ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA BACILLUS SUBTILIS VÀ KHÁNG SINH TRONG VIỆC ỨC CHẾ VI KHUẨN E.COLI

DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Phân lập E.coli Sơ đồ 2.2 : Thực hiện kháng sinh đồ Sơ đồ 2.3 : Kiểm tra khả năng đối kháng trực tiếp của Bacillus subtilis với E.coli Sơ đồ 2.4 : đọc kết quả

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI- THÚ Y



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA BACILLUS

SUBTILIS VÀ KHÁNG SINH TRONG VIỆC ỨC CHẾ

VI KHUẨN E.COLI

Lớp :DH05DY Sinh viên thực hiện :Nguyễn Ngọc Quỳnh Trâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI- THÚ Y

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đệ trình cấp bằng bác sỹ thú y chuyên ngành dược

ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG TÁC GIỮA BACILLUS SUBTILIS VÀ

KHÁNG SINH TRONG VIỆC ỨC CHẾ VI KHUẨN E.COLI

Người hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Ngọc Quỳnh Trâm

Em chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa chăn nuôi thú y về sự dạy dỗ tận tình trong suốt quá trình học tập của em

Cuối cùng, cảm ơn tất cả những người bạn của tôi về sự giúp đỡ, động viên và nhất là tình bạn mà họ đã mang đến cho tôi

100% các chủng E.coli được phân lập đề kháng với colistin, 71,43% đề kháng

với ampicilin và 64,29% đề kháng với gentamycin, riêng ofloxacin còn hiệu quả cao

trên E.coli, tỉ lệ nhạy cảm là 85,71%

54,5% các chủng Bacillus subtilis hiện diện ở phòng thí nghiệm thể hiện khả năng đối kháng yếu với E.coli

100% các chủng Bacillus subtilis nhạy cảm với gentamycin và streptomycin,

83,3% nhạy cảm với ampicilin, ngược lại 100% đề kháng với colistin

Không có sự đồng vận giữa Bacillus subtilis và kháng sinh nhưng có một chủng Bacillus subtilis đối kháng với ampicilin

Từ khóa : E.coli- Bacillus subtilis- Kháng sinh- Đề kháng- Đối kháng- Tương tác

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1: kết quả phân lập mẫu trên môi trường EMB

Hình 3.2: hình thái vi khuẩn nghi ngờ E.coli dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần

Hình 3.3 : Những khu vực ức chế được tạo ra bởi các đĩa giấy tẩm kháng sinh

Hình 3.4 : Những khu vực ức chế được tạo ra bởi những chủng Bacillus subtilis trên thạch được trải E.coli

Hình 3.5 : Những vùng ức chế được tạo ra bởi canh khuẩn Bacillus subtilis ở các nồng

độ đường 0%, 1%, 2%, 3%

Hình 3.6 : Những vùng ức chế được tạo ra bởi các đĩa giấy tẩm kháng sinh trên thạch

được trải E.coli

Hình 3.7 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis và ampicilin

Hình 3.8 : Không có sự đồng vận giữa Bacillus subtilis và colistin

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 : Kết quả phân lập E.coli

Bảng 3.2 : Kết quả thực hiện kháng sinh đồ

Bảng 3.3 : Kết quả của thí nghiệm cấy trực tiếp khuẩn lạc Bacillus subtilis và E.coli

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Phân lập E.coli

Sơ đồ 2.2 : Thực hiện kháng sinh đồ

Sơ đồ 2.3 : Kiểm tra khả năng đối kháng trực tiếp của Bacillus subtilis với E.coli

Sơ đồ 2.4 : đọc kết quả của thí nghiệm 3.3.1

Sơ đồ 2.5 : đánh giá gián tiếp dịch cấy Bacillus subtilis với E.coli

Sơ đồ 2.6: tương tác giữa Bacillus subtilis và kháng sinh

Sơ đồ 2.7: đồng vận giữa Bacillus subtilis và kháng sinh

Sơ đồ 2.8: sự trung lập giữa Bacillus subtilis và kháng sinh

Sơ đồ 2.9: Sự đối kháng giữa Bacillus subtilis và kháng sinh

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về E.coli 3

2.1.1 Nhắc lại về E.coli 3

2.1.2 Đặc điểm E.coli 3

2.2 Sơ lược về Bacillus subtilis 7

2.2.1 Lịch sử 7 2.2.2 Đặc điểm phân loại 8

2.2.3 Đặc điểm phân bố 8

2.2.5 Đặc điểm nuôi cấy 9

2.2.7 Kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp 9

2.2.8 Độc tính của Bacillus subtilis 13

2.2.9 Ứng dụng của Bacillus subtilis 14

2.3 Kháng sinh và sự đề kháng với kháng sinh 15

2.3.3 Biện pháp hạn chế sự gia tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn 19

2.4 Kháng sinh đồ 20 2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng lên kháng sinh đồ 20

2.5.3 Các phối hợp kháng sinh đồng vận và đối kháng 22

1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 23

1.1 Địa điểm 23

2 Vật liệu 23 2.1 Mẫu 23 2.2 Thiết bị 23

2.3 Chủng Bacillus subtilis 23

3 Phương pháp thí nghiệm 24

3.2 Thực hiện kháng sinh đồ với các chủng E.coli 26

3.3 Đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus subtilis với E.coli 27

3.4 Thực hiện kháng sinh đồ trên các chủng Bacillus subtilis có khả năng đối

3.5 Thí nghiệm đánh giá khả năng tương tác giữa Bacillus subtilis và kháng sinh

trên E.coli 30

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

1.1 Kết quả được ghi nhận 34

1.2 Thảo luận 34

2 Kết quả thí nghiệm thực hiện kháng sinh đồ 35

2.1 Kết quả được ghi nhận 35

2.2 Thảo luận 35

3 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus subtilis 36

3.1 Thí nghiệm cấy trực tiếp những khuẩn lạc Bacillus subtilis và E.coli 36

3.2 Thí nghiệm đánh giá gián tiếp dịch cấy của Bacillus subtilis đối với E.coli

3.2.1 Kết quả ghi nhận 37

4 Kết quả thí nghiệm thực hiện kháng sinh đồ với Bacillus subtilis 39

4.1 Kết quả ghi nhận 39

5 Kết quả thí nghiệm đánh giá sự tương tác giữa Bacillus subtilis và kháng sinh 40

5.1 Kết quả được ghi nhận 40

5.2 Thảo luận 41

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.ĐẶT VẤN ĐỀ

E.coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột

của người và động vật Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp thì E coli gây độc tăng

sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc còn non gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi

Do tính chất đề kháng rất nhanh với nhiều loại kháng sinh của E coli thì việc

sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn đến xáo trộn hệ vi sinh vật đường ruột và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho người tiêu dùng Chính vì thế, hiện nay, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay cho kháng sinh giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và giảm sự đề kháng của kháng sinh đang rất được chú trọng

Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nhà sản xuất thức ăn gia súc luôn luôn trộn

kháng sinh vào trong sản phẩm của họ, mục đích là để phòng bệnh cho thú Việc này

gây ra nhiều bất lợi trong việc áp dụng những sản phẩm chứa vi khuẩn có ích Bacillus

subtilis là vi khuẩn được chọn lựa cho nhiều probiotics được sử dụng trong chăn nuôi,

vì thế thật hữu ích nếu Bacillus subtilis tương tác với kháng sinh trong trường hợp

trộn vi khuẩn này với kháng sinh

Dựa trên ý tưởng này, được sự đồng ý của khoa chăn nuôi thú y trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, bộ môn vi sinh truyền nhiễm, dưới sự hướng dẫn của Phó Giáo

Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Ngọc Hải, tôi đã thực hiện đề tài với chủ đề: “Đánh giá sự tương

tác giữa Bacillus subtilis và kháng sinh trong việc ức chế vi khuẩn E.coli.”

2 MỤC ĐÍCH

Đánh giá khả năng của Bacillius subtilis khi kết hợp với kháng sinh để điều trị tiêu chảy do E.coli

3 YÊU CẦU

-Phân lập E.coli trên phân tiêu chảy

-Thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn E.coli phân lập được

-Thử độ nhạy cảm với kháng sinh từ kết quả kháng sinh đồ của một vài chủng

Bacillus subtilis có ở phòng thí nghiệm

-Đánh giá khả năng tương tác giữa:

 Bacillus subtilis với E.coli

 Kháng sinh với E.coli

 Bacillus subtilis kết hợp với kháng sinh trên E.coli

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về E.coli

2.1.1 Nhắc lại về E.coli

E.coli thuộc giống Escherichia họ Enterobactericeae, một kí sinh bình thường

trong đường ruột và được phân lập từ phân của động vật hữu nhũ Những giống thành lập nên họ này là những vi khuẩn gram-, rộng 0,5-1µm, dài 1-6µm, thường di động, có

vỏ bọc, có lông và không sinh bào tử, hiếu khí hay yếm khí tuỳ nghi.(dẫn liệu Lê Thị Mai Khanh, 2004)

Có 5 loài thuộc giống Escherichia:

2.1.2.1 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hoá

E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ nghi Nhiệt độ thích hợp là

35-370C, pH thích hợp là 6,4-7,5 (tối ưu nhất là 7,2-7,4)

Trong môi trường lỏng, sau 4-5 giờ, E.coli làm đục nhẹ môi trường, càng để

lâu càng đục, có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng trên bề mặt môi

trường E.coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng Trên môi trường EMB,

E.coli tạo khuẩn lạc tím ánh kim Trên môi trường Macconkey, E.coli tạo khuẩn lạc

đỏ hồng, tròn, lồi

E.coli lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như lactose,

glucose, manitol Người ta căn cứ vào khả năng lên men đường lactose để phân biệt

E.coli với một số vi khuẩn đường ruột khác( dẫn liệu Nguyễn Văn Nghĩa, 2002)

 ONPG(+), Urease(-), H2S(-), LDC(+)

 Nghiệm pháp IMViC: indol(+), methyl red(+), VP(-), simmons citrate(-)

2.1.2.2 Cấu tạo kháng nguyên

E.coli có đủ 4 loại kháng nguyên O,H,K,F

Kháng nguyên O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharide của

màng tế bào, bền với nhiệt và cồn, khi đun nóng ở 1000C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên Kháng nguyên O có thể được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết, kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và

có tính chất chuyên biệt cho từng loại vật chủ Các E.coli có chung tính kháng nguyên

O thường có sự tương tác lẫn nhau và với nhiều nhóm kháng nguyên O của Shigella,

Salmonella

Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, là các vi

nhung mao của vi khuẩn, tạo nên khả năng di chuyển của E.coli, kém chịu nhiệt, có 56

type kháng nguyên H

Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): kháng nguyên K lúc đầu được

xác định bằng phản ứng ngưng kết Người ta xác định có sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị đun nóng Có hơn 80 type kháng nguyên K đã được xác định

Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): tiêm mao dài khoảng 4µm,

đường kính 2,1-7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn Tiêm mao không tham gia vào sự di chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn Một vài

E.coli đặc biệt là E.coli tiết độc tố ruột có những lông bám kháng mannose (mannose

ressistant-MR) cũng được dùng để phân loại về mặt huyết thanh học Một vài lông bám kháng mannose (ví dụ K88, K89) đã từng được coi là kháng nguyên K Về sau khi xác định được thành phần hoá học của những lông bám này có bản chất là protein nên việc xếp chúng vào kháng nguyên K không còn phù hợp, chúng được xếp vào nhóm kháng nguyên tiêm mao F

2.1.2.3 Các chất độc do E.coli tổng hợp nên

Độc tố của E.coli: vi khuẩn E.coli tạo 2 loại độc tố đường ruột (Smith và Oyles,

1970), sự khác biệt giữa chúng là khả năng chịu nhiệt

Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin-LT): độc tố LT của E.coli là

oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (Cholera

toxin-CT) do Vibrio cholerae tiết ra LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như: cấu

trúc, trình tự acid amine (giống nhau khoảng 80%, tương đồng thụ thể, hoạt tính enzyme và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào)

LT có 2 nhóm chính là LT-I và LT-II, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn

dịch chéo nhau LT-I được biểu hiện trong các chủng E.coli gây bệnh trên người và động vật còn LT-II chỉ được tìm thấy trên những chủng E.coli phân lập được trên

động vật và rất ít chủng phân lập được trên người Tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy LT-II có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập trung chủ yếu vào LT-I

LT-I là một oligopeptide, trọng lượng phân tử 86kDa, được cấu tạo từ một tiểu đơn vị A có trọng lượng phân tử 28kDa và 5 tiểu đơn vị B11, 5 kDa 5 tiểu đơn vị là B

sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfic LT-I

có 2 loại, LTh-I có độc tính trên người và LTp-I có độc tính trên heo, sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển của golgi (golgi vận chuyển) Mục tiêu của LT trong tế bào là enzyme adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein liên kết GTP (GTP-binding protein) là

Gs, gây hoạt hoá enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào Vì vậy, enzyme cAMP sẽ gắn vào và hoạt hoá enzyme protein kinase A Enzyme này hoạt động làm phosphoryl hoá kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào biểu mô ruột vượt quá mức bình thường

Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl bởi những tế bào có lông nhung Do đó, hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng làm nước bên trong tế bào kéo ngược ra ngoài và dẫn đến hiện tượng tiêu chảy

LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55-57% ở tiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B LT-II làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm thụ thể thay vì GM1, tuy nhiên

như đề cập ở trên, thì không có bằng chứng cho thấy LT-II gây độc cho tế bào của người và động vật

Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin-ST): ST có trọng lượng phân tử nhỏ, trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tạo nên khả năng kháng nhiệt của độc tố Độc tố này có 2 loại, có cấu trúc và cơ chế hoạt động khác biệt nhau là STa và STb

STa là một peptide gồm 18-19 acid amine với trọng lượng phân tử khoảng 2

kDa, STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) từ E.coli phân lập được trên heo và STb (ST human hay STIb) của E.coli phân lập được trên người

Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C), nó nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột Sự kết hợp của STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl gây ra sự tiết chất lỏng trong ruột

STb chủ yếu có lien quan đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù cũng có báo cáo vài chủng ETEC người cũng sản sinh STb Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao một phần Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào Tác động của STb trong tế bào không giống như STa, thay vì phân tiết Cl- nó lại kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3-) STb không làm gia tăng hàm lượng cGMP nội bào mà làm gia tăng hàm lượng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngoài (dẫn liệu Lê Thị Mai Khanh, 2004)

2.1.2.4 Các chủng E.coli gây bệnh

Đối với các E.coli gây bệnh đường ruột, người ta chia làm 5 loại sau đây:

 Enteroaggregative E.coli (E.A.E.C hay E.Agg.E.C) là nhóm E.coli không

sinh enterotoxin, gây tiêu chảy kéo dài (trên 14 ngày) Trong hầu hết các báo cáo đều

mô tả E.A.E.C ở các ca tiêu chảy lẻ tẻ, nhưng E.A.E.C cũng có thể là tác nhân gây thành ổ dịch (Vial và cộng sự, 1998)

 Enteroinvasive E.coli (E.I.E.C): rất giống với Shigella về mặt kháng nguyên sinh hoá và đặc tính gây bệnh Cả Shigella spp và E.I.E.C đều có khả năng

xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng và chúng đều tiết 1 hay nhiều độc tố ruột liên quan đến tiêu chảy (H.Lior,1994)

 Enterophathogenic E.coli (E.P.E.C): số lượng rất ít (chỉ nhóm O45 và

O108 là hiện diện trên heo) và thường liên quan đến các trường hợp tiêu chảy trên những con heo cai sữa và sau cai sữa (Th.Alogninouwa,1994)

 Enterohaemorrhagic E.coli (E.H.E.C): gây tiêu chảy xuất hiện trên cả thú

và người, sản sinh độc tố thần kinh verotoxin (VT) hay độc tố shiga-like (shiga-like toxin producing E.coli: SLTEC) gây các triệu chứng viêm ruột xuất huyết và hội chứng viêm huyết niệu (H.Lior,1994)

 Enterotoxigenic E.coli (E.T.E.C): nhóm này gồm những E.coli tạo ra ít

nhất một trong hai loại độc tố đường ruột là ST và LT Các ST và LT thường có một hay nhiều yếu tố kết dính (F4, F5, F6, F41)cho phép chúng bám vào các vi nhung mao ruột Các nguồn E.T.E.C thường kết hợp với bệnh tiêu chảy trên heo còn bú và thường thuộc các nhóm huyết thanh sau: O8, O9, O138, O141, O147, O149,…(Th.Alogninouwa,1994)

2.1.2.5 Khả năng gây bệnh cho người

 Gây bệnh cho người

E.coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở

đường tiêu hoá Tuy là vi khuẩn sống cộng sinh với người nhưng E.coli có thể gây

bệnh cơ hội, chúng có thể gây viêm đường tiêu hoá, tiết niệu, sinh dục, đường mật, đường hô hấp và nhiễm khuẩn huyết, đặc biệt gây viêm dạ dày ruột ở trẻ em

 Gây bệnh thực nghiệm trên thú

Khả năng gây bệnh cho súc vật yếu, phải đưa một lượng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hay đường tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết

E.coli gây bệnh trên heo con theo mẹ hầu hết đều thuộc lớp sản sinh độc tố ruột

hay E.T.E.C

2.2 Sơ lược về Bacillus subtilis

2.2.1 Lịch sử

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y

học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các chiến sĩ

Đến năm 1949-1957 khi Herry, Albot và các cộng sự tách được các chủng

thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó, “subtilistherapie” có nghĩa là sutilin ra đời trị

các chứng viêm ruột, viêm đại tràng , chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá

Ngày nay vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi

trong chăn nuôi, y học, thực phẩm…(dẫn liệu Nguyễn Duy Khánh, 2006)

2.2.2 Đặc điểm phân loại

2.2.3 Đặc điểm phân bố

B.subtilis thường có mặt trong đất, nước, không khí, xác bã thực vật thối rửa và

cả trong đường tiêu hoá của người và động vật B.subtilis hiện diện trong đất với một

số lượng phổ biến là 106-107 CFU/g Vi khuẩn này có khả năng sinh bào tử để có thể chịu đựng các điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt và những thay đổi bất lợi của môi trường

sống.Thông thường có khoảng 60% số lượng B.subtilis trong đất tồn tại ở trạng thái

này (Alexander, 1977)

2.2.4 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là các vi khuẩn gram dương hiếu khí, hình trực thẳng, hai đầu

tròn, kích thước 0,5-0,8 µm x 2,5-3 µm Những vi khuẩn này nằm riêng rẽ hay sắp xếp với nhau thành những chuỗi ngắn

Bacillus subtilis có khả năng tạo bào tử dưới dạng hình ovale với kích thước

0,8-1,8 µm ở trung tâm tế bào vi khuẩn.Bào tử của Bacillus subtilis phát triển bằng

cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm,

Bảng : phân loại Bacillus subtilis

năng di động nhờ vào hệ thống lông roi phủ trên bề mặt vi khuẩn (Kenethe Todar, 2008)

Trên thạch dinh dưỡng: khuẩn lạc Bacillus subtilis trong mờ và gù lên Những

khuẩn lạc này có màu trắng kem, bề mặt sáng với viền nhăn nheo Đường kính khuẩn lạc từ 3-5 mm Sau 1-4 ngày nuôi cấy, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo với màu nâu nhạt ( Nguyễn Đức Duy Anh, 2005)

Trong môi trường lỏng: Bacillus subtilis tạo những lớp màng mỏng trên bề mặt

sau thời gian nuôi cấy (Kenethe Todar, 2008)

2.2.5 Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus subtilis là loài vi khuẩn ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là

36-560C và nồng độ NaCl có khả năng ức chế vi khuẩn là 10-1 (Lương Đức Phẩm, 2000)

Nhu cầu Oxy: Bacillus subtilis là loài hiếu khí hay yếm khí tuỳ nghi

Bacillus subtilis có thể phát triển trong những môi trường phức tạp hoặc khá

đơn giản Sự phân lập bước đầu có thể thực hiện trên thạch dinh dưỡng (peptone 5g/l, cao thịt 3g/l, agar 15g/l, pH 6,8) hoặc trên J-agar (tryptone 5g/l, chiết nấm men 15g/l, K2HPO4, glucose 2g/l, agar 20g/l, pH 7,4) (Kenethe Todar, 2008)

2.2.6 Đặc điểm sinh hoá

Các phản ứng sinh hoá được sử dụng để khẳng định Bacillus subtilis: phản ứng

lecithinase (-), khả năng phân giải casein(+), khả năng phân giải tinh bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose

2.2.7 Kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp

Tiềm năng sản xuất các kháng sinh của Bacillus subtilis đã được nhận thấy

khoảng 50 năm trước Những kháng sinh có bản chất peptide chiếm ưu thế trong các kháng sinh tổng hợp Tuy nhiên, các nghiên cứu có hệ thống điều tra về phổ kháng

khuẩn hoàn chỉnh của các kháng sinh tổng hợp bởi các chủng B.subtilis khác nhau thì

vẫn còn hiếm (Pinchuk et al, 2002)

Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 66 loại kháng sinh khác nhau như

subtilin, subtilosin, sublancin, surfactin, bacitracin,…(Katz và Demain, 1997) Phần

chống lại các vi khuẩn gram dương (Ming và Epperson, 2002) Tuy nhiên, hỗn hợp polymyxin, colistin và circulin thể hiện khả năng chống lại vi khuẩn gram âm hay bacillomycin, mycobacillon và fungistatin có tác động mạnh trên nấm mốc và nấm men (Katz và Demain, 1997)

Các kháng sinh peptide do Bacillus subtilis tổng hợp được chia thành 2 nhóm

lớn Đó là các peptide kháng khuẩn tổng hợp dựa vào ribosome (RAMPs- Ribosomally synthesized Antimicrobial peptides) và những peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome (non-RAMPs) (Hancock và Chapple, 1999) Các

RAMPs được tổng hợp trong suốt pha phát triển chủ động của B.subtilis, trong khi các non-RAMPs được tổng hợp sau pha phát triển chủ động của B.subtilis (Tamehiro et al,

2001)

 Các peptide kháng khuẩn tổng hợp dựa vào ribosome (RAMPs)

Các RAMPs do B.subtilis tổng hợp ra bao gồm surfactin, nhóm inturin,

fengycin (Zuber, Nakano, et Marahiel, 1993), bacitracin, bacilysin (Ozcengiz, Alaeddingolu et Demain, 1990)…

Surfactin: sỡ hữu khả năng kháng khuẩn, chống ung thư, tiêu máu, chống đông, phân huỷ fibrin Giống với các biosurfactant mạnh nhất, surfactin có rất nhiều ứng dụng trong ngành môi trường và công nghệ sinh học Những khả năng khác của nó đã

được ghi nhận gồm có sự nhũ hoá và chống mycoplasma…(Al-Ajlani et al, 2007)

Nhóm Inturin: những kháng sinh thuộc nhóm này là các hợp chất peptidolipid

có tác động chống nấm rất mạnh Chúng có một chuỗi β-aminoacide gắn với một nửa peptide gồm D và L α-aminoacides (Mhamedi et al, 1982)

Fengycin: bao gồm các enzyme (fengycin synthetase)- Fen C, Fen D, Fen A và Fen B Fengycin có khả năng kháng nấm rất mạnh

 Các peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome RAMPs)

(non-Những peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome bao gồm TasA (Stover và Driks, 1999), subtilosin (Babasaki et al, 1985)

TasA: có phổ kháng khuẩn rộng, được tiết ra trong môi trường nuôi cấy 30 phút sau khi sự tạo bào tử bắt đầu Nó định vị trong lớp peptidoglycan của bào tử

TasA giúp B.subtilis chiếm ưu thế trong sự hình thành (dẫn liệu Nguyễn Quỳnh

Nam,2006)

Subtilosin: là một bacteriocin có khả năng kháng khuẩn mạnh chống lại

Listeria monocytogenes và Bacillus cereus (dẫn liệu Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)

Sublancin: kháng sinh này không tác động lên các vi khuẩn gram âm nhưng nó

có khả năng đối kháng rất mạnh lên các vi khuẩn gram dương Sublancin là một bacteriocin bền, không mất hoạt tính sau 2 năm bảo quản trong những điều kiện bình thường (dẫn liệu Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)

Bacilysocine: cấu trúc của bacilysocine là phosphoglycerol Bacilysocine thể hiện những khả năng kháng khuẩn nói chung và khả năng kháng nấm nói riêng Sự tổng hợp bacilysocine bắt đầu ngay lập tức sau pha tăng sinh nhưng trước khi sự hình thành bào tử bắt đầu (Tamehiro et al, 2001)

1-(12-methyltetradecanoyl)-3- Những yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp kháng sinh của Bacillus subtilis

 Các khoáng chất thiết yếu

Mặc dù phần lớn các kháng sinh không cần đến ion kim loại cho các hoạt động của nó nhưng vẫn có rất nhiều kháng sinh cần đến các ion kim loại để hoạt động, ví dụ như bacitracin (Jamil et al, 2006) Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và chức năng của các kháng sinh này Những kháng sinh này được gọi

là “metaloantibiotics” theo tiếng anh (Epperson et Ming, 2000)

Các ion kim loại có thể rất thiết yếu cho sự hình thành bacitracin (Weimberg, 1958) Sự sản xuất bacitracin bị ức chế bởi EDTA Tác động ức chế của EDTA bị đảo ngược bởi sự thêm vào trong môi trường nuôi cấy lượng dư Mn2+, Co2+, Zn2+ (Haavik, 1974)

 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Trong nghiên cứu “ Phân lập B.subtilis MH4 từ đất và tiềm năng của nó trong

việc sản xuất các kháng sinh polypeptide” của (Jamil et al, 2007), sự ủ trong vòng 96 giờ đã cho ra sự sản xuất kháng sinh tối ưu Điều này cũng đã được thảo luận trong nghiên cứu của (Demain, 1972) mà trong đó ông đã kết luận rằng sự tổng hợp của các kháng sinh polypeptide được bắt đầu sau pha tăng trưởng của vi khuẩn

 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

pH tối ưu cho sự sản xuất kháng sinh của Bacillus subtilis là 8 Tuy nhiên ở pH

từ 6-9 sự sản xuất kháng sinh cũng rất tốt (Jamil et al, 2007) Những sự thay đổi pH từ bên ngoài ảnh hưởng rất nhiều đến các quy trình tế bào như sự điều hoà sinh tổng hợp

các chất biến dưỡng thứ cấp Sự sản xuất bacitracin của Bacillus subtilis phụ thuộc

vào pH (Montserrat et al, 2000)

 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Người ta đã tìm ra rằng sự hình thành các kháng sinh đạt tối đa khi glycerol được sử dụng như một nguồn carbon Tuy nhiên, các hoạt động sản xuất kháng sinh sẽ tăng đáng kể khi maltose, glucose, sorbitol và lactose được sử dụng như nguồn carbon (Jamil et al,2007)

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Sự tạo các kháng sinh đạt đến tối ưu khi acid L-glutamic được sử dụng làm nguồn nitơ (Jamil et al, 2007) (Egorov et al, 1986) đã kết luận rằng sự thay thế glutamate bởi tryptone có thể gây ra sự suy giảm đáng kể sự tăng sinh của vi khuẩn,

sự tích tụ sinh khối cũng như làm dừng quá trình tổng hợp kháng sinh

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nghiên cứu của (Jamil et al, 2007) đã cho thấy rằng nhiệt độ tối ưu cho sự hình thành các kháng sinh phụ thuộc vào các vi khuẩn kiểm nghiệm, nó là 300C đối với

Staphylococcus aureus, và là 370C đối với Micrococcus luteus Tuy nhiên, theo

(Anker et al, 1947) thì sự sản xuất kháng sinh này đạt đến tối đa ở 370C

2.2.7 Tính đối kháng của Bacillus subtilis

 Với vi sinh vật gây bệnh

Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh

là cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh

Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng chủ yếu sau:

 Làm ngưng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn và do đó phá huỷ tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg2+, Na+, Ca2+ thoát

ra ngoài, tế bào chết

 Ảnh hưởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn Chất kháng sinh

có thể phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi polypeptide hay đưa đến tổng hợp protein bất thường

 Ảnh hưởng đối với acid acetic, cụ thể là phá huỷ sự trao đổi của AND

và ARN bằng cách ức chế men ARN polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn chuỗi xoắn kép AND

Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số

lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn bởi Lý Kim Hữu)

 Với đồng loại

 Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra

chất kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này nhằm tiêu thụ chất dinh dưỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài thời

kì trước khi tạo bào tử (Richard Losik, Jone Gonzales và cộng sự, 1993)

2.2.8 Độc tính của Bacillus subtilis

( Dẫn liệu Nguyễn Nhật Chen, 2008)

 Đối với con người

Một số chủng Bacillus subtilis cũng như họ hang gần của nó là B.licheniformis,

B.pumulis, B.megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có khả năng

phá vỡ tế bào của động vật hữu nhũ Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người

Một số nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis cũng liên quan đến vài trường hợp

gây ngộ độc thực phẩm

Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có

độc tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài, gây những bệnh như viêm da, viêm đường

hô hấp…

Bacillus subtilis có tính độc rất thấp đối với người vì nó sản xuất enzyme ngoại bào và là tác nhân gây độc nhưng không đủ để có thể gây hại cho người Ngoại trừ những trường hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miễn dịch của người

đang suy yếu Trong một số trường hợp, người ta vẫn phát hiện Bacillus subtilis ở

những bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả… Tuy nhiên, tỉ lệ các trường hợp này là rất hiếm, chỉ có 2 trong 24 trường hợp nhiễm

Bacillus (trong 1034 ca nhiễm) là do Bacillus subtilis

 Đối với động vật

Bacillus subtilis được phát hiện trong một số trường hợp bò và cừu sẩy thai

Tuy nhiên, Bacillus subtilis vẫn không được cho là nguyên nhân gây bệnh

Bacillus subtilis nhiễm vào và gây tử vong cho muỗi Anophelis aulicifacies gây

sốt rét ở Ấn Độ (I.Geetha và A.M Manonmani, 2008) và được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học trong nghiên cứu bệnh này

 Đối với thực vật

Bacillus subtilis gây phân huỷ pectin và polysaccharides của mô thực vật dẫn

đến thối củ khoai tây, gây những vết viêm loét trên một số cây rừng

2.2.9 Ứng dụng của Bacillus subtilis

Các đặc tính có ích của Bacillus subtilis

- Sản sinh enzyme amylase, pectinase, protease, lipase, trypsin, urease, mannose,…

- Sản sinh các acid hữu cơ: acid lactic, acid acetic làm giảm pH đường ruột

- Sản sinh vitamin nhóm B

- Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh

- Sản xuất các kháng sinh ức chế các vi sinh vật gây bệnh

- Bacillus subtilis còn được xem là tác nhân kích thích miễn dịch trong điều trị một số bệnh

 Trong công nghiệp

Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất ra enzyme và một

số chất hoá học cho công nghiệp như amylase, protease, inosine, ribosides, aminoacid,… Trong đó, protease được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy

 Trong y học

Việc trao đổi gen giữa những chủng thuộc Bacillus subtilis khi chúng cùng phát

triển trong đất đã được biết đến khá lâu Klier và cộng sự đã chứng minh khả năng

trao đổi plasmide giữa Bacillus subtilis và Bacillus thuringensis Một số nghiên cứu chỉ ra rằng Bacillus subtilis chuyển gen có khả năng kích ứng hay làm ức chế khả

năng biểu hiện độc tố hay 1 số thành phần độc tố trong các vi khuẩn trong các bệnh ho

gà, bạch hầu, viêm phổi,… điều này có ý nghĩa rất lớn đối với y học Tuy nhiên, cũng

còn tồn tại một vấn đề là Bacillus subtilis hoàn toàn có thể nhận được các gen quy

định tính độc từ các vi khuẩn độc có quan hệ tương đối gần về mặt di truyền và gây hại

Giáo sư Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên đã nghiên cứu sản xuất chế

phẩm B.subtilis đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy

Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm B.subtilis dung điều trị bệnh tiêu chảy trên người

Năm 1982, bác sĩ Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế

phẩm coli_subtyl (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu

chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt

 Trong nông nghiệp

Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia

solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae,… ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch

Bacillus subtilis được ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm nhằm làm giảm tái

phát bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với điều trị bằng kháng sinh

2.3 Kháng sinh và sự đề kháng với kháng sinh

2.3.1 Kháng sinh

2.3.1.1 Định nghĩa

Kháng sinh là một chất có nguồn gốc sinh học hoặc tổng hợp, có tác dụng đặc hiệu lên một giai đoạn chính trong sự chuyển hoá của vi khuẩn (kháng sinh kháng khuẩn)

hay nấm (kháng sinh kháng nấm) (Hồ Huỳnh Quang Trí và Nguyễn Thị Thanh,1995)

 Nhóm glycopeptides

Vancomycine và Teicoplanine ức chế một trong những giai đoạn cuối cùng của

sự tổng hợp peptidoglycane Chúng tạo thành một phức hợp dipeptide alanine nằm ở đầu của chuỗi peptidoglycane

- Kháng sinh tác dụng lên sự tổng hợp đạm

 Nhóm Aminosides

Các kháng sinh nhóm aminosides bám vào tiểu đơn vị 30S của ribosome, ngăn cản việc giải mã di truyền bởi các ARN vận chuyển làm cho sự tổng hợp đạm của vi khuẩn bị ức chế