CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ CÓ TRIỆU CHỨNG BỆNH HÔ HẤP

Kết quả chẩn đốn bệnh viêm phế quản truyền nhiễm của chúng tơi trong 5 trại cĩ triệu chứng bệnh hơ hấp đã thu được kết quả như sau: • Kết quả chẩn đốn dựa vào triệu chứng, bệnh tích đại

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

***********

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

**********

ĐỖ THỊ THANH HƯƠNG

CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở

GÀ CÓ TRIỆU CHỨNG BỆNH HÔ HẤP

Khóa luận ñược ñệ trình ñể ñáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS NGUYỄN ĐÌNH QUÁT BSTY HỒ HOÀNG DŨNG

Tháng 08/2010

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ tên sinh viên thực tập: Đỗ Thị Thanh Hương

Tên luận văn: “Chẩn đốn bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà cĩ triệu chứng bệnh hơ hấp”

Đã hồn thành luận văn theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét, đĩng gĩp của hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa Chăn Nuơi Thú Y ngày ………

Giáo viên hướng dẫn

TS NGUYỄN ĐÌNH QUÁT BSTY HỒ HỒNG DŨNG

LỜI CẢM TẠ

• Thành kính biết ơn!

Cha mẹ - người ñã có công sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và tạo mọi ñiều kiện cho

có ñược ngày hôm nay

• Xin chân thành cảm ơn!

- Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm cùng toàn thể quý thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y ñã tận tình dạy dỗ, dìu dắt chúng tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

- Thầy Nguyễn Đình Quát và Cô Nguyễn Thị Phước Ninh ñã hướng dẫn, sửa chữa tận tình luận văn cho chúng tôi

- Thầy Hồ Hoàng Dũng – giám ñốc Nghiên Cứu vá Triển Khai Công Nghệ Công Ty Trách Nhiệm Hữu Hạn Cargill Việt Nam, ñã tận tình hướng dẫn và tài trợ cho chúng tôi tiến hành nghiên cứu

- Cùng toàn thể nhân viên kỹ thuật gia cầm của Công Ty ñã giúp ñỡ

và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài

- Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn ñến những người bạn lớp DH05TY

và những người bạn cùng khóa ñã cùng tôi chia sẽ vui buồn, ñã gắn bó và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

LUẬN VĂN TĨM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Chẩn đốn bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà cĩ triệu chứng bệnh hơ hấp” được tiến hành tại 5 trại gà thuộc địa bàn các tỉnh Miền Đơng và Miền Tây Nam Bộ thời gian từ 09/03 đến ngày 25/05 năm 2010

Kết quả chẩn đốn bệnh viêm phế quản truyền nhiễm của chúng tơi trong 5 trại cĩ triệu chứng bệnh hơ hấp đã thu được kết quả như sau:

• Kết quả chẩn đốn dựa vào triệu chứng, bệnh tích đại thể và vi thể cho thấy sự nghi ngờ về bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trong các trường hợp khảo sát

• Kết quả chẩn đốn huyết thanh học cho thấy trong 5 trại được chúng tơi khảo sát,

cĩ 2 trại được xác định đang mắc bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (trại 1, 3), 1 trại cĩ tiếp xúc (trại 4), 1 trại cĩ tiếp xúc trước đĩ nhưng âm tính tại thời điểm khảo sát (trại 5), 2 trại chúng tơi chưa cĩ khẳng định chính xác mặc dù kết quả HI cho thấy cĩ sự hiện diện của kháng thể chủng 4/91 trên đàn gà khơng chủng ngừa chủng 4/91 (trại 2 và trại 4)

- Kết quả ELISA cho thấy 5 trại gà đã từng tiếp xúc với virus IB

- Kết quả HI cho thấy sự hiện diện của kháng thể kháng lại IB.4/91 trong tổng số 5 trại khảo sát chiếm tỷ lệ 100%

- Kết quả AGP cho thấy cĩ sự tiếp xúc của IBV trong thời gian gần đây, điều này khẳng định triệu chứng hơ hấp ở thời điểm chúng tơi khảo sát là

do virus IB gây ra (trại 1 và 3)

• Kết quả phân lập virus đã chứng minh sự hiện diện của virus IB hoang dại trong 2 trại (trại 1 và 3)

MỤC LỤC

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm tạ iii

Luận văn tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các hình và sơ ñồ viii

Chương 1 1

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 3

CƠ SỞ LÝ LUẬN 3

2.1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM 3

2.2 LỊCH SỬ BỆNH VÀ TÌNH HÌNH BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM 3

2.2.1 Lịch sử của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm 3

2.2.2 Tình hình bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trong và ngoài nước 4

2.3 CĂN BỆNH 5

2.3.1 Phân loại 5

2.3.2 Hình thái 5

2.3.3 Cấu trúc hoá học 6

2.3.4 Serotypes 6

2.3.5 Sự nhân lên virus 6

2.3.6 Sức ñề kháng 6

2.3.6 Đặc ñiểm nuôi cấy 7

2.3.7 Tính sinh miễn dịch 8

2.4 DỊCH TỂ HỌC 9

2.4.1 Lồi mắc bệnh 9

2.4.2 Chất chứa căn bệnh 9

2.4.3 Đường xâm nhập và truyền lây mầm bệnh 10

2.4.4 Cách sinh bệnh 10

2.5 ĐẶC ĐIỂM TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH 11

2.5.1 Triệu chứng 11

2.5.2 Bệnh tích 13

2.6 CHẨN ĐỐN 14

2.6.1 Chẩn đốn lâm sàng và phân biệt một số bệnh khác 14

2.6.2 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm 15

2.7 PHỊNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM 20

2.7.1 Phịng bệnh 20

2.7.2 Điều trị: 21

2.8 LƯỢC DUYỆT MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 21

2.8.1 Trong nước 21

2.8.2 Nước ngồi 22

Chương 3 23

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 23

3.1.1 Thời gian 23

3.1.2 Địa điểm 23

3.2 Đối tượng khảo sát 23

3.3 Nội dung nghiên cứu 23

3.4 Phương pháp nghiên cứu 23

3.4.1 Bố trí thí nghiệm 23

3.4.2 Chẩn đốn dựa vào triệu chứng, bệnh tích 24

3.4.3 Chẩn đốn dựa vào các phương pháp huyết thanh học 26

3.4.4 Chẩn đốn dựa vào phương pháp phân lập 34

3.5 Những chỉ tiêu theo dõi 37

3.6 Các cơng thức tính 37

Chương 4 38

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Kết quả chẩn đốn dựa vào triệu chứng, bệnh tích .38

4.1.1 Triệu chứng lâm sàng 38

4.1.2 Bệnh tích đại thể 39

4.2.3 Bệnh tích vi thể 40

4.3.2 Kết quả phản ứng AGP 44

4.3.3 Kết quả đo hiệu giá ELISA 46

4.4 Kết quả chẩn đốn phân lập 48

Chương 5 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

5.1 KẾT LUẬN 52

5.2 ĐỀ NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 63

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình: 2.1 Hình thái virus IB dưới kính hiển vi ñiện tử 5

Hình: 2.2 Cấu trúc virus IB 5

Hình 4.1 Thận sưng, tích urate 40

Hình 4.2 Khí quản tiết nhiều dịch nhày 40

Hình 4.3 Khí quản tụ máu và thấm nhập tế bào lympho 41

Hình 4.4 Viêm thận kẽ 41

Hình 4.5 Phản ứng AGP với mẫu huyết thanh dương tính 46

Hình 4.6 Phôi bình thường và phôi lùn 51

Hình 4.7 Phản ứng AGP dương tính với kháng huyết thanh chuẩn 51

Sơ ñồ 3.1 Sơ ñồ phân lập virus IB qua phôi trứng (Nguồn: Trạm CĐXN – 151 Lý Thường Kiệt, P.7, Q11, TP.HCM) .35

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Bảng bố trí thí nghiệm 24

Bảng 3.2 Quy trình chủng ngừa vaccine IB 24

Bảng 3.3 Cách thực hiện phản ứng HA 28

Bảng 3.4 Cách thực hiện phản ứng HI 30

Bảng 4.1 Bảng liệt kê triệu chứng lâm sàng .38

Bảng 4.2 Bệnh tích ñại thể 39

Bảng 4.3 Bệnh tích vi thể 40

Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu dương tính theo phương pháp HI 42

Bảng 4.5 Tỷ lệ mẫu có hiệu giá lớn hơn 7 ở trại 2 và 3 .43

Bảng 4.6 Tỷ lệ mẫu dương tính theo phương pháp AGP 44

Bảng 4.7 Hiệu giá kháng thể ELISA 46

Bảng 4.8 Tỷ lệ mẫu có hiệu giá > 4000 ở trại 2 và 3 theo phương pháp ELISA 47

Bảng 4.9 Kết quả tiêm truyền bệnh phẩm qua phôi trứng .49

Bảng 4.10 Kết quả tìm kháng nguyên trong nước trứng qua phản ứng AGP 50

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AGP: Agar Gel Precipitation

BPL: Beta – Propiolactone

CĐXN: Chẩn Đoán Xét Nghiệm

CEL: Chick Embryo Liver

CEK: Chick Embryo Kidney

CK: Chick Kidney

CPCN: Cổ Phần Chăn Nuôi

CPE: Cytopathic Effects

CRD: Chronic Respiratory Disease

EDS: Egg Drop Syndrome

EDTA: Ethylen Diamino Tetra Acetate

ELISA: Enzyme – Linked Immunosorbent Assay

GD: Viện Gezondheidsdienst voor Dieren, Hà Lan

GMT: Geometric Mean Titre, log2

HA: Haemagglutination

HI: Haemagglutination Inhibition

IBD: Infectious Bursal Disease

IBV: Infectious Bronchitis HI: Haemaglutination Inhibition

ILT: Infectious Laryngotracheitis

MDA: Maternally – Derived Antibody

NA: Nutrient Agar

NB: Nutrient Broth

ND: Newcastle Disease

OD: Optical Density

OIE: Organism International Epidemic

PBS: Phosphate Buffered Saline

RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SPF: Specific Pathogen Free

VN: Virus Neutralization

VPQTN: Viêm Phế Quản Truyền Nhiễm

bệnh IB (Infectious bronchitis)

Bệnh VPQTN được coi là bệnh phổ biến nhất trên gà, trên cả bệnh Newcastle Đây được coi là một bệnh khĩ phịng ngừa vì cĩ nhiều serotypes khác

nhau, khơng cĩ thuốc đặc hiệu vì gây ra do virus (Coronavirus), chủ yếu gây bệnh

trên đường hơ hấp với tỷ lệ chết thấp nhưng làm giảm tăng trọng và tăng tiêu tốn thức ăn và cũng cĩ serotype gây bệnh hướng thận (serotype 4/91) gây tỷ lệ chết cao hoặc gây rối loạn quá trình tạo trứng trên gà đẻ Thực tế theo quan sát của chúng tơi, bệnh “khị khè” trên gà thịt lơng trắng và lơng màu nuơi cơng nghiệp là một vấn nạn lớn cho người chăn nuơi gà tại các tỉnh miền Đơng và Tây Nam Bộ, mà trong điều kiện hạn chế thường được chẩn đốn là bệnh CRD và nhiều trường hợp việc sử

dụng các kháng sinh kháng Mycoplasma gallisepticum khơng đem lại hiệu quả điều

trị, trong khi đĩ những khảo sát về bệnh VPQTN ở nước ta mà chúng tơi tìm thấy thì chưa nhiều

Do đĩ, xuất phát từ những thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ Mơn Vi Sinh – Truyền Nhiễm thuộc Khoa Chăn Nuơi Thú Y – Trường Đại Học Nơng Lâm

TP Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Đình Quát và BSTY Hồ

Hồng Dũng chúng tơi tiến hành đề tài: “Chẩn đốn bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà cĩ triệu chứng bệnh hơ hấp”

− Phân lập virus IB trên phơi trứng gà

− Xét nghiệm huyết thannh học bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch, Haemagglutination Inhibition, Enzyme – Linked immunosorbent Assay

Chương 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM

Viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious bronchitis) là một bệnh truyền

nhiễm cấp tính, rất lây lan và xảy ra ở mọi lứa tuổi của gà Bệnh gây rối loạn nghiêm trọng ñường hô hấp, làm viêm thận và giảm sản lượng cũng như chất lượng trứng Về cấu trúc, chúng thuộc nhóm RNA virus, giống Coronavirus, họ

Coronaviridae có tên là Infectious bronchitis virus, viết tắt là IBV (Nguyễn Thị

Phước Ninh, 2005)

Coronavirus có vỏ ngoài bao bọc và cơ sở vật chất di truyền là RNA dương

bản, phân cực, thẳng, không phân ñoạn Thuật ngữ corona dùng ñể chỉ peplomer dạng dùi cui thưa, tạo thành tua nhọn có ánh hào quang toả ra từ vỏ bọc ngoài của virus như chiếc vương miện (Trần Thanh Vân, 2000)

2.2 LỊCH SỬ BỆNH VÀ TÌNH HÌNH BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM

2.2.1 Lịch sử của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm

IB ñược quan sát ñầu tiên tại miền Bắc Dakota (Mỹ) vào năm 1930 Năm

1931, Schalk và Hawn viết về những dấu hiệu lâm sàng và những nghiên cứu mở ñầu trong phòng thí nghiệm ñược công nhận như một bản báo cáo về IB ñầu tiên trên thế giới Khởi ñầu, IB ñược xem như một bệnh chủ yếu trên gà con Tuy nhiên, những quan sát sau ñó ñều thấy trên cả những ñàn gà gần trưởng thành và gà ñẻ Những biểu hiện khác của IB bao gồm giảm sản lượng trứng trên những ñàn gà ñẻ, theo sau bệnh hô hấp ñiển hình vào thập niên 1940 và tổn thương thận ñược quan sát vào thập niên 1960 (trích dẫn bởi Cavanagh và Naqi, 2003)

Năm 1936, Beach và Schalm đã phát hiện ra căn bệnh học virus Beaudette

và Hudson nuơi cấy virus trên phơi trứng gà đầu tiên vào năm 1937 Năm 1956, báo cáo của Jungherr và các cộng sự cho thấy chủng Connecticut vào năm 1951 và chủng Massachusetts vào năm 1941 sinh ra những bệnh giống nhau nhưng khơng cĩ bảo hộ chéo hay trung hịa chéo Bài báo cáo này đã chứng tỏ căn bệnh học của IB bao gồm nhiều hơn một serotype (trích dẫn bởi Fabricant, 2000)

2.2.2 Tình hình bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trong và ngồi nước

2.2.2.1 Tình hình bệnh viêm phế quản trên thế giới

VPQTN được phân bố rộng khắp thế giới Ở Mỹ, ngồi type Massachusetts, nhiều serotype của IBV đã được xác định, cĩ khoảng hơn 20 chủng virus IB bắt đầu

từ năm 1950 (Fabricant, 2000) Nhiều chủng thuộc type Mass đã được phân lập ở Châu Âu từ năm 1940 (Cavanagh và Davis, 1992) Nhiều serotypes khác, khác biệt với các serotypes đã được phân lập ở miền Bắc Châu Mỹ cũng đã được phân lập ở Châu Phi; Châu Á gồm cĩ Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc Châu Úc và Châu Âu với nhiều tác giả khác nhau đã phân lập thành cơng IBV Sự bùng nổ về

IB thường xuyên xảy ra, thậm chí ở cả những đàn đã chủng ngừa (trích dẫn bởi Cavanagh và Naqi, 2003)

2.2.2.2 Tình hình bệnh viêm phế quản ở Việt Nam

Theo Trần Thanh Phong (1996) ở nước ta, cĩ một số ca bệnh nghi ngờ Phan Văn Lục (1997) cho rằng bệnh này cĩ ở nước ta từ vài năm nay Trần Thanh Vân (2000) đã xác địnhsự hiện diện của hai biến chủng mới 4/91 và CR88 ở đàn gà bố

mẹ giống thịt HUBBARD HI – YIELD tại hai trại An Đơ (Tân Uyên – Bình Dương) và Bắc Sơn (Thống Nhất – Đồng Nai) bằng phương pháp trung hịa virus bởi huyết thanh gà nghi mắc bệnh Đặng Thị Hồng Thắm ghi nhận 4 ca bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trên gà đem mổ khám tại Bệnh Xá Thú Y qua kết quả chẩn đốn bệnh tích đại thể và vi thể

2.3 CĂN BỆNH

2.3.1 Phân loại

Virus IB thuộc họ Coronaviridae (gồm 2 giống: Coronavirus và Torovirus),

nằm trong nhóm 3 thuộc giống Coronavirus (Cavanagh, 2000; Enjuanes và ctv,

2000) Gần ñây, một vài Coronavirus phân lập từ gà tây cho thấy có mối quan hệ

gần gũi với IBV nhưng Guy cũng chứng minh ñược rằng những dấu hiệu lâm sàng

không ñược bộc lộ sau khi tiêm nhiễm Coronavirus từ gà tây vào gà, mặc dù có sự

nhân lên của virus ở mô ruột (Guy, 2000) và ñã ñược xếp vào nhóm 3 (Cavanagh,

2001; Enjuanes và ctv, 2000)

2.3.2 Hình thái

Virus IB có dạng cầu hoặc ña hình thái Virus có vỏ bọc ñường kính khoảng

120nm và có mấu nhô lên bề mặt tạo ra những gai dạng chùy (spikes) có chiều dài

khoảng 20nm (hình 2.1) Các mấu nhô ra này không dày ñặc hình gậy như ở

Paramyxo virus (Davies và Macnaughton, 1979)

Cấu trúc nucleoprotein ñược phóng thích từ các hạt virus có thể nhìn thấy

ñược bằng kỹ thuật chụp bóng (shadow) nhưng không thấy ñược bằng kỹ thuật

nhuộm âm bản (negative staining) (Davies và ctv, 1981) Đa số các nucleoprotein

ñược nhìn thấy ở dạng sợi có ñường kính 1 – 2nm nhưng ñôi khi quan sát ñược ở

dạng xoắn ốc với ñường kính 10 – 15nm (Davies và ctv, 1981)

Hình 2.1 Hình thái virus IB dưới kính hiển Hình 2.2 Cấu trúc virus IB

vi ñiện tử (ñộ phóng ñại 3300.000)

(Cavanagh và Naqi, 2003)

2.3.3 Cấu trúc hoá học

Hạt virus (virion) chứa 3 protein cấu trúc chính (hình 2.2): Mấu gai (spike: S), glycoprotein của màng (M) và protein của nucleoprotein bên trong (N) (Enjuanes và ctv, 2000; Lai và Cavanagh, 1997) Ngoài ra, một protein thứ tư (protein màng nhỏ E) ñược tin là tạo nên lớp vỏ bọc có số lượng rất ít, protein này chủ yếu cho chức năng thành lập hạt virus Protein S bao gồm 2 hay 3 phiên bản của

2 protein S1 và S2 (khoảng 520 – 625 amino acids) Các kháng thể HI và kháng thể trung hoà virus ñược tạo ra bởi protein S1 (Ignjatovic và ctv, 1997) Chỉ có khoảng 10% protein M là hiện diện ở mặt ngoài của virus Protein N là 1 mảnh ñơn của 1 sợi dương ñơn, bộ gen ARN có khoảng 27.600 nucleotides, toàn bộ ñã ñược dòng hoá và giãi chuỗi (Bayon-Auboyer và ctv, 1999)

2.3.4 Serotypes

Hiện tượng ñột biến làm cho virus có khả năng biến ñổi một phần cấu trúc của chuỗi polypeptid S1 tạo ra nhiều serotypes khác nhau Do ñó số biến chủng của virus rất lớn Sự khác nhau giữa chuỗi polypeptid S1 của chúng nhiều hay ít là tiêu chuẩn xác ñịnh mối quan hệ họ hàng của chúng gần hay xa (Trần Thanh vân, 2000)

2.3.5 Sự nhân lên virus

Virus IB nhân lên ở tế bào chất, 6 ARN tổng hợp ñược sản xuất bởi cơ chế phiên bản không liên tục ñể tạo ra sự tái tổ hợp (Lai và Cavanagh, 1997) Sự hình thành hạt virus do quá trình nảy mầm từ màng của mạng lưới nội tế bào không phải

từ màng tế bào Mặc dù protein S có thể di hành xuyên mạng lưới nội tế bào, protein M thì không thể (Tomley và ctv, 1987) Hạt virus tập trung ở các nang nhưng cơ chế giải phóng chúng từ tế bào thì chưa ñược biết Virus mới ñược tạo ra khoảng 3 – 4h sau khi nhiễm, với sản lượng cao nhất trên mỗi tế bào ñạt ñược sau 12h ở nhiệt ñộ 37oC

2.3.6 Sức ñề kháng

Virus có sức ñề kháng yếu ñối với ngoại cảnh Hầu hết các chủng IBV ñều mất hoạt tính sau 15 phút ở 56oC và sau 90 phút ở 45oC (Cavanagh và Naqi, 1997) Tuy nhiên virus trong nước trứng bảo quản ở -30oC có thể sống ñược 30 năm Ở

ngồi trời, virus cĩ thể sống được đến 12 ngày vào mùa xuân và 56 ngày vào mùa đơng Những mơ bị nhiễm nếu bảo quản trong 50% glycerol thì được duy trì tốt và

cĩ thể chuyển đến phịng xét nghiệm để chẩn đốn bệnh mà khơng cần phải giữ lạnh (Cavanagh và Naqi, 1997; Hofstad, 1984) IBV nhạy cảm các chất sát trùng thơng thường, khơng bền trong mơi trường ether nhưng một vài virus cĩ thể sống được 18h ở 4oC trong 20% ether, bị tiêu diệt bởi 50% chloroform (10 phút, nhiệt độ phịng) và 0,1% sodium deoxycholate (18h, 4oC) (Cavanagh và Naqi, 1997) Nếu đơng khơ ở 37oC thì virus bị vơ hoạt trong 6 tháng, các chất sát trùng thường sử dụng là phenol 1%, crezyl 1%, NaOH 5%, thuốc tím 1/10000 (Trần Thanh Phong, 1996) Xử lý bằng 0,1% beta – propiolactone (BPL) hoặc 0,1% formalin loại trừ khả năng nhiễm IBV (King, 1984)

2.3.6 Đặc điểm nuơi cấy

Nuơi cấy trên trứng gà cĩ phơi

Virus IB nhân lên tốt trên phơi trứng gà 9 – 11 ngày tuổi (đường tiêm xoang niệu mơ) gây phơi lùn, cịi cọc ở một vài phơi với tỷ lệ sống sĩt 90% tính đến ngày thứ 19 của tuổi phơi, mặc dù một vài chủng khơng gây ra phơi lùn, cịi cọc sau 3 đời tiêm truyền Tỷ lệ chết phơi và phơi lùn tăng lên khi số đời tiêm truyền qua trứng tăng lên Vì thế mà qua 10 đời tiêm trứng, hầu hết phơi đều chậm phát triển và cĩ thể lên tới 80% phơi chết sau 20 ngày tuổi phơi (Cavanagh và Naqi, 2003)

Nuơi cấy trên mơi trường tế bào

Virus cũng phát triển tốt trên mơi trường tế bào thận phơi gà CEK (Chick Embryo Kidney) (Gillette, 1973), tế bào gan phơi gà CEL (Chick Embryo Liver), tế bào thận gà CK (Chick Kidney) (Alexander và Collins, 1975) Những tế bào CK được sử dụng rộng rãi trong nhiều lần phân lập IBV, và chỉ cĩ chủng Beaudette được sử dụng rộng rãi trong những tế bào Vero Trên tế bào thận gà, tế bào bị tác động vĩn lại thành từng đám lớn gọi là những tế bào khổng lồ (syncytia) cĩ từ 2 đến nhiều nhân sau 6h tiêm nhiễm bằng chủng Beaudette (Alexander và Collins, 1975) Sau 18 – 24h, syncytia chứa 20 – 40 nuclei hoặc nhiều hơn và trở thành chứa khơng bào (trích dẫn bởi Cavanagh và Naqi, 2003)

Nuôi cấy cơ quan

Ngoài ra, nuôi cấy ở cơ quan khí quản và những mô khác cũng ñã ñược thực hiện thành công bởi Darbyshire (Darbyshire, 1978) Những vòng khí quản ñược chuẩn bị từ phôi gà 20 ngày tuổi, hiện tượng mất lông rung (cilia) xuất hiện sau 3 –

4 ngày nhiễm ñược quan sát dể dàng dưới kính hiển vi

2.3.7 Tính sinh miễn dịch

2.3.7.1 Miễn dịch chủ ñộng

Gà vừa ñược khỏi bệnh do nhiễm từ tự nhiên có khả năng ñề kháng sau khi công cường ñộc ở cùng chủng ñã nhiễm (bảo hộ ñồng chủng), nhưng phạm vi bảo

hộ sau khi công cường ñộc với những chủng khác thì khác nhau (bảo hộ dị chủng)

Nó tuỳ thuộc vào các serotypes khác nhau, sự khác nhau về ñộc lực nằm trong những chủng virus (Cavanagh và Naqi, 2003)

Miễn dịch chủ ñộng qua việc dùng vaccin nhược ñộc cho phép tiết IgA trong khí quản (bắt nguồn từ tuyến Harder…), những IgA ngăn trở sự kết bám của virus trên tế bào (Trần Thanh Vân, 2000) Bảo vệ ñường hô hấp thường ñược ước lượng khoảng 3 – 4 tuần sau khi nhiễm hay tạo miễn dịch ñã ñược làm bằng nhiều phương pháp khác nhau (Cavanagh và Naqi, 2003)

Vai trò bảo hộ của kháng thể cũng khá rõ bởi thực tế là những gà nhiễm virus

Infectious bursal disease (IBD) ñã bị làm suy yếu hệ miễn dịch bị nhiễm IBV

nghiêm trọng hơn (Thompson và ctv, 1997)

Tuy nhiên kháng thể không phải là nguồn ñề kháng duy nhất vì khi ñiều trị trên gà bằng thuốc hỗn hợp chống ung thư hoặc cắt bỏ tuyến Bursa trong trứng thì

gà vẫn ñề kháng ñược với virus IB công cường ñộc khi không có kháng thể nào ñược phát hiện (Cook và ctv, 1991)

Vai trò của miễn dịch trung gian qua tế bào ñã ñược chứng minh qua phản ứng chuyển dạng lympho bào (Lymphocyte Transformation Assay), khi chủng bằng virus sống, sự hoạt ñộng của lympho ác tính (Seo và Collisson, 1997), quá trình quá mẫn muộn (Chubb và ctv, 1988), sự hoạt ñộng của tế bào diệt tự nhiên (Thompson

và Naqi, 1997) và bằng chứng mô học ñáng chú ý là sự xâm nhập từng tốp của tế

bào T (ñặc biệt là CD4+) vào trong mô hô hấp và thận khi nhiễm IBV (Janse và ctv, 1994)

2.3.7.2 Miễn dịch bị ñộng

“Kháng thể từ mẹ MDA (maternally – derived antibody) có thể làm giảm cả hai: Sự phản tác dụng của vaccin và tính hiệu quả của vaccin nếu vaccin cùng type với vaccin ñã ñược gây miễn dịch ở những ñàn gà giống Trong một nghiên cứu, kháng thể từ mẹ bảo vệ chống lại virus công cường ñộc vào lúc 1 ngày tuổi và 1 tuần nhưng không còn vào lúc 2 tuần tuổi (Mockett và ctv, 1987) Sự hiện diện của kháng thể từ mẹ có thể ngăn chặn tổn thương vòi trứng trong những ngày tuổi ñầu khi nhiễm IBV (Chew và ctv, 1997) (trích dẫn bởi Cavanagh và Naqi, 2003)

Mondal và Naqi cho thấy rằng gà mới nở với kháng thể từ mẹ ở mức ñộ cao

có sự bảo hộ cao (>95%) chống lại việc công cường ñộc vào lúc 1 ngày tuổi nhưng không còn ở lúc 7 ngày (<30%) Điều ñáng chú ý là sự bảo hộ này liên quan tới mức ñộ kháng thể cục bộ trên ñường hô hấp và không liên quan với kháng thể có trong huyết thanh Những con gà MDA+ (có kháng thể từ mẹ) có kháng thể trung hoà virus ñáp ứng lại sự chủng IBV lần 2 yếu hơn những con gà MDA- (không có kháng thể từ mẹ) Kháng thể từ mẹ giảm xuống nhanh chóng hơn sau khi chủng vào lúc 1 ngày tuổi so với không chủng” (trích dẫn bởi Cavanagh và Naqi, 2003)

2.4 DỊCH TỂ HỌC

2.4.1 Loài mắc bệnh

Trong tự nhiên chỉ xảy ra trên gà Gà ở mọi lứa tuổi ñều có thể bị bệnh, nhưng bệnh hầu hết nặng ở gà con và gây ra khá nhiều tử vong (Hofstad, 1984) Khi tuổi tăng thêm, gà trở nên ñề kháng hơn với những ảnh hưởng trên thận, tổn thương ống dẫn trứng và tỷ lệ tử vong do nhiễm (trích dẫn bởi Cavanagh và Naqi, 2003)

2.4.2 Chất chứa căn bệnh

Virus ñược phân lập từ khí quản, phổi, thận và túi Bursa của gà sau 24h và

trong suốt 7 ngày sau khi tiếp xúc IBV bằng cách phun khí (Hofstad và Yoder,

1996) Tần số xuất hiện của những lần phân lập giảm xuống theo thời gian và sự khác nhau ñối với chủng nhiễm, nhưng IBV ñược phân lập từ nốt bạch huyết ở van

hồi manh tràng vào lúc 14 tuần và từ phân lúc 20 tuần sau khi nhiễm (Alexander và Gough, 1997) Sự bài tiết lại của IBV ñã ñược phát hiện từ những gà mái ñã âm tính với virus nhiều tuần sau khi bình phục từ việc tiêm nhiễm vào lúc 1 ngày tuổi (Jones và Ambali, 1987) Tính dai dẳng khi nhiễm IBV trong tự nhiên còn lại không ñược xác ñịnh, mặc dù thận có thể là một trong những nơi của sự nhiễm trùng dai dẳng (Cavanagh và Naqi, 2003)

2.4.3 Đường xâm nhập và truyền lây mầm bệnh

Mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể bằng hai ñường: Đường hô hấp qua không khí, bụi có mầm bệnh và ñường tiêu hoá do thức ăn, nước uống có chứa mầm bệnh (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2005)

Trong ñiều kiện tự nhiên bệnh lây qua ñường không khí, virus có sức ñề kháng yếu khó truyền ñi xa (Trần Thanh Phong, 1996)

Phương thức lây lan có thể do không khí mang mầm bệnh từ ñường hô hấp của con này truyền sang cho con khác trong ñàn, hoặc từ ñàn này sang ñàn khác trong cùng một trại Tuy nhiên, việc truyền bệnh qua phân cũng rất quan trọng Trong ñó con người và vật dụng trong trại ñóng vai trò chủ yếu (Trần Thanh Vân, 2000)

Mặc dù có nhiều báo cáo phân lập ñược virus từ trứng cho ñến 43 ngày sau khi phục hồi, gà ñược ấp từ những ñàn bị nhiễm và ñược nuôi nấng thì sạch mầm bệnh ñối với IB (Cavanagh và Naqi, 2003)

2.4.4 Cách sinh bệnh

Virus viêm phế quản truyền nhiễm sinh sản ở bào tương Khi tiếp xúc với tế bào vật chủ, enzyme neuraminidase của virus sẽ làm giảm khả năng phòng vệ của lớp niêm dịch tế bào, cho phép chúng ñi vào bên trong bào tương Đầu tiên vỏ ngoài của virus dung hợp với màng tế bào, sau ñó mRNA của virus cùng với lớp protein bao bọc chung quanh ñi vào tế bào chất Kế ñến, mRNA sẽ thoát ra khỏi vỏ protein

ñể tiến hành tổng hợp RNA âm bản và protein cho virus mới RNA âm bản sẽ tổng hợp mRNA mới Cơ chế sinh bệnh chủ yếu là do virus tiết ra các enzyme phân huỷ

thành phần tế bào và sử dụng các vật chất trong tế bào làm nguồn nguyên liệu tổng hợp nên virus mới (Trần Thanh Vân, 2000)

Sau khi hít phải virus chúng sẽ sinh sản ở niêm mạc khí quản dẫn ñến niêm mạc bị viêm dày lên nhiều lần, thêm vào ñó có sự bong tróc của tế bào vẩy, sự tiết dịch nhày quá nhiều, tiêm mao tế bào hô hấp bị phá huỷ, không tống tẩy ñược dẫn ñến nòng khí quản bị hẹp lại (gà có biểu hiện lâm sàng: âm ran khí quản, hắt hơi, chảy nước mũi …(Trần Thanh Phong, 1996) Khởi ñầu virus phát triển ở ñoạn ñầu

hệ thống hô hấp (tồn tại ở mô khí quản trong tuần ñầu tiên sau khi nhiễm) sau ñó lan ra những cơ quan khác, ñặc biệt là ñường sinh dục và thận (Cavanagh và Naqi, 2003) Thận và những cơ quan khác không thuộc hệ thống hô hấp là nơi tồn tại dai dẳng khi nhiễm IBV và ñược bài thải có ñịnh kỳ trong chất tiết từ mũi và phân (Dhinaker Raj và Jones, 1997) Ngoài ra virus còn nhân lên trong mô ruột, thận và ống dẫn trứng) Tuyến Harder cũng là nơi nhân lên của virus khi gây nhiễm bằng cách nhỏ vào mắt (Toro và ctv, 1996) (trích dẫn Cavanagh và Naqi, 2003)

dinh dưỡng là nhân tố góp phần thêm vào tính nghiêm trọng của bệnh ñối với những chủng gây bệnh ở thận (Cook và ctv, 2001) Bệnh lan truyền nhanh chóng trong ñàn gà mẫn cảm Trong khoảng một vài ngày, hầu như tất cả gà trong ñàn ñều

có triệu chứng bệnh (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2005)

Triệu chứng

Biểu hiện trên ñường hô hấp: Ở gà con có ñặc ñiểm thở há hốc miệng, ho, hắt hơi, âm ran khí quản và chảy nước mũi Mắt ướt có thể ñược quan sát và thỉnh thoảng xoang mũi có thể sưng lên, xuất hiện sự suy nhược và có thể nằm tụ thành ñống lộn xộn xung quanh nguồn nhiệt Mức tiêu thụ thức ăn và mức tăng trọng giảm xuống là ñiều ñáng chú ý Ở gà lớn hơn 6 tuần tuổi và ở những gà trưởng thành, triệu chứng tương tự gà con nhưng xuất dịch mũi không thường xuyên Bệnh

có thể phát hiện ñược khi kiểm tra một cách cẩn thận bằng tay hoăc lắng nghe chúng vào ban ñêm khi ñã yên lặng (Hofstad, 1984) Ỏ Mỹ và Anh, chủng phân lập ban ñầu vào năm 1990 không gây bệnh thường xuyên và gây ra sưng mặt nghiêm trọng, viêm màng túi khí, bệnh số khác nhau trên gà choai và gà trưởng thành (Gough và ctv, 1992)

Trên gà thịt bị nhiễm một trong những virus gây bệnh ở thận có thể chết hoặc phục hồi sau pha hô hấp ñiển hình và sau ñó cho thấy những dấu hiệu của sự suy yếu, xù lông, mất nước, uống nhiều nước (Cumming, 1969) Khi bệnh sỏi niệu liên kết với IB trên những ñàn gà ñẻ, có thể làm tăng bệnh số nếu không thì ñàn gà vẫn khoẻ mạnh (Cook và ctv, 1987)

Trên gà ñẻ, chất lượng và sản lượng trứng giảm sút ngoài những biểu hiện về

hô hấp Tuy nhiên, vẫn phân lập ñược virus từ những ñàn gà giống hay ñẻ với mức sinh sản giảm không ñáng kể và trứng có vỏ trắng nhợt nhưng không có biểu hiện

hô hấp (Cook và ctv, 1987) Mức sinh sản giảm với mức ñộ khác nhau ở từng thời

kỳ ñẻ và tuỳ chủng virus nhiễm Sau 6 – 8 tuần, mức sinh sản mới trở lại như ban ñầu nhưng hầu hết trường hợp ñều không ñạt tới Số trứng không chấp nhận ñược tăng lên, tỷ lệ ấp nở giảm xuống: võ mềm, méo mó, xù xì Chất lượng trứng bên trong ñược quan sát khi ñập bể trứng trên bề mặt bằng phẳng, albumin có thể loãng

và nhiều nước, không xác ñịnh ñược ranh giới giữa phần ñặc và loãng của lòng trắng trên trứng tươi bình thường

2.5.2 Bệnh tích

2.5.2.1 Đại thể

Mổ khám sau khi chết thấy: Nhiều dịch viêm hay casein trong khí quản, ống mũi và xoang mũi Túi khí có thể bị vẫn ñục hoặc chứa dịch casein màu vàng Xuất hiện ñốm mủ giống pho - mát màu vàng trong khí quản ở ñoạn dưới (ngã ba khí quản) hoặc ở cuống phổi trên gà con Viêm phổi vùng nhỏ có thể ñược quan sát xung quanh cuống phổi lớn (Hofstad, 1984) Cảm nhiễm ở thận gây ra thận sưng và nhạt màu, tích tụ nhiều urate trong ống thận và ống dẫn tiểu (Cumming, 1963; Gillette, 1973) Chất lỏng từ lòng ñỏ ñược tìm thấy trong xoang bụng của gà trong giai ñoạn sinh sản nhưng cũng thấy ở những bệnh khác làm giảm sản lượng trứng rõ ràng Nhiễm IBV vào lúc 1 ngày tuổi có thể gây ra tổn thương vĩnh cửu ống dẫn trứng dẫn ñến làm giảm sản lượng và chất lượng trứng khi gà ñến tuổi sinh sản Tuy nhiên, nhiễm ở lứa tuổi lớn hơn thì ảnh hưởng nhỏ hơn và ở một vài serotype không gây ra một chút thay ñổi bệnh lý nào ngay cả khi nhiễm lúc 1 ngày tuổi (Cook và ctv, 1986) (trích dẫn bởi Cavanagh và Naqi, 2003) Đoạn giữa 1/3 của ống dẫn trứng, hầu như bị ảnh hưởng nghiêm trọng, có thể làm giảm số lượng tuyến nhờn trên ống dẫn trứng (Hofstad, 1984)

2.5.2.2 Vi thể

Sau khi nhiễm virus 18h, lớp niêm mạc của khí quản bị phù nề, các lông rung

bị mất, tế bào thượng bì bị bào mòn và tróc ra, tế bào bạch cầu hạt và lympho thấm nhập nhẹ Trong vòng 48h, lớp niêm mạc sẽ ñược tái lập Lớp dưới niêm sẽ tăng sinh với sự xâm nhập của rất nhiều tế bào lympho, thành lập nhiều trung tâm mầm (germinal centers) sau 7 ngày Nếu túi khí có liên quan thì sẽ thấy phù, lớp thượng

bì tróc ra và có ít dịch tiết chứa fibrin trong vòng 24h Sau ñó có thể thấy số lượng bạch cầu hạt tăng lên và có những nốt lympho, tăng sinh tế bào fibroblast và tế bào thượng bì hình khối vuông ñược tái lập (Cavanagh và Naqi, 2003)

Bệnh tích ở thận chủ yếu là viêm thận kẽ Virus cĩ thể gây thối hố dạng hạt, khơng bào hố hoặc tế bào thượng bì của ống dẫn bị trĩc ra Trong giai đoạn cấp tính, một số lượng lớn bạch cầu hạt thấm nhập vào mơ kẽ thận Bệnh tích ở các ống dẫn thấy chủ yếu ở vùng tuỷ thận Cĩ thể thấy các nốt hoại tử hoặc những dấu hiệu tái sinh của tế bào thượng bì các ống dẫn Trong giai đoạn phục hồi, các tế bào viêm chủ yếu là tế bào lympho và tương bào Trong trường hợp sỏi thận, các ống dẫn tiểu bị bất dưỡng phồng lên chứa đầy urate (Cavanagh và Naqi, 2003)

Cho nhiễm thí nghiệm virus vào ống đẫn trứng của gà mái trưởng thành làm giảm chiều cao và mất lơng rung của tế bào thượng bì, các tuyến bị dãn ra, thấm nhập lympho, tế bào đơn nhân, tương bào và bạch cầu hạt Lớp niêm mạc bị phù và tăng sinh tế bào sợi khắp các vùng của ống dẫn trứng (Riddell, 1987)

2.6 CHẨN ĐỐN

2.6.1 Chẩn đốn lâm sàng và phân biệt một số bệnh khác

2.6.1.1 Chẩn đốn lâm sàng

Chẩn đốn lâm sàng dựa vào triệu chứng, bệnh tích và tính chất dịch tể (lịch

sử bệnh trong vùng, mức độ lây lan, gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết…) để xác định bệnh.Viêm phế quản truyền nhiễm thường lây nhanh, thường lây hết trong đàn khoảng 48h, với những triệu chứng hơ hấp, mổ khám bệnh tích sau khi chết (dịch nhày tiết nhiều ở khí quản, tích dịch viêm đọng lại như pho - mát

ở ngã ba khí quản, viêm túi khí, thận sưng…), điều trị bằng kháng sinh khơng hiệu quả hoặc triệu chứng hơ hấp thường tái lại sau khi khỏi, năng suất trứng giảm (trên 20%), chất lượng trứng kém (lịng trắng nhiều nước, vỏ xù xì, nhăn hay cĩ vân, nhạt màu) là những cơ sở quan trọng để định hướng bệnh

2.6.1.2 Chẩn đốn phân biệt

Viêm phế quản truyền nhiễm cĩ thể giống những bệnh hơ hấp cấp tính khác như Newcastle (ND), viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILT) và sổ mũi truyền nhiễm Bệnh ND thơng thường ảnh hưởng nghiêm trọng hơn IB Những triệu chứng thần kinh cĩ thể được quan sát ở những chủng cĩ độc lực của ND và trên những đàn

gà đẻ, mức sinh sản giảm xuống lớn hơn IB ILT lây lan chậm hơn trong đàn và dấu

hiệu hơ hấp nghiêm trọng hơn IB Sổ mũi truyền nhiễm cĩ thể được phân biệt với

IB căn cứ vào biểu hiện sưng mặt, rất hiếm khi thấy ở IB Cùng làm giảm sản lượng trứng và gây ra những biến đổi về phẩm chất vỏ như gặp ở bệnh hội chứng giảm đẻ (EDS) do Adenovirus gây ra nhưng đối với IB thì làm giảm cả chất lượng bên trong trứng

2.6.2 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

Việc theo dõi các triệu chứng lâm sàng và mổ khám xem bệnh tích khơng đủ

để kết luận gà cĩ bị bệnh hay khơng Do đĩ xét nghiệm là phương pháp tối cần thiết

để nhận biết kháng nguyên hoặc kháng thể

2.6.2.1 Lấy mẫu bệnh phẩm và bảo quản mẫu dùng trong chẩn đốn

Mẫu được lấy từ những con gà cĩ triệu chứng, bệnh tích nghi ngờ Đối với những bệnh hơ hấp cấp tính, lấy mẫu bằng tăm bơng từ đường hơ hấp phía trên ở những gà sống hoặc mơ khí quản và mơ phổi từ những con gà vừa giết được giữ bằng nước đá trong mơi trường chuyên chở chứa penicillin (10.000 UI/ml) và streptomycin (10mg/ml) Đối với những gà cĩ biểu hiện viêm thận, gặp những vấn

đề về sinh sản, mẫu được chọn là thận hoặc ống dẫn trứng nhưng tỷ lệ thành cơng cao nhất là những mẫu ruột, đặc biệt mơ hai bên manh tràng hoặc phân Tuy nhiên, những phân lập từ đường ruột cĩ thể khơng thích hợp khi nhiễm mới xảy ra hoặc biểu hiện lâm sàng (OIE, 2004)

Những mẫu mơ từ khí quản, thận, ống dẫn trứng, nốt bạch huyết ở van hồi manh tràng trong mơi trường chuyên chở khơng bị nhiễm cùng với kháng sinh và những tăm bơng khơ từ đường hơ hấp hoặc lỗ huyệt cĩ thể chuyển đến phịng xét nghiệm để phân tích PCR Những mẫu để xét nghiệm yêu cầu gởi ngay đến phịng xét nghiệm để chẩn đốn và thực sự cần thiết phải giữ lạnh hoặc lạnh đơng mẫu trong suốt quá trình gởi đi Nơi làm chậm trể nhiều hơn 3 ngày, ưu tiên gởi mẫu đĩng băng trước và gởi đi trong mơi trường đá khơ Mẫu được chọn từ xác động vật tươi cho việc kiểm tra mơ bệnh học Những mẫu máu từ gà bị nhiễm bệnh nên chuyển đến để phân tích huyết thanh học (OIE, 2008)

2.6.2.2 Nuôi cấy phân lập virus

Thể vẫn của mô ñược chuẩn bị trong Phosphate Buffered Saline (PBS) hoặc canh dinh dưỡng vô trùng ñể tiêm trứng hoặc tạo môi trường nuôi cấy mô cho việc tiêm nhiễm cơ quan khí quản Thể vẫn ñược lọc bằng máy ly tâm tốc ñộ chậm và cách lọc xuyên qua màng lọc vi khuẩn trước khi tiêm vào trứng hay nuôi cấy cơ quan khí quản (OIE, 2004)

Với mục ñích phân lập chủng thực ñịa gây bệnh, tránh những chủng từ vaccin thì thời ñiểm lấy mẫu ñược khuyến cáo là sau 3 tuần ñối với vaccin IBV sống (http://www.canadianpoultry.k/infectious_bronchitis_virus_IBV.htm)

Trứng gà có phôi và nuôi cấy cơ quan khí quản ñược sử dụng rộng rãi ñể chuẩn ñộ hoặc phân lập virus Nuôi cấy tế bào không ñược dùng ñể phân lập gốc virus mà nó thường cần thiết ñể làm thích nghi với phôi trứng trước khi gây bệnh tích tế bào (CPE) ñược quan sát khi nhiễm virus

Trứng ñể sử dụng trong tất cả các công việc nuôi cấy IBV phải ñược xuất phát từ những gà không nhiễm hoặc không chủng ngừa IB, tốt nhất là từ những gà mái SPF Thông thường tiêm 0,1 – 0,2 ml phần nước trong bên trên vào xoang niệu

mô của phôi gà 9 – 11 ngày tuổi Sau ñó, phôi ñược kiểm tra hàng ngày Những phôi chết xảy ra trong vòng 24h có vẻ như không ñặc hiệu và trứng phải ñược loại

ra Sự tiêm nhiễm ban ñầu thường không ảnh hưởng trên phôi trừ khi chủng phân lập ñược bắt nguồn từ vaccin và vừa ñược trứng thích nghi Thông thường, dịch xoang niệu mô ñược thu hoạch sau 3 – 7 ngày tiêm nhiễm Dịch này ñược pha loãng 1/5 – 1/10 với nước canh có chứa kháng sinh và tiêm truyền thêm nữa nếu như ñược yêu cầu làm lại Một chủng virus IB hoang dại sẽ gây ra những thay ñổi trong phôi vào ñời tiêm truyền thứ 2 hoặc thứ 3 bao gồm: phôi chậm phát triển, cuộn tròn cùng với chứng suy nhược các bắp cơ và lắng ñọng urate trong giữa thận Một vài sự tử

vong có thể xảy ra ở những ñời sau ñó Những virus khác, ñáng chú ý là Adenovirus

có thể gây ra bệnh tích phôi không thể phân biệt ñược với IB Vì thế mà phân lập IBV phải ñược khẳng ñịnh bằng việc kiểm tra miễn dịch hoặc kiểu di truyền Dịch

xoang niệu mô phải ñược giữ ở -60oC hoặc dưới nếu bảo quản thời gian dài, nếu không thì ở -4oC sau khi ñông khô (OIE, 2004)

2.6.2.3 Phát hiện kháng nguyên

Những ñoạn hay những mãnh nạo ra của niêm mạc khí quản và những mô khác ñược thu thập từ những con gà vừa mới chết có thể ñược kiểm tra bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang, sử dụng huyết thanh nhiều dòng hoặc kháng thể ñơn dòng ñặc hiệu cho IBV Bệnh phẩm khí quản có thể ñược kiểm tra bằng phản ứng AGP (Agar Gel Precipitation) Bhattecharjee nuôi cấy cơ quan khí quản và gây nhiễm IBV, sau ñó kiểm tra sự hiện diện của virus bằng miễn dịch huỳnh quang và ñược quan sát dưới kính hiển vi (trích dẫn bởi De Wit, 2000)

Nếu virus ñược tiêm truyền vào trong trứng có phôi và ñược thích nghi thì sự hiện diện của virus ñược khẳng ñịnh bằng phản ứng AGP Tổng số IBV trong trứng ñược gây nhiễm ñôi khi thấp nên màng nhung niệu hoặc tế bào cặn từ dịch xoang niệu mô ñược ñánh giá bằng miễn dịch huỳnh quang (Naqi, 1990) IBV trong dịch xoang niệu mô hay sau khi sinh trưởng trong cơ quan khí quản nuôi cấy ñược phát hiện bằng phản ứng ELISA ñể bắt giữ kháng nguyên (Ignjatovic và Ashton, 1996) (trích dẫn bởi De Wit, 2000).d

2.6.2.4 Phát hiện kháng thể

Tất cả các serotype của IBV dường như ñều có những ñiểm gắn kết thông

thường dựa vào protein N và M, phần S2 của protein gai (Spike) IBV cũng gây ra

những ñáp ứng kháng thể ñặc hiệu type và tất nhiên ñược xác ñịnh dựa vào những ñiểm gắn kết (epitop) của protein S1 (Cavanagh và Naqi, 2003).Cavanagh

Kháng thể IBV trong huyết thanh gà ñược phát hiện bằng các phản ứng: ELISA, miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch khuếch tán, trung hoà virus (Virus Neutralization), HI (Haemaglutination Inhibition)

Đối với ELISA, miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch khuếch tán có sự kết hợp kháng thể với kháng nguyên ñặc hiệu nhóm Do ñó, những type IBV không ñược phân biệt bằng những phản ứng này Hầu hết những kháng thể ñáp ứng lại khi nhiễm IBV xuất hiện ñặc hiệu type và phân biệt ñược chủng virus qua HI và VN

Tuy nhiên, việc xác định chủng nhiễm phải dựa vào một giá trị ngưỡng (cut off – value) (chỉ số GMT > 7 hoặc 8 dùng cho chẩn đốn HI) để loại ra sự phản ứng chéo giữa các chủng (De Wit và ctv, 1997).(

Phản ứng ELISA

Phương pháp này cĩ tên đầy đủ là Enzyme – Linked Immunosorbent Assay

Kỹ thuật thực hành tương đối đơn giản, nhưng nhạy cảm, an tồn và cho kết quả nhanh Về nguyên tắc, phương pháp ELISA được tiến hành dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên chuẩn và kháng huyết thanh nghi ngờ hoặc ngược lại Dùng máy quang phổ kế (spectrophotometer) đo chỉ số OD (Optical Density) của các mẫu thử

và mẫu đối chứng sẽ tính được hiệu giá kháng thể

Theo kết quả nghiên cứu của Dewit và ctv (1992), ơng ủng hộ việc sử dụng ELISA cho những chẩn đốn huyết thanh học để xác định nhiễm IBV trên những đàn gà thịt ELISA phát hiện kháng thể IBV đầu tiên trong vịng một tuần sau khi nhiễm, sớm hơn xét nghiệm HI và trung hồ virus (Dewit và ctv, 1997; De wit và ctv, 1998)

Phản ứng này cĩ những ưu điểm và nhược điểm sau:

− Ưu điểm: nhanh, dễ dàng thực hiện, rất nhạy và sẵn cĩ trên thị trường

− Nhược điểm: Khơng xác định được serotype

Phản ứng AGP

Đối với phản ứng AGP, theo nghiên cứu của De Wit và ctv (1997) cho thấy phản ứng này tuy cĩ độ nhạy thấp nhưng độ đặc hiệu cao (100%) trên những đàn cĩ chủng ngừa được đánh giá sau 28 ngày tiêm chủng Ở gia cầm, những phản ứng huyết thanh học với độ đặc hiệu cao quan trọng hơn là độ nhạy cao vì độ nhạy thấp

cĩ thể được thay thế bằng cách lấy số mẫu cao hơn.Naqi,

Phản ứng HI

Phát hiện kháng thể chống virus viêm phế quản truyền nhiễm ở gà sau khi nhiễm hoặc sau khi tiêm vaccin Dựa vào đặc điểm ngưng kết hồng cầu gà của virus sau khi được xử lý bằng enzyme để sử dụng phản ứng HI Dùng kháng nguyên chuẩn chủng 4/91 để phát hiện kháng thể kháng virus IBV4/91 cĩ trong mẫu huyết

thanh cần chẩn đốn Dựa vào mức độ ngăn trở ngưng kết hồng cầu mà chúng ta cĩ thể xác định hiệu giá kháng thể kháng IB chủng 4/91

Phản ứng này cĩ những ưu điểm và nhược điểm sau:

− Ưu điểm: Đây là phản ứng xét nghiệm khá nhanh, thao tác đơn giản và tiết kiệm chi phí hơn so với trung hồ virus, cĩ thể đặc hiệu với từng serotype

− Nhược điểm: Virus phải được xử lý bằng enzym neuraminidase (Schultze và ctv, 1992) Thiếu sự tiêu chuẩn hố và kiểm sốt, khĩ lý giải được kết quả

2.6.2.5 Phản ứng RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)

PCR là một kỹ thuật tiên tiến nhằm phát hiện và xác định hệ gen của virus IBV đặc biệt là khi chúng hiện diện với một lượng rất thấp Do hệ gen của virus IB

là một chuỗi RNA đơn nên cần tổng hợp một DNA bổ sung (cDNA) trước khi được nhân lên Enzyme RT (Reverse Transcriptase) là một polymerase dùng để tổng hợp nên cDNA Kỹ thuật PCR đã đựơc áp dụng trực tiếp đối với mơ từ những con gà bị nhiễm hoặc sau khi virus đựơc nhân lên trong trứng

Handberg đã sử dụng một PCR 40 chu trình để phát hiện gen protein N của IBV trong những phần chiết từ mơ khí quản sau khi gây bệnh thực nghiệm trên gà bằng một số type IBV RT – PCR sinh ra một DNA sản phẩm của 453 bp tương ứng với phần gen S, sinh ra sản phẩm khoảng 450 bp và phát hiện được virus vào ngày thứ ba sau khi nhiễm (Handberg và ctv, 1999)

Tuy nhiên, kỹ thuật PCR được áp dụng rộng rãi sau khi mơ hoặc những mẫu tăm bơng chứa virus được nhân lên trong phơi trứng sau một hoặc hai đời, kết quả được đánh giá qua dịch xoang niệu mơ sau 24h (Gelb và ctv, 1997) Virus được phát hiện bằng RT – PCR Mặc dù, tiến trình này địi hỏi phải sử dụng trứng và yêu cầu phải giữ mẫu ở nhiệt độ thấp trong quá trình chuyên chở để duy trỳ tính lây nhiễm của mầm bệnh nhưng kỹ thuật này ngắn hơn là việc tiêm truyền giống qua 3 – 4 đời tiêm trứng và qua nhiều ngày ủ Sự sinh trưởng của IBV trong trứng ưu tiên

trước khi thực hiện PCR thích hợp hơn là sử dụng RNA ly trích từ những mẫu tăm bông khi những sản phẩm PCR tương ñối lớn (khoảng 2000 bp) (Kwon và ctv, 1993)

2.7 PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM 2.7.1 Phòng bệnh

2.7.1.1 Vệ sinh phòng bệnh

Cần áp dụng biện pháp cách ly hoàn toàn và tái phục hồi ñàn gà con 1 ngày tuổi theo sau những biện pháp vệ sinh, sát trùng một cách nghiêm ngặt Gà giống phải ñược mua từ cơ sở không mắc bệnh, phải ñược cách ly theo dõi (ít nhất 1 tuần)

Xử lý tốt xác chết (thiêu hủy), phân và chất ñộn chuồng Giết loại thải những gà khỏi bệnh (tránh mang trùng)

2.7.1.2 Phòng bệnh bằng vaccine

Có một số loại vaccin ñang ñược thương mại hoá:

− Vaccine sống nhược ñộc: Có thể ñưa vaccine vào bằng ñường nhỏ mắt,

nhỏ mũi, ñưa vào khí quản, cho uống hay phun sương…

− Vaccine vô hoạt: tiêm bắp thịt hay dưới da cổ

Sự kết hợp giữa vaccine viêm phế quản truyền nhiễm và vaccine khác: Ngày nay trên thị trường có nhiều vaccin kết hợp viêm phế quản truyền nhiễm với Newcastle (như BP vaccine Nobilis H120…) Theo các nhà sản xuất ñể ức chế sự miễn dịch cần có sự thích hợp về số lượng (nồng ñộ) của hai virus này: Số lượng virus Newcastle phải gấp 100 – 1000 lần nhiều hơn virus IB (Bùi Trần Anh Đào, 1999)

Không nên chủng ngừa bằng vaccine sống phòng bệnh ñường hô hấp cách nhau trong vòng 1 tuần ngoại trừ nơi sản xuất cho phép, vì có thể gây phản ứng mạnh hoặc làm cho vaccine sau mất tác dụng (Bùi Trần Anh Đào)

Vaccine sống ñược sử dụng trên gà thịt và chủng lúc ban ñầu trên gà giống

và gà ñẻ Vaccine bất hoạt nhủ dầu ñược sử dụng chủ yếu vào lúc ñẻ trên gà giống

và gà ñẻ (Cavanagh và Naqi, 2003)

Trong những trường hợp chưa biết serotype virus IB gây bệnh việc dùng vaccin chứa nhiều serotype càng tốt Trong vaccin trên thị trường hiện nay thường

kết hợp chủng Massachusetts và Connecticut (Bùi Trần Anh Đào, 1999) Theo quan ñiểm IB phổ rộng thì kết hợp chủng Massachusetts (1 ngày tuổi) và 4/91 (14 ngày tuổi) (Terregino và ctv, 2008)

2.7.2 Điều trị:

Không có thuốc ñiều trị ñặc hiệu hiện có cho IB Sự ñề phòng bằng cách ủ

ấm ñể hạn chế stress lạnh, cố gắng duy trì mức tiêu thụ thức ăn ñể ngăn chặn việc giảm cân là những nhân tố quản lý ñàn có thể làm giảm sự thiệt hại từ IB Điều trị bằng những chất kháng khuẩn thích hợp có thể làm giảm hậu quả viêm màng túi khí

do phụ nhiễm vi khuẩn theo sau việc nhiễm IB Tăng cường sức ñề kháng cho gà bằng việc cung cấp ñầy ñủ chất ñiện giải, áp dụng trong nước uống ñể bù ñắp lượng

Na+ và K+ ñã bị mất nghiêm trọng, ñồng thời làm giảm sự thiệt hại do viêm thận Liều khuyến cáo ñể ñiều trị là 72 meq Na+ và K+ kết hợp tối thiểu 1/3 citrate hoặc bicarbonate ở dạng muối (Cavanagh và Naqi, 2003)

2.8 LƯỢC DUYỆT MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

2.8.1 Trong nước

Đặng Thị Hồng Thắm (2002), khảo sát bệnh tích trên thận của gà mắc bệnh

Gumboro, viêm phế quản truyền nhiễm và do E.coli ñược mổ khám tại Bệnh Xá

Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Kết quả mổ khám xem bệnh tích ñại thể và vi thể cho thấy, trong 64 ca bệnh ghi nhận có 42 ca bệnh Gumboro, 4 ca bệnh

viêm phế quản truyền nhiễm, 18 ca bệnh E.coli

Trần Thanh Vân (2000), khảo sát ảnh hưởng của các biến chủng virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ñến tỷ lệ chết và sản xuất trứng ở ñàn gà bố mẹ giống thịt HUBBARD HI – YIELD tại hai trại An Đô và Bắc Sơn Qua kết quả xét nghiệm bằng phương pháp trung hoà virus cho thấy sự hiện diện của kháng thể trung hòa ñối với hai biến chủng IB 4/91 và CR88 ở hai trại gà này

2.8.2 Nước ngồi

De Wit và ctv (1997) đã chứng tỏ kháng thể kết tủa khuếch tán trên thạch biến mất sau 28 ngày tiêm chủng và cũng khơng cịn sau 21 ngày cơng cường độc trong khi kháng thể được phát hiện bằng phản ứng ELISA vẫn duy trì ở mức hiệu giá cao Phản ứng HI cho thấy cĩ sự phản ứng chéo giữa các chủng với nhau, vì vậy

để cho phản ứng HI cĩ ý nghĩa trong chẩn đốn (đặc hiệu cho từng serotype), ơng

đề nghị lấy giá trị ngưỡng lớn hơn 7 hoặc 8 log2 De Wit và ctv (1992) chứng tỏ ELISA cĩ ý nghĩa trong chẩn đốn bệnh VPQTN trên gà thịt khi lấy mẫu 1 lần De Wit và ctv (1998) cho thấy kháng thể kết tủa được phát hiện trong tuần đầu tiên sau những triệu chứng hơ hấp ban đầu

Terregino và ctv (2008), đo hiệu giá kháng thể vào lúc 5 tuần tuổi qua phản ứng HI (4/91) của những đàn gà sau khi chủng ngừa lúc 1 ngày tuổi (Ma5) và 2 tuần tuổi (4/91) cho kết quả GMT ± SD = 4,5 ± 1

Cook và ctv (1999) , đo hiệu giá kháng thể vào lúc 5 tuần tuổi qua phản ứng

HI (49/1) của những đàn gà được chủng vào lúc 1 ngày tuổi (Ma5) cho kết quả GMT < 4

McMartin (1993), IBV khơng gây ra bệnh tích đặc trưng khi nuơi cấy trên phơi trứng Clarke và ctv (1972) cho thấy 24 trong 70 chủng thực địa khơng gây ra biểu hiện phơi lùn, cịi cọc sau 3 đời tiêm trứng

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và ñịa ñiểm thực hiện

3.1.1 Thời gian

Từ ngày 09/03 ñến ngày 25/05 năm 2010

3.1.2 Địa ñiểm

− Nơi lấy mẫu: Các trại nuôi gà ở Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang

− Nơi phân tích mẫu: Phòng Xét Nghiệm và Chẩn Đoán công ty CPCN CP Việt Nam, Trạm CĐXN – 151 Lý Thường Kiệt, P.7, Q.11, TP.HCM, Phòng Xét Nghiệm công ty TNHH Cargill Việt Nam

3.2 Đối tượng khảo sát

Gà có biểu hiện hô hấp

Trứng gà có phôi

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Quan sát triệu chứng và bệnh tích trên ñường hô hấp của gà khảo sát

- Xác ñịnh sự hiện diện của virus IB gián tiếp qua các phản ứng huyết thanh học

- Phân lập virus IB qua phôi trứng

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Bố trí thí nghiệm

Chúng tôi tiến hành khảo sát tại 5 trại có triệu chứng hô hấp trên ñịa bàn các tỉnh Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Bảng bố trí thí nghiệm

Quy trình chủng ngừa của 5 trại ñược trình bày qua Bảng 3.2

Bảng 3.2 Quy trình chủng ngừa vaccine IB

Trại Loại vaccin Chủng Số lần

chủng ngừa Gà thịt Gà ñẻ

Lứa tuổi khảo sát

2 ND+IB (Fort Dodge) H120 2 3(d), 21(d) - 35(d)

3 ND+IB (Fort Dodge) H120 2 3(d), 21(d) - 60(d)

vi thể

3.4.2.2 Ghi nhận triệu chứng

Ghi nhận triệu chứng quan sát ñược, lịch sử bệnh tại trại và tất cả những thông tin liên quan ñến trại gà (nguồn gốc, giống, tuổi, triệu chứng, tỷ lệ bệnh, tỷ lệ chết, quy trình chủng ngừa…) qua ghi nhận của người trực tiếp quản lý trại

Tỷ lệ nhiễm bệnh ñường hô hấp ñược tính dựa vào những con có triệu chứng tại thời ñiểm khảo sát / tổng số con trong ñàn khảo sát * 100%

Tỷ lệ chết ñược tính theo tổng số gà chết từ lúc có triệu chứng bệnh ñến thời ñiểm khảo sát / tổng số gà trong ñàn * 100%

Tỷ lệ trứng kém chất phẩm chất vỏ bao gồm: Trứng nhỏ, trứng dị hình, trứng mỏng vỏ, ñọng canxi / tổng số trứng thu ñược * 100%

Năng xuất trứng ñược tính theo tổng số trứng thu ñược / tổng số con trong ñàn * 100%

3.4.2.3 Mổ khám bệnh tích

Thu thập 5 – 10 gà/một trại có triệu chứng hô hấp bao gồm những con có triệu trứng nhẹ, nặng và mới chết (nếu có) Tất cả ñều ñược mổ khám xem bệnh tích

Phương pháp mổ khám: Gà ñược giết bằng cách cắt tiết ở tĩnh mạch cổ Sau

ñó, cắt ngang mỏ xem có chất tiết ở mũi hay không, cắt da vùng thanh khí quản từ

mỏ trở xuống ñể bộc lộ lòng ống khí quản xem bệnh tích xung huyết, xuất huyết, tiết nhầy…

Để quan sát phủ tạng, ñặt con vật nằm ngữa và bẻ gẫy khớp háng ñể kéo hai chân mở ra hai bên Làm sạch lông phần ức, cắt da từ ñiểm giữa nơi mỏm ức ra hai bên và lên phía trên xương ức ñể xem phần cơ phía dưới Sau khi quan sát phần xương sườn, dùng kéo cắt phần sườn nơi hai bên hông ñến tận xương ñòn Cắt xương ñòn, nâng phần sườn lên ñể quan sát túi khí xem có bị mờ, bị dày ñục hoặc

có bệnh tích nấm phổi hay không Quan sát nội tạng bên trong gồm gan, ruột, dạ dày và sát hai bên cột sống về phía lưng là thận và buồng trứng (gà ñẻ) Quan sát bệnh tích ở các cơ quan như phổi, thận Lấy mẫu khí quản, phổi, thận ñể làm vi thể

Mẫu khí quản tươi được dùng cho chẩn đốn bằng nuơi cấy phân lập virus

3.4.2.4 Bệnh tích vi thể

Mẫu sau khi làm tiêu bản vi thể được đọc kết quả tại phịng Xét Nghiệm cơng ty TNHH Cargill Việt Nam

3.4.3 Chẩn đốn dựa vào các phương pháp huyết thanh học

3.4.3.1 Bố trí lấy mẫu và cách lấy mẫu huyết thanh

Bố trí lấy mẫu

Mẫu huyết thanh được thu thập từ 5 trại cĩ triệu chứng hơ hấp Mỗi trại thu thập từ 19 – 20 mẫu huyết thanh

Cách lấy mẫu huyết thanh

Dùng bơng gịn cĩ tẩm cồn sát trùng vị trí lấy máu (ở tĩnh mạch cánh) Sau

đĩ, dùng ống tiêm nhựa 3ml để rút máu Số lượng máu gà cần lấy: 1,5 – 2ml/con Lấy máu xong, đậy nắp kim tiêm, đặt nghiêng ống tiêm nhựa 30o, giữ yên 15 – 20 phút Cho các ống tiêm nhựa vào túi nilon Tồn bộ mẫu máu được giữ trong bình xốp cĩ đá và chuyển về phịng xét nghiệm cơng ty CPCN CP Việt Nam để thực hiện phản ứng ELISA và Trạm CĐXN – 151 Lý Thường Kiệt, P.7, Q.11, TP.HCM để thực hiện phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch

3.4.3.2 Xác định sự hiện diện của IBV4/91 bằng phản ứng HI

Phản ứng HI được thực hiện tại phịng xét nghiệm cơng ty CPCN CP Việt Nam

− Nước muối sinh lý 0,9%

− Chất kháng đơng EDTA (Ethylen Diamino Tetra Acetate)