứng nhạy cảm thông thường Môi trường này có chứa một ít chất ức chế sulfonamide, trimethoprim và tetracycline, và hầu hết mầm bệnh phát triển tốt trên nó Hàm lượng quá mức thymidine hoặc thymine trong môi trường phản ứng có thể ức chế sulfonamide và trimethoprim, vùng vô khuẩn nhỏ hoặc không có Sự thay đổi các cation hóa trị hai, chủ yếu là magie và canxi, sẽ ảnh hưởng đến độ lớn vòng vô khuẩn của tetracycline,

polymycin và aminoglycoside trong phản ứng chống Pseudomonas aeruginosa Đối

Mueller-Hinton, thay vào đó môi trường thạch máu chứa 5 - 10% máu cừu có thể sử dụng Nhưng độ lớn vòng vô khuẩn của nafcilin, novobiocin và methicillin sẽ nhỏ hơn 2 - 3 mm so với giới hạn thông thường Độ dày của thạch và pH của môi trường cũng nên được tiêu chuẩn hóa vì nó cũng có thể ảnh hưởng đến độ lớn của vòng vô khuẩn

(3) Chất kháng sinh và nồng độ của nó trên đĩa giấy: khả năng khuyếch tán của kháng sinh trên bề mặt thạch có sự khác nhau và vùng vô khuẩn của một số chất, như streptomycin, thì luôn tương đối nhỏ Nồng độ của chất kháng sinh trên đĩa giấy được chọn dựa vào sự tương quan giữa độ lớn vùng vô khuẩn với nồng độ đạt được trong máu khi điều trị Hiệu lực của chất kháng sinh trên đĩa giấy nên có phương pháp kiểm soát và duy trì

(4) Điều kiện ủ: Tiêu chuẩn chung cho các phản ứng thử độ mẫn cảm thông thường là ủ trong điều kiện đủ oxy ở 350C trong 16 - 18 giờ hoặc 24 giờ Đĩa thạch không nên ủ trong điều kiện gia tăng CO2 vì điều đó sẽ làm thay đổi có ý nghĩa vòng vô khuẩn của một số kháng sinh Vi khuẩn kỵ khí không nên kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạch và NCCLS (1990) đã công bố phương pháp chuẩn để kiểm tra sự nhạy cảm của vi khuẩn kỵ khí (M11-T2) (Quinn, 1998)

2.6.2 Phương pháp định lượng

Có thể xác định tính nhạy cảm với kháng sinh bằng cách dựa vào nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimal inhibitory concentration) để biết vi khuẩn đó có nhạy cảm hay đề kháng với kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp nhất của kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn có thể nhìn thấy được sau 18 - 24 giờ được nuôi cấy Đối chiếu MIC với nồng độ huyết tương của kháng sinh, có thể

gặp 3 trường hợp

- Nếu MIC < nồng độ huyết tương của kháng sinh: vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh Trong thực tế, một vi sinh vật được gọi là nhạy cảm với kháng sinh khi MIC ≤ ¼ nồng độ huyết tương an toàn của kháng sinh đó

- Nếu MIC > nồng độ huyết tương an toàn: vi khuẩn đề kháng với kháng sinh

- Nếu MIC ở khoảng giữa hai trường hợp trên vi khuẩn nhạy cảm trung gian với kháng sinh Nghĩa là vi khuẩn không bị tiêu diệt nếu dùng liều điều trị thông thường, nhưng nếu dùng liều cao bằng đường toàn thân hoặc bất cứ đường nào miễn

là kháng sinh tập trung vào ổ nhiễm khuẩn (chẳng hạn đào thải qua nước tiểu thì trị được nhiễm khuẩn đường tiểu) thì kháng sinh có tác dụng trên vi khuẩn

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Nguyễn Văn Vinh (1990) đã phân lập vi khuẩn trên 194 mẫu sữa bò viêm vú

và ghi nhận phát hiện Staphylococcus spp (192 mẫu; 50,52%), Streptococcus spp

(68 mẫu; 35,05%) Những vi khuẩn này nhạy cảm với cephalexin và thấp nhất là penicillin

Trần Trung Thái (1998) đã phân lập 45 mẫu sữa ở Bình Dương và các vùng lân cận Kết quả cho thấy, trong 14 mẫu sữa viêm vú (chiếm 31%) có các vi khuẩn

Staphylococcus spp (chiếm 78,57%), Streptococcus spp (chiếm 14,29%) Trong 31 mẫu sữa viêm vú ở dạng tiềm ẩn, Staphylococcus spp chiếm 61,92%, kế đến là Streptococcus spp (chiếm 38,71%), Pseudomonase (chiếm 9,66%) và E.coli (chiếm

6,45%) Những vi khuẩn này nhạy cảm với các loại kháng sinh cephalexin, norfloxacin, gentamicin và chloramphenicol

Nguyễn Văn Phát và ctv (1999) đã khảo sát đàn bò đang cho sữa của 80 hộ chăn nuôi thuộc Bình Chánh, TP.HCM Kết quả cho thấy là những vi khuẩn chính

hiện diện trong sữa bò viêm vú tiềm ẩn gồm Staphylococcus spp, Streptococcus spp, E.coli Theo kết quả kháng sinh đồ thì những vi khuẩn này nhạy cảm với các kháng

sinh như: norfloxacin, gentamicin, và cephalosporin

Nguyễn Thị Kim Loan (2000) đã phân lập 100 mẫu sữa bò bị viêm vú tiềm ẩn tại 4 khu vực: Thuận An, Bến Cát Bình Dương, Hóc Môn Tp.HCM và trại bò An

Phước Kết quả cho thấy vi khuẩn phân lập chủ yếu là Streptococcus spp (49%), Staphylococcus aureus (33%), E.coli (20%) và Enterobacter spp (4%) Kết quả

kháng sinh đồ cho thấy norfloxacin, gentamicin, cephalosporin và bactrim có tác dụng tốt

Lê Ngọc Thuỷ (2001) đã phân lập 82 mẫu sữa bò bị viêm vú ở 2 khu vực Hóc Môn và Long Thành Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm giữa các loài vi khuẩn là

Staphylococcus spp (54 mẫu, chiếm 68,85%), Streptococcus spp ( 34 mẫu, chiếm

amoxicillin

Nguyễn Minh Hải (2005) qua khảo sát 55 mẫu sữa bò bị bệnh viêm vú tiềm ẩn

ở khu vực Quận 12 TP.HCM Kết quả cho thấy: Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Pseudomonas spp đề kháng mạnh với nhiều loại kháng sinh như: ampicillin,

amoxicillin, ofloxacin, cephalexin Các kháng sinh có hiệu quả cao như: norfloxacin, ciprofloxacin, tetracycline, gentamicin, kanamycin

Nguyễn Hoàng Trúc (2005) đã phân lập 74 mẫu sữa thu được các loài vi khuẩn

Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Đa số các mẫu sữa đều có từ 1-2 loài vi

khuẩn, trong đó 66 mẫu nhiễm 1 loài vi khuẩn chiếm 89,2%, có 8 mẫu nhiễm 2 loài

vi khuẩn chiếm 10,8% và không có mẫu nào nhiễm 3 loài vi khuẩn Qua kết quả

kháng sinh đồ cho thấy Staphylococcus spp nhạy cảm với gentamicin, ofloxacin, tetracycline; Streptococcus spp nhạy cảm với ofloxacin, ampicillin, norfloxacin,

doxycycline, amoxicillin, cephalexin

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Phân lập, định danh và giữ gốc một số chủng vi khuẩn thu thập được 3.2.2 Khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với một số loại kháng sinh

3.3 Vật liệu

3.3.1 Đối tượng khảo sát

Mẫu dịch mũi heo (15 mẫu) và mẫu sữa bò (22 mẫu) tại các lò mổ và các trại

bò tại Tp Hồ Chí Minh để phân lập các chủng Staphylococcus spp và Streptococcus spp

Tổng số 20 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập từ thịt heo tại Tp Hồ Chí

Minh được thu thập từ Chi Cục Thú Y Tp Hồ Chí Minh

3.3.2 Môi trường, hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn

3.3.2.1 Môi trường

Môi trường nuôi cấy: canh dinh dưỡng BHI (Brain Heart Infusion Broth), môi trường thạch máu BA (Blood Agar), môi trường NA (Nutrient Agar), môi trường XLD (Xylose Lysine Deoxycholate)

Môi trường thực hiện kháng sinh đồ: môi trường thạch MHA (Mueller – Hinton Agar)

3.3.2.2 Hóa chất

Nước muối sinh lý, cồn 960C, nước oxy già

Giấy tẩm Oxydase, độ đục chuẩn Mac Farland 0,5 (Công ty TNHH Nam Khoa, Tp Hồ Chí Minh)

Giấy tẩm kháng sinh (Công ty TNHH Nam Khoa sản xuất) gồm penicillin (Pn,

10 units); clindamycin (Cl, 2µg); ciprofloxacin (Ci, 5µg); rifampicin (Rf, 5µg); trimethoprim/sulfamethoxazole (Bt, 1.25/23.75 µg); oxacillin (Ox, 1µg); gentamicin (Ge, 10µg); chloramphenicol (Cl, 30µg ); tetracycline (Te, 30µg); erythromycin (Er, 15µg); doxycycline (Dx, 30µg); vancomycin (Va, 30µg); cephalexin (Cp, 30µg); ofloxacin (Of, 5µg); nitrofurantoin (Fr,300µg); ampicillin (Am, 10µg); cefotaxime (Ct, 30µg); nalidixic acid (Ng, 30µg); cefepime (Cm, 30 µg)

Hình 3.1 Lọ chứa các đĩa giấy tẩm các loại kháng sinh

3.4 Phương pháp tiến hành

3.4.1 Cách lấy mẫu và thực hiện

Cách lấy mẫu dịch mũi heo: lúc heo vừa bị chích điện, dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào bên trong mũi để lấy dịch mũi Sau đó, cho tăm bông vào ống