Nghiên cứu đông lạnh trứng lợn non và nuôi thành thục trứng sau đông lạnh

Page 7Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ AI : anametaphea I trứng ở giai đoạn đầu của phân bào I BMP 15 :

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Trang 3

Page ii

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một

số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác, các số liệu trong luận văn là trungthực và chính xác

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đượccảm ơn đầy đủ, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 18 tháng 6 năm 2015

Tác giả luận văn

Chu Xuân Cừ

Trang 4

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hạnh– Phó trưởng phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi thực hiện các thí nghiệm cũng nhưtạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Việt Linh, ThS.Nguyễn Thị Hiệp, ThS Nguyễn Thị Nhung, ThS Nguyễn Thị Hồng, và các cô, chú, anhchị em ở Phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoahọc và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tnh giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luậnvăn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh lý - Tập tnh động vật và tậpthể cán bộ, giáo viên khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình đã động viên, ủng hộ, khích lệtôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn Thạc sỹ

này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 6 năm 2015

Tác giả luận văn

Chu Xuân Cừ

Trang 5

hình ix MỞ ĐẦU 1

13

1.2.1 Lịch sử đông lạnh trứng 13

1.2.2 Cơ chế đông lạnh tế bào trứng 15

1.2.3 Tình hình nghiên cứu đông lạnh trứng lợn 21

Trang 6

Page 5

1.2.4 Đông lạnh trứng lợn và những vấn đề khó khăn 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

Trang 7

Page 5

2.2.2 Đánh giá tác động của các yếu tố môi trường bảo quản lạnh đến nuôi thành thục trứng sau đông

2.3.2 Phương pháp đông lạnh trứng 27

2.3.3 Phương pháp nuôi trứng 29

2.3.4 Phương pháp nhuộm trứng 29

2.3.5 Các phương pháp đánh giá 30

2.3.6 Các chỉ tiêu theo dõi đánh giá 33

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 343.1 Kết quả thu trứng và nuôi thành thục trứng lợn non 343.1.1 Kết quả thu trứng lợn non 34

3.1.2 Kết quả đánh giá khả năng thành thục theo chất lượng trứng 35

3.2 Kết quả tác động của các yếu tố môi trường bảo quản lạnh đến nuôi thành thục trứng sau đông lạnh

39

3.2.1 Kết quả tác động của nồng độ chất bảo quản trong môi trường đông lạnh lên sự sống và phát triển của trứng lợn non ở điều kiện nhiệt độ

phòng 39

Trang 8

Page 6

3.2.2 Kết quả tác động của tổ hợp chất bảo quản đông lạnh lên sự sống và phát triển của trứng non trong điều kiện nhiệt độ phòng

41

3.3 Kết quả tác động của tốc độ hạ nhiệt lên sự sống và phát triển của trứng lợn non .46

3.4 Kết quả tác động của thời gian xử lý lên sự sống và phát triển của trứng lợn non trong điều kiện nhiệt độ phòng 49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

1 Kết luận 52

2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

Trang 9

Page 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

AI : (anametaphea I) trứng ở giai đoạn đầu của phân bào

I BMP 15 : Bone morphogentic protein

CB : Môi trường cân bằng

CTT : Chưa thành thục

Deg : (Degen erated) trứng thoái hóa

DMSO : Dimethyl sulfoxide

EG : Etylene Glycol

FSH : Folicle Stimulating Hormone

FRF : Follicle Releasing Factor FDA

: 3’6’ fluorescein diacetate

GDF-9 : Growth differentiation factor-9

GV : (germinal vesicle) trứng ở giai đoạn bóng mầm

GVBD : (germinal vesicle break down) trứng ở giai đoạn

màng nhân tan

LH : Luteinzing Stimulating Hormone

LRF : Luteinizing releasing factor

MI : (metaphase I) trứng ở giai đoạn chu kỳ I

MII : (metaphase II) trứng ở giai đoạn chu kỳ II

Trang 10

36Bảng 3.3 Tác động của nồng độ chất bảo quản lên tỷ lệ sống và phát triển của trứng lợn non

Trang 11

Đồ thị 3.2 Tác động của nồng độ chất bảo quản lên sự sống và phát triển của trứng lợn non

Trang 12

Page 9

DANH MỤC HÌNH

STT Tên các hình ảnh Trang

Hình 1.1 Chu kỳ động dục ở lợn nái 3

Hình 1.2 So sánh mô hình sóng nang giữa các loài 4

Hình 1.3 Sự thay đổi buồng trứng trong chu kỳ động dục 5

Hình 2.1 Thu buồng trứng tại lò mổ 24

Hình 2.2 Phương pháp rạch nang và thu trứng 26

Hình 2.3 Phân loại tế bào trứng theo Mayes (2002) 27

Hình 2.4 Cấu trúc dụng cụ cryotop Thanh polypropylene (a) gắn với giá đỡ bằng nhựa (b) sau khi đặt mẫu đông lạnh lên trên thì đậy bằng ống nhựa (c) có nút bảo vệ mẫu trong nitơ (d)

28 Hình 2.5 Phương pháp nuôi trứng 29

Hình 3.1 Mẫu buồng trứng chuẩn bị thu trứng 34

Hình 3.2 Trứng lợn sau khi nuôi invitro: 37

Hình 3.3 Trứng sống sau khi nuôi invitro (trứng và tế bào cận noãn đều sống sau khi nuôi in vitro) (20X) 37

Hình 3.4 Trứng tại thời điểm thu, trước khi xử lý với chất chống đông và đông lạnh (20X)

44 Hình 3.5 Trứng lợn sau quá trình đông lạnh và rã đông (40X) 44

Hình 3.6 Trứng lợn được nhuộm FDA để theo dõi trạng thái sống/chết của tế bào trứng (20X) sau khi xử lý qua các môi trường đông lạnh 45

Hình 3.7 Trứng lợn được cố định và nhuộm orcein để kiểm tra trạng thái thành thục sau quá trình đông lạnh – rã đông và nuôi thành thục (20X) 45

Hình 3.8 Trứng lợn sống sau đông lạnh nuôi invitro (20X) (trứng bắt màu sáng đậm là trứng sống, những trứng bắt màu nhạt là trứng đã bị chết)

48

Trang 13

Page 10

Hình 3.9 Trứng thành thục sau khi đông lạnh và nuôi thành thục (40X) 51

Trang 14

nuôi, bảo quả nguồn gen invitro, chuyền gen, sinh sản vô tnh.

Đông lạnh trứng là hướng nghiên cứu đã được thực hiện từ rất sớmkhông chỉ trên các động vật nuôi, động vật hoang dã và mà còn được áp dụng trênngười Đông lạnh trứng là cách để duy trì, bảo quản nguồn giao tử cái và sử dụng

nó khi điều kiện cho phép Hiện nay, đông lạnh trứng đã trở thành nghiên cứu khảdụng và áp dụng nhiều vào thực tế, tuy nhiên trên một số đối tượng hiệu quả củanghiên cứu vẫn chưa cao Do vậy, nhiều nghiên cứu nhằm cải thiện chất lượngtrứng sau đông lạnh vẫn đang được triển khai Trong số đó, trứng lợn được xem làmột trong số các loài có kết quả đông lạnh trứng thấp, việc đông lạnh trứng lợn vẫncòn là hướng nghiên cứu được quan tâm của nhiều phòng thí nghiệm trên thếgiới Nguyên nhân là do trong thành phần trứng lợn có số lượng các giọt mỡ cao

đã tác động đến hiệu quả quá trình đông lạnh

Các kết quả nghiên cứu cho thấy buồng trứng của các loài động vật có tiềmnăng khổng lồ về sản sinh tế bào noãn Số lượng nang ở giai đoạn thành thục sinhsản là hơn

68.000 - 70.000 đối với bò (Erickson, 1996a); 12.000 – 86.000 đối với lợn (Driancourt

et al., 1985) (Dẫn theo Nguyen B.X (2006) Tính nhạy cảm trong quá trình đông lạnh

của trứng phụ thuộc vào loài (Bou et al., 2009) Trong quá trình đông lạnh, những

yếu tố làm giảm sự thành công của quá trình bảo quản lạnh trứng bao gồm sự hìnhthành tinh thể đá, các dạng tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo vệ lạnh

(Liebermann et al., 2002) Theo Smorag and Gajda (1994); Vajta and Kuwayama

Trang 15

Page 2

(2006), sự hình thành tinh thể đá có thể được ngăn chặn nhờ vào tốc độ đông lạnh giải đông và nồng độ chất bảo vệ lạnh trong dung dịch thủy tinh hóa Kết quả nuôi

Trang 16

-Page 3

trứng thành thục chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường nuôi, thời giannuôi, nhiệt độ nuôi, cũng như trạng thái chất lượng trứng khi đưa vào nuôithành thục Môi trường sống ở miền Bắc Việt Nam, điều kiện khí hậu, chế độdinh dưỡng và đặc biệt là phương thức chăn nuôi chưa tiêu chuẩn hóa ảnh hưởngnhiều đến sự phát triển của vật nuôi từ đó ảnh ảnh hưởng rất lớn đến chất lượngtrứng trước khi đem nuôi thành thục và tỷ lệ thành thục sau khi nuôi

Ở Việt Nam, với mục đích bảo vệ nguồn gen đa dạng sinh học động vật, kĩthuật lạnh nhanh đã được áp dụng đối với tế bào sinh dưỡng của các loài đôngvật quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng cao như Sao la, Mang lớn, bò tót, khỉ, lợnrừng Đông lạnh trứng mặc dù đã được ứng dụng để bảo quản trứng ở một sốbệnh viện có ứng dụng kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm Tuy nhiên, để xây dựng một

ngân hàng lạnh bảo tồn nguồn gen các giống lợn bản địa Việt Nam, việc “Nghiên cứu đông lạnh trứng lợn non và nuôi thành thục trứng sau đông lạnh” nhằm xây

dựng phương pháp đông lạnh và nuôi thành thục trứng là rất cần thiết

2 Mục tiêu của đề tài

Tối ưu được các yếu tố ảnh hượng đến quá trình đông lạnh và nuôithành thục tế bào trứng lợn non

3 Ý nghĩa của đề tài

Nghiên cứu này góp phần đánh giá khả năng xây dựng phương phápđông lạnh trứng lợn để lập ngân hàng giao tử cái cho mục đích bảo tồn lâu dàinguồn gen các giống lợn bản địa ở Việt Nam

Trang 17

Page 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về tế bào trứng

1.1.1 Sự hình thành, phát triển nang trứng và tế bào trứng

Các giai đoạn phát triển nang trứng và sự hình thành tế bào trứng gắnliền với các hoạt động chu kỳ của buồng trứng

Buồng trứng được hình thành từ quá trình phát triển phôi thai, nó là một bộphận sinh dục của con cái, buồng trứng của lợn cái có một cặp hình hạt đậu, nằm

ở hai bên hốc xoang bụng Buồng trứng có chức năng sản sinh ra giao tử cái(noãn bào - tế bào trứng) và hormone sinh sản cái (oestrogen và progesterone)

Lợn là gia súc đa thai, mỗi chu kỳ động dục có thể có 15 – 20 tế bào trứngthành thục và rụng Sự phát triển của các nang trứng chịu sự tác động bởi yếu

tố thần kinh và thể dịch, nang trứng phát triển có sự tương quan chặt chẽ vớinồng độ của các loại hóc môn khác nhau Các yếu tố kiểm soát chu kỳ động dụcnhư: GnRH, FSH, LH, oestradiol, progesterone inhibin.v.v Sự phát triển của nangtrứng lên đến rụng trứng và thả trứng vào thời điểm tốt nhất để được thụ tinh(hình 1.1)

Hình 1.1 Chu kỳ động dục ở lợn nái

Trang 18

Page 5

(nguồn

h t p: // www2 un i pr .i t / ~ f d e r e n s i / r i p_p i g / r i p_p i g h tm)

Trang 19

Page 6

Ở lợn sóng nang tương đối đồng đều, độ dài của các sóng nang đầutiên không có sự khác biệt, do lợn là gia súc đa thai Còn sóng nang của các loàikhác như Bò, Ngựa, Cừu không có sự đồng đều, các sóng nang phát triển với các độdài khác nhau (hình 1.2)

Hình 1.2 So sánh mô hình sóng nang giữa các loài

(nguồn h t p: // www2 un i pr .i t / ~ f d e r e n s i / r i p_p i g / r i p_p i g h tm)

Ở lợn cái sự thành thục sinh dục xuất hiện từ lúc 6 - 7 tháng tuổi (đối với cácgiống lợn ngoại), 4-5 tháng (đối với các giống lợn nội) Chu kỳ động dục của lợncái dài từ 18-24 ngày, trung bình 21 ngày Thời gian động dục của lợn cái từ 4-5ngày (đối với lợn ngoại), 2 - 3 ngày (đối với lợn nội) Sự rụng trứng bắt đầu xảy ra

và đặc trưng bởi sự tiết progesteron từ thể vàng (CLs) Những thể vàng bắt đầuphát triển ngay sau khi trứng rụng, mặc dù sau 2 - 4 ngày chúng vẫn chưa đạt khảnăng cực đại tiết progesteron Khi progesteron tiết nhiều thì chúng ức chế sựphát triển của các bao noãn ở con cái Progesteron tác động lên trung khu sinh dụclàm giảm thiểu sản sinh các yếu tố giải phóng FRF (Follice releasing factor) và LRF(Luteinizing releasing factor) Hơn nữa progesterone gây nên sự tiết dinh dưỡng vào

tử cung để nuôi dưỡng phôi giai đoạn đầu làm tổ vào khoảng 12 - 16 ngày sau khiphối

Trang 20

Page 7

Sau 16 - 17 ngày vào thời kỳ cuối và kết thúc chu kỳ, chức năng thể vàng bịgiới hạn bởi hormone Prostaglandin F2α được sản xuất với nồng độ cao.Hormone này được tiết bởi tử cung bắt đầu khoảng 12 - 14 ngày sau khi trứng rụng

Ở những lợn nái không có chửa, khi các buồng trứng tăng về khối lượng, đồng thờikhi nồng độ hormone prostagladin đủ sẽ tiêu huỷ thể vàng ở khoảng ngày thứ

16 - 17 sau rụng trứng, thể vàng tiêu biến và không có chất tiết của nó làprogesterone Kết quả là tăng nhanh sự tiết các yếu tố giải phóng FRF và LRF và dẫnđến tăng tiết FSH và LH Các hormone đó kích thích các bao noãn phát triển nhanhchóng lại sau 4 - 5 ngày Sự sinh trưởng này được kết hợp với mức tiết oestrogentrong máu bởi các bao noãn Oestrogen tăng tiết làm phát triển lớp tế bào bề mặt

tử cung chuẩn bị cho việc phối tinh Giai đoạn tiết oestrogen cao nhất sẽ làm tăngtiết LH và rụng trứng Sự tăng tiết oestrogen ở nồng độ cao sẽ làm xuất hiện hiệntượng động dục

Trong chu kỳ động dục buồng trứng có sự thay đổi, sau khi trứng rụngkhoảng 2 - 4 ngày thể vàng tiếp tục phát triển, từ ngày thứ 5 đến ngày 15 thìthể vàng thành thục Thể vàng thoái hóa vào ngày thứ 16 đến ngày thứ 20 và từngày 21 lại động dục trở lại (hình 1.3)

Trang 21

Page 8

Hình 1.3 Sự thay đổi buồng trứng trong chu kỳ động dục

(nguồn partners in reproducton)

Trang 22

Page 9

Buồng trứng lợn có hình hạt đậu, màu hồng vân, kích thước trung bình từ 0,8– 1,2 cm, nằm ở hai bên hốc bụng Buồng trứng gồm có 2 miền, miền tuỷ bêntrong và miền vỏ bên ngoài Miền tuỷ có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết.Miền vỏ gồm các tế bào, các lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng vàhormone Lớp ngoài cùng của miền vỏ trứng là biểu mô bề mặt Biểu mô bề mặt làmột lớp tế bào lập phương Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dàyđặc các mô liên kết Phía dưới là nhu mô (parenchyma), được coi là lớp chứcnăng bởi vì nó chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng

Nang sơ cấp (nang bậc I) được hình thành trước khi con vật cái được sinh ra

Số lượng lớn nhất được tìm thấy ở bào thai lợn ở giai đoạn từ 50 – 90 ngày saukhi thụ thai Nang sơ cấp là một tế bào sinh dục được bao quanh bởi một lớp tế bàohạt Chúng nằm trong nhu mô và thường xuyên được nhìn thấy theo nhóm gọi

là tổ trứng (egg nest), số nang trứng tối đa là 2.700.000, số nang lúc sinh135.000, số nang mất trong quá trình phát triển 95%, mỗi lần động dục lợn nái cóthể rụng từ 10

– 30 noãn bào Kích thước nang xoang là 8 – 10 mm, kích thước nang noãnthành thục là 8 – 12 mm Một số noãn bào có khả năng phát triển đến thànhthục hoàn toàn sẽ được giải phóng vào đường sinh dục (ống dẫn trứng) để thụtinh và phát triển thành phôi, những noãn bào khác sẽ tiếp tục phát triển rồi thoáihoá Vì thế, số noãn bào có khả năng phát triển thu được từ buồng trứng đểtạo ra lợn lớn hơn nhiều so với thực tế nhận thấy

Giải phẫu miền vỏ buồng trứng của một gia súc cái có hoạt động sinh sảncho ta thấy nang sơ cấp (nang bậc I – primary follicle) Sau giai đoạn nang sơ cấp là

sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển.Một tế bào trứng có khả năng phát triển được bao quanh bởi hai hay nhiều lớp tếbào hạt được gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle) Trong quátrình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hìnhthành một xoang Có nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là có chức năngquan trọng Ngoài cùng là lớp tế bào sợi được gọi là tế bào vỏ bên ngoài (theca

Trang 23

Page 10

externa) Tiếp theo là lớp tế bào vỏ bên trong (theca interna) Trong các lớp này cónhiều mạch máu Các tế bào vỏ, các mạch máu được hình thành khi nang trứnglớn lên và di chuyển

Trang 24

Page 11

vào miền tuỷ Màng mềm (basement membrane) tách lớp tế bào vỏ bên trongkhỏi lớp tế bào trong cùng - lớp tế bào hạt, ngăn cản sự di chuyển của hệ thốngmạch máu vào các tế bào này Ngoài ra, khối Cumulus Oophorus, tế bào hạt, nằm ởphía bên kia của xoang Noãn bào có khả năng phát triển nằm trong khối tế bàoCumulus với những tế bào hạt bao quanh và tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng

có khả năng phát triển được gọi là vành phóng xạ Cả tế bào vỏ bên trong và bênngoài đều liên quan đến việc tạo ra oestrogen Lý thuyết gần đây được chấp nhận

là tế bào vỏ bên trong tạo ra androgen, chất này thấm qua màng mềm để biếnđổi thành oestrogen bởi enzyme aromatase trong các tế bào hạt Ngoài ra, tế bàohạt là tế bào chủ yếu tạo ra progesterone trong thể vàng Chúng cũng phân tiếtmột số thành phần khác được nhận biết trong dịch nang trứng, giúp điều khiểnchức năng của buồng trứng, một số tế bào hạt và tế bào trứng có khả năng pháttriển vào xoang cơ thể gần với chỗ mở ra của ống dẫn trứng Trong lúc giải phóng ra,

tế bào trứng được bao quanh bởi vành phóng xạ và một khối tế bào hạt (Cumulus)dính giúp ống dẫn trứng thu tế bào trứng và dịch chuyển xuống ống dẫn trứng

Ở lợn cũng như ở phần lớn các loài động vật có vú khác, sự phát triển của tếbào trứng được kiểm soát trước tiên bởi một hệ thống tương tác ngược có tham giacủa hormone giải phóng từ vùng đồi thị, hormone kích thích tế bào trứng FSH, LH vàcác steroids (oestrogens, androgens, progestins), proteins (inhibin-relaredproteins) được tiết từ buồng trứng Kết quả hiện tại cho thấy các yếu tố cổ điểnđược coi là có tham gia vào quá trình trao đổi chất như hormone sinh trưởng (GH)insulin và yếu tố sinh trưởng giống insulin (IGF), cũng có một ảnh hưởng quan trọngđến sự phát triển của tế bào trứng ở lợn Điều này quan trọng là sự tham gia củachúng có thể là một phần của cơ chế đã được biết là ảnh hưởng của các yếu tốmôi trường, dinh dưỡng lên sinh sản ở

lợn

Những nghiên cứu gần đây đã khám phá ra những nhân tố được trứng tiết rađiều chỉnh sự khởi đầu phát triển nang nguyên thủy (Picton 2001 for review)

Trang 25

Page 12

và điều hòa sự hoạt động vùng chí tuyến của FSH và LH lên sự phát triển nang tiềnxoang và có xoang (Knight and Glister, 2006)

Trang 26

Page 13

Các nhân tố được trứng tiết ra bao gồm Kit, GDF-9, BMP 15… Trong đó, kit là nhân tố kích thích sự phát triển của trứng Sự tiết thụ thể c-kit đã được tmthấy ở trứng chuột ở giai đoạn diplotene và ở trứng thai cừu ở nang nguyênthủy Phối tử c-kit được tiết bởi GCs ở nang nguyên thủy chuột và cừu Khi thêmvào kháng thể anti-c-kit làm ngăn cản sự bắt đầu phát triển của nang chuột CònGDF-9 (Growth diferentiation factor-9) và BMP 15 (bone morphogentic protein) làthành viên của liên họ TGF-ß, được tiết theo kiểu đặc biệt của trứng từ giai đoạn rấtsớm Hai yếu tố này đóng vai trò chìa khóa trong xúc tiến sự phát triển nang vượt xahơn giai đoạn nang sơ cấp chuột với sự chuyển biến vô hiệu của gen gdf-9 hoặccừu với sự mất hoạt tnh của gen gdf-9 hay bmp 15 là giảm hiệu quả với sự pháttriển nang dừng ở giai đoạn sơ cấp (Knight and Glister, 2006) Sự tiết GDF-9mARN của trứng được tm thấy ở tất cả các giai đoạn phát triển, trừ nang nguyênthủy và được tiếp tục tiết sau khi trứng rụng nhưng không xuất hiện ở 1,5 ngày saukhi thụ tinh BMP 15 có vai trò quan trọng trong điều chỉnh sự nảy nở và biệt hóacủa GCs ở buồng trứng Đó là kích thích nguyên phân GCs và ngăn cản thụ thể FSHmARN ở GC bằng cách đó đóng vai trò then chốt trong cơ chế phức tạp điều khiển

c-sự hình thành nang buồng trứng Nhưng tác động này của BMP 15 bị mất dướiảnh hưởng của follistatin

1.1.2 Cấu tạo tế bào trứng

Trứng có hình cầu hoặc hình trứng, có đường kính từ 60 tới 20 mcrm ở độngvật có vú và cầu gai từ 1mm đến 2 mm ở cá ếch, ở bò sát và chim, trứng có thể cóđường kính tới vài centimet và cân nặng tới hàng kilogram (Nguyễn Mộng Hùng,1993)

Cấu tạo tế bào trứng được chia làm ba phần: Màng, nguyên sinh chất và nhân(Trần Tiến Dũng và cs., 2002)

Màng tế bào trứng gồm 3 loại màng: Màng ngoài, màng giữa, màngtrong

Màng ngoài bao gồm nhiều lớp tế bào nang bao quanh trứng theo hình phóng

Trang 27

Page 14

xạ còn gọi là màng phóng xạ, các tế bào gắn liền với nhau bởi axit hyaluronilic, axit này bị phân huỷ bởi men hyaluronidase có ở xoang acrosome của tinh trùng

Trang 28

Màng giữa (Zona pellucida) còn gọi là màng sáng rất bền vững, được xâydựng nên từ nhiều tế bào sinh ra từ các tế bào hình nang Màng giữa chính lànơi tích trữ nhiều dinh dưỡng trong nuôi dưỡng trứng, màng giữa có menZonalizin là men đặc hiệu chủng loại có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài vàonhân trứng trong quá trình thụ tinh.

Màng trong là một lớp mỏng bao bọc phần nguyên sinh chất còn gọi là màngnoãn hay màng nguyên sinh chất Giữa màng giữa và màng trong có khoảngtrống có độ dày là 1,4 – 2 mm chứa nồng độ ion cao 3 – 5 PH, đây là màng có vai trònuôi dưỡng trứng sau khi được thụ tinh, trong màng cũng chứa một loại men làMuraminidase

Nguyên sinh chất bao gồm thành phần chủ yếu là nước, vật chất hữu cơ, cácmuối khoáng và các vật chất khác Thành thục nguyên sinh chất của trứng được đặctrưng bằng sự dịch chuyển của các hạt vỏ (Granule Corticale) theo hướng từ bộ máygolgi đến màng bào tương của trứng Những hạt này có chứa ovoperoxidasegóp phần vào việc giảm thiểu sự thụ tinh đa tinh trùng có mặt trong trứng của tất

cả các loài động vật có vú, các hạt này cố định trên bề mặt màng bào tươngbởi một protein lạ gọi là Calpactine

Một trong những điều kiện cần thiết để màng trong suốt có thể nhận biếtmột cách đặc hiệu những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh của loài đó

là sự thành thục của màng trứng Đặc biệt phải kể đến sự có mặt củaglycoprotein ZP3 trên màng trong suốt, nó chính là nhân tố chịu trách nhiệm nhậnbiết trước tiên các giao tử đực Vùng trong suốt gồm 95% của 3 glycoprotein được

tổ chức thành các sợi dài hợp nhất gọi là ZP1, ZP2, ZP3 (Cù Xuân Dần và cs., 1996).Phần ZP3 và ZP2 hợp thành các sợi, còn ZP1 làm nhiệm vụ bắc cầu liên kết các sợi vớinhau Chỉ có glycoprotein ZP3 được tinh trùng nhận biết và phát ra thể đỉnh; ZP2

có vai trò can thiệp khi xảy ra sự thụ tinh bằng cách cố định tạm thời đầu tinhtrùng trong khi tinh trùng đi qua vùng trong suốt

Nhân tế bào noãn bao gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều loại nhân.Với mỗi giai đoạn phát triển của noãn thì tế bào trứng cũng sinh trưởng và

Trang 29

phát triển dần dần thành thục Sự phát sinh tế bào trứng bắt đầu từ tếbào trứng

Trang 30

Page 10

nguyên thuỷ trải qua 3 lần phân chia cuối cùng hình thành tế bào trứng chính thức

Các trứng thành thục phải đủ chất lượng để thụ tinh, bình thường khôngđược dị dạng, teo lại hay trương phồng, cần có màu hồng tươi đẹp

1.1.3 Quá trình sinh trứng

Sự thành thục tế bào chất

Sau khi đạt tới kích thước cực đại, noãn bào chuyển sang một giai đoạnmới, đó là giai đoạn thành thục Sự kiện này xảy ra dưới ảnh hưởng của các cơ chếđiều chỉnh, có vai trò quan trọng là cơ chế thần kinh – hormone trong tương tácnoãn bào với các tế bào xung quanh Sự chuyển sang thời kỳ thành thục đượcthực hiện dưới ảnh hưởng của các hormone kích dục tố của thuỳ trước tuyến yênvào cuối giai đoạn lớn noãn bào và kích thích quá trình thành thục (hay quá trìnhchín) Quá trình thành thục được nghiên cứu kỹ ở lưỡng thê, cá, động vật có vú, do

đó ngày nay người ta có thể gây chín noãn bào invitro.

Trong điều kiện tự nhiên, các hormone kích dục chỉ tiết vào máu trongnhững thời kỳ xác định của chu kỳ sinh sản Ở động vật sinh sản theo mùa, nó diễn

ra vào trước thời kỳ đẻ trứng Số nang chịu phản ứng phụ thuộc vào nồng

độ hormone và đặc trưng cho từng loài Tuy nhiên có thể tiêm thêm hormonevào cơ thể để gây chín đồng loạt nhiều trứng

Đồng thời với các diễn biến của nhân, trong tế bào chất cũng diễn ra nhữngbiến đổi Trứng trở nên mọng nước, tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tếbào chất bề mặt trở nên có tnh co dãn, xuất hiện khả năng phân chia Trong tế bàochất của trứng cũng xuất hiện một loạt các tác nhân có ý nghĩa quan trọng cho

sự phát triển tiếp theo Một trong những sự kiện quan trọng trong thành thục là sự

vỡ màng nhân, màng nhân bị vỡ dưới ảnh hưởng của tác nhân phá huỷ màng nhân.Tác nhân này xuất hiện trong noãn bào dưới ảnh hưởng của hormoneprogesterone và không có sự tham gia của nhân (trong thí nghiệm với noãn bàokhông nhân) Hoạt tnh của tác nhân này xuất hiện trước khi màng nhân vỡ Nếu

Trang 31

Page 11

lấy tế bào chất của noãn bào giai đoạn này tiêm cho noãn bào chưa chín thì sẽlàm màng nhân vỡ mà không cần

Trang 32

Page 12

kích thích hormone Tác nhân không có tnh đặc hiệu loài, có bản chất protein và cókhả năng nhân lên trong tế bào chất

Sự thành thục nhân tế bào chất

Trong noãn hoàng chuẩn bị thành thục, nhân có kích thước rất lớnthường được gọi là bóng phôi (germinal vesicle) Nó có vị trí khác nhau trongnoãn bào ở các loài khác nhau: ở trung tâm, lệch về cực động vật, lệch hẳn tới giữađĩa tế bào chất, sát bề mặt trứng trên cực động vật Sau khi tiếp nhận kích thíchbởi các kích dục tố, nhân nhanh chóng tiếp tục các kỳ phân bào giảm nhiễm(Meiose) Các lưỡng trị hội tụ trở lại và qua giai đoạn cuối cùng của tiền kỳ làDiakines Đồng thời nhân di chuyển tới bề mặt trứng trên cực động vật, màng nhân

vỡ ra, dịch nhân hoà vào tế bào chất, các lưỡng trị sắp xếp thành tấm trung kỳcủa thoi phân chia Thoi phân chia trực giao với bề mặt trứng Sự phân ly cáclưỡng cực xảy ra ở hậu kỳ Sau mạt kỳ (Meiose 1) hình thành nên hai tế bào Mộtgồm có nhân và một chút tế bào chất tách khỏi noãn bào và nằm ngoài màng sinhchất nhưng ở trong màng noãn hoàng đó là thể cực thứ nhất Tế bào thứ hai lànoãn bào bậc hai Các nhiễm sắc thể trong nhân noãn bào ngay lập tức phân bốthành tấm trung gian kỳ của lần phân chia thứ hai Sự phân chia có thể tiếp biếntiếp tục và ở hậu kỳ này xảy ra sự phân ly các nhiễm sắc thể của bộ đơn bội(giống như phân bào nguyên nhiễm nhưng với số nhiễm sắc thể đơn bội) Saumạt kỳ thể cực thứ hai được hình thành và trứng thành thục (Nguyễn MộngHùng,1993)

Trứng phát triển đến độ thành thục sẽ kèm theo những biến đổi về mặt hìnhthái, sinh lý và sinh hoá liên quan đến nhân trứng, nguyên sinh chất và màngtrứng Sự thành thục của nhân trứng bắt đầu bằng việc tan biến màng (GVBD:Germinal Vesicle Break Down), các nhiễm sắc thể đặc lại, điển hình nhất là sự xuấthiện của thể cực thứ nhất (First Polar Body) và nhiễm sắc thể ở trạng tháiMetaphase II Trạng thái này sẽ được duy trì cho đến khi tinh trùng xâm nhập

Sau khi vỡ màng nhân bắt đầu hoạt động một tác nhân khác, đó là nhânhội tụ nhiễm sắc thể Tác nhân này xuất hiện chỉ khi có sự hoà lẫn dịch nhân với tế

Trang 33

Page 13

bào chất, cơ chế xuất hiện còn chưa rõ, tác động cả tác nhân này cũng không đặchiệu

Trang 34

Page 14

Nó gây hội tụ nhiễm sắc thể của bất kỳ tế bào nào (như của tế bào thần kinhnếu như nhân nó được tiêm vào noãn bào đã vỡ màng nhân)

Trong noãn bào đang thành thục cũng xuất hiện một loại tác nhân, nếukhông có chúng, nhân tinh trùng không thể biến thành nhân nguyên đực vàkhông có sự hoạt hoá tổng hợp AND Đó là các tác nhân trương nhân tinh trùng

Để xuất hiện tác nhân này phải có sự tham gia của cả nhân và tế bào chất củanoãn bào Trong quá trình thành thục còn xuất hiện các phân bào Không có tácnhân này, sự phân cắt sau thụ tinh sẽ không thực hiện được Tác nhân này xuấthiện trong nhân ở giai đoạn sớm của tạo noãn và giữ trong nhân cho tới khi vỡmàng nhân (Nguyễn Mộng Hùng,1993)

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự tồn tại một yếu tố thúc đẩy sự thànhthục hay còn gọi là MPF (Manturation Promoting Factor) Người ta nhận thấyprogesterone có vai trò kích thích sự sinh sản ra MPF, một yếu tố thúc đẩy sự phânbào, sự có mặt của yếu tố này dẫn đến sự đặc lại của nguyên sinh chất, nó tác độngđến sự phát triển của nhân và góp phần làm xuất hiện các thoi phân bào Vềbản chất, MPF là một phức hợp protein bao gồm sự liên hợp của một số cycline vàmột

protein kinase P34 (khối lượng phân tử là 34 kdal); đây là histone kinase H1 tươngtự

một yếu tố men được sản xuất bởi gen cdc2, gen này tham gia vào việc kiểmsoát quá trình phân bào Để được hoạt hoá, protein kinase P34 phải đượckhử gốc photpho bởi các cyclin Sự lớn lên của nguyên sinh chất, sự biệt hoá của tythể, sự tổng hợp, sự tch luỹ noãn hoàng và các ARN thông tin, cuối cùng là sựbiến mất của các hạt trung tâm, đó là những sự kiện phải được hoàn tất trướckhi xảy ra sự hồi phục phân bào ở nhân trứng

Sự tạm dừng của trứng ở trạng thái Metaphase II cho đến khi được thụ tinh

là do một sản phẩm có trong bào tương có nguồn gốc từ một gen ung thư (proto –oncogen) C – mos, được gọi là nhân tố ổn định sự phân bào MSF (Meiosisstabilizing factor) Sự hoạt hoá trứng phụ thuộc đồng thời vào các quá trình

Trang 35

Page 15

photphoryl – dephotphoryl hoá; mà quá trình này lại bị ức chế bởi 6 – DMAP dimethyl – aminopurine) và các quá trình tổng hợp protein, chúng lại bị ức chế bởipuromicine Hai chất này có thể làm dừng một cách độc lập với nhau nhờ sự đặclại

Trang 36

(6-Page 16

của nguyên sinh chất hay cũng chính là làm cản trở sự phục hồi khả năng phân bàocủa trứng

1.2 Tổng quan về tình hình đông lạnh trứng

1.2.1 Lịch sử đông lạnh trứng

Vào nửa cuối thập kỷ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đầutiên về bảo quản phôi thỏ ở nhiệt độ thấp (Hoàng Kim Giao và cs., 1997) Đếnnăm

1949, Polge và cộng sự phát hiện ra glycerol có thể giữ được sự sống của tinh trùnggia cầm khi nhiệt độ được hạ xuống -700C Phát hiện này mở ra khả năng có thể bảoquản các loại tế bào và mô ở nhiệt độ thấp hơn Smith (1952), đã đông lạnh phôithỏ ở nhiệt độ -790C và -1960C nhưng đạt kết quả không cao, sau khi rã đông chỉ có1% số phôi được bảo quản còn giữ được một phôi bào có khả năng tiếp tục phânchia

Năm 1976, Parkening và cộng sự tiến hành đông lạnh trứng chuột ở -300C và-500C có tỷ lệ sống đạt 51% - 56%; ở -750C chỉ đạt 18% trứng sống Một loạt

nghiên cứu của tác giả Willadsen (1977), Trouson et al (1977), đã cải tiến phương

pháp đông lạnh và rã đông theo phương pháp giảm từng bước một, nhằm phaloãng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và rã đông mà vẫn bảotồn sức sống của phôi, thu được kết quả tốt ở bò và chuột Những cải tiến này cũnghạn chế được sự biến đổi về hình thái học của phôi Việc đơn giản hóa kỹ thuậtđông lạnh và rã đông theo phương pháp một bước (one –step method) do Leibo(1980), đề xuất đã thực sự thúc đẩy việc sử dụng phôi cũng như tinh trùng đônglạnh rộng rãi trong sản xuất Hiệu quả cho thấy khi sử dụng tinh đông lạnh thìsức sống của phôi đạt trên 80% và tỷ lệ thụ thai đạt 50 – 60%

Đến năm 1985, Rall and Fahy đã công bố phương pháp đông lạnh cực nhanhvitrification hay còn gọi là phương pháp thủy tinh hóa, bằng cách nhúng trựctiếp phôi chuột 8 tế bào vào nitơ lỏng từ nhiệt độ trên 00C, do đó chỉ mất vàigiây để đông lạnh Và ông đã thành công trong trữ lạnh phôi gia súc (bò) Phươngpháp này không yêu cầu những dụng cụ lành lạnh đắt tiền hay kỹ năng đặc biệt mà

Trang 37

Page 17

có thể tiến hành rất nhanh Mặt khác, phương pháp thủy tinh hóa đơn giản hơnphương pháp

đông lạnh thông thường Từ đó, phương pháp thủy tinh hóa được sử dụng rộngrãi và bây giờ được xem như là phương pháp thay thế phương pháp đông lạnhchậm

Trang 38

Page 18

Mặc dù, phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall

và Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 Tuy nhiên,

quy trình này chỉ được Kuleshova et al (1999) ứng dụng đầu tiên trên trứng người

vào năm 1999 và sau đó vài tháng, quy trình này được thực hiện đầu tiên trên

phôi người đang phát triển ở giai đoạn phôi nang bởi Lane et al (1999).

Kỹ thuật đông lạnh bằng phương thủy tinh hóa áp dụng thành công

trên trứng bò (Martino et al., 1996) Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đông lạnh và rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa là 80% (Shaw et al.,

1991);

99% (Lane and Gardner, 2001); 90% (Kim et al., 2007) Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh và rã đông là 85% (Otoi et al.,1998); 87% (Asada and Fukui, 2000); 88% (Men et al., 2002); đặc biệt Chian Ri et al (2004), thu được tỷ lệ trứng bò

sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene glycol(EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng 15%ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)

Martins et al (2005) đã tiến hành đông lạnh trứng bò chưa chín bằng

phương pháp thủy tinh hóa, sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứngsống là 20% so với nhóm đối trứng là 74,6% Năm 2006, Cetin và Bastan đã bảoquản trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa với cácchất bảo quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20% so với nhóm đối chứng là 79,6%

Somfai et al (2006), khảo sát ảnh hưởng của Cytohalasin B trên quá trình

thủy tinh hóa trứng heo sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trên bề mặt kimloại Họ sử dụng quy trình bổ sung CPA qua 2 bước (trong EG 4% khoảng 10 – 15phút ở 370, sau đó trong dung dịch thủy tinh hóa cuối cùng EG 35% với 5% PVP vàtrehalose 0,3M

Gupta et al (2006), sử dụng quy trình thủy tinh hóa tương tự với quy

trình trên Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cảithiện khi kết hợp sử dụng EG và DMSO, vì vậy họ sử dụng kết hợp hai chất nàytrên đối tượng trứng MII Tuy nhiên, phương pháp này làm giảm đáng kể khả

Trang 39

Page 19

năng phát triển của trứng, chỉ 3,4% phát triển đến blastocyst so với lô đối chứng là20,1%

Trang 40

Page 20

1.2.2 Cơ chế đông lạnh tế bào trứng

1.2.2.1 Khái niệm

Đông lạnh tế bào nói chung, đông lạnh TBT lợn nói riêng là quá trình chuyển

tế bào từ trạng thái sinh lí bình thường sang trạng thái tiềm sinh đông lạnh,bảo quản trong nitơ lỏng (nhiệt độ -1960C) Tại điều kiện này, mọi hoạt động sống,các quá trình chuyển hóa và phát triển của TBT đều dừng lại, nhưng các cấutrúc và thành phần sinh học của chúng được bảo tồn, nhờ đó người ta có thểgiữ TBT ở trạng thái tiềm sinh trong một thời gian dài Sau khi giải đông, mọi hoạtđộng sống của tế bào, các quá trình chuyển hóa… trở lại trạng thái bình thường(Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2006; Anchamparuthy, 2007; Jacque and Kim,2011)

1.2.2.2 Cơ chế sinh học lạnh của tế bào

* Tốc độ làm lạnh và giải đông

Tốc độ làm lạnh (cooling rate)

Hỗn hợp các muối và các chất hòa tan khác có trong môi trường đông lạnhvẫn giữ nguyên trạng thái đông lạnh và tạo thành phần không đông Tốc độ làmlạnh sẽ ảnh hưởng lớn đến khả năng khử nước và khả năng sống của tế bào saugiải đông Nếu tốc độ làm lạnh quá nhanh, có thể tạo ra chênh lệch lớn về ápsuất thẩm thấu giữa hai bên màng bào tương, làm tổn thương độ đàn hồi củamàng Ngược lại, nếu tốc độ làm lạnh quá chậm, tế bào có nhiều thời gian để khửnước, nhưng có thể bị mất nước quá nhiều, điều này cũng làm tổn thương màng tếbào Tế bào tiếp xúc với điều kiện áp suất thẩm thấu của môi trường ngoại bào cao,các muối, chất bảo vệ lạnh (cryoprotectant agents - CPA), các chất hòa tan kháctrong thời gian dài có thể gây độc cho tế bào Tính đàn hồi của màng tế bào cũng

bị ảnh hưởng do tế bào ở trạng thái co nguyên sinh quá lâu (Hồ Mạnh Tường và cs.,2011; Jacque and Kim, 2011)

Tốc độ giải đông (warming rate)

Tốc độ giải đông phụ thuộc rất nhiều vào tốc độ làm lạnh tối ưu đã thực hiệnvới chính tế bào trước đó Một số nghiên cứu trước đây cho thấy giải đông nhanh

Định dạng
Số trang	111
Dung lượng	4,92 MB