PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 11 GIỐNG MÈ (Sesamum indicum L.) THU THẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH KHU VỰC BẮC VÀ TRUNG BỘ SỬ DỤNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ SSR

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism Kỹ thuật đa hình về chiều dài các đoạn DNA được nhân bản ANOVA: analysis of variance Phân tích biến lượng AMOVA:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH H

PHẠM HỮU HOÀNG

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 11 GIỐNG

MÈ (Sesamum indicum L.) THU THẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH

HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ SSR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thàn ph Hồ ChíMinThán 03/201

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH H

**********************

PHẠM HỮU HOÀNG

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 11 GIỐNG

MÈ (Sesamum indicum L.) THU THẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 11 GIỐNG

MÈ (Sesamum indicum L.) THU THẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH

KHU VỰC BẮC VÀ TRUNG BỘ SỬ DỤNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ SSR

PHẠM HỮU HOÀNG Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: TS Võ Thái Dân

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

2 Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Thị Lang

Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

3 Phản biện 2: TS Nguyễn Hữu Hổ

Viện Sinh Học Nhiệt đới

4 Thư ký: TS Phạm Đức Toàn

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

5 Ủy viên: TS Bùi Minh Trí

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

Tốt nghiệp Đại học ngành Nông học, hệ tại chức tại Đại học Nông Lâm TP

Hồ Chí Minh Sau đó làm việc tại Công ty Cổ phần Cao su Phước Hòa, huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương

Tháng 9 năm 2008 theo học Cao học ngành Trồng trọt tại Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh

Tình trạng gia đình:

Năm kết hôn: 2008

Vợ: Cao Minh Thủy Nguyên

Địa chỉ liên lạc: Ấp 1A xã Phước Hòa, huyện Phú Giáo, tỉnh Bình Dương Điện thoại cá nhân: 0985661981

Email: huuhoang58@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của tôi Các số liệu, kết quả được nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được bất cứ ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Các Thầy Cô trong Khoa Nông học cùng các Thầy Cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt 2 năm Cao học vừa qua, cám ơn các Thầy Cô đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:

TS Bùi Minh Trí đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như tạo điều kiện tốt nhất cho việc thực hiện và hoàn tất đề tài tốt nghiệp

ThS Võ Thị Thúy Huệ đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Các anh chị trong Trung tâm Phân tích Hóa sinh đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Chương trình hợp tác nghiên cứu Việt Nam – Thụy Điển (SIDA/SAREC) đã

hỗ trợ tài chính thực hiện đề tài này

Gia đình, các bạn lớp Cao học 2008 đã chia sẻ, góp ý và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

TP HCM, tháng 03 năm 2012

Phạm Hữu Hoàng

TÓM TẮT

Đề tài ” “Phân tích tính đa dạng di truyền của 11 giống mè (Sesamum

indicum L.) thu thập tại một số tỉnh khu vực Bắc và Trung bộ sử dụng đặc điểm

hình thái và chỉ thị SSR” đã được tiến hành tại khu thực nghiệm trường Cao đẳng Nông nghiệp Nam bộ, tỉnh Tiền Giang và tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, từ tháng 03/2010 đến tháng 10/2010

Bố trí thí nghiệm ngoài đồng cho 11 mẫu giống mè thu thập từ các tỉnh khu vực Bắc và Trung bộ Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên một yếu tố với 11 nghiệm thức, 3 lần lặp lại Theo dõi và ghi nhận các số liệu về đặc điểm hình thái, sử dụng phần mềm Microsoft excel, Statgraphics 7.0 phân tích số liệu và phần mềm Ntsyspc 2.1 xây dựng cây phân nhóm di truyền dựa trên các đặc điểm hình thái

Phân tích đa dạng di truyền của 11 giống mè thí nghiệm với 10 cặp mồi SSR

Sử dụng phần mềm Popgene 1.32 để phân tích các chỉ số đa dạng di truyền Xây dựng cây phân nhóm di truyền theo phương pháp UPGMA bằng phần mềm Ntsyspc 2.1 kết hợp phân tích độ tin cậy của sự phân nhóm thông qua hệ số Bootstrap

Kết quả cho thấy:

Có sự khác biệt rõ rệt về các đặc điểm hình thái giữa 11 mẫu giống mè (p<0,05), trừ chỉ tiêu về ngày thu hoạch (p>0,05)

Kết quả xây dựng cây phân nhóm di truyền dựa vào các đặc điểm hình thái

đã phân 11 mẫu giống mè thí nghiệm làm 2 nhóm lớn: Nhóm 1 bao gồm 2 giống mè 112TH và 121NB Nhóm 2 bao gồm các giống mè còn lại

Sử dụng 10 cặp mồi phát hiện các marker SSR, kết quả thu được 54 băng, đều là các băng đa hình

Kết quả phân tích cho thấy chỉ số đa hình (PIC) của các mồi dao động trong khoảng từ 0,16 đến 0,85, trung bình 0,57 Trong đó, mồi Sesame-09 cho PIC cao

nhất (0,85), còn mồi GBssr-sa-33 cho PIC thấp nhất (0,16) Chỉ số Nm dao động trong khoảng từ 0,0 – 0,46, trung bình 0,13 Chỉ số dị hợp tử HE nằm trong khoảng 0,17 – 0,86, trung bình 0,59

Trắc nghiệm AMOVA phân tích sự biến động di truyền cho thấy phần trăm biến động di truyền giữa 11 giống mè thí nghiệm khá cao (65,77%), biến động di truyền trong mỗi mẫu giống mè khá thấp (34,23%)

Cây phân nhóm di truyền dựa vào chỉ thị SSR chia 11 giống mè làm 2 nhóm: Nhóm 1 gồm giống 66NL, 162ND, 112TH, 121NB, 119HD, 143TB Nhóm

2 bao gồm 5 giống còn lại

SUMMARY

The study "Analysis of genetic diversity of eleven sesame accessions

(Sesamum indicum L.) collected from Northern and Central Viet Nam using

morphological and SSR markers" was carried out at the reseach station of Southern Agricultural College in Tien Giang and at Plant Biotechnology Department, Reseach Insitute of Biotechnology and Environment, Nong Lam University in Ho Chi Minh City Experiments were carried out from March 2010 to October 2010

Eleven sesame accessions used in this study were collected from various regions in Northern and Central Viet Nam The trial layout was based on Randomized Completely Block Design with three replications The data were calculated using Microsoft Excel, Statgraphics 7.0 and Ntsyspc 2.1 sofware while phylogenetic relationship between accessions were estimated using group average cluster analysis

Ten SSR markers were used to estimated genetic diversity of the 11 sesame accessions Genetics variation and genetic structure were computed with the Popgen sofware version 1.32 UPGMA dendrogram was built by using Ntsyspc 2.1 sofware

Results indicated that:

The ontained results indicated that among eleven sesame accessions, there were significant differences between the accessions for almost characters (p< 0.05), except the harvest date (p > 0.05)

Cluster analysis for phylogenetic relationship between accessions showed that sesame accessions grouped into two main clusters: the first group consisted 112TH and 121NB, while the second group included all of the remaining accessions

SSR analysis with ten primers gave 54 amplicons, rate of polymorphics was 100% The polymorphism informaton contents (PIC) of markers varied from 0.16 to 0.85 with an average of 0.57 The marker Sesame-09 revealed a highest PIC of 0.85,

while the marker GBssr-sa-33 had the lowest PIC of 0.16 Gene flow (Nm) was found of 0.13 on average and ranged from 0.0 – 0.46 Expected heterozygosity (HE) ranged from 0.17 to 0.86 with a mean of 0.59

The results from analysis of molecular variance (AMOVA) of 11 sesame accessions displayed a high percentage of genetic variation among populations (65.77%) and percentage of genetic variation within population was as low as 34.23%

Dendrogram based on UPGMA analysis group 11 sesame accessions into two main groups Group 1 included 6 accessions (66NL, 162ND, 112TH, 121NB, 119HD, 143TB) Group 2 included all of the remaining accessions

MỤC LỤC

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm tạ iv

Tóm tắt v

Mục lục ix

Danh sách các chữ viết tắt xiii

Danh sách các bảng xv

Danh sách các hình xvi

Danh sách các biểu đồ xvii

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Giới hạn khóa luận 2

2 TỔNG QUAN 3

2.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây mè 3

2.2 Phân loại và đặc điểm thực vật học của cây mè 3

2.3 Công dụng và giá trị kinh tế 4

2.3.1 Công dụng 4

2.3.1.1 Hạt mè 4

2.3.1.2 Dầu mè 4

2.3.2 Giá trị dinh dưỡng 4

2.4 Tình hình sản xuất mè trên thế giới và Việt Nam 5

2.5 Yêu cầu về điều kiện ngoại cảnh của cây mè 7

2.5.1 Điều kiện nhiệt độ 7

2.5.2 Điều kiện ánh sáng 7

2.5.3 Yêu cầu về lượng nước 7

2.5.4 Cao độ 8

2.5.5 Gió 8

2.5.6 Đất đai 8

2.5.7 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mè 9

2.6 Công tác nghiên cứu giống mè ở Việt Nam và thế giới 10

2.6.1 Công tác nghiên cứu giống mè ở Việt Nam 10

2.6.2 Công tác nghiên cứu giống mè ở thế giới 11

2.7 Đa dạng di truyền, một số phương pháp nghiên cứu 13

2.7.1 Đa dạng di truyền và bảo tồn đa dạng di truyền 13

2.7.2 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 14

2.7.2.1 Phương pháp chỉ thị hình thái 14

2.7.2.2 Phương pháp chỉ thị isozyme 14

2.7.2.3 Phương pháp dùng chỉ thị phân tử 15

2.8Giới thiệu về kỹ thuật PCR 15

2.8.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 15

2.8.2 Các thành phần và việc tối ưu hóa phản ứng PCR 17

2.8.2.1 DNA mẫu 17

2.8.2.2 Taq polmerase 17

2.8.2.3 Primer 18

2.8.2.4 Nhiệt độ bắt cặp 19

2.8.2.5 Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu 20

2.8.2.6 Các thành phần khác 21

2.8.3 Các chỉ thị phân tử đánh giá sự đa dạng di truyền 22

2.8.3.1 Chỉ thị RFLP 22

2.8.3.2 Chỉ thị AFLP 23

2.8.3.3 Chỉ thị RAPD 24

2.8.3.4 Microsatellite 24

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thời gian và địa diểm 29

3.2 Nội dung 1: Khảo sát các đặc điểm hình thái 29

3.2.1 Vật liệu 29

3.2.2 Bố trí thí nghiệm 30

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

3.2.3.1 Ghi nhận các đặc điểm hình thái 31

3.2.3.2 Phân tích số liệu 32

3.3 Nội dung 2: Khảo sát đa dạng di truyền 11 mẫu giống mè trồng thực nghiệm bằng kỹ thuật SSR 33

3.3.1 Vật liệu 33

3.3.2 Hóa chất và thiết bị dụng cụ dùng trong phản ứng SSR 33

3.3.2.1 Hóa chất 33

3.3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 34

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu 35

3.3.3.1 Giai đoạn 1 35

3.3.3.2 Giai đoạn 2 36

3.3.3.3 Giai đoạn 3 36

3.3.4 Quy trình ly trích DNA 36

3.3.5 Định tính sản phẩm bằng kỹ thuật điện di 37

3.3.6 Định lượng sản phẩm sử dụng máy quang phổ kế 37

3.3.7 Quy trình phản ứng microsatellite 38

3.3.7.1 Phản ứng PCR với 1 cặp primer 38

3.3.7.2 Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer 39

3.3.8 Phương pháp phân tích bằng máy giải trình tư DNA 39

3.3.9 Phân tích đa dạng di truyền 40

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm hình thái 11 giống mè 41

4.1.1 Chiều cao cây, độ dài lóng 42

4.1.2 Sự phát triển số nhánh và số lá 43

4.1.3 Sự hình thành trái 45

4.1.4 Các tính trạng liên quan đến năng suất các giống mè 46

4.1.5 Xây dựng cây phân nhóm dựa vào các tính trạng hình thái 48

4.2 Nội dung 2: Khảo sát đa dạng di truyền 11 mẫu giống mè trồng thực nghiệm bằng kỹ thuật SSR 49

4.2.1 Kết quả điện di trên máy giải trình tự ABI3100 49

4.2.2 Đánh giá mối quan hệ di truyền của 11 mẫu giống mè thí nghiệm 51

4.2.3 Đánh giá sự biến thiên trong quần thể các giống mè 53

4.2.4 Đánh giá sự đa dạng gen của các giống mè thí nghiệm 54

5 KẾT QUẢ VÀ ĐỀ NGHỊ 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Đề nghị 58

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

7 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism (Kỹ thuật đa hình về chiều dài các đoạn DNA được nhân bản)

ANOVA: analysis of variance (Phân tích biến lượng)

AMOVA: The Analysis of Molecular Variance (phân tích nguồn biến lượng phân tử)

ASPAC: The Australasian Soil & Plant Analysis Council (Hội đồng phân tích đất

và cây trồng Úc)

Ave-HE: Average Heterozygosity (chỉ số dị hợp tử trung bình)

bp: base pair (cặp bazơ)

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

EB: Extraction Buffer (dịch trích)

EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông Lương Thế giới)

H: Shannon’s Information index (Chỉ số Shannon)

HE: Expected heterozygosity (Hệ số dị hợp tử mong đợi)

HO: Observed Heterozygosity (Hệ số dị hợp tử quan sát)

Na: Number of Alleles (Số alen)

Ne: Effective Number of Alleles (Số allen thực tế)

Nm: Gene Flow Estimated from Gst (Dòng chảy gen hay Di nhập gen)

NSG: Ngày sau gieo

NTSYS: Numercial Taxonomy System

OD: Optical Density (Mật độ quang)

PCI: Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25 : 24 : 1)

PCA: Principal Coordinate Analysis

PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng nhân bản DNA)

PIC: Polymorphism Information Content (Chỉ số đa hình)

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình DNA các đoạn DNA được

nhân bản ngẫu nhiên)

RCBD: Randomized Complete Block Design (Kiểu bố trí thí nghiệm khối hoàn

toàn ngẫu nhiên)

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt giới hạn)

SDS : Sodium Dodecyl Sulfat

SSCP: Single Strand Conformation Polymophism (Đa hình trong mạch đơn của DNA)

SSRs: Simple Sequence Repeats (Đoạn trình tự lặp lại đơn giản)

Ta: Annealing temperature (Nhiệt độ bắt cặp)

Taq-polymerase: Thermus aquaticus polymerase

TBE: Tris – borate – EDTA

TE: Tris – EDTA

Tm: Melting temperature (Nhiệt độ nóng chảy)

UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic (Phương pháp tính

khoảng cách trung bình với giá trị số đại số)

WWF: World Wildlife Fund (Quỹ quốc tế bảo vệ thiên nhiên)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Diện tích, sản lượng và năng suất mè 6

Bảng 2.1 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây mè 9

Bảng 3.1: Danh sách các mẫu giống mè sử dụng trong thí nghiệm 30

Bảng 3.2: Các chỉ tiêu theo dõi và cách thu thập số liệu ngoài đồng 31

Bảng 3.3: Các primer microsatellite dùng trong thí nghiệm 35

Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR với 1 primer 38

Bảng 3.5: Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR 38

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng trên máy giải trình tự DNA 39

Bảng 4.1: Kết quả thống kê về chiều cao cây, số nhánh và độ dài lóng của 11 mẫu giống mè 42

Bảng 4.2 Sự phân nhánh và lá của của 11 giống mè 43

Bảng 4.3: Sự phát triển của hoa và trái của 11 giống mè 45

Bảng 4.4 Các chỉ tiêu liên quan đến năng suất 47

Bảng 4.5: Sản phẩm khuyếch đại của 10 primer 50

Bảng 4.6: Hệ số tương đồng di truyền của các giống mè nghiên cứu 51

Bảng 4.7: Kết quả phân tích biến động di truyền (AMOVA) của 11 giống mè53 Bảng 4.8: Kết quả phân tích bằng phần mềm POPGENE 1.32 55

Bảng 4.9 Khoảng cách di truyền và đồng dạng di truyền các giống mè 55

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30

Hình 4.1: Thử tỷ lệ nảy mầm trong đĩa petri và trong bầu đất 41

Hình 4.2 Đất được cải tạo và xử lý thuốc diệt cỏ trước khi bố trí thí nghiệm 42 Hình 4.3: Sự phân nhánh ít (A, B) phân nhánh nhiều (C, D) của các giống mè 44

Hình 4.4: Phân nhóm 11 giống mè dựa trên các chỉ tiêu hình thái 49

Hình 4.5: Phân nhóm 11 mẫu giống mè dựa trên các chỉ thị SSR 52

Hình 4.6: Phân nhóm 3D 11 mẫu giống mè dựa trên các chỉ thị SSR 53

………

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây mè (Sesamum indicum L.) hay còn gọi là cây vừng, là một loại cây trồng

có dầu quan trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có nguồn gốc từ châu Phi, là loại cây có dầu được trồng vào khoảng 2000 năm trước công nguyên Mè sớm phát triển ở vùng phía Tây châu Á, đến Ấn Độ, Trung Quốc và Nhật Bản Những nơi này được xem như là trung tâm phân bố của cây mè

Hiện nay cây mè đã được trồng rộng rãi khắp nơi, chúng có nhiều công dụng trong chế biến thực phẩm, đem lại nhiều lợi ít cho người canh tác Ngoài ra mè còn được ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm và kỹ nghệ Những lợi ích của cây mè đối với sức khỏe con người đang được quan tâm và đánh giá lại Do đó việc gia tăng diện tích canh tác cũng như nâng cao kỹ thuật trồng mè ngày càng được phát triển ở Việt Nam

Tuy nhiên, do hình thức canh tác hiện nay chủ yếu là quảng canh, đầu tư cho nghiên cứu và ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất mè còn chưa đúng mức, nên năng suất mè nước ta vẫn còn thấp chưa đạt hiệu quả kinh tế cao Thêm vào đó thông tin về tài nguyên di truyền cây mè ở nước ta còn giới hạn, chỉ có một vài nghiên cứu về đa dạng kiểu hình Do đó việc xác định đa dạng di truyền ở phạm vi rộng các giống mè có ý nghĩa cho các chương trình nghiên cứu và quản lý nguồn gen đối với cây mè

Các kỹ thuật được sử dụng để đánh giá di truyền chủ yếu là các chỉ thị phân

tử và sử dụng phổ biến nhất là các kỹ thuật dựa vào kỹ thuật PCR như: RAPD, AFLP, RFLP, SSRs Những kỹ thuật này đều có ưu, khuyết điểm riêng, nhưng

chúng đều có tiềm năng xác định đa hình dựa vào sự khác biệt của sản phẩm DNA được khuyếch đại và có thể sử dụng ở bất cứ giai đoạn phát triển nào của cây trồng

SSR là một công cụ đắc lực để giải quyết vấn đề như định danh, phát hiện những cây bị mất lai lịch và đánh giá mức độ đa dạng di truyền của cây Do đó tìm hiểu thông tin về khoảng cách di truyền của tài nguyên giống là một chỉ tiêu quan trọng trong quá trình chọn tạo giống vì khi các cặp cha mẹ có độ đồng nhất di truyền cao sẽ làm hạn chế tính ưu thế lai

Trên cở sở đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và thực hiện đề tài: “Phân

tích tính đa dạng di truyền của 11 giống mè (Sesamum indicum L.) thu thập tại

một số tỉnh khu vực Bắc và Trung bộ sử dụng đặc điểm hình thái và chỉ thị SSR”

Ly trích DNA từ mẫu lá với độ tinh khiết cao

Xây dựng quy trình PCR ổn định đối với 10 primers

Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền giữa các giống mè khảo sát qua hình thái và phân tích microsatellite bằng máy giải trình tự

Mô tả được quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các giống mè khảo sát

1.4 Giới hạn khóa luận

Chỉ nghiên cứu giới hạn ở 11 giống mè, nên kết quả phân tích đa dạng di truyền còn ở phạm vi hẹp

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây mè

Cây mè có tên khoa học là Sesamum indicum L, có nguồn gốc từ châu Phi, là

loại cây có dầu được trồng rất lâu đời Mè sớm phát triển ở vùng phía Tây châu Á, đến Ấn Độ, Trung Quốc và Nhật Bản Những nơi này được xem như là trung tâm phân bố của cây mè

Hiện nay, mè đã được gieo trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và thông qua việc chọn tạo giống thì một số giống có thể trồng thích hợp ở một số nước ôn đới (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.2 Phân loại và đặc điểm thực vật học của cây mè

Cây mè thuộc bộ Tubiflorae, họ Pedaliacea, trong đó có 16 chi và khoảng 60

loài Trên thế giới giống Sesamum gồm hơn 20 loài, mè được trồng là Sesamum

indicum L có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 26, ngoài ra còn có S capennsen, S

Mè có nhiều giống và giống khác nhau về thời gian sinh trưởng, màu sắc của hạt và dạng cây Hiện nay phân loại giống mè dựa vào những đặc tính thực vật như sau (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006):

Dựa vào thời gian sinh trưởng phân loại giống có thời gian sinh trưởng dài ngày hoặc giống sinh trưởng ngắn ngày Cách phân loại này quan trọng khi chọn giống để luân canh với cây trồng khác như lúa, bắp, đậu, khoai

Dựa vào số khía trên trái mè phân loại các giống mè bốn khía, sáu khía, tám khía, phân loại này cho phép chọn cỡ hạt

Dựa vào trái bị nứt khi thu hoạch hay không bị nứt, phân loại này giúp dự

Dựa vào màu hạt đây là cách phân loại phổ biến nhất Phân biệt hai loại mè:

mè đen (Sesamum indicum L.) và mè trắng (Sesamum orientale L.) (Phạm Đức Toàn, 2008)

Ngoài các cách phân loại trên, người ta còn phân loại mè theo thời vụ trồng,

số hoa ở nách lá, sự phân cành trên thân

2.3 Công dụng và giá trị kinh tế

2.3.1 Công dụng

2.3.1.1 Hạt mè

Hạt mè được sử dụng rất phổ biến để chế biến nhiều dạng thức ăn (kẹo

mè, chè mè) Trong dân gian, hạt mè còn dùng mè để nấu cháo (nếp với mè) cho người mẹ cho con bú rất tốt

2.3.1.2 Dầu mè

Dầu mè tiêu thụ nhiều nhất, có chất lượng tốt, khác với các loại dầu khác

là ít bị oxy hóa nên không chuyển thành mùi khó chịu Vì trong dầu mè có chứa chất sesamol, ngăn cản quá trình oxy-hóa

Trong kỹ nghệ, dầu mè sử dụng để bôi trơn máy móc cao cấp: máy bay, máy dùng trong khoa học kỹ thuật, dầu dùng để pha sơn, pha vecni rất tốt vì có màu láng bóng

Trong y học, dùng để làm thuốc viên con nhộng Dầu mè còn dùng trong

mỹ phẩm, ở Ấn Độ, người ta còn dùng dầu mè để bôi vào tóc cho bóng mượt

2.3.2 Giá trị dinh dưỡng

Mè có giá trị dinh dưỡng cao, trong hạt mè có chứa: 45 - 55% dầu, 19 - 20% protein, 8 - 11% đường, 5% nước, 4 - 6% chất tro Thành phần axit hữu cơ chủ yếu của dầu mè là 2 loại acid béo chưa no sau (Ashri, 1989):

Axit oleic (C18 H34 O2): 45,3 - 49,4%

Axit linoleic (C18 H32 O2): 37,7 - 41,2%

Nếu so sánh hàm lượng acid amin có trong bột mè và trong thịt, ta thấy các acid amin có trong bột mè gần tương đương với acid amin có trong thịt

2.4 Tình hình sản xuất mè trên thế giới và Việt Nam

Trước thế chiến thứ hai, diện tích trồng mè trên thế giới từ 5 triệu ha vào năm 1939, đạt sản lượng 1,5 tấn, trong đó Ấn Độ là quốc gia trồng nhiều nhất với diện tích 2,5 triệu ha, kế đó là Trung Quốc 1,5 triệu ha, Miến Điện 700.000 ha, Mehico 200.000 ha Năm 2008, diện tích cây mè 7,5 triệu ha, năng suất bình quân 0,47 tấn/ha Trong đó Ethiopia 1,85 triệu ha, Ấn Độ có diện tích 1,75 triệu ha, Myanmar 1,58 triệu ha (FAO, 2008)

Ở nước ta mè được trồng nhiều ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Miền Đông Nam Bộ và Trung Bộ (riêng tỉnh An Giang, diện tích trồng mè hiện nay tăng lên đến 16.000 ha) Mè được trồng lâu đời nhất là ở Miền Bắc, nhưng diện tích không mở rộng được vì điều kiện khí hậu và đất đai không thích hợp cho cây trồng phát triển

Theo Tổng cục thống kê (2004), diện tích trồng mè cả nước khoảng 40.800

ha, trong đó các tỉnh phía Nam 25.600 ha, phía Bắc 15.200 ha, vùng trồng nhiều nhất là Bắc Trung Bộ (13.500 ha) Tổng sản lượng trung bình cả nước gần 21.000 tấn, năng suất trung bình cả nước khoảng 0,5 tấn/ha nhiều nhất ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long 0,9 tấn/ha (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007) Tại vùng Châu Phú - An Giang, năng suất đạt từ 400 - 600kg/ha Nếu áp dụng biện pháp thích hợp, năng suất mè có thể đạt 1 tấn/ha Các tỉnh đang trồng mè nhiều ở Đồng Bằng Sông Cửu Long là: Cần Thơ (4.700 ha), Đồng Tháp (1.200 ha),

An Giang (600 ha), Long An (400 ha) (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006) Hiện nay, tuy với diện tích không nhiều, mè đã được trồng khắp các châu lục trên thế giới Sản lượng mè hàng năm trên thế giới theo công bố của FAO (2006) là hơn 3 triệu tấn.Trong đó chủ yếu là châu Á chiếm gần 60%, còn lại là châu Mỹ, châu Phi Các nước trồng mè nhiều là Ấn Độ, Trung Quốc, Sudan, Mexico, sau đó

là Myanmar, Thái Lan, Nigeria, Colombia Năng suất trung bình trên thế giới khoảng 0,3 - 0,4 tấn/ha Ở Mỹ năng suất mè vùng Texas lên tới 2 tấn Trung Quốc 1 tấn/ha Ở Trung Quốc, Thái Lan mè là cây có giá trị xuất khẩu cao (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Về sản xuất, cây mè có khả năng thích ứng rộng, dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, rất thích hợp trong việc thâm canh tăng vụ, nâng cao thu nhập trên một đơn vị diện tích đất, nhất là trên đất trồng lúa Nhu cầu dầu mè trên thế giới ngày càng tăng cũng tạo điều kiện tốt cho việc mở rộng trồng mè trong thời gian tới (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Bảng 2.1 Diện tích, sản lượng và năng suất mè trên thế giới và Việt Nam 2008

(FAOSTAT, 2009)

Quốc gia Diện tích (ha) Sản lượng (tấn) Năng suất (tấn/ha) Châu Á 4.107.825 2.428.190 0,59

Afghanistan 47.000 32.000 0,68 Bangladesh 32.932 28.461 0,86 Campuchia 35.874 27.286 0,76 Trung Quốc 472.460 586.408 1,24

Ấn Độ 1.700.000 640.000 0,38 Iran 40.000 28.000 0,70 Iraq 16.300 18.222 1,12 Hàn Quốc 28.794 19.472 0,68 Lào 10.235 8.658 0,85 Myanmar 1.431.000 853.390 0,60 Pakistan 90.639 40.997 0,45 Thái Lan 59.137 44.290 0,75 Turkey 28.589 20.338 0,71 Uzbekistan 29.498 18.518 0,63 Việt Nam 45.000 23.000 0,51 Yemen 22.212 23.895 1,08

Châu Mỹ 258.211 156.182 0,60 Châu Phi 3.040.467 1.241.280 0,41 Thế giới 7.406.757 3.827.112 0,52

2.5 Yêu cầu về điều kiện ngoại cảnh của cây mè

2.5.1 Điều kiện nhiệt độ

Vì cây mè có nguồn gốc nhiệt đới nên nhiệt độ trung bình thích hợp khoảng

25 – 300C Nhiệt độ thích hợp cho hạt nảy mầm, sinh trưởng, các bộ phận dinh dưỡng và sự hình thành hoa khoảng 25 - 270C Nhiệt độ thích hợp cho sự nở hoa và

sự phát triển quả vào khoảng 28 - 320C Nếu nhiệt độ dưới 200C kéo dài thời gian nảy mầm Nhiệt độ dưới 180C sẽ gây khó khăn cho sự phát triển và nếu nhiệt độ dưới 100C cây ngừng phát triển và chết Thời kỳ quả chín gặp nhiệt độ thấp sẽ giảm

tỉ lệ và chất lượng dầu của hạt (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Nhiệt độ trên 400C vào thời gian ra hoa sẽ cản trở sự thụ phấn, thụ tinh, tăng

tỷ lệ hoa rụng và do đó làm giảm số hoa

2.5.2 Điều kiện ánh sáng

Mè là cây ngày ngắn Trong điều kiện thời gian chiếu sáng dưới 10 giờ/ngày

sẽ rút ngắn thời gian sinh trưởng của mè Mè sẽ ra hoa sớm hơn bình thường 15 - 20 ngày trong điều kiện tự nhiên (12 giờ/ngày)

Cường độ ánh sáng, số giờ nắng trong ngày ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất mè Trong thời gian sinh trưởng, nhất là sau khi trổ hoa, mè cần khoảng 200 -

300 giờ nắng/tháng cho đến khi trái chín

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy: cường độ ánh sáng trong thời gian kết quả đến khi chín vào khoảng 28.000 lux là thích hợp nhất cho quá trình hình thành dầu Hàm lượng dầu trong hạt giảm 8% nếu cường độ ánh sáng giảm xuống 7000 lux (Trần Thị Kim Ba, 2003)

2.5.3 Yêu cầu về lượng nước

Nước là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến năng suất mè Mè tương đối chịu hạn nhưng cho năng suất thấp khi đất có ẩm độ dưới 70% Mè ít cần nước mưa, mè cho năng suất cao ở lượng mưa 500 - 650 mm Trong điều kiện có tưới tổng lượng nước cần lên tới 900 - 1000 mm

Mè yêu cầu lượng nước phân bố đều trong vụ: thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng 34%, thời kỳ ra hoa kết quả 45%, và thời kỳ chín là 21% Độ ẩm đất thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển và cho năng suất của mè khoảng 70 - 80%

Mưa lúc thu hoạch sẽ làm giảm phẩm chất mè do bệnh Mè rất dễ mẫn cảm với nước, nếu mưa liên tục sẽ làm cây đổ ngã và chết Trong lúc gieo hạt mưa nhiều hạt sẽ không nảy mầm (Trần Thị Kim Ba, 2003)

2.5.4 Cao độ

Cây mè thích hợp ở độ cao dưới 1,250 m Nếu cây mè trồng ở vùng cao hơn thì thường cây nhỏ, không phân cành, chỉ có một hoa dưới nách lá do đó năng suất thấp Ở Ấn Độ và Venezuela, người ta thấy rằng cùng một giống nếu đem trồng ở nhiều độ cao khác nhau thì càng lên cao năng suất càng giảm (Trần Thị Kim Ba, 2003)

2.5.5 Gió

Mè rất dễ bị thiệt hại do gió mạnh, nhất là khi thân chính phát triển, gió cũng làm mất hạt khi trái bị nứt Khi chọn thời vụ trồng mè người ta thường tránh thời gian mưa to gió lớn Ở Pháp người ta không trồng mè ở miền nam do vùng này có gió mạnh Ở thung lũng Kasmia của Ấn Độ mè bị thiệt hại nặng do gió mạnh từ miền núi thổi qua Do đó khi canh tác thường chọn những giống có lóng ngắn, thân ngắn cho nhiều trái, và phải chú ý vun gốc cho cây (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.5.7 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mè

Theo Langham (2008), chu kỳ sinh trưởng của mè chia làm 11 giai đoạn trong 4 pha chính: pha sinh trưởng, pha sinh sản, pha chín và pha khô Ở mỗi giai đoạn sẽ có dấu hiệu kết thúc và những điểm cần chú ý trong quá trình canh tác mè, thời gian kết thúc ở các giai đoạn sẽ khác nhau tùy vào giống mè

Bảng 2.2: Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển cây mè (Langham, 2008)

STT Pha/giai đoạn Dấu hiệu kết thúc Ghi chú

I Pha sinh trưởng

1 Giai đoạn nảy

mầm

Khi hạt ló lên khỏi đất

Gieo khi nhiệt độ thấp khoảng

220C Đợi khoảng 7 ngày, chú ý theo dõi mặt đất sau mưa

2 Giai đoạn cây

mầm

Cặp lá thật thứ 3

có chiều dài bằng cặp thứ 2

Khó nhìn thấy, tăng trưởng rất chậm, khó chăm sóc cần kiên nhẫn, tránh ẩm ớt nhưng không

để cây mầm quá khô

3 Giai đoạn cây con Ra nụ hoa đầu tiên Có thể kiểm soát tăng trưởng,

tưới nước đều nhưng không quá nhiều có thể gây stress

4 Giai đoạn tiền

5 lóng thân có trái Cung cấp nước phân bón, hoa trổ

sớm và rụng vào buổi chiều

6 Giai đoạn trổ hoa

giữa

Nhánh ngừng trổ hoa

Hơn 70% hoa trổ vào 2 tuần đầu tiên của giai đoạn này

7 Giai đoạn trổ hoa

cuối

90% cây không trổ hoa nữa

Tưới lần cuối, lá nhạt bắt đầu rụng

Có thể thu hoạch ở cuối giai đoạn này

10 Giai đoạn khô ban

2.6 Công tác nghiên cứu giống mè ở Việt Nam và thế giới

2.6.1 Công tác nghiên cứu giống mè ở Việt Nam

Ở Việt Nam, so với các giống cây trồng khác thì những tiến bộ kỹ thuật về giống mè còn rất hạn chế, số giống mè chọn tạo được áp dụng trong sản xuất không nhiều Ngược lại các giống mè địa phương lại rất phong phú Điều này có thể do cây mè chưa được xem như một cây trồng chính nên những đầu tư trong nghiên cứu

và ứng dụng tiến bộ kỹ thuật vào sản xuất mè còn rất hạn chế và có thể xem đây là một trong những trở ngại chính đối với phát triển sản xuất mè trong thời gian qua (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

Những năm gần đây, công tác này đã được quan tâm nhiều hơn nhằm góp phần thúc đẩy phát triển sản xuất mè ở nhiều địa phương trong cả nước Sự thay đổi

về diện tích gieo trồng thể hiện rõ nhất ở các tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ và đồng bằng sông Cửu Long Diện tích mè cả nước năm 2007 là 44,7 ngàn ha: khu vực phía Nam là 31,9 ngàn ha (71,4%), khu vực Bắc Trung Bộ (11,1 ngàn ha), Đông Nam

Bộ (9,8 ngàn ha), đồng bằng sông Cửu Long (9,8 ngàn ha), Duyên Hải Nam Trung

Bộ (8,5 ngàn ha) Năng suất mè trung bình cả nước là 6,7 tạ/ha Và theo xu hướng

đa dạng hóa cây trồng trên nền đất lúa thì chắc chắn mè là một trong những cây

trồng cạn ngắn ngày có nhiều cơ hội phát triển trong thời gian tới (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

Phạm Đức Toàn và ctv (2008) đã sử dụng 10 chỉ thị phân tử RAPD nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên 22 giống mè ở Việt Nam và Campuchia, kết quả cho thấy có sự đa dạng cao giữa các giống mè nghiên cứu (10 chỉ thị phân tử RAPD cho tổng cộng 107 sản phẩm khuếch đại, trong đó có 88 sản phẩm thể hiện sự đa hình (chiếm 83%))

Bằng cách chiếu xạ tia gamma (Co60) trên cây mè đen, các nhà nghiên cứu Việt Nam đã tạo ra được giống mè đột biến với tính trạng có lợi như nhiều quả, không giảm chất lượng dầu trong mè Đối với biến dị nhiều trái, nghiên cứu cho thấy, đây là loại biến dị có triển vọng theo hướng lai tạo để tạo ra giống mè mới (Đoàn Phạm Ngọc Ngà, 2008)

2.6.2 Công tác nghiên cứu giống mè ở thế giới

Ercan và ctv (2004) đã sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích đa dạng di truyền

trên 38 giống mè (Sesamum indicum L.) ở 4 vùng địa lý khác nhau thuộc Thổ Nhĩ

Kỳ Nghiên cứu thu được tổng cộng 61 băng, trong đó có 78% là băng đa hình Phân tích biến động quần thể (AMOVA) cho thấy phần trăm biến động giữa các quần thể rất cao (91,90%), đồng thời các chỉ số Shannon's index cho thấy có sự đa dạng di truyền rất cao giữa các giống thuộc vùng Đông Bắc Thổ Nhĩ Kỳ và sự đa dạng thấp hơn giữa các giống ở vùng Tây Nam Thổ Nhĩ Kỳ

Dixit và ctv (2005) đã chọn lọc từ ngân hàng gen cây mè (Sesamum indicum

L.) 50 trình tự SSR, sau khi khảo sát, Dixit đã chọn sử dụng 10 trình tự SSR để xác định đa dạng di truyền giữa 16 giống mè ở Hàn Quốc Nghiên cứu thu được các đoạn khuếch đại có kích thước 150 - 307 bp, số allel/locus dao động trong khoảng 3 – 6, trung bình 4,6 allel/locus

Salazar và ctv (2006) đã dùng kỹ thuật RAPD để đánh giá đa dạng di truyền

2 giống mè thương mại (Fonucla, UCLA-1) và 7 dòng mè (UCLA-249, UCLA-295, UCLA-37-1, UCLA-65, UCLA-83, UCLA-90, UCLA-2) có nguồn gốc từ

Venezuela Nghiên cứu kết luận có 94 band đa hình khi sử dụng 12 mồi ngẫu nhiên với mức độ đa hình cao

Laurentin và ctv (2006) đã tiến hành nghiên cứu quan hệ di truyền của các giống mè có nguồn gốc ở Ấn Độ, châu Phi, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Á và Tây Á bằng kỹ thuật AFLP Nghiên cứu cho thấy 93% trong tổng số các chỉ thị phân tử AFLP là đa hình và không có sự tương quan với nguồn gốc địa

lí

Ghulam và ctv (2007) đã sử dụng kỹ thuật AFLP phân tích đa dạng di truyền

96 giống mè thu thập từ các nơi trên thế giới, với 21 cặp mồi thu được tổng cộng

445 sản phẩm khuếch đại, trong đó có 157 sản phẩm là đa hình Dựa trên hệ số tương đồng tác giả đã phân 96 giống mè thí nghiệm thành 2 nhóm: nhóm 1 bao gồm các giống có nguồn gốc Đông Á, nhóm 2 bao gồm các giống có nguồn gốc Nam Á Arriel và ctv (2007) đã sử dụng 30 tính trạng hình thái và đặc tính nông học

để đánh giá đa dạng di truyền của 108 dòng mè ở Brazil Nghiên cứu cho thấy có sự

đa hình cao giữa các dòng mè, trong đó, tính trạng số trái/cây và năng suất dòng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

Abdellatef và ctv (2008) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 10 giống mè thu thập từ các vùng khác nhau ở Sudan Nghiên cứu cho thấy

có sự đa hình rất cao giữa các giống thu thập, tổng cộng có 75 băng trong đó có 64 băng đa hình Cây phân nhóm UPGMA chia 10 giống thành 2 nhóm

Parsaeian và ctv (2010) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền trên 24 giống mè dựa trên tính trạng nông học và chỉ thị phân tử ISSR Kết quả cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giống về những tính trạng nghiên cứu, dựa vào tính trạng hình thái, các giống nghiên cứu được chia làm 5 nhóm Nghiên cứu ISSR chia các giống mè làm 7 nhóm

Phạm Đức Toàn và ctv (2010) đã tiến hành đánh giá các giống mè có nguồn gốc địa lý khác nhau từ El Salvator, Tanzania, Kenya, Ấn Độ, Campuchia và Việt Nam, thí nghiệm được thực hiện ở vùng đồng bằng châu thổ sông Mekong thuộc Việt Nam Nghiên cứu cho thấy, các giống thuộc Châu Phi và Trung Mỹ cho cây có

kích thước lớn, ra hoa chậm và năng suất kém, các giống thuộc Campuchia và Việt Nam cho năng suất cao

Seymus và ctv (2010) đã dựa trên 21 tính trạng nông học để đánh giá đa dạng di truyền của 103 giống mè lấy từ các vùng trồng mè ở Thổ Nhĩ Kỳ Kết quả các tính trạng liên quan đến sự nảy mầm, ra hoa, tạo trái và năng suất hạt là những yếu tố chính xác định sự đa dạng di truyền trong bộ giống nghiên cứu Qua cây phân nhóm, 103 giống được chia làm 8 nhóm chính và không thấy có sự tương quan

về sự phân nhóm và nguồn gốc địa lý của các giống

2.7 Đa dạng di truyền, một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 2.7.1 Đa dạng di truyền và bảo tồn đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là tập hợp tất cả các gen khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau, là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể Qua đó, sự đa dạng của các biến dị

có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã được biểu hiện Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền Đa dạng di truyền giúp cho các loài sinh vật đảm bảo sự sinh sản, chống chịu với bệnh tật và khả năng thích nghi với điều kiện môi trường luôn luôn thay đổi (Primack, 1999)

Bảo tồn nguồn gen không chỉ nhằm ngăn chặn sự tuyệt chủng của một loài

mà bảo tồn nguồn gen còn nhằm ngăn chặn sự mất mát của các gen, các phức hợp gen và các genotype, ngăn chặn sự tuyệt chủng các chủng hoang dại (landraces) mà vốn gen của chúng bị suy giảm nghiêm trọng tới mức một số gen và một số phức hợp gen có thể bị mất đi, tiềm năng di truyền của loài bị giảm mạnh, và trong trường hợp cực đoan, đó là sự tuyệt chủng của loài (Primack, 1999)

2.7.2 Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

2.7.2.1 Phương pháp chỉ thị hình thái

Gen thể hiện bản chất di truyền, thường thể hiện một hay nhiều tính trạng có thể đo đếm được, gen đó xem như gen chỉ thị Chỉ thị hình thái là một trong những phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền

Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không thỏa mãn yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể Sự thể hiện các chỉ thị hình thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điều này làm cho chỉ thị hình thái kém thu hút trong cải tiến giống cây trồng

2.7.2.2 Phương pháp chỉ thị isozyme

Isozyme là các dạng protein có cùng phản ứng enzyme nhưng có sự khác nhau khi chạy điện di Kỹ thuật điện di được dùng để đo sự di động của phân tử protein trong một khoảng thời gian nhất định, trên điện trường đồng nhất Các protein đột biến khác nhau về điện tích sẽ có sự di chuyển khác nhau nên có thể phát hiện sự khác nhau giữa chúng bằng kỹ thuật điện di Sự khác nhau này phản ánh sự khác nhau trong kích thước và cấu trúc của phân tử protein Trong nhiều trường hợp, còn liên quan tới sự thay thế bởi một amino acid trong phân tử protein

do đột biến từ alen này sang alen khác

Nhờ kỹ thuật điện di này, cùng lúc có thể phân tích nhiều cá thể của một quần thể nào đó để đánh giá chính xác số phần trăm dị hợp tử của một gen nhất định Chỉ thị isozyme cho biết sự đa dạng giữa các nhóm sinh vật theo các protein được quan sát

Tuy việc áp dụng chỉ thị isozyme đã làm thay đổi việc nghiên cứu đa dạng di truyền theo chiều hướng thuận lợi hơn nhưng số chỉ thị cũng quá ít, không đáp ứng cho nhu cầu nghiên cứu

2.7.2.3 Phương pháp dùng chỉ thị phân tử

Chỉ thị phân tử đã chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme, do số lượng của chỉ thị này hơn nhiều lần so với chỉ thị isozyme (Tanksley và ctv, 1980)

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được phân biệt giữa hai cá thể, hai giống hoặc hai giống khác nhau đều có thể được xem là một chỉ thị phân tử Các chỉ thị phân tử có thể chia làm hai nhóm như sau:

Chỉ thị dựa vào phương pháp lai DNA (DNA – DNA hydridization based): RFLP (Restriction Fragment Length Polymophism), minisatellite

Chỉ thị dựa vào phương pháp PCR: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymophism), SSCP (Single Strand Conformation Polymophism), SSR (Simple Sequence Repeats)

Những lợi ích của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme:

Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền

Có nhiều chỉ thị trong quần thể

Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển

2.8 Giới thiệu về kỹ thuật PCR

2.8.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn như sau (Nguyễn Thị Phương Dung, 2005):

Giai đoạn 1: Biến tính

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95o C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

Giai đoạn 2: Gắn primers

Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template để có phân tử DNA mới

Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 - 70oC, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng Giai đoạn này gọi là giai đoạn lai

Giai đoạn 3: Kéo dài chuỗi nhờ enzyme DNA polymerase

Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m : là số bản sao của mẫu ban đầu

n : là số chu kỳ

Ba trình tự này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA Trong chu

kỳ thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài được hình thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và chuỗi ngắn Sản phẩm chuỗi dài được tích tụ theo hướng tuyến tính, còn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit Do đó, người ta hy vọng có khoảng 105 lượng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25 - 30 chu kỳ Về nguyên tắc PCR được áp dụng

để khuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000 bp

Những phản ứng trên được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase,

và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho giai đoạn biến tính và giai đoạn bắt cặp

2.8.2 Các thành phần và việc tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR

2.8.2.1 DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch Tuy nhiên, những kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1μg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế các khuếch đại “kí sinh”, tạo những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

Thông thường, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA

sẽ không ảnh hưởng xấu đến sự nhân DNA Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch

Đối với những DNA có kích thước quá lớn (>50 kb), sự biến tính có thể không hữu hiệu và năng suất PCR thấp Trong trường hợp này, cần phải cắt DNA trước bằng enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; hoặc có thể tách DNA bằng cách dùng nhiệt độ tới 100oC trong 2 - 5 phút

ta sẽ không có đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn

Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một

nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo giống (TA - cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation) Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính

của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc

Pfu Use Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác

2.8.2.3 Primer

Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, việc thiết kế primer phải tuân thủ một số chỉ tiêu cơ bản sau (Prezioso, 2004):

a Chiều dài primer

Đây là một chỉ tiêu quan trọng cho sự thành công của PCR, vì tính đặc hiệu

và nhiệt độ bắt cặp của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer Thông thường primer có chiều dài từ 18 - 24 base có tính đặc hiệu cao, và cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu Kích thước primer không nên quá ngắn, trừ trường hợp phục vụ cho mục đích đặc biệt, và cũng không nên quá dài vì sẽ làm giảm khả năng bắt cặp

b Nhiệt độ chảy T m

Hai primer xuôi và ngược trong phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng chảy không cách biệt nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có

Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai

được với DNA

c Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer như đã nói ở trên Để có độ đặc hiệu cao, primer phải được thiết kế sao cho chỉ khuếch đại một trình tự đặc trưng duy nhất trên DNA hay chỉ cho một sản phẩm chính, và không nên có nhiều trình tự lặp lại trên primer, vì điều này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các sản phẩm phụ Nhiệt độ của giai đoạn kéo dài không được quá thấp so với nhiệt

độ bắt cặp của primer để đảm bảo tính đặc hiệu

d Trình tự bổ sung trên primer

Trình tự primer phải được thiết kế sao cho có không quá 3 cặp base có trình

tự bổ sung với nhau, vì điều này sẽ dẫn đến hiện tượng “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer, làm ngăn cản sự bắt cặp của primer với DNA

Hai primer xuôi và ngược phải không có trình tự bắt cặp bổ sung với nhau để tránh hiện tượng “dimer primer”, vì điều này sẽ dẫn đến sự cạnh tranh bắt cặp với DNA và cản trở sự hình thành sản phẩm mong muốn Ngoài ra, nồng độ quá thừa của primer cũng dẫn đến sự hình thành “dimer primer” (Bùi Chí Bửu và ctv, 1999)

Thông thường, primer xuôi và primer ngược thường có nồng độ bằng nhau, khoảng 0,1 μM tương đương với 2,5 pmol trong 25 μl dung dịch phản ứng Trình tự DNA nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không được quá lớn Phản ứng sẽ tối ưu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb (Hoàng Thị Liễu, 2004)

e Hàm lượng GC

Thành phần nucleotide của các primer nên cân bằng, tránh cặp GC lặp lại nhiều lần Hàm lượng GC của primer nên nằm trong khoảng 45% đến 50% (Kwork và ctv., 1990), trình tự primer lý tưởng nhất là có 50% GC (Wallace và ctv, 1981) Trình tự primer phải không có poly G hay poly C, poly A hay poly T, vì điều này sẽ làm cho sự bắt cặp không đặc hiệu Trình tự polypyrimidine TC hay polypurine Ag cũng cần phải tránh vì nó làm giảm hiệu quả khuếch đại

f Trình tự đầu 3’

Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng

“mismatch” - bắt cặp không đặc hiệu Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà thay vào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G - C mạnh hơn A - T sẽ bảo đảm cho sự bắt cặp đặc hiệu

Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)

A, T, C, G là số lượng các base có trong oligonucleotide

Khi chiều dài primer từ 14 – 70 base

Tms = 81,5 + 16,6(log10[J+]) + 0,41(%G+C) - (600/l) + [J+] : nồng độ mol các cation hoá trị I

+ (%G+C) : % nucleotide loại G và C Khi chiều dài primer từ 20 - 35 base

Tmp = 22 + 1,46([2 x (G+C)] + (A+T)) Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có

số liệu đúng về nhiệt độ bắt cặp Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngược lại

Mối quan hệ giữa nhiệt độ bắt cặp Ta và đoán nhiệt độ nóng chảy Tm của primer là một trong những vấn đề vẫn đang được tìm hiểu Thông thường, nhiệt độ bắt cặp thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy từ 2 - 5oC Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫn đến sản phẩm được nhân lên quá mức do sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra Nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, năng suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm

Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp nên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết Tm khoảng 5oC Thông thường, với một oligonucleotide có 20 nucleotide có thể dùng nhiệt độ bắt cặp 50 - 55oC Nếu chuỗi dài hơn (25 nucleotide hay nhiều hơn) hoặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ bắt cặp

có thể đến 55 - 65oC Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn bắt cặp và kéo dài có thể được kết hợp và thực hiện ở 68 - 72oC (Hoàng Thị Liễu, 2004)

2.8.2.5 Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu

Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primer DNA mẫu Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống như trường hợp DNA mẫu quá loãng Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều

Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá 0,5 μM (12,5 pmol/25 μL phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện tượng primer-dimer

2.8.2.6 Các thành phần khác

a Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat)

Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20 - 200 μM Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh" Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lượng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm được khuếch đại Vì thế, nồng độ dNTP tối ưu cho từng phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm

b Nồng độ MgCl 2

Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR

Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase,

làm tăng Tm của DNA mạch kép Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức

độ chuyên biệt thấp

c Chất ổn định hoạt động enzyme

Những hoạt chất ổn định hoạt động enzyme cũng được chú ý Nhiều nhà sản xuất hoá chất đã xem xét gelatin hoặc Triston X - 100 trong những buffer để tồn trữ enzyme Có trường hợp người ta sử dụng cả hai làm dung dịch đệm Nhằm bảo quản và ổn định enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch đệm trong phản ứng đều có chứa gelatin ở nồng độ 0,01% và Triston X - 100 ở nồng độ 0,1%

d Dung dịch đệm

Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đối với các đệm đang có mặt trên thị trường

RFLP là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau (Powell và ctv, 1996) RFLP có ưu điểm là chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này

Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn Một cặp primer oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo