ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE CHỌN LỌC CÁC CÁ THỂ CON LAI GIỐNG LÚA OM576 CÓ HÀM LƯỢNG AMYLOSE TRUNG BÌNH

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE CHỌN LỌC CÁC CÁ THỂ CON LAI GIỐNG LÚA OM576 CÓ HÀM LƯỢNG AMYLOSE TRUNG BÌNH TRƯƠNG THỊ TÚ ANH Hội đồng chấm luận văn: 1.. TÓM TẮT Đề tài “Ứng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*************************

TRƯƠNG THỊ TÚ ANH

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE CHỌN LỌC CÁC CÁ THỂ CON LAI GIỐNG LÚA OM576

CÓ HÀM LƯỢNG AMYLOSE TRUNG BÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE CHỌN LỌC

CÁC CÁ THỂ CON LAI GIỐNG LÚA OM576 CÓ

HÀM LƯỢNG AMYLOSE TRUNG BÌNH

TRƯƠNG THỊ TÚ ANH

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN

Trung tâm nghiên cứu sâm và dược liệu TP HCM

2 Thư ký: TS LÊ THỊ DIỆU TRANG

Đại học Nông Lâm TP HCM

3 Phản biện 1: TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Đại học Nông Lâm TP HCM

4 Phản biện 2: TS BÙI MINH TRÍ

Đại học Nông Lâm TP HCM

5 Ủy viên: TS TRẦN KIM ĐỊNH

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Ký tên

Trương Thị Tú Anh

LỜI CẢM ƠN

Thành kính ghi nhớ công ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình

đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho con, động viên, khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

- Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng quý thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt khóa học

- Ban lãnh đạo phòng Công Nghệ Sinh Học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

- TS Trần Kim Định, ThS Trương Quốc Ánh đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

- TS Lê Đình Đôn, TS Bùi Minh Trí và TS Lê Thị Diệu Trang đã quan tâm, góp ý chỉnh sửa những thiếu sót cho tôi trong thời gian hoàn thiện luận văn

- KS Lý Hậu Giang và các anh chị thuộc phòng Công nghệ sinh học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

- Tập thể lớp Cao Học khóa 08 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt khóa học

TP Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2011

TRƯƠNG THỊ TÚ ANH

TÓM TẮT

Đề tài “Ứng dụng chỉ thị phân tử microsatellite chọn lọc các cá thể con lai giống lúa OM576 có hàm lượng amylose trung bình” được tiến hành tại phòng nghiên cứu công nghệ sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, thời gian từ 01/08/2010 đến 01/07/2011

OM576 là giống lúa có năng suất tương đối cao, ổn định, khả năng thích nghi tốt Tuy nhiên, giống lúa này có hàm lượng amylose cao, nên phẩm chất cơm thấp Nhiều công trình nghiên cứu chứng minh rằng hàm lượng amylose được kiểm soát bởi locus Wx nằm trên vùng vai ngắn của nhiễm sắc thể số 6 Vì vậy, hàm lượng amylose của giống này được cải thiện bằng cách du nhập gen có hàm lượng amylose thấp từ giống lúa VD20 thông qua phương pháp lai hồi giao

Hai chỉ thị phân tử RM190 và RM510 được liên kết với gen wx nhờ cho băng đa

hình phân biệt giữa hai giống OM576 và VD20, được sử dụng để chọn lọc những con lai mang alen của VD20 và OM576 trên quần thể hồi giao BC1F1 và

BC2F1 Ở quần thể BC1F1 mức độ tương đồng của những cá thể mang gen dị hợp của hai chỉ thị RM190 và RM510 là 30% Có 30 con lai mang gen dị hợp được

sử dụng để làm vật liệu lai xây dựng quần thể BC2F1 Đánh giá kiểu hình của quần thể BC2F1 có 53 cá thể có hàm lượng amylose trung bình, 35 cá thể có hàm lượng amylose cao và 12 cá thể có hàm lượng amylsose thấp Mức độ chính xác giữa kiểu gen và kiểu hình của RM190 của những cá thể mang gen Aa là 81,63%,

và RM510 là 74% Kết quả so sánh kiểu gen và kiểu hình chọn được 34 con lai mang gen dị hợp và có hàm lượng amylose trung bình Kết quả này tạo tiền đề cho công tác chọn tạo giống lúa có hàm lượng amylose trung bình bằng chỉ thị phân tử

amylose content of OM576 was improved by introgressing the Waxy gene region from

VD20 rice variety - that is low in amylose content by backcrossing method assisted selection was applied to select the inviduals carrying parent’s allele from VD20 and OM576 varieties RM190 and RM510 markers showing polymorphism between

Marker-parents closely linked to the waxy gene were surveyed of 100 individuals of BC1 F 1 and

100 individuals of BC 2 F 1 population in this research Thirty individuals exhibiting heterozygotes were selected to produce BC 2 F 1 population The results showed that heterozygous level of two markers RM190 and RM510 was 30% at BC 1 F 1 population.The evaluation on phenotype of the BC 2 F 1 population showed that 53 individuals medium amylose content, 35 individuals of high amylose and 12 exhibited low amylose The exact exhibition between genotype and phenotype by marker RM190 showing heterozygous genotype Aa was 81.63%, and marker RM510 was 74% The result of comparison of genotype and phenotype showes that 34 progenies heterozygous with RM190 and RM510, and have medium amylose content These results pointed toward the potential to use marker-assisted backcrossing to improve rice genotype with medium and low amylose content

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm ơn iv

Tóm tắt v

Abstract vi

Mục lục ix

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 3

1.3 Mục đích 3

1.4 Đối tượng nghiên cứu 3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về cây lúa 4

2.2 Tinh bột 5

2.2.1 Amylose 6

2.2.2 Amylopectin 7

2.3 Chỉ thị di truyền 8

2.3.1 Khái niệm 8

2.3.2 Phân loại 8

2.3.3 Chỉ thị phân tử 9

2.3.4 Chọn giống thực vật nhờ chỉ thị phân tử 11

2.4 Phương pháp lai hồi giao 14

2.4.1 Khái niệm 14

2.4.2 Cơ sở di truyền của phép lai hồi giao 15

2.4.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử vào phương pháp lai hồi giao 16

2.5 Chỉ thị phân tử microsatellite 17

2.5.1 Khái niệm 17

2.5.2 Phân loại 18

2.5.3 Ứng dụng microsatellite trong chọn tạo giống lúa 19

2.6 Phương pháp PCR 21

2.6.1 Khái niệm 21

2.6.2 Nguyên tắc 21

2.7 Cơ sở dữ liệu và khai thác QTL từ gramene 23

2.8 Các nghiên cứu di truyền tính trạng amylose trên lúa gạo 25

2.8.1 Các nghiên cứu trong nước 25

2.8.2 Các nghiên cứu ngoài nước 27

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

3.1 Nội dung và vật liệu nghiên cứu 31

3.1.1 Nội dung nghiên cứu 31

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 31

3.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 34

3.2.1 Thời gian nghiên cứu 34

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 34

3.3 Phương pháp nghiên cứu 34

3.3.1 Đánh giá kiểu gen 34

3.3.1.1 Ly trích DNA tổng số 34

3.3.1.2.Tuyển chọn chỉ thị phân tử cho phản ứng PCR 36

3.3.1.3 Phản ứng PCR với các chỉ thị phân tử 38

3.3.2 Đánh giá kiểu hình quần thể BC2F1 39

3.3.3 So sánh kiểu gen và kiểu hình quần thể con lai BC2F1 41

4.1 Sản phẩm DNA tổng số sau ly trích 42

4.2 Kết quả điều tra nguồn vật liệu lai ban đầu 44

4.2.1 Kết quả đánh giá hàm lượng amylose trên vật liệu nguồn 44

4.2.2 Kết quả điều tra đa hình trên vật liệu nguồn bố mẹ 44

4.2.2.1 Sản phẩm PCR với chỉ thị phân tử RM190 47

4.2.2.2 Sản phẩm PCR với chỉ thị RM510 48

4.3 Kết quả sản phẩm PCR quần thể BC1F1 49

4.3.1 Sản phẩm PCR với chỉ thị phân tử RM190 .49

4.3.2 Sản phẩm PCR với chỉ thị phân tử RM510 .50

4.3.3 Mức độ tương đồng sản phẩm PCR giữa hai chỉ thị phân tử RM190 và RM510 51

4.4 Kết quả đánh giá quần thể BC2F1 54

4.4.1 Kết quả đánh giá kiểu gen 54

4.4.2 Kết quả đánh giá kiểu hình 56

4.5 So sánh kiểu gen và kiểu hình quần thể BC2F1 58

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

5.1 Kết luận 64

5.2 Đề nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 73

- GBSS: Granule-bound starch synthase

- MAB: Marker Assisted Backcross

- MAS: Marker Assisted Selection

- OD: Optical density

- PCR: Polymerase Chain Reaction

- QTL: Quantitative Trait Loci

- SBE: Starch branching enzyme

- SDE: Starch debranching enzyme

- SNP: Single Nucleotide Polymorphism

- SSR: Simple Sequence Repeats

- SSS: Soluble stach synthase

- STR: Short Tandem Repeats

- TBE: Tris – Borate – EDTA

- TE: Tris – EDTA

- Tm: Melting temperature

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 2.1: Các loại chỉ thị DNA 9

Bảng 2.2: Giá trị trung bình của gen phục hồi qua từng thế hệ hồi giao .16

Bảng 2.3: Danh sách các dạng SSR trên thực vật 19

Bảng 2.4: Phân loại gạo dựa vào hàm lượng amylose .26

Bảng 3.1: Một số đặc tính của các giống lúa làm vật liệu ban đầu 32

Bảng 3.2: Các chỉ thị phân tử SSR khai thác từ gramene 37

Bảng 3.3: Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 38

Bảng 3.4: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 38

Bảng 4.1: Giá trị OD của vật liệu lai ban đầu 42

Bảng 4.2: Hàm lượng amylose của các vật liệu lai ban đầu 44

Bảng 4.3: Kết quả sản phẩm PCR quần thể BC1F1 với hai chỉ thị phân tử RM190 và RM510 52

Bảng 4.4: Kết quả so sánh kiểu gen và kiểu hình quần thể BC2F1 59

Bảng 4.5: Mức độ chính xác của kiểu gen AA và kiểu hình 62

Bảng 4.6: Mức độ chính xác của kiểu gen Aa và kiểu hình 62

Bảng 4.7: Mức độ chính xác của kiểu gen aa và kiểu hình 62

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Cây lúa 4

Hình 2.2 Cấu trúcphân tử amylose 7

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử amylopectin 8

Hình 2.4 Chỉ thị đồng hợp trội (a) và chỉ thị trội hoàn toàn (b) 11

Hình 2.5 Độ tin cậy chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đơn và chỉ thị phân tử kế cận 13

Hình 2.6 Phản ứng PCR 23

Hình 2.7 Bản đồ QTL gen amylose trên nhiễm sắc thể số 6 29

Hình 3.1 Sơ đồ tạo quần thể hồi giao 32

Hình 3.2 Lúa sau gieo 30 ngày 33

Hình 3.3 Hạt lúa sau khi phơi khô 34

Hình 3.4 Hạt lúa đã được bóc vỏ 39

Hình 3.5 Sự khác biệt kiểu gen của các cá thể trên quần thể hồi giao 41

Hình 4.1 DNA tổng số 43

Hình 4.2 Sản phẩm PCR của mẫu bố mẹ với các chỉ thị SSR 46

Hình 4.3 Sản phẩm PCR của mẫu bố mẹ với RM190 47

Hình 4.4 Sản phẩm PCR của mẫu bố mẹ với RM510 48

Hình 4.5 Sản phẩm PCR của quần thể BC1F1 với RM190 50

Hình 4.6 Sản phẩm PCR của quần thể BC1F1 với RM510 51

Hình 4.7 Sản phẩm PCR quần thể BC2F1 với RM190 và RM510 55

Hình 4.8 Biến động hàm lượng amylose quần thể BC2F1 56

Hình 4.9 Đánh giá hàm lượng amylose 57

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính trên

thế giới, cung cấp nguồn lương thực ổn định cho hơn 50% dân số thế giới Trên thế giới có khoảng 110 quốc gia sản xuất và tiêu thụ lúa gạo, trong đó có khoảng 90% sản lượng lúa gạo được sản xuất và tiêu thụ ở châu Á (Bao và ctv, 2002b) Ở Việt Nam, lúa gạo là một nguồn lương thực chính cung cấp năng lượng cho cuộc sống hằng ngày của người dân Những thành tựu trong sản xuất lúa gạo đã đưa Việt Nam thành nước sản xuất lúa gạo phát triển nhanh và ổn định so với các nước trong khu vực Đông Nam Á

Trước đây, các nhà chọn giống chú trọng nghiên cứu chọn tạo các giống lúa

có năng suất cao, khả năng chống chịu tốt để đáp ứng với nhu cầu lương thực của người dân Theo Bùi Chí Bửu (2004), mục tiêu chiến lược cải tiến giống lúa đến năm 2010 là: “Phát triển giống lúa đáp ứng cả hai yêu cầu về an toàn thực phẩm và

có khả năng cạnh tranh cao về chất lượng nông sản đáp ứng thị hiếu của thị trường nội địa và xuất khẩu” Ngày nay, vấn đề an ninh lương thực đã ổn định, cuộc sống của người dân được cải thiện và nhu cầu ngày càng cao hơn Vì vậy, người tiêu dùng chú trọng đến những sản phẩm có chất lượng tốt Vì vậy, cải thiện chất lượng lúa gạo là một trong những mục tiêu chính của các nhà chọn giống lúa hiện nay

Chất lượng là một yếu tố quan trọng của sản phẩm, chất lượng có thể quyết định giá trị thương phẩm của nông sản Chất lượng hạt gạo bao gồm các thành phần

như chất lượng xay chà, chất lượng dinh dưỡng và phẩm chất cơm Hầu hết thị hiếu người tiêu dùng chú ý tới phẩm chất cơm sau khi nấu Phẩm chất cơm bao gồm các yếu tố như: hàm lượng amylose (AC), độ bền thể gel, nhiệt độ trở hồ Hàm lượng amylose là một trong những tiêu chuẩn được nhiều nhà chọn giống lúa quan tâm Hàm lượng amylose trong phôi nhũ hạt gạo là chìa khóa quyết định chất lượng gạo, quyết định đến sự mềm cơm hoặc ngược lại (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2004) Nếu gạo có hàm lượng amylose cao, sau khi nấu cơm sẽ nở nhiều và dễ tróc, nhưng khi nguội, cơm sẽ khô và cứng ăn không ngon Ngược lại, gạo có hàm lượng amylose thấp, sau khi nấu cơm ít nở, mềm và dẻo Những loại gạo có hàm lượng amylose trung bình và thấp được người tiêu dùng ưa chuộng và được trả giá cao hơn

Giống lúa OM576 còn có tên gọi là giống Hầm Trâu do Kiều Thị Ngọc lai tạo và chọn lọc từ tổ hợp lai giữa giống IR84 và Hungary Giống lúa này được nhiều nông dân ưa chuộng vì thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao, khả năng thích nghi tốt Tuy nhiên, nhược điểm của OM576 là gạo cứng cơm, hàm lượng amylose từ 25 - 26% thích hợp cho làm bún và làm rượu Khi sử dụng các phương pháp chọn giống truyền thống, chẳng hạn như chọn lọc cá thể dựa vào kiểu hình để cải thiện hàm lượng amylose thường gặp khó khăn Bởi vì hàm lượng amylose bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường Hàm lượng amylose thường biến động đối với các điều kiện môi trường khác nhau

Sự phát triển của kỹ thuật di truyền phân tử và công nghệ sinh học cùng với

sự phát triển của nhiều loại chỉ thị phân tử với những chiến lược chọn giống đã hỗ trợ cho các nhà chọn giống và các nhà di truyền học vượt qua nhiều vấn đề khó khăn khi chọn giống bằng phương pháp truyền thống Đối với các tính trạng bị chi phối bởi đa gen và các yếu tố môi trường, nếu tiến hành chọn lọc bằng kiểu hình thì

độ chính xác không cao, tốn thời gian và công sức Quá trình chọn giống với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử marker-assisted selection (MAS) đã tỏ ra rất hiệu quả, chính xác, giúp cho việc chọn lọc nhanh quá trình chuyển gen mong muốn vào giống cây trồng Chỉ thị phân tử microsatellite hay còn gọi là SSR (simple sequence repeat)

cung cấp công cụ đủ mạnh bởi sự đa hình, tính đồng trội, giá thành tương đối rẻ và

dễ sử dụng, hỗ trợ cho quá trình chọn lọc một cách nhanh chóng, chính xác và đạt hiệu quả cao (Collard và Mackill, 2008)

Vì vậy, đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử microsatellite chọn lọc các cá thể

con lai giống lúa OM576 có hàm lượng amylose trung bình ” hỗ trợ cho công tác

chọn lọc, đánh giá khả năng cải thiện hàm lượng amylose và chọn ra được các dòng

có triển vọng về hàm lượng amylose phục vụ cho nhu cầu về giống có năng suất và chất lượng tốt

1.4 Đối tượng nghiên cứu

Giống lúa OM576

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây lúa

Theo phân loại thực vật, cây lúa thuộc

Lúa là cây hằng niên có 2n = 24 nhiễm sắc thể (NST) Về phân loại thực vật

lúa thuộc họ Poaceae, chi Oryza Oryza có khoảng 20 loài, trong đó chỉ có hai loài

chiếm đa số là lúa trồng và lúa hoang Lúa trồng ngày nay được hình thành qua nhiều thiên niên kỷ từ quá trình tiến hóa liên tục của cây lúa dại dưới sự tác động của con người và thiên nhiên Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng với

các điều kiện môi trường và chiếm đại bộ phận diện tích thế giới là Oryza sativa L Loài Oryza glaberrima chỉ được trồng ở các nước Châu Phi

Dựa theo sinh thái địa lý, cây lúa trồng Oryza sativa L được chia thành ba loài phụ là indica, japonica và javanica (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Lúa indica

thường được trồng ở những vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Giống lúa

Hình 2.1 Cây lúa

này có hạt gạo dài và dễ bị vỡ, khi nấu không bị kết dính Lúa indica thường được

trồng ở các nước Nam Á như Việt Nam, Ấn Độ, Thái Lan và nam Trung Quốc Lúa

japonica có dạng cây thấp đến trung bình Nhóm lúa này có khả năng chống ngã tốt,

chống chịu nhiều loại sâu bệnh, thời gian sinh trưởng từ ngắn đến trung bình Lúa

japonica có khả năng chịu lạnh, sinh trưởng ở nhiệt độ thấp khoảng 15oC, tuy nhiên nhiệt độ xuống tới 110C ở giai đoạn trổ bông sẽ gây hại nặng Hạt gạo của lúa

japonica tròn, cơm dẻo do có hàm lượng amylose thấp và chứa amylopectin Lúa japonica thích hợp trồng ở những vùng có khí hậu ôn đới, cận nhiệt đới và cao nhiệt

đới như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, các nước thuộc khu vực Trung cận đông như Ai Cập, Ma-rốc, Thổ Nhĩ Kỳ Tùy theo hàm lượng amylose trong tinh bột hạt gạo, người ta phân biệt lúa nếp và lúa tẻ Những giống lúa nếp có hàm lượng amylose rất thấp (< 2%), lúa tẻ có hàm lượng amylose > 2% Những giống lúa có hàm lượng amylose càng thấp thì gạo càng dẻo Theo Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2011), có ba nhóm lúa trồng chính ở Việt Nam là nhóm lúa mùa, nhóm lúa hoang và nhóm lúa cao sản

Trong thành phần hạt gạo chứa: 12% nước, 7,6 – 10% protein, 0,3 – 0,5% lipid, 74,5 – 88% tinh bột, 0,1% vitamin B1, 0,2 – 0,3% cellulose Ngoài ra trong gạo còn chứa rất nhiều acid amin nhất là các acid amin không thay thế như: lysin, methionin, triptophan và treonin Chất lượng hạt gạo bao gồm: chất lượng xay chà, chất lượng cơm và chất lượng dinh dưỡng Chất lượng cơm bao gồm hàm lượng amylose, độ trở hồ, độ bền thể gel Hàm lượng dinh dưỡng bao gồm hàm lượng

protein, vitamin, khoáng vi lượng Chất lượng gạo của giống indica bị ảnh hưởng

bởi hàm lượng amylose cao, độ bền thể gel cứng và nhiệt độ hóa hồ cao

2.2 Tinh bột

Tinh bột là chất rắn vô định hình, màu trắng, không tan trong nước lạnh, tan trong nước nóng Tinh bột là chất dinh dưỡng phổ biến nhất của con người Đó là các polysacharide dự trữ trong các tổ chức “amyloseplats” (được chia ra thành nhiều proplastids) của thực vật Tinh bột được tích lũy chủ yếu trong các loại hạt, đặc biệt

là các loại hạt thuộc họ hòa thảo và các loại củ Trong tế bào, tinh bột tồn tại ở dạng

hạt có kích thước nhỏ Các dạng hạt nhỏ này khác nhau khá rõ rệt về kích thước và

có thể được quan sát dưới kính hiển vi Số hạt tinh bột trong các giống cây khác nhau thì khác nhau Trên cây lúa, số lượng các hạt tinh bột rất nhiều (Nguyễn Tiến Huyền, 2005)

Ở cây lúa, tinh bột chiếm tỉ lệ 90% trong hạt gạo Những đặc tính lý hóa của tinh bột và hàm lượng tinh bột trong hạt gạo có ảnh hưởng lớn đến phẩm chất cơm Tinh bột trong hạt gạo được hình thành do hai phân tử: amylose (chuỗi thẳng 20 – 30%) và amylopectin (chuỗi phân nhánh 70 – 80%)

2.2.1 Amylose

Amylose là một trong hai thành phần cấu thành tinh bột Amylose có dạng chuỗi không phân nhánh, dài khoảng 300 đến 1000 gốc glucose nối với nhau bằng liên kết α - 1,4 glucosit Chuỗi này xoắn theo kiểu lò xo, mỗi xoắn có 6 gốc glucose Cấu trúc phân tử amylose thể hiện qua hình 2.1 Amylose có trong phôi nhũ của hạt,

và được phân bố bên trong hạt tinh bột Dung dịch amylose có độ nhớt thấp hơn amylopectin Amylose là thành phần phân tử quan trọng bao gồm α - 1,4 liên kết α –

D - glucopyranosyl (α - D Glcp) Về đặc tính hóa sinh, amylose được kiểm soát bởi granule-bound starch synthase (GBSS) GBSS được xem là protein waxy (Wx), là

sản phẩm của gen wx đóng vai trò chính trong việc tổng hợp amylose (Bao và ctv,

2002a) Sự hiện diện GBSSI quyết định sự tổng hợp amylose (Kuipers và ctv, 1994)

Amylose được xem là một yếu tố quan trọng quyết định phẩm chất cơm của lúa gạo Chất lượng cơm của những giống lúa có hàm lượng amylose (AC) khác nhau thì rất khác nhau Những giống lúa gạo có hàm lượng amylose thấp thường dẻo khi nấu, trong khi những giống lúa gạo có hàm lượng amylose trung bình thường mềm cơm sau khi nấu Những giống có hàm lượng amylose cao (>25%) cơm thường cứng sau khi nấu và những giống này thường được dùng cho ngành chế biến thực phẩm (Ayres và ctv, 1997)

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử amylose

(http://www.bio.miami.edu/dana/pix/amylose.jpg&imgrefurl)

2.2.2 Amylopectin

Amylopectin có dạng chuỗi phân nhánh, là sợi nhánh thành phần phân tử của chuỗi amylose và nhánh liên kết với α - 1,6 – glucosidic Amylopectin có cấu trúc phân tử gồm một nhánh chính chứa α - 1,4 glucosit Từ nhánh chính này phát sinh

ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose, trọng lượng phân tử khoảng 2.000 đến 1 triệu Cấu trúc phân tử amylopectin thể hiện qua hình 2.2

Amylopectin phân bố ở mặt ngoài hạt tinh bột Dung dịch amylopectin có độ nhớt cao (Huỳnh Thị Dung và Nguyễn Vũ, 2002) Trong phôi nhũ chứa hai dạng enzyme là: GBSS và soluble stach synthase (SSS), hai hợp chất này tác động chặt chẽ với nhau để tổng hợp amylopectin Starch branching enzyme (SBE), soluble starch synthase (SBS) và starch debranching enzyme (SDE) đóng vai trò chính trong việc tổng hợp amylopectin (Smith và ctv, 1997)

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử amylopectin

(http://www.scientificpsychic.com/fitness/amylopectin.gif)

2.3 Chỉ thị di truyền

2.3.1 Khái niệm

Chỉ thị di truyền là những chỉ thị có thể phân biệt được sự khác biệt về mặt

di truyền giữa các cá thể trong một quần thể hay ở các loài riêng lẻ Chỉ thị di truyền không đại diện cho gen mục tiêu nhưng hoạt động như một dấu hiệu được định vị gần với các gen mục tiêu Chỉ thị di truyền chỉ định vị gần hoặc liên kết với gen kiểm soát tính trạng nên không ảnh hưởng đến kiểu hình của tính trạng Tất cả các chỉ thị di truyền chiếm một vị trí chuyên biệt trong bộ gen trên nhiễm sắc thể gọi là

“loci” (Collard và ctv, 2005)

2.3.2 Phân loại

Chỉ thị di truyền được chia thành 3 loại chính:

- Chỉ thị hình thái: chỉ thị hình thái là những tính trạng hay đặc tính về kiểu hình, có thể nhìn thấy được bằng mắt thường như màu sắc hoa, kích thước hạt, màu da Chỉ thị hình thái có những bất lợi như bị giới hạn về số lượng, phụ thuộc cao vào môi trường và các giai đoạn phát triển của thực vật Thông thường, những điều kiện để thực vật phát triển có thể ảnh hưởng tới sự biểu hiện của chỉ thị hình

thái và dẫn tới sai sót trong quá trình chọn lọc Bên cạnh đó, khi tiến hành thí nghiệm với những chỉ thị này thì tốn thời gian, nhân công và yêu cầu phải có quần thể lớn (Akhtar và ctv, 2010)

- Chỉ thị hóa sinh: chỉ thị hóa sinh hay còn gọi là chỉ thị isozyme Chỉ thị hóa sinh bao gồm sự khác nhau về alen của các enzyme Trong tế bào, hệ thống enzyme đều có hệ gen tương ứng và được sắp xếp một cách hợp lý Cấu trúc phân

tử của enzyme là do cấu trúc đặc biệt của DNA trong một đoạn tương ứng của nhiễm sắc thể Phân tử enzyme có thể tồn tại ở dạng anion, cation, hoặc trung tính tùy thuộc vào pH của môi trường Vì chỉ thị isozyme là sự khác biệt trong enzyme nên có thể được phát hiện nhờ điện di và nhuộm màu chuyên biệt (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1995; Collard và ctv, 2005)

- Chỉ thị phân tử: hay còn được gọi chỉ thị DNA Đó là những trình tự DNA được tìm thấy tại những vị trí đặc biệt trong bộ gen và được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác theo quy luật cơ bản và được nhận diện bằng phân tích DNA

2.3.3 Chỉ thị phân tử

Trong một loài, các giống khác nhau thường có trình tự bộ gen khác nhau Trình tự bộ gen của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau Sự khác nhau này bắt nguồn từ các loại đột biến khác nhau như đột biến điểm, đột biến chèn đoạn, đột biến mất đoạn, hoặc có sai sót xảy ra trong quá trình sao chép của DNA được lặp lại một cách có thứ tự (Paterson, 1996) Đây chính là cơ sở để ứng dụng chỉ thị phân tử vào việc phân tích di truyền và chọn giống Không giống với chỉ thị hình thái và hóa sinh, chỉ thị DNA không bị giới hạn về số lượng và không chịu tác động bởi các yếu tố môi trường hoặc các giai đoạn phát triển của thực vật

Dựa vào phương pháp phát hiện, chỉ thị DNA được chia thành ba nhóm:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở của phản ứng PCR

- Chỉ thị dựa trên cơ sở đánh dấu thăm dò, lai DNA

- Chỉ thị dựa trên giải trình tự DNA (Winter và Kahl, 1995; Gupta và ctv, 1999; Joshi và ctv, 1999; Varshney và Tuberose, 2007)

Bảng 2.1: Các loại chỉ thị DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2008)

RAPD Random amplified polymorphic DNA

AFLP Amplified fragment length polymorphism

SSR Simple sequence repeat (microsatellite) SSCP Single strand conformation polymorphism RFLP Restriction fragment length polymorphism

Theo Akhtar và ctv (2010), chỉ thị phân tử là một công cụ quan trọng hỗ trợ cho quá trình phân tích di truyền như xây dựng bản đồ liên kết gen Chỉ thị phân tử giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền trong ngân hàng gen để xác định các giống cây trồng có những tính trạng ưu việt nhằm ứng dụng trong chọn giống thực vật Về bản chất, chỉ thị DNA thể hiện sự khác nhau về mặt di truyền nên có thể xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật điện di và nhuộm màu với các chất hóa học như ethidium bromide (EB) hay bạc, hoặc phát hiện với các chất phóng xạ hay các mẫu

dò nhuộm màu

Dựa vào kiểu hình chỉ thị DNA được chia thành hai loại là đồng trội và trội hoàn toàn Chỉ thị DNA đồng trội cho các băng chỉ ra sự khác biệt về kích thước cả hai alen trội và lặn, ngược lại chỉ thị DNA trội hoàn toàn chỉ sự có mặt hay không

có mặt và chỉ cho băng mang alen trội không cho băng mang alen lặn (hình 2.4) Tóm lại, các dạng khác nhau của các chỉ thị phân tử (thể hiện các băng kích thước khác nhau trên gel khi điện di) được gọi là chỉ thị phân tử “alen” Chỉ thị phân tử đồng trội có thể có nhiều alen khác nhau Ngược lại, chỉ thị trội hoàn toàn chỉ thể hiện băng mang alen trội khi điện di trên gel Chỉ thị đồng trội thể hiện kiểu gen đầy

đủ của thực vật, chỉ thị trội hoàn toàn không thể phân biệt được giữa các kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử ở quần thể F2 Tỷ lệ phân ly của các chỉ thị có thể được

hiểu một cách dễ dàng bằng sử dụng trắc nghiệm Punnet để xác định nguồn gốc các kiểu gen của quần thể

Hình 2.4 Chỉ thị đồng hợp trội (a) và chỉ thị trội hoàn toàn (b) (Collard và ctv,

2005)

Những chỉ thị DNA thể hiện sự khác nhau giữa bố mẹ (chỉ thị đa hình) là yếu tố quyết định trong việc xây dựng một bản đồ liên kết gen (Young, 1994) Nhìn chung, các loài thụ phấn chéo có mức độ đa hình DNA cao hơn so với các loài cận giao Việc lập bản đồ trong các loài cận giao yêu cầu chọn lựa bố mẹ có quan hệ xa Trong nhiều trường hợp, nếu bố mẹ cung cấp đủ đa hình thì việc lựa chọn dựa trên mức độ đa dạng di truyền giữa bố mẹ (Anderson, 1993) Khả năng chỉ thị DNA được sử dụng cho lập bản đồ có thể phụ thuộc vào từng loại chỉ thị hay phụ thuộc vào sự thích hợp của các chỉ thị đặc biệt cho các loài đặc biệt

2.3.4 Chọn giống thực vật nhờ chỉ thị phân tử

Trong nông nghiệp, một trong những mục tiêu chính của các nhà chọn giống

là cải thiện những giống cây trồng thiếu một hoặc nhiều tính trạng ưu việt như tính chống chịu với các điều kiện môi trường, tính kháng sâu bệnh, năng suất cao, phẩm chất tốt… bằng cách lai những giống này với các dòng sở hữu những tính trạng mong muốn Trước đây, phương pháp chọn giống truyền thống thường tiến hành lai toàn bộ bộ gen sau đó sẽ chọn những dạng tái tổ hợp mang những đặc tính mong muốn từ quần thể phân ly Tuy nhiên, quá trình này đòi hỏi lai tạo qua nhiều thế hệ nên tốn thời gian và công sức Đặc biệt, phải chú ý việc lựa chọn kiểu hình và hiện

tượng liên kết chặt của nhiều locus không mong muốn với locus mong muốn (linkage drag) gây khó khăn trong việc đạt được mục tiêu

Sự xuất hiện của kỹ thuật di truyền, sự phát triển của nhiều loại chỉ thị phân

tử với những chiến lược chọn giống đã tạo ra khả năng cho các nhà chọn giống và các nhà di truyền học vượt qua nhiều vấn đề khó khăn khi chọn giống bằng phương pháp truyền thống (Varshney và Tuberose, 2007) Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử MAS (marker-assited selection) là một xu hướng được thế giới ủng hộ mạnh mẽ từ những năm 1995 Đây là phương pháp tác động mạnh mẽ đến hiệu quả chọn giống trên cơ sở phản ứng PCR để đánh dấu kiểu gen của tính trạng mục tiêu Kết quả đánh giá kiểu gen được so sánh với kết quả đánh giá kiểu hình để tìm ra mức độ chính xác của phương pháp

Để đạt được độ tin cậy cao trong quá trình chọn lọc đòi hỏi chị thị phải liên kết chặt với gen mục tiêu, thông thường khoảng cách di truyền giữa chỉ thị phân tử

và vị trí mục tiêu thường nhỏ hơn 5 cM Bên cạnh đó, sử dụng những chỉ thị phân

tử nằm kế cận với gen mục tiêu sẽ làm gia tăng mức độ tin cậy của chỉ thị phân tử trong việc dự đoán kiểu hình (hình 2.5) Giả sử tần suất tái tổ hợp giữa vị trí mục tiêu và chỉ thị phân tử A khoảng 5% (5 cM) Do đó, ở thế hệ con lai, quá trình tái tổ hợp có thể xảy ra giữa vị trí mục tiêu và chỉ thị phân tử xấp xỉ 5% Đối với chỉ thị phân tử B, tần suất tái tổ hợp giữa chỉ thị B và vị trí mục tiêu tương đương 4% (4 cM) Như vậy, cơ hội tái tổ hợp xảy ra của cả hai chỉ thị này (quá trình trao đổi chéo) sẽ thấp hơn so với một chỉ thị phân tử (khoảng 0,4%) Vì vậy, mức độ tin cậy trong quá trình chọn lọc sẽ lớn hơn rất nhiều lần khi sử dụng những chỉ thị phân tử

kế cận (Collard và Mackill, 2008)

Hình 2.5 Độ tin cậy chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đơn và chỉ thị phân tử kế

cận (Collard và Mackill, 2008) Với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử giúp các nhà chọn giống có thể chọn lọc bất

cứ giai đoạn nào trong cây, chọn lọc gen đồng hợp và dị hợp đối với tính trạng được điều khiển bởi gen đơn, hoặc chồng gen và chọn lọc trên tất cả các quần thể (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2011) Hiện nay có nhiều loại chỉ thị phân tử được sử dụng để chọn giống thực vật bao gồm:

- RFLP là chỉ thị có tính chất đồng trội và rất đáng tin cậy Kỹ thuật này sử dụng cDNA hoặc thể probe được đánh dấu bằng phóng xạ hay huỳnh quang, cộng với sự phân cắt hạn chế của enzyme tương thích

- RAPD là một dạng chỉ thị DNA, có tính chất trội, được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR Mức độ khuếch đại cao nhờ cặp mồi đơn giản, ngắn (10 mer) Bởi vì RAPD có tính chất ngẫu nhiên nên có mức độ tin cậy thấp

- STS là chỉ thị được thiết kế từ chuỗi ký tự của RFLP (20 – 24 mer), được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR STS có tính chất đồng trội, đôi khi STS cũng thể hiện tính trội Đây là phương pháp có thể sử dụng enzyme phân cắt trong trường hợp sự

đa hình không thể hiện rõ Kết quả có độ tin cậy tốt

- Microsatellite hoặc SSR (simple sequence repeat) là chỉ thị được thiết kế từ trước và sau những vệ tinh có chuỗi mã đơn giản, lặp lại nhiều lần SSR có tính chất đồng trội, mức độ tin cậy cao, khả năng dò tìm đa hình khá nhạy Do đó, SSR đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD với các kiểu lặp lại “dinucleotide” hoặc

“trinucleotide” (GA, GT, CAT, CTT)

- AFLP là dạng chỉ thị dựa trên cơ sở PCR AFLP phối hợp cả hai tính chất của RFLP và RAPD nên có khả năng phát hiện đa hình rất tốt Tuy nhiên, vì AFLP thường có tính chất trội nên gặp hạn chế khi thể hiện alen lặn

2.4 Phương pháp lai hồi giao

2.4.1 Khái niệm

Lai hồi giao (BC) là phương pháp có tiềm năng rất lớn để bổ sung cho phương pháp chọn tạo giống thông thường khác và được kỳ vọng là một trong những phương pháp có tính chất tiếp cận với những phương pháp hiện đại trong thời điểm hiện nay Phương pháp lai hồi giao được thực hiện trong trường hợp muốn du nhập một gen mục tiêu quan trọng từ nguồn vật liệu cho (là giống cây bản địa, loài hoang dại có quan hệ gần gũi) vào giống cây trồng Tổ hợp lai F1 bao gồm:

 Nguồn vật liệu cho (donor) thường được sử dụng làm bố

 Nguồn giống cây trồng có nhiều tính trạng ưu việt, chỉ thiếu một hoặc vài gen điều khiển tính trạng mục tiêu thường được sử dụng làm mẹ; thuật ngữ chuyên môn gọi là giống tái tục (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) Lai hồi giao nhằm duy trì toàn bộ kiểu gen ưu việt của giống tái tục trong quá trình du nhập gen mục tiêu của giống cho Mức độ thành công của phương pháp này tùy thuộc vào:

- Quan hệ di truyền giữa giống tái tục và giống cho

- Hiệu quả chọn lọc đối với những tính trạng của giống tái tục

- Phá vỡ liên kết giữa gen mong muốn được chuyển vào với gen không mong muốn của giống cho

Nguyên tắc chung của phương pháp này là chọn được giống tái tục và giống cho đạt yêu cầu cải tiến giống, cây F1 phải được lai lặp lại với cây tái tục Trong mỗi thế hệ hồi giao, phải chọn những cây có tính trạng mong muốn để lai lặp lại với giống tái tục từ 4 đến 6 lần

2.4.2 Cơ sở di truyền của phép lai hồi giao

Quá trình lai hồi giao nhiều lần với giống tái tục, và sau khi đã chuyển gen mục tiêu của giống cho vào giống tái tục, quần thể con lai sẽ đạt một trạng thái cận giao đặc biệt hướng về kiểu gen của giống tái tục Bên cạnh đó, nhiều gen không mong muốn khác cũng sẽ được chuyển vào giống tái tục cùng với gen mục tiêu Những gen không mong muốn này có thể tái tổ hợp với các gen của giống tái tục và biểu hiện những kiểu hình không mong muốn Phương pháp hồi giao sẽ khắc phục hiện tượng này bằng cách lai lặp lại nhiều lần với giống tái tục Tỉ lệ cá thể có gen hoàn toàn đồng hợp tử sau mỗi thế hệ hồi giao là: [(2m-1)/2m]n

Trong đó, m là số lần hồi giao, n là số gen điều khiển tính trạng (Allard,

1960 trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007)

Sự thay đổi thành phần trong quần thể hồi giao là kết quả của sự thay thế gen giữa giống cho và giống nhận Tần suất gen của giống cho trong bất cứ thế hệ hồi giao nào đều biểu thị (1/2)m+1 làm giảm đi tỉ lệ gen không mong muốn và làm tăng lên gen cần phục hồi của giống tái tục (bảng 2.2) Tuy nhiên, quá trình phục hồi kiểu gen của giống tái tục chỉ đạt được trong trường hợp gen mục tiêu được chuyển sang từ giống cho di truyền độc lập với những gen còn lại của giống tái tục Thông thường, để phục hồi tính trạng ưu việt của giống tái tục và làm cho bộ NST của giống tái tục trở nên đồng hợp, các nhà chọn giống chỉ cần lai hồi giao 5 lần Tuy

nhiên, khả năng xảy ra tái tổ hợp không mong muốn sẽ rất cao đối với những tổ hợp

lai có khoảng cách di truyền xa giữa bố và mẹ, chẳng hạn như trường hợp chuyển gen từ loài lúa hoang dại vào giống lúa trồng hoặc lai giữa các giống lúa thuộc

nhóm indica và japonica Ngoài ra, chọn lọc tính trạng của dòng tái tục trên quần

thể lớn trong mỗi thế hệ hồi giao cũng làm phục hồi tính trạng ưu việt của giống tái tục ngay cả lần hồi giao BC4

Bảng 2.2: Giá trị trung bình của gen được phục hồi qua từng thế hệ hồi giao

(Chahal và Gosal, 2002) Giá trị trung bình việc phục hồi gen

(%) Thế hệ

Giống tái tục Giống cho

2.4.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử vào phương pháp lai hồi giao

Theo Paterson (1996), phương pháp hồi giao được trợ giúp bởi chỉ thị phân

tử đã và đang được ứng dụng rộng rãi, giúp tiết kiệm từ một tới hai thế hệ, giúp cải tiến cây trồng đáp ứng với sản xuất sớm hơn rất nhiều Chọn lọc cá thể có những tính trạng tốt thông qua chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng đó Bởi vì chỉ thị phân

tử không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, không bị ảnh hưởng của các điều kiện cây trồng đang sinh trưởng và phát triển, nên quá trình chọn lọc sẽ đạt độ chính xác cao

Marker-assisted backcrossing (MAB) là phương pháp ứng dụng chỉ thị phân

tử vào phép lai hồi giao Phương pháp này rất hữu ích cho việc chọn lọc những tính trạng cần nhiều thời gian trong quá trình sàng lọc kiểu hình bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử vào việc kết hợp, thay thế hoặc sàng lọc những gen mục tiêu hoặc QTL (quantitative trait loci) Phương pháp này cho phép chọn lọc tính trạng trong giai đoạn cây con, hỗ trợ cho quá trình chọn lựa những cây tốt nhất để lai hồi giao Đặc

biệt, có thể chọn được những tính trạng do alen lặn quy định giúp gia tăng hiệu quả chọn lọc lên rất nhiều lần (Collard và Mackill, 2008) Đối với những trường hợp như biểu hiện của một tính trạng được quy định bởi một gen, hoặc một gen chịu trách nhiệm chính về việc biến thiên kiểu hình của tính trạng mục tiêu, quá trình chuyển đoạn NST từ thể cho sang thể nhận để cải thiện tính trạng mong muốn sẽ đạt hiệu quả cao nếu kết hợp giữa chọn giống truyền thống và chỉ thị phân tử (Francia

và ctv, 2004)

Chọn lọc tái tổ hợp liên quan tới việc lựa chọn con lai của quần thể hồi giao

có những tính trạng mục tiêu bằng chỉ thị phân tử nằm kế cận locus mục tiêu Mục đích của việc chọn lọc tái tổ hợp là chọn được những con lai mang những đoạn gen nhận được từ giống cho Chỉ thị phân tử có thể xác định các dạng tái tổ hợp từ quần thể phân ly Bên cạnh đó, khi du nhập gen mục tiêu vào giống nhận, các gen không mong muốn khác cũng được chuyển vào, các gen này liên kết chặt với gen mục tiêu biểu hiện những kiểu hình không mong muốn Hồi giao truyền thống thường tiến hành chọn lọc dựa trên kiểu hình, vì vậy phải mất rất nhiều thời gian, công sức để chọn lọc Vì vậy, ứng dụng chỉ thị phân tử vào chọn lọc cá thể ngay từ BC2 hoặc

BC3 giúp chọn được những cá thể gần giống với cây tái tục thay vì phải đến BC10 Hơn nữa, hiện tượng “linkage drag” được ghi nhận giảm ít nhất 10 lần trong khoảng thời gian cần thiết so với phương pháp hồi giao truyền thống (Chahal và Gosal, 2002)

2.5 Chỉ thị phân tử microsatellite

2.5.1 Khái niệm

Chỉ thị phân tử microsatellite (vi vệ tinh) hay còn được gọi là chỉ thị phân tử SSR (simple sequence repeat) Đây là các đoạn trình tự ngắn, lặp lại ngẫu nhiên nhiều lần SSR có kích thước từ 2 – 6 bp, phân tán rộng khắp trong bộ gen, trên nhiều vị trí, kích thước tại mỗi vị trí từ 20 – 100 Sự đột biến tại vùng SSR bắt nguồn từ những sai sót trong suốt quá trình sao chép, tần suất trượt của DNA polymerase, sự thêm hoặc mất vài cặp base SSR được tìm thấy trong tất cả cơ thể

sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trong nhiều vùng trên toàn bộ gen Đó là những trình tự mã hóa, trình tự không dịch mã (5’ – UTR và 3’ – UTR) và intron Những chuỗi mã ngắn này có thể tồn tại ở dạng lặp lại của hai, ba hay bốn nucleotide và được sắp xếp ngẫu nhiên trên một dãy của 5 – 50 bản sao chẳng hạn như (AT)29, (CAC)16 hay (GACA)32 (Cardle và ctv, 2000)

Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những alen đồng trội (bao gồm 2 loại: alen đồng hợp và alen dị hợp), có các tính chất cần thiết của một chỉ thị phân tử Tần số đột biến từ 104 – 5.10-6, tuân theo định luật Mendel Vị trí của SSR trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ Microsatellite được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: lập bản đồ gen, nghiên cứu những gen liên quan đến bệnh di truyền, giám định pháp y, xác định phả

hệ, xác định cấu trúc quần thể Đặc biệt, microsatellite còn được ứng dụng trong việc xác định cấu trúc và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần thể và xác định các vị trí liên quan đến tính trạng số lượng

2.5.2 Phân loại

Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 – 6 lần), SSR được chia thành nhiều

dạng sau:

Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6

GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4

CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4

ACTCACTCACTCACTC

Sự hiện diện của dạng SSR trinucleotide ít hơn dạng SSR dinucleotide khoảng

10 lần, và dạng SSR tetranucleotide thì rất hiếm xuất hiện (Ma và ctv, 1996)

Những đoạn lặp lại của poly A/poly T là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các bộ gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau (bảng 2.3) Tuy nhiên, những đoạn lặp lại poly A/poly T không phù hợp trong việc lập bản đồ và phân tích quần thể vì chúng không ổn định và bền vững trong quá trình phân tích bằng PCR Trong quá

trình PCR, dưới tác động của enzyme Taq polymerase có thể làm cho kích thước

alen bị thay đổi bằng cách thêm một nucleotide A vào cuối đoạn hoặc chèn vào vùng lặp lại của alen

Bảng 2.3: Danh sách các dạng SSR trên thực vật (Mohan và ctv,

1997) Loài SSR Arabidopsis

Hướng dương, cà chua

Cây nhiệt đới

Lúa mì

Khoai sọ

AT, AG, GA, CT, TC, CA

AT, TCT, CT, TG, CTT, TGC, ATTT ATT, (TAT)(TAG)

CA

GA, GT, A

T, AG, CA, AC, AG, GA

GA, GT, AT, GGT

AG, AC, ACC, AAG

AT, ATT, TAT, CT, TA, AAT, TAA

CA

GT, GA, ATT, GATA

AC, A, AA, CAG, GA, GT, CT

CT, AT, (TA)(CA)

Trong số ba nucleotide lặp lại, CAG và ATT là nhiều nhất, nhưng tần số xuất hiện của các kiểu này tùy thuộc vào chủng loại bộ gen CA/GT là những đoạn lặp lại thường gặp hơn, cặp này cũng có ở động vật có vú, tần suất xuất hiện của cặp này gấp đôi so với AT và gấp ba lần so với AG/TC AA/TT và AT/TA là những loại dinucleotide thường gặp ở thực vật Chúng được chia thành ba loại sau:

- Hoàn hảo: không có sự ngắt quãng

2.5.3 Ứng dụng microsatellite trong chọn tạo giống lúa

Chỉ thị phân tử SSR có giá trị cao bởi vì chúng là dạng di truyền đồng trội, đồng phân ly, có tính đa hình cao và dễ dàng phân tích bằng PCR Bên cạnh đó, SSR rất phong phú về số lượng với các dạng lặp lại trên những vùng mã hóa và vùng không mã hoá của bộ gen cây lúa giúp cho việc khảo sát sự hiện diện và sự khác biệt các chuỗi mã đơn giản lặp lại trên bộ gen ngày càng hoàn hảo (Wu và

Tanksley, 1993; Akagi và ctv, 1996; Chen và ctv, 1997; Temnykh và ctv, 2000) Có

khoảng 5.700 đến 10.000 SSR có trình tự khác nhau với 2, 3 hoặc 4 đơn vị lặp lại trên cây lúa Vì vậy, SSR rất hữu ích trong thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý

và bản đồ chuỗi mã cơ bản trên cây lúa Bản đồ di truyền SSR trên bộ gen cây lúa được thiết kế với các chỉ thị phân tử SSR được viết tắt là RM (Rice Microsatellite)

ở Mỹ và OSR (Oryza Sativa Rice) ở Nhật

Năm 1997, Chen và ctv đã dùng 121 chỉ thị phân tử SSR lập bản đồ gen của cây lúa Sau khi sàng lọc thư viện gen của cây lúa, McCough và ctv (1997), đã đề nghị rằng có khoảng 5.700 – 10.000 SSR trên cây lúa, và đã lập bản đồ bao gồm 120 chỉ thị SSR phủ khắp 12 NST của cây lúa

Temnykh và ctv (2000), đã lập bản đồ di truyền của cây lúa với 312 chỉ thị phân tử SSR bao phủ khắp bộ gen với mật độ bao phủ trung bình của một chỉ thị là 6

cM Năm 2002, McCouch và ctv đã thiết lập bản đồ trên cây lúa với 2.240 SSR mới

Bản đồ liên kết gen kháng rầy nâu với chỉ thị phân tử SSR trên quần thể IR64/Hoa Lài với 229 cá thể con lai F2 được thực hiện bởi Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2002), có kết quả sau: 118/300 chỉ thị phân tử cho kết quả đa hình, phủ

trên 12 NST với tổng chiều dài là 1.298,007 cM, giá trị liên kết là 0,2 cM với chỉ thị RM227 và 5,0 cM với chỉ thị RM260

Bởi vì SSR rất phong phú và phân bố rộng trong bộ gen cây lúa nên chúng còn được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền giữa các giống lúa (McCouch và

ctv, 1997) So sánh 323 chỉ thị SSR (194 chỉ thị từ kho dự trữ bộ gen cây lúa và 129

chỉ thị từ kho lưu trữ thiết lập từ protein (chỉ thị isozyme) thể hiện các tính trạng rice – expressed sequence tags – (ESTs), Cho và ctv (2000), xác định tỉ lệ đa hình tìm thấy nhờ các chỉ thị từ bộ gen cao hơn rất nhiều các chỉ thị từ ESTs (83,8% so với 54,0%) Về các motif lặp lại, mức độ đa dạng di truyền cao nhất tìm thấy ở chỉ thị khuếch đại chuỗi mã GA trong khi hầu hết các chỉ thị khuếch đại chuỗi mã CCG hoặc CAG không tìm thấy sự khác biệt

2.6 Phương pháp PCR

2.6.1 Khái niệm

Kỹ thuật PCR được giới thiệu bởi Kary Mullis và cộng sự Đây là phương pháp tăng bội một đoạn phân tử DNA trong ống nghiệm, nhằm tạo ra hàng triệu đoạn DNA đồng nhất từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysacharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền Người ta còn gọi là kỹ thuật tạo dòng DNA PCR in vitro Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực về sinh học (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2008)

2.6.2 Nguyên tắc

Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan tâm bằng đoạn mồi chuyên biệt kết hợp với hoạt động của enzyme chịu nhiệt

polymerase trong một chu trình nhiệt hợp lý

Các chuỗi mã DNA được xử lý in vitro bằng cách phát triển mồi đồng loạt trên các dây đơn DNA Tác động của mồi được xem như yếu tố đánh dấu cho hoạt động

của polymerase khi nó được gắn kết vào DNA mạch đơn làm khuôn trong giai đoạn

bắt cặp Khi các cặp mồi kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện đã

được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo phản ứng

dây chuyền với polymerase (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2008) Mồi xuôi tác

động trên dây DNA 3’ – 5’ Mồi ngược tác động trên dây 5’ – 3’

Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu

kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Bước 1: Biến tính: Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 – 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch đôi tách hoàn toàn thành hai mạch đơn Chính hai mạch đơn này đóng vai trò làm khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới

Bước 2: Bắt cặp: Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer

bắt cặp được với khuôn, nhiệt độ dao động trong khoảng 30 – 700C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các cặp mồi sử dụng Các cặp mồi này sẽ tác động lên dây nền, gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên sợi khuôn để có phân tử DNA mới

Bước 3: Kéo dài: Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’

– 3’ của hai primer nhờ hoạt động của polymerase Nhiệt độ được tăng lên 720C

giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này tùy

thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: là số bản sao của chuỗi mã hóa

n: là số chu kỳ

Nếu hiệu quả phản ứng đạt 100%, sau 30 chu kỳ, tổng số khuếch đại sẽ đạt được là 1,07x109

Hình 2.6 Phản ứng PCR ( http://universe-review.ca/I11-50-PCR.jpg)

2.7 Cơ sở dữ liệu và khai thác QTL từ gramene

Hiện nay, có rất nhiều trang web cung cấp cơ sở dữ liệu của cây lúa như:

 Viện nghiên cứu lúa gạo quốc tế IRRI: http://www.irri.org

 Dự án xây dựng bộ gen lúa OMAP: http://www.omap.org

 GRAMENE: http://www.gramene.org

Cơ sở dữ liệu gramene là nơi lưu trữ dữ liệu genome, protein, các bản đồ di truyền, các chỉ thị phân tử, tính trạng số lượng QTL (quantitative trait loci) của lúa gạo, lúa mì và một số loài thực vật khác Nơi đây tập trung hầu hết các thông tin di truyền liên quan đến thực vật thuộc họ gramene Ngoài ra, Cơ sở dữ liệu gramene không ngừng được mở rộng và bổ sung thêm thông tin từ các phòng thí nghiệm, các học viện, các viện nghiên cứu và các cơ sở dữ liệu di truyền uy tín trên thế giới nên

dữ liệu tại đây rất đáng tin cậy Các thành phần trong trang gramene chứa các thông tin di truyền liên quan trực tiếp với các đối tượng sau: lúa, lúa mì, bắp, và một số thực vật khác, bao gồm:

 Genomes: Chứa thông tin về bộ gen của thực vật như lúa, lúa mỳ, bắp và các loại thực vật khác

 Proteins: Cho phép tìm kiếm các thông tin về protein

 Comparative Maps: Cho phép tìm kiếm các thông tin liên quan đến bản đồ di truyền và bản đồ vật lý Mục này cho phép so sánh giữa các bản đồ di truyền, QTL và trình tự của các loại thực vật

 Marker: chứa các thông tin về các chỉ thị phân tử, các DNA probe, chuỗi trình tự, vùng di truyền, v.v…

 Traits: Cho phép nghiên cứu thông tin về các gen và các QTL đã được định

vị trên các bản đồ cây lúa, bắp và nhiều cây khác

 Ngoài ra, còn có nhiều thành phần khác liên quan

Nhiều tính trạng nông nghiệp quan trọng chẳng hạn như năng suất, chất lượng, tính chống chịu, tính kháng được kiểm soát bởi nhiều gen, và những tính trạng này được xem là tính trạng số lượng Những vùng trên bộ gen chứa gen liên kết với tính trạng số lượng đặc biệt nào đó được gọi là QTL QTL là một vùng đặc biệt của bộ gen chứa một hoặc nhiều gen Quá trình xây dựng bản đồ liên kết và thực hiện phân tích QTL (xác định những vùng trên bộ gen chứa tính trạng) được gọi là bản đồ QTL Bản đồ QTL chỉ ra khoảng cách của các chỉ thị phân tử trên NST Bản đồ QTL bao gồm bản đồ của bộ gen, chỉ ra mối quan hệ giữa tính trạng với những chỉ thị phân tử đa hình, chứng minh một QTL định vị kề cận những chỉ thị phân tử QTL thường được tìm thấy trên nhiều NST khác nhau (www.gramene.org)

Nguyên tắc lập bản đồ QTL với chỉ thị phân tử là phải phát hiện sự kết hợp giữa chỉ thị phân tử và tính trạng trên cơ sở liên kết gen thông qua các phương pháp

bố trí thí nghiệm và phân tích thống kê Quần thể phục vụ cho phân tích QTL thường là quần thể F2, quần thể hồi giao, quần thể đơn bội kép (DH) hoặc quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) Những quần thể này phải được đánh giá kiểu hình, đánh giá kiểu gen thông qua bản đồ liên kết gen với sự bao phủ của các chỉ thị phân tử

Bên cạnh đó, để lập bản đồ QTL còn phải thực hiện phân tích thống kê thông qua việc phân tích từng chỉ thị phân tử đơn, phân tích bản đồ cách quãng và mô hình tuyến tính (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2011)

Mục tiêu cơ bản của bản đồ QTL là tìm hiểu cơ sở di truyền của các tính trạng số lượng bằng cách xác định số lượng, vị trí, các ảnh hưởng của gen và hoạt động của những loci bao gồm tương tác gen (epistasis) và tương tác QTL x môi trường Bản đồ QTL được thực hiện để xác định những QTL mang tính chất hiệu quả, phục vụ yêu cầu chọn giống, dòng hóa (cloning) các gen điều khiển tính trạng

số lượng phức tạp thông qua kỹ thuật map base cloning (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2011) Ngoài ra, QTL có thể sử dụng để dự đoán những gen ứng cử viên (candidate genes) cho một tính trạng nào đó Ví dụ như một vùng DNA có ảnh hưởng tới kiểu hình, vùng DNA này được giải trình tự Trình tự DNA của vài gen trong khu vực này có thể đem so sánh với dữ liệu DNA của những gen khác mà những gen này đã được xác định chức năng

Cơ sở dữ liệu QTL của Gramene bao gồm nhận dạng nhiều tính trạng nông nghiệp trên các loại thực vật như lúa gạo, lúa mì, bắp, QTL chứa thông tin liên kết của các tính trạng và vị trí bản đồ của bản đồ di truyền Sự hiểu biết về số lượng của QTL có thể giải thích biến thiên kiểu hình Chẳng hạn như sau khi phân tích được QTL của tính trạng quy định chiều cao cây, chúng ta có thể biết được tính trạng này được kiểm soát chủ yếu bởi một gen chính và vài gen phụ khác Ảnh hưởng của gen chính giải thích phần trăm biến thiên kiểu hình

2.8 Các nghiên cứu di truyền tính trạng amylose trên lúa gạo

2.8.1 Các nghiên cứu trong nước

Trong các tính trạng phẩm chất cơm, amylose được xem là tính trạng có ý nghĩa quyết định đến sự mềm cơm và ngược lại (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2004) Hàm lượng amylose trong phôi nhũ của gạo là chìa khóa quyết định đến chất lượng gạo Hàm lượng amylose chịu ảnh hưởng trong thời kỳ chín hạt

Bảng 2.4: Phân loại gạo dựa vào hàm lượng amylose (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)

ít hút nước, ít nở trong lúc nấu và cơm có độ bóng cao Tất cả các mẫu giống Basmati của Ấn độ và Pakistan, giống Sadri được xếp chung vào nhóm có hàm lượng amylose trung bình

Nghiên cứu di truyền hàm lượng amylose trên quần thể BC2F2 của cặp lai IR64/Hoa Lài của Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2004), cho kết quả như sau: hàm lượng amylose do gen định vị trên NST số 5 và số 6 kiểm soát Sử dụng chỉ thị

Wx phát hiện gen wx trong quần thể BC2F2 có biến thiên kiểu gen là 12%, trong đó 40% biến thiên đồng hợp tử và 60% biến thiên do dị hợp tử Kết quả tần số của IR64 là 12% và Hoa Lài là 28,58% Tần suất con lai 60% nghiêng về cả bố lẫn mẹ

QTL giải thích biến thiên kiểu gen wx là 17,8% Đối với cặp lai

IR64/KhaoDawkMali105 có kết quả như sau: 98% biến thiên đồng hợp tử, 2% biến thiên dị hợp tử Kết quả tần số alen của IR64 là 47,6% tần số alen của

KhaoDawkMali105 là 51,58% QTL giải thích biến thiên kiểu gen wx là 19,7%