SO SÁNH HIỆU QUẢ SỬ DỤNG CỦA KẼM VÔ CƠ VÀ HỮU CƠ TRONG THỨC ĂN THỰC NGHIỆM CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG

TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “So sánh hiệu quả sử dụng của kẽm vô cơ và hữu cơ trong thức ăn thực nghiệm của cá tra Pangasianodon hypophthalmus giống” được tiến hành tại trung tâm nghiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

********

NGUYỄN THÚY HẰNG

SO SÁNH HIỆU QUẢ SỬ DỤNG CỦA KẼM VÔ CƠ VÀ HỮU

CƠ TRONG THỨC ĂN THỰC NGHIỆM CỦA CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2011

SO SÁNH HIỆU QUẢ SỬ DỤNG CỦA KẼM VÔ CƠ VÀ HỮU

CƠ TRONG THỨC ĂN THỰC NGHIỆM CỦA CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG

Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản

SO SÁNH HIỆU QUẢ SỬ DỤNG CỦA KẼM VÔ CƠ VÀ HỮU CƠ TRONG

THỨC ĂN THỰC NGHIỆM CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

GIỐNG

NGUYỄN THÚY HẰNG

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS.TS DƯƠNG THANH LIÊM

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

2 Thư ký: TS NGUYỄN HỮU THỊNH

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3 Phản biện 1: TS NGUYỄN NHƯ TRÍ

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

4 Phản biện 2: PGS.TS NGUYỄN NGỌC TUÂN

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

5 Ủy viên: PGS.TS LÊ THANH HÙNG

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Nguyễn Thúy Hằng sinh ngày 18 tháng 01 năm 1984

Nơi sinh: xã Long Trung, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang

Cha: Ông Nguyễn Tấn Bửu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Thúy Hằng

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi kính gửi lời cảm ơn đến:

- Quý Thầy Cô trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt và hỗ trợ kiến thức cho tôi suốt thời gian học tại trường

- PGS.TS Lê Thanh Hùng đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn Thạc sĩ này

- TS Ooi Ei Lin đã cho phép tôi thực tập tại trung tâm nghiên cứu thủy sản Novus và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc tại trung tâm

- TS Phạm Minh Anh và các anh chị trong trung tâm nghiên cứu thủy sản Novus đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực tập tại đây

- Quý Thầy Cô khoa thủy sản trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập cũng như làm luận văn tốt nghiệp

- Gia đình, bạn bè và tập thể lớp cao học thủy sản khóa 2008 đã luôn động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt chương trình học cũng như quyển luận văn này

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “So sánh hiệu quả sử dụng của kẽm vô cơ và hữu cơ

trong thức ăn thực nghiệm của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống”

được tiến hành tại trung tâm nghiên cứu Novus trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2010 đến tháng 10/2010 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, trên hai hệ thống tuần hoàn, mỗi hệ thống gồm 24 bể composite thể tích 250 lít/bể Trong thí nghiệm này, 8 khẩu phần ăn được thiết lập cùng mức protein (32%) và năng lượng (GE 3.800 kcal/kg) Trong

đó, kẽm sulphate (15, 30, 60 và 120 mg Zn/kg thức ăn) và phức hợp Zn chelate (15,

30 và 60 mg Zn/kg thức ăn) là hai nguồn kẽm được bổ sung vào các khẩu phần tương ứng với sự giảm dần của alpha-cellulose Sau 12 tuần cho ăn thức ăn bổ sung

các nguồn kẽm khác nhau, cá được gây cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri ở mật độ 106 CFU/ml Kết quả thu được như sau:

Việc bổ sung kẽm vô cơ cũng như hữu cơ vô khẩu phần thức ăn thực

nghiệm chưa ảnh hưởng lên tăng trưởng của cá tra giống (P > 0,05)

Kẽm hữu cơ không có ảnh hưởng lên hiệu quả sử dụng thức ăn khi các chỉ

số FCR, PER khác nhau không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức bổ sung các nguồn kẽm khác nhau cũng như nghiệm thức đối chứng (P > 0,05)

Kẽm hữu cơ không cải thiện được hàm lượng kẽm trong cơ thể cũng như thành phần sinh hóa cơ thể cá so với kẽm vô cơ (P > 0,05)

Kẽm hữu cơ và kẽm vô cơ không có tác dụng gia tăng hoạt tính enzyme lysozyme và SOD Do đó, ảnh hưởng của việc bổ sung kẽm vào khẩu phần thức ăn

có hàm lượng protein thực vật cao lên khả năng kháng bệnh cũng như các chỉ tiêu miễn dịch là chưa rõ ràng

ABSTRACT

The research “Comparison of the effect of inorganic and organic zinc in

practical diets for fingerlings of Tra catfish (Pangasianodon hypophthalmus)”

was conducted at the Novus aquaculture research center, Nong Lam University, from April 2010 to October 2010 The experiment was set to random block in two recirculating systems which have twenty-four 250 liter-composite tanks in each system Eight diets with the same protein (32 %) and gross energy (3800 kcal/kg) were established Diets were supplemented with zinc sulfate (15, 30, 60 and 120

mg Zn/kg diet) or chelated zinc (15, 30 and 60 mg Zn/kg diet) with corresponding decreases in the amount of cellulose After feeding with different feed added various zinc sources, fish were challenged with Edwardsiella ictaluri at density 106CFU/ml The results were followed:

Zinc supplement from inorganic or organic source to diet did not effect to growth of tra catfish fingerlings (P > 0,05)

There were not significant differences in FCR, PER between fish fed diets from zinc sulfate or chelated zinc or fish fed the basal diet

Organic zinc did not help improve the body zinc as well as the body compositions in comparison with inorganic

The activities of lysozyme and SOD were not increased as zinc increased for fish fed either zinc sulfate or chelate zinc So, the effect of adding zinc on disease resistance and immune parameters were not clear in high soybean meal diet

2.1 Vai trò sinh học của kẽm (Zn) trong dinh dưỡng động vật 3

2.2 Nhu cầu kẽm của động vật trên cạn 4

2.2.1 Trên gia cầm 4

2.3 Nhu cầu và một số dấu hiệu thiếu kẽm trên thủy sản 5

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hấp thu kẽm của động vật thủy sản 6

2.6 Một số đặc điểm sinh học của cá Tra 10

2.6.2 Phân bố 10

2.6.4 Điều kiện môi trường sống 11

2.6.4.4 Độ mặn 11 2.6.5 Đặc điểm dinh dưỡng 12

2.6.7 Đặc điểm sinh sản 12

2.7 Một vài đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và một số

2.7.1 Một vài đặc điểm của vi khuẩn E ictaluri 13

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 15

3.1.2 Thời gian nghiên cứu 15

3.2 Nội dung nghiên cứu 15

3.3.2 Hệ thống thí nghiệm 16

3.3.3 Nguồn nước 16

3.3.5 Các dụng cụ và vật liệu thí nghiệm 19

3.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung kẽm hữu cơ và

vô cơ lên tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn 20

3.4.1.4 Phương pháp lấy mẫu và phân tích số liệu 22

3.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh của cá sau khi sử dụng

thức ăn bổ sung các nguồn kẽm khác nhau 23 3.4.2.1 Nuôi cấy vi khuẩn 23

3.4.2.2 Phương pháp gây bệnh 25

3.4.2.3 Thu thập số liệu và ghi nhận kết quả 25

4.1 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn 27

4.2 Các thông số môi trường 27

4.2.1 Nhiệt độ 28

4.2.3 pH và độ kiềm 29 4.2.4 Hàm lượng nitrit và ammonia tổng số 30

4.3 Khảo sát tăng trưởng 32

4.3.1.1 Tăng trọng 35 4.3.1.2 Ảnh hưởng của kẽm lên hiệu quả sử dụng thức ăn thông qua các chỉ

tiêu hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR), hiệu quả sử dụng protein (PER), lượng ăn FI (g thức ăn/con/ngày) và hệ số gan/thể trọng (HSI) của cá

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DO: Dissolved Oxygen

DWG: Daily Weight Gain

FCR: Feed Conversion Ratio

FI: Feed Intake

GE: Gross Energy

HSI: Hemato – Somatic Index

NRC: National Research Council

NT: Nghiệm Thức

PER: Protein Efficiency Ratio

SGR: Specific Growth Rate

SOD: Super Oxide Dimutase

TSB: Tryptic Soy Broth

TSA: Tryptic Soy Agar

WG: Weight Gain

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.2 Phức hợp kẽm gắn với acid phytic 7

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của Mintrex Zinc 10

Hình 3.1 Hệ thống thí nghiệm 16 Hình 3.2 Máy ép sợi thức ăn 19

Hình 3.5 Máy nghiền nguyên liệu 19 Hình 3.6 Cách cấy để xác định mật độ vi khuẩn 25

Hình 4.1 Nhiệt độ môi trường nước trong thời gian thí nghiệm 28

Hình 4.2 Hàm lượng oxy hòa tan (DO) trong thời gian thí nghiệm 29

Hình 4.3 pH môi trường nước trong thời gian thí nghiệm 30

Hình 4.4 Hàm lượng ammonia tổng số trong thời gian thí nghiệm 31

Hình 4.5 Hàm lượng NO2- trong thời gian thí nghiệm 32

Hình 4.6 Trọng lượng trung bình của cá sau 12 tuần thí nghiệm ở hệ

Hình 4.7 Hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) của cá Tra khi cho ăn thức

ăn thực nghiệm có bổ sung các nguồn kẽm khác nhau ở hệ thống A 38

Hình 4.8 Lượng ăn (FI) của cá sau thí nghiệm ở hệ thống A 39

Hình 4.9 Hàm lượng kẽm (ppm) trong cơ thể cá sau thí nghiệm ở hệ

Hình 4.10 Tỷ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn

Hình 4.11 Gan thận cá bị đốm trắng khi cá nhiễm vi khuẩn E

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần nguyên liệu của thức ăn cơ bản 17

Bảng 3.2 Các nghiệm thức thức ăn trong thí nghiệm 18

Bảng 3.3 Thành phần nguyên liệu trong các nghiệm thức của thí

nghiệm 21

Bảng 4.1 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn thí nghiệm sau khi phân

tích 27

Bảng 4.2 Các chỉ tiêu về tăng trọng và tỷ lệ sống của cá sau thí nghiệm 33

Bảng 4.3 Kết quả phân tích thống kê yếu tố tăng trọng của cá ở 2 hệ

Bảng 4.6 FCR, hệ số gan/thể trọng (HSI), hiệu quả sử dụng protein

(PER) và lượng ăn FI (g thức ăn/con/ngày) ở cá tra cho ăn thức ăn bổ

sung các nguồn kẽm khác nhau từ ZnSO4 và Zn – chelate trong hệ

Bảng 4.7 Thành phần sinh hóa của cơ thể cá tra cho ăn các khẩu phần

bổ sung các nguồn kẽm khác nhau ở hệ thống A (n = 3) 40

Bảng 4.8 Kết quả phân tích thống kê yếu tố tăng trọng của cá ở hệ

Bảng 4.9 Các chỉ tiêu về tăng trọng và tỷ lệ sống của cá sau thí nghiệm

Bảng 4.10 FCR, hệ số gan/thể trọng (HSI), hiệu quả sử dụng protein

(PER) và lượng ăn FI (g thức ăn/con) ở cá tra cho ăn thức ăn bổ sung

các nguồn kẽm khác nhau từ ZnSO4 và Zn – chelate trong hệ thống B 43

Bảng 4.11 Thành phần sinh hóa của cơ thể cá tra cho ăn các khẩu phần

bổ sung các nguồn kẽm khác nhau ở hệ thống B 44

Bảng 4.12 Tỷ lệ sống của cá ở ngày thứ 7 và ngày thứ 14 sau khi gây

Bảng 4.13 Hàm lượng enzyme lysozyme, SOD và tỷ lệ sống của cá

sau cảm nhiễm khi cho cá ăn các nguồn kẽm khác nhau 47

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam với lợi thế tiềm năng là diện tích mặt nước lớn, sông ngòi dày đặc,

bờ biển dài nên rất thuận lợi cho ngành thủy sản phát triển Trong những năm vừa qua, ngành thủy sản Việt Nam đã đóng góp rất lớn vào giá trị kim ngạch xuất khẩu của cả nước Ngành nuôi trồng thủy sản phát triển làm cho ngành sản xuất thức ăn cho các đối tượng nuôi cũng phát triển theo Trong công nghệ sản xuất thức ăn, người ta thường sử dụng một tỷ lệ bột cá nhất định Do đó đẩy nhu cầu bột cá tăng cao nhưng sản lượng bột cá thế giới không tăng mà lại có khuynh hướng giảm Hiện nay trong ngành sản xuất thức ăn thủy sản, đặc biệt là thức ăn cho cá tra thường dùng nguồn protein thực vật để thay thế nguồn protein từ bột cá Tuy nhiên việc thay thế này sẽ dẫn đến kết quả là không cân bằng được các chất dinh dưỡng như vi khoáng, acid amin thiết yếu, … Để giải quyết vấn đề này, nhà sản xuất phải

bổ sung các dưỡng chất vào thức ăn Tuy nhiên, có một số chất phải bổ sung với lượng cao hơn nhu cầu, ví dụ việc bổ sung các vi khoáng như Cu, Zn, Se,… vào thức ăn là một điển hình bởi vì sự hấp thu khoáng thường bị hạn chế, đặc biệt là khoáng ở dạng vô cơ Phần khoáng không hấp thụ được sẽ thải ra môi trường, qua thời gian dài sẽ tác động xấu đến môi trường

Kẽm là một nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cơ thể động vật Kẽm thường được bổ sung vào thức ăn ở dạng vô cơ như ZnSO4, ZnS, ZnO, … Tuy nhiên, hoạt tính sinh học của kẽm ở dạng vô cơ bị hạn chế bởi một số yếu tố trong thức ăn như acid phytic, Ca, P,… Nhằm hạn chế tác động xấu đến môi trường và sử dụng tốt các nguồn khoáng bổ sung, đặc biệt là kẽm, được sự cho phép của Khoa Thủy Sản trường Đại học Nông Lâm Thành Phố

Hồ Chí Minh cùng với sự hỗ trợ của Trung Tâm nghiên cứu Thủy Sản Novus,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “So sánh hiệu quả sử dụng của kẽm vô cơ và

hữu cơ trong thức ăn thực nghiệm của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

giống”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- So sánh tác dụng của việc bổ sung kẽm vô cơ và hữu cơ vào thức ăn lên sự tăng trưởng, tỷ lệ sống và hiệu quả sử dụng thức ăn

- Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cá tra thông qua việc theo dõi các chỉ tiêu như hoạt tính enzyme lysozyme, superoxide dismutase

(SOD) và khả năng kháng bệnh với vi khuẩn Edwarsiella ictaluri

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Vai trò sinh học của kẽm (Zn) trong dinh dưỡng động vật

Kẽm được biết là một vi dưỡng chất cho cả động vật lẫn thực vật Kẽm cần cho sự tăng trưởng, phát triển và chức năng bình thường của tất cả các loài động vật Chức năng chủ yếu của kẽm như là một co-factor trong một vài hệ thống enzyme và nó cũng là thành phần của một số lượng lớn enzyme biến dưỡng, bao gồm carbonic anhydrase, alkaline phosphatase, carboxypeptidase, alcohol dehydrogenase, glutamic dehydrogenase, lactate dehydrogenase, ribonuclease và DNA polymerase (NRC, 1980)

Vai trò của kẽm có liên quan đến sự tăng trưởng và phát triển của cơ thể động vật Cơ chế cơ bản của tác dụng này là sự liên kết với cấu trúc và hoạt động của vô số enzyme liên quan đến nhiều quá trình biến dưỡng khác nhau Khi kẽm tác động lên sự phát triển của sụn thì nó có liên quan đến nhiều phản ứng của enzyme Theo Brandao-Neto và ctv (1995), tác dụng của kẽm đối với sự tăng trưởng và phát triển gồm 3 tác dụng: (1) tác dụng lên mùi và vị, điều chỉnh sự thèm ăn; (2) tác dụng lên sự tổng hợp DNA và RNA, thúc đẩy quá trình nhân đôi tế bào

và sự phân biệt tế bào sụn, tế bào tạo xương, nguyên bào sợi, sự tổng hợp somatomedin-C (ở gan), enzyme alkaline phosphatase, collagen và osteocalcin (xương), biến dưỡng lipid, carbohydrate và protein; (3) tác dụng lên sự điều khiển hormone bằng cách tham gia vào tổng hợp và bài tiết hormone tăng trưởng trong các tế bào soma, tác dụng lên hormone tăng trưởng thông qua việc sản xuất somatomedin-C ở gan, hoạt hóa somatomedin ở các sụn xương Thêm vào đó, kẽm cũng tương tác với những hormone khác liên quan đến sự phát triển của xương như testosterone, hormone thyroid, insulin và vitamin D3

Ngoài tác dụng lên sự tăng trưởng và phát triển, kẽm còn có vai trò đối với

sự đáp ứng miễn dịch và sự kháng bệnh Trên động vật đẳng nhiệt, người ta đã nghiên cứu và tìm ra mối quan hệ giữa sự thiếu kẽm với sự kém đáp ứng miễn dịch

và sự nhạy cảm với bệnh lây nhiễm Theo Bray và Bettger (1990), kẽm có vai trò là chất kháng oxi hóa trong nhiều hệ thống hóa học đã được xác định Tuy nhiên, bằng chứng về vai trò của Zn đối với sự miễn dịch và khả năng kháng bệnh trên cá

là chưa rõ ràng Lim và ctv (1996) cho thấy rằng việc bổ sung Zn sẽ làm tăng tính hóa hướng động của macrophage của cá da trơn Mỹ đối với kháng nguyên bề mặt

Edwardsiella ictaluri Tuy nhiên, hoạt tính thực bào được xác định bằng sự thử

phát quang bằng phản ứng hóa học thì bị triệt tiêu bởi sự bổ sung Zn trong khẩu phần Do đó, mặc dù Zn có tác dụng gia tăng đại thực bào, nhưng nó có thể có hiệu quả ức chế lên sự thực bào Karl và ctv (1973) cho rằng Zn ức chế đáng kể khả năng thực bào của đại thực bào trích từ chuột được xử lý với liều Zn thấp (0,05%

mg ZnCl2/chuột) hoặc cao (0,25 mg ZnCl2/chuột) Họ cũng cho thấy rằng tốc độ

mà các đại thực bào tiêu diệt các vi khuẩn là chậm hơn đáng kể sau khi xử lý với

Zn Paripatananont và Lovell (1995) tìm thấy rằng khẩu phần chứa ít kẽm làm giảm đáng kể đáp ứng ngưng kết kháng thể của cá da trơn Mỹ 14 ngày sau khi gây cảm

nhiễm với E ictaluri Kháng thể tối đa thu được trên cá được cho ăn các khẩu phần

chứa 15 mg Zn/kg từ nguồn kẽm methionine hoặc ít nhất 30 mg Zn/kg từ ZnSO4 Tuy nhiên, Lim và ctv (1996) quan sát thấy rằng kẽm trong thức ăn không bảo vệ

cá da trơn Mỹ chống lại E ictaluri khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn này

2.2 Nhu cầu kẽm của động vật trên cạn

2.2.1 Trên gia cầm

Kẽm là nguyên tố vi lượng dễ thiếu trong thức ăn gia cầm Theo Dương Thanh Liêm (2008), giống gia cầm nặng cân, lớn nhanh nhu cầu kẽm cao hơn giống gia cầm bình thường, gia cầm đẻ trứng giống có nhu cầu Zn cao hơn gia cầm

đẻ trứng thương phẩm Thiếu kẽm trên gia cầm góp phần gây ra triệu chứng perosis, khớp xương sưng phồng, tế bào chân lông bị sừng hóa gây rối loạn sự phát

triển bộ lông (Dương Thanh Liêm và ctv, 2002) Theo Tôn Thất Sơn (2005), để phòng ngừa sự thiếu kẽm trên gà nên bổ sung 35 ppm Zn đối với gà 0 – 18 tuần tuổi và 50 – 65 ppm Zn đối với gà đẻ

2.2.2 Trên gia súc

Do có nhiều yếu tố hạn chế sự hấp thu kẽm trong thức ăn, nên để xác định nhu cầu chính xác là việc làm rất khó khăn Không thể khuyến cáo liều kẽm bao nhiêu cho đủ để bảo đảm năng suất tối đa cho thú, để tránh bệnh khô da, đặc biệt nhất là ở heo (Dương Thanh Liêm và ctv, 2002) Thiếu kẽm trên heo thường gây ra hiện tượng viêm da trạng thái parakeratosis Sự thiếu kẽm cũng làm giảm tỷ lệ thụ tinh trên heo Ở Mỹ người ta sử dụng kẽm với liều rất cao trong thức ăn của heo là trên 1,5g ZnSO4/kg Để phòng ngừa bệnh da hóa sừng trên bò nên cho bò ăn thức

ăn có 0,5% Zn (Tôn Thất Sơn, 2005) Trong điều kiện nhiệt đới nên bổ sung hàng ngày 20 – 30 ppm Zn trong thức ăn

2.3 Nhu cầu và một số dấu hiệu thiếu kẽm trên động vật thủy sản

Cá có thể hấp thụ kẽm từ cả môi trường nước và thức ăn Tuy nhiên, kẽm trong khẩu phần thức ăn được hấp thụ hiệu quả hơn kẽm trong nước (NRC, 1993) Nhu cầu kẽm trong khẩu phần ăn đã được xác định trên một vài loài cá Giá trị nhu

cầu được báo cáo là 15 – 30 mg/kg thức ăn trên cá Hồi vân và cá chép Cyprinus

carpio (Ogino và Yang, 1978, 1979), và 20 mg/kg trên cá da trơn Mỹ Ictalurus punctatus (Gatlin và Wilson, 1984a), 20 mg/kg trên cá rô phi xanh Oreochromis aurea (McClain và Gatlin, 1988), 20 – 25mg/kg trên cá đù đỏ Sciaenops ocellatus

(Gatlin và ctv, 1991)

Trên cá Hồi vân, sự thiếu kẽm sẽ gây ra sự giảm tăng trưởng, đục thủy tinh thể và bị còi (Ogino và Yang, 1978; Ketola, 1979; Satoh và ctv, 1987c) Tăng trưởng chậm, mất sự thèm ăn, tỷ lệ chết cao và mòn vây và da là triệu chứng thiếu kẽm trên cá chép (Ogino và Yang, 1979) Thêm vào đó khi nghiên cứu trên cá đù

đỏ các dấu hiệu thiếu kẽm được ghi nhận là tăng trưởng chậm, ăn kém, sống yếu và

hàm lượng kẽm trong xương và vảy giảm (Gatlin và ctv, 1991) Cá da trơn Mỹ cho

ăn thức ăn thiếu kẽm làm giảm tăng trọng, sự thèm ăn, tỉ lệ sống, hàm lượng kẽm trong huyết thanh, hoạt tính enzyme alkaline huyết thanh và hàm lượng kẽm và Ca trong xương cũng giảm (Gatlin và Wilson, 1984; Scarpa và Gatlin, 1992) Hiện tượng thiếu kẽm có thể làm giảm khả năng sử dụng protein trên cá thông qua mối liên hệ giữa các enzyme carboxypeptidase B và insulin (Prasad, 1993) Carboxypeptidase B là enzyme exopeptidase thuộc tuyến tụy chứa kẽm là yếu tố cấu trúc thiết yếu (Folk và Schirmer, 1963) Enzyme exopeptidase là enzyme thủy phân các nối peptide trong chuỗi protein bằng cách phân cắt các đầu peptide để tạo thành các amino acid Trong khi đó, insulin làm tăng khả năng hấp thụ các amino acid ở các mô trên cá và kích thích sự tổng hợp protein (Ince và Thorpe, 1978; Millward, 1989) Kẽm cần thiết để hình thành các tế bào β thuộc tuyến tụy nơi mà insulin được tổng hợp và dự trữ và kẽm là phần không thể thiếu của nơi dự trữ insulin (Scott, 1934; Greider và ctv, 1969) Ngoài ra sự thiếu kẽm còn ảnh hưởng

hệ thống miễn dịch và khả năng sinh sản của cá Theo Kiron và ctv (1993), thiếu kẽm sẽ làm giảm đáp ứng miễn dịch trên cá hồi vân Thành phần khoáng của tuyến sinh dục trên cá chép cũng bị ảnh hưởng đáng kể khi loại bỏ kẽm khỏi việc cung cấp khoáng trong khẩu phần (Satoh và ctv, 1987c)

Tuy nhiên, kẽm là yếu tố vi lượng, do đó nếu chúng ta cung cấp kẽm với liều quá cao sẽ gây độc cho các đối tượng nuôi Theo Clearwater và ctv (2002), liều hàng ngày 9 -12 mg Zn/kg trọng lượng/ngày trong các khẩu phần được chuẩn bị

trong phòng thí nghiệm thì độc với 3 loài cá là cá chép C carpio, cá rô phi O

niloticus và cá bống Poecilia reticulate

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thu kẽm của động vật thủy sản

Sự hấp thu kẽm trong ruột lệ thuộc vào nhiều yếu tố liên quan đến thức ăn (Lê Thanh Hùng, 2008) Khả năng hấp thu và sử dụng kẽm bị ảnh hưởng bởi hình thức hóa học của kẽm trong khẩu phần, nguồn protein và sự hiện diện của các thành phần thức ăn như Ca, P và acid phytic (Watanabe và ctv, 1997) Acid phytic

liên kết với kẽm và các ion dương khác như Ca, Fe và Mn trong đường ruột tạo thành phức hợp không tiêu hóa được (Spinelli và ctv, 1983) Canxi làm giảm sự hấp thụ kẽm (NRC, 1993) Nhu cầu Zn trên cá da trơn Mỹ cần cho sự tăng trưởng tối đa và duy trì hàm lượng Zn cao trong huyết thanh và xương được xác định trong khẩu phần ăn có bột đậu nành chứa hàm lượng phytate cao là 150 mg/kg từ nguồn kẽm ZnO (Gatlin và Wilson, 1984b) so với 20 mg/kg trong khẩu phần tinh chế chứa lòng trắng trứng từ nguồn kẽm ZnS (Gatlin và Wilson, 1983) Phytic acid trong thức ăn làm giảm hoạt tính sinh học của kẽm và điều này trầm trọng hơn khi hiện diện canxi cao trong khẩu phần Gatlin và Phillip (1989) đề nghị cung cấp 200

mg Zn/kg thức ăn sẽ đảm bảo đủ Zn cho cá da trơn Mỹ ngay cả khi khẩu phần chứa nồng độ canxi và phytate cao Theo McClain và Gatlin (1988), cá rô phi xanh có nhu cầu Zn là 20 mg/kg trong khẩu phần tinh chế chứa lòng trắng trứng, tuy nhiên khi 1,5% phytate được thêm vào thì có một sự suy giảm có ý nghĩa về lượng Zn trong vảy và xương Phytate xuất hiện làm cho Zn trong thức ăn không có giá trị và

Zn tích lũy trong mô bị sử dụng

Hình 2.1 Phytic acid Hình 2.2 Phức hợp kẽm gắn với acid phytic

Theo Dương Thanh Liêm và ctv (2002), có những chất khoáng quá dư sẽ cạnh tranh vị trí hấp thụ lẫn nhau trên protein mang, ví dụ các cặp cạnh tranh nhau như: Ca-Zn, Ca-Mg, Cu-S, Se-S Hoạt tính của Zn trong các khẩu phần chứa bột cá trắng giàu Ca3(PO4)2 trên cá Hồi vân thì rất thấp (Satoh và ctv, 1987a) Spinelli và ctv (1983) cho rằng hoạt tính sinh học của Zn trong các khẩu phần tinh chế trên cá Hồi vân bị giảm khi hàm lượng Ca và Mg tăng

2.5 Nguồn cung cấp kẽm

Cá có thể hấp thụ kẽm từ nước (Spry và ctv, 1988), từ thức ăn và từ xương khi thiếu ăn (El – Mowafi và ctv, 1997) Mang và hệ thống tiêu hóa là con đường hấp thụ kẽm, trong đó mang hấp thụ kẽm chủ yếu từ nước và dạ dày ruột hấp thụ kẽm từ thức ăn (Watanabe và ctv, 1997) Trong thức ăn, nguồn kẽm được cung cấp

từ các nguyên liệu và từ premix khoáng Khi bột cá trong thức ăn được sử dụng với

tỷ lệ giảm dần sẽ dẫn đến sự thiếu hụt một số khoáng cần thiết Do đó, để đảm bảo nhu cầu khoáng, các nhà sản xuất thức ăn sử dụng một tỷ lệ nhất định premix khoáng Kẽm được cung cấp trong premix chủ yếu dưới dạng các muối kẽm, trong

đó kẽm sulphate và kẽm nitrate được hấp thu tốt nhất (Lê Thanh Hùng, 2008) Satoh và ctv (1987c) cho thấy rằng hoạt tính sinh học của Zn trên cá Hồi vân là cao nhất trên ZnSO4, thấp nhất ở ZnCl2, và trung bình ở Zn(NO3)2 hoặc ZnCO3 Tuy nhiên, do nhiều yếu tố ảnh hưởng lên sự hấp thu kẽm nên người ta thường dùng với lượng cao hơn nhiều so với nhu cầu để nhằm đáp ứng đủ cho vật nuôi Điều này rất

có hại cho môi trường vì con vật hấp thu rất ít, đại đa số còn lại thải ra ngoài và gây

ô nhiễm môi trường Vì vậy xu hướng chung của thế giới hiện nay là sử dụng khoáng hữu cơ để tránh sử dụng nhiều mà vẫn có hiệu quả

Trong công nghệ sản xuất cho đến ngày nay, khoáng hữu cơ có 3 thế hệ (theo Wikipedia):

- Thế hệ 1: khoáng được chelate với một loại amino acid đơn như methionine hoặc lysine gọi là amino – acid complex

- Thế hệ 2: khoáng được chelate với một đoạn peptide ngắn gọi là protenate

- Thế hệ 3: khoáng được chelate với 2 phân tử hữu cơ, liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu trên rất nhiều đối tượng để đánh giá hiệu quả của việc sử dụng kẽm vô cơ và kẽm hữu cơ Theo Paripatananont và Lovell (1995), hoạt tính sinh học của Zn trong Zn methionine thì lớn hơn Zn trong ZnSO4trên cá da trơn Mỹ Cho cá Hồi vân ăn thức ăn chứa kẽm acid amin cho kết quả là tích lũy kẽm trong các mô cơ thể cao hơn ZnSO4 trong khẩu phần chứa ít

Ca3(PO4)2, nhưng không cao hơn trong các khẩu phần chứa nhiều Ca3(PO4)2

(Hardy và Shearer, 1992) Paripatananont và Lovell (1995) cho rằng sự hấp thu cuối cùng của Zn từ Zn proteinate so với ZnSO4 là 138% trong khẩu phần tinh và 174% trong khẩu phần thực nghiệm trên cá da trơn Mỹ Tuy nhiên, Li và Robinson (1996) cho thấy rằng hoạt tính sinh học của ZnSO4 và Zn methionine trên cá da trơn Mỹ là như nhau khi cá được cho ăn khẩu phần thực nghiệm Ashmead (1992) cho rằng các nguyên tố gắn với acid amin sẽ có hoạt tính sinh học cao hơn bởi vì việc gắn với acid amin bảo vệ nguyên tố đó khỏi sự hình thành phức hợp không tan trong đường tiêu hóa và bằng cách hỗ trợ vận chuyển nguyên tố đó qua nhu mao ruột Ông cũng cho rằng dạng chelate có thể duy trì không đổi cho đến khi nó tìm thấy được vị trí trong cơ thể mà nguyên tố đó cần

Kẽm hữu cơ của công ty NOVUS INTERNATIONAL với tên thương mại Mintrex Zinc là một dạng khoáng chelate thế hệ 3, chứa một nguyên tử kim loại gắn với 2 phân tử 2-hydroxy-4 (methylthio) butanoic acid Vì thế Mintrex Zinc cung cấp một lượng hoạt tính methionine xác định thêm vào nguồn sẵn có trong thức ăn Trong thành phần của Mintrex Zinc, kẽm chiếm 16% và hoạt tính methionine chiếm 80% Công ty Novus đã có nhiều nghiên cứu Mintrex zinc trên nhiều đối tượng như heo, bò, gà Khi dùng phương pháp MT để so sánh các vị trí hấp thụ của các nguồn kẽm khác nhau như kẽm sunphate, zinc protonate, zinc –

AA và Mintrex zinc, kết quả cho thấy Mintrex zinc có tính hữu dụng vượt trội so với các nguồn kẽm khác tương ứng với số đơn vị MT mRNA cao đáng kể Mặt khác, Mintrex zinc cũng cho hàm lượng kẽm trong xương ống của vật nuôi cao hơn nguồn kẽm sulphate và zinc Met Đồng thời khi so sánh lượng kẽm thải ra môi trường qua phân, Mintrex zinc làm giảm đáng kể lượng kẽm trong phân so với kẽm

vô cơ (Nguồn: công ty Novus International)

Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)

Tên tiếng anh : tra catfish, striped fish Tên tiếng việt : cá tra

2 6.2 Phân bố

Vùng phân bố tự nhiên của loài cá tra giới hạn trong hạ lưu sông Mekong, bao gồm Campuchia, Lào, Thái Lan và Việt Nam, kể cả sông Chao Phraya ở Thái Lan (Roberts và Vidthayanon, 1991) Cá nhỏ thường phân bố ở khu vực hạ lưu, còn cá gần trưởng thành thường phân bố ở vùng trung lưu (Rainboth, 1996) Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi rất ít gặp trong tự nhiên ở địa phận Việt Nam

do cá tra có tập tính di cư ngược dòng sông MêKông để sinh sản (Phạm Văn Khánh, 2000)

2.6.3 Đặc điểm hình thái

Cá tra có đầu rộng, dẹp bằng, răng nhỏ mịn, mắt tương đối to, miệng rộng

Có hai đôi râu, râu mép ngắn kéo dài chưa đến gốc vây ngực Toàn thân không vẩy,

thon dài, lưng có màu tro nhạt, bụng có màu trắng bóng Mặt sau của vây lưng, vi ngực có răng cưa hướng xuống gốc vi (Nguyễn Văn Thường, 2008)

2.6.4 Điều kiện môi trường sống

2.6.4.1 Oxy hòa tan

Nhu cầu oxy hòa tan của các loài khác nhau tùy theo giống, giai đoạn sống, hoạt động sống Trong tự nhiên cá tra sống được ở thủy vực nước chảy và nước tĩnh Cá tra có cơ quan hô hấp phụ là bóng khí và da nên thở trực tiếp được khí trời, chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy (có khi bằng 0) Hàm lượng oxy hòa tan tối ưu cho cá là 3 – 6 mg/L (Phạm Văn Khánh, 2000) Tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của cá tra thấp hơn 3 lần so với cá mè trắng (Teresa và Katy, 2007)

2.6.4.2 Nhiệt độ

Cá tra là loài chịu lạnh kém vì là loài đặc trưng phân bố trong vùng nhiệt đới Nhiệt độ tối ưu cho cá tra là 26 – 30 oC (Phạm Văn Khánh, 2000) Tuy nhiên, theo Trần Thị Thanh Hiền và Nguyễn Anh Tuấn (2009), cá tra tiêu hóa protein và năng lượng tốt nhất ở 32 oC Ở nhiệt độ 15 oC thì cường độ bắt mồi của cá giảm nhưng cá vẫn sống Khi nhiệt độ tăng lên 39 oC thì cá có hiện tượng mất nhớt, bơi lội lờ đờ không bình thường (Nguyễn Tuần, 2000)

có biểu hiện mất nhớt nếu kéo dài thì cá sẽ chết

2.6.4.4 Độ mặn

Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, không sống được trong nước mặn, nhưng có khả năng sống được trong các vùng nước lợ Khả năng mà cá tra có thể chịu đựng được từ 8 – 10 ‰ (Nguyễn Duy Khoát, 2004)

2.6.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá tra có tính ăn tạp và thức ăn chủ yếu là thực vật, trái cây và một số loài động vật thân mềm (Vithayanon, 1993) Ở giai đoạn cá bột hết noãn hoàng thì thích

ăn mồi tươi sống, ăn các loài động vật phù du có kích thước vừa cỡ miệng như luân trùng, trứng nước, thậm chí cá tra bột còn ăn thịt lẫn nhau trong bể ương nuôi nếu cho ăn không đầy đủ

Khi phân tích thức ăn trong ruột cá tra đánh bắt ngoài tự nhiên, thành phần thức ăn được tìm thấy là nhuyễn thể 35,4%, cá 31,85%, côn trùng 18,2% và thực vật 10,7% Trong ao nuôi, cá tra có khả năng ăn những loại thức ăn có hàm lượng protein khác nhau do nguồn cung cấp (Phạm Văn Khánh, 2000)

2.6.6 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, cá còn nhỏ phát triển nhanh

về chiều dài Cá 2 tháng tuổi đã đạt chiều dài 10 – 12 cm, nặng 14 – 15 g/con (Nguyễn Chung, 2007) Theo Phạm Văn Khánh (2000), cá có trọng lượng 0,30 – 0,40 kg/con thì tăng nhanh về chiều dài cũng như trọng lượng, còn cá từ khoảng 2,5 kg/con trở đi mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với chiều dài cơ thể

2.7 Một vài đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và một số

phương pháp gây bệnh trên cá

2.7.1 Một vài đặc điểm của vi khuẩn E ictaluri

Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn này có một số đặc

điểm : có dạng hình que mảnh, gram âm, kích thước 1x2-3 μm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành tiêm mao Là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản ứng catalase dương, cytocrom oxidase âm tính, phản ứng oxy hóa âm và lên men trong môi

trường O/F glucose Thường gặp 2 loài : Edwardsiella tarda và Edwardsiella

ictaluri Vi khuẩn E ictaluri đầu tiên được phân lập vào năm 1976 khi nó được xác

định là nguyên nhân gây chết hàng loạt trên cá da trơn Mỹ (Waltman và ctv, 1986)

Vi khuẩn Edwardsiella spp thường gây bệnh ở các loài cá nước ấm Ở Việt Nam,

E ictaluri được phân lập từ cá tra giống và cá tra thịt Bệnh gây thiệt hại lớn trong

các ao nuôi cá tra hương (4-6 cm) đến 5 – 6 tháng tuổi, tỉ lệ chết của cá từ 60 – 70%, có khi tới 100% Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu và trong

ao nuôi mật độ cao, chất lượng nước xấu và trong nuôi cá lồng bè

Cá bệnh do nhiễm khuẩn E ictaluri thường kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy yếu,

bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt lồi Một số cơ quan nội tạng như gan, lá lách, thận bị hoại tử tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5 – 2,5 mm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2005)

- Phương pháp gây cảm nhiễm bằng cách tiêm dung dịch vi khuẩn: tiêm 0,1

ml dung dịch vi khuẩn ở nồng độ xác định tùy vào loài vi khuẩn Cá ở nghiệm thức đối chứng được tiêm dung dịch PBS (phosphate buffer saline)

- Phương pháp gây cảm nhiễm bằng cách tiêm qua ống thông dạ dày: bơm thức ăn có trộn vi khuẩn gây bệnh vào dạ dày của cá ở một nồng độ nhất định tùy vào loài vi khuẩn Cá ở nghiệm thức đối chứng được bơm thức ăn không chứa vi khuẩn gây bệnh

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu Thủy sản Novus Với diện tích 1.000 m2 trong khuôn viên trường Đại học Nông Lâm, Trung tâm nghiên cứu Novus được trang bị hệ thống trang thiết bị cho văn phòng, phòng vi sinh, phòng chất lượng nước, phòng thức ăn Đồng thời Trung tâm có các hệ thống tuần hoàn gồm các bể có thể tích từ 80 lít đến 1.000 lít để tiến hành các thí nghiệm độc lập nhau

3.1.2 Thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm của đề tài được tiến hành trong khoảng thời gian từ tháng 4/2010 đến tháng 10/2010

3.2 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá hiệu quả của các nguồn bổ sung kẽm khác nhau trong khẩu phần thức ăn thực nghiệm lên tăng trưởng và sức kháng bệnh của cá tra

3.3 Vật liệu và trang thiết bị

3.3.1 Đối tượng khảo sát

Cá tra giống (trọng lượng trung bình 5 g) được mua từ trại giống ở Bình Dương Sau khi vận chuyển về Trung tâm, cá được nuôi trong bể composite để thích nghi với điều kiện mới thông qua qui trình kiểm dịch chuẩn của trung tâm Sau khoảng 2 – 3 tuần cá đạt trọng lượng trung bình khoảng 7 - 8 g thì tiến hành chọn những cá khỏe mạnh, kích cỡ đồng đều, không bị xây xát hay dị tật để tiến hành thí nghiệm

Khi tiến hành thí nghiệm, cá sẽ được chọn ngẫu nhiên vào 48 bể, với mật độ

50 con mỗi bể Sau 12 tuần thí nghiệm, tất cả cá trong các bể được cân, đếm số lượng để tính tỷ lệ sống, đánh giá tốc độ tăng trưởng và các yếu tố khác

3.3.2 Hệ thống thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trong hai hệ thống tuần hoàn khép kín (A và B), mỗi hệ thống có 24 bể composite thể tích 300 lít mỗi bể Hệ thống được trang bị gồm: bộ lọc cơ học, bộ khử trùng bằng tia UV và bộ lọc sinh học

Hình 3.1 Hệ thống thí nghiệm 3.3.3 Nguồn nước

Nguồn nước sử dụng cho hệ thống thí nghiệm là nước máy được trữ trong

bể chứa có sục khí Nước trong các bể thí nghiệm sẽ qua hệ thống lọc cơ học rồi được xử lý bằng tia UV, sau đó đi qua hệ thống lọc sinh học rồi trở lại các bể nuôi

Bảng 3.1 Thành phần nguyên liệu của thức ăn cơ bản(1)

(1) Khẩu phần cơ bản chứa 24,2 mg Zn/kg thức ăn

(2) (g/kg premix): CoCl 2 6H 2 O 0,74;CuSO 4 5H 2 O 2,5; FeSO 4 7H 2 O 73,158;

MgSO 4 7H 2 O 283,98; MnSO 4 H 2 O 6,5; KI 0,68; Na 2 SeO 3 0,1; cellulose

633,008

(3) (g/kg premix): Thiamin HCl 0,438; Riboflavin 0,632; Pyridoxine

hydrochloride 0,908; D-Pantothenic acid hemicalcium salt 1,724; Nicotinic

acid 4,583; Biotin 0,211; Folic acid 0,549; Vitamin B12 0,001; Inositol

21,053; Menadione sodium bisulfite 0,889, Vitamin acetate 0,677; Vitamin

0,50 0,10 2,25 2,25 0,10 1,80 1,00 Tổng 100,00

Khẩu phần cơ bản chứa 32% protein, năng lượng thô 3.800 kcal/kg Kẽm sulphate và phức hợp kẽm chelate (Mintrex Zn) là hai nguồn kẽm sẽ được sử dụng

ở 4 mức độ 15, 30, 60 và 120 mg Zn/kg thức ăn đối với kẽm vô cơ và 3 mức độ 15,

30 và 60 mg Zn/kg thức ăn đối với kẽm hữu cơ, tương ứng với sự giảm dần của alpha-cellulose (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Các nghiệm thức thức ăn trong thí nghiệm

Nghiệm thức (NT) ZnSO4 (mg/kg) Zn – chelate (mg/kg)

Các nguyên liệu đó được phối trộn trong máy trộn Hobart trong 30 phút Sau

đó dầu sẽ được cho vào hỗn hợp đó và được làm đồng nhất trong máy trộn này trong khoảng 15 phút Một lượng nước cất vừa đủ (khoảng 50%) được cho vào để định dạng viên thức ăn, sau đó hỗn hợp được đồng nhất kỹ hơn Thức ăn được tạo viên bằng máy ép viên Hobart có đường kính các lỗ là 2 mm Các viên thức ăn sẽ được làm khô ở nhiệt độ phòng, sau đó sẽ được trữ ở tủ đông (-5 oC) cho đến khi sử dụng Trước khi cho ăn, thức ăn được bảo quản ở 4 oC

Bể composite thể tích 2 m3 dùng để chứa cá trước khi thí nghiệm

Máy đo DO, pH cầm tay

Máy đo NH3, nitrite, độ kiềm

Cân, thước đo, vợt

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung kẽm hữu cơ

và vô cơ lên tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn

Thí nghiệm được tiến hành để đánh giá hiệu quả của các nguồn kẽm khác nhau trong khẩu phần thức ăn thực nghiệm Trong thí nghiệm này, 8 khẩu phần ăn được thiết lập cùng mức protein và năng lượng Trong đó, kẽm sulphate và phức hợp Zn chelate (Mintrex Zn) là hai nguồn kẽm được bổ sung vào các khẩu phần tương ứng với sự giảm dần của alpha-cellulose Kẽm sulphate được bổ sung ở 4 nồng độ (15, 30, 60 và 120 mg Zn/kg thức ăn) và 3 nồng độ cho kẽm hữu cơ (15,

30 và 60 mg Zn/kg thức ăn) Thêm vào đó một nghiệm thức đối chứng không bổ

sung kẽm được sử dụng

3.4.1.1 Theo dõi các chỉ tiêu môi trường

Nhiệt độ, DO, pH được kiểm tra hàng ngày bằng máy Ngoài ra, hàng tuần

NH3, nitrite, độ kiềm được kiểm tra hàng tuần bằng máy quang phổ Nhiệt độ nước trong hệ thống thí nghiệm sẽ được duy trì trong khoảng 28 – 32 oC Oxy hòa tan được duy trì ở mức gần bão hòa để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho cá nuôi pH cũng

sẽ được điều chỉnh trong khoảng 6,5 – 7,5

3.4.1.2 Quản lý và chăm sóc cá

Trước khi bắt đầu thí nghiệm, tất cả cá sẽ được cho ăn thức ăn cơ bản trong thời gian để cá thích nghi với điều kiện thí nghiệm Cá được cho ăn từ từ bằng tay đến khi thỏa mãn, mỗi ngày 2 lần, vào lúc 9 giờ sáng và 4 giờ chiều

3.4.1.3 Phương pháp lấy mẫu và phân tích số liệu

Sau 12 tuần thí nghiệm, cá sẽ được đếm và cân trọng lượng Sau khi cho ăn lần cuối cùng 20 giờ, từ mỗi bể lấy 15 con để làm mẫu phân tích Trong 15 con lấy mẫu, chọn ngẫu nhiên 5 con để phân tích hàm lượng kẽm trong toàn bộ cơ thể, số

cá còn lại được lấy máu để xác định hoạt tính enzyme lysozyme Đồng thời gan cá cũng được trữ lại để xác định hoạt tính enzyme superoxide dimutase (SOD)

Tăng trọng, tỷ lệ sống, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR), hiệu quả sử dụng protein (PER), tăng trọng ngày (DWG), tốc độ tăng trọng đặc biệt (SGR), hệ số gan/thể trọng (HSI), lượng ăn hàng ngày FI (g/con/ngày) được tính theo các công thức sau:

Tăng trọng (%) = (Trọng lượng cuối – Trọng lượng đầu)*100/Trọng lượng đầu

DWG (g/ngày) = (Trọng lượng cuối – Trọng lượng đầu)/Thời gian thí nghiệm

SGR (%/ngày) = [Ln(trọng lượng cuối) – Ln(trọng lượng đầu)]*100/Thời gian thí

nghiệm

PER = (Trọng lượng cuối – Trọng lượng đầu)/Trọng lượng protein ăn vào

HSI = Trọng lượng gan*100/Trọng lượng thân

Tỷ lệ sống = Số cá còn sống*100

FCR =Lượng thức ăn khô sử dụng/Tăng trọng cá trong thí nghiệm

FI (g/con/ngày) = Tổng lượng thức ăn sử dụng/(Tổng số cá*Tổng số ngày thí

nghiệm)

Tất cả các số liệu thu thập được sau thí nghiệm sẽ được tính toán và sau đó

xử lý bằng phần mềm thống kê Minitab 13 (Minitab, Inc., Hoa Kỳ) để đánh giá các chỉ tiêu

3.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh của cá sau khi sử dụng thức ăn bổ sung các nguồn kẽm khác nhau

3.4.2.1 Nuôi cấy vi khuẩn

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri giống NLF33 có nguồn gốc từ trường Đại

học Nông Lâm TP HCM Quá trình tăng sinh vi khuẩn trải qua 3 giai đoạn: từ vi khuẩn giống được trữ ở tủ -80 oC chuyển qua ống nghiệm 50 ml chứa 30 ml dung dịch TSB, sau đó đặt vào tủ lắc với vận tốc 100 vòng/phút ở 30 oC Sau 24 giờ chuyển toàn bộ vi khuẩn sang bình tam giác 500 ml chứa 220 ml dung dịch TSB cũng lắc với vận tốc 100 vòng/phút ở 30 oC Tiến hành tương tự khi chuyển vi khuẩn sang bình tam giác 1.000 ml chứa 450 ml dung dịch TSB Tất cả dụng cụ phải được tiệt trùng trước khi sử dụng

Đồng thời với quá trình tăng sinh thì sự kiểm tra độ thuần của vi khuẩn cũng được tiến hành Vi khuẩn giống được cấy lên môi trường TSA, sau 48 giờ kiểm tra

độ thuần, nếu có một loại khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa cấy thì cho thấy rằng vi khuẩn gốc ban đầu rất thuần, không bị tạp nhiễm Nếu có nhiều loại khuẩn lạc xuất

hiện chứng tỏ dung dịch vi khuẩn gốc bị tạp nhiễm, sẽ ảnh hưởng đến kết quả gây nhiễm

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

TSB (Tryptic Soy Broth): hòa tan 3g TSB trong 100 ml nước cất

TSA (Tryptic Soy Agar): hòa tan 3g TSB và 1,5 agar trong 100 ml nước cất Sau đó môi trường TSA, TSB được hấp tiệt trùng ở 121oC trong vòng 15 phút Khi môi trường TSA hạ xuống còn khoảng 50 oC thì tiến hành đổ đĩa petri Môi trường TSB để ở nhiệt độ phòng

Cách xác định nồng độ vi khuẩn

Sau 24 giờ tăng sinh vi khuẩn ở bình tam giác 1000 ml, tiến hành cấy vi khuẩn để xác định nồng độ Lấy 7 ống nghiệm, đánh dấu từ 1 – 7, tiến hành pha loãng như sau:

Ống nghiệm 1 (A): 1 ml vi khuẩn + 9 ml TSB

Nguyên tắc đếm: chỉ đếm ở những nồng độ cho khuẩn lạc từ 30 – 300 khuẩn

lạc/đĩa

Hình 3.6 Cách cấy để xác định mật độ vi khuẩn 3.4.2.2 Phương pháp gây bệnh

a Nguồn cá

Sau 12 tuần thí nghiệm cho ăn với thức ăn ở các nồng độ kẽm khác nhau, từ mỗi nghiệm thức chọn ngẫu nhiên 60 con cá cho vào bể ổn định 2 ngày để chuẩn bị cho thí nghiệm gây bệnh

b Gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm

Từ mỗi nghiệm thức với 60 con cá được phân phối ngẫu nhiên vào 3 bể composite thể tích 100 lít (20 con/bể) Sau 2 ngày ổn định cùng với nguồn vi khuẩn

đã chuẩn bị, tiến hành cảm nhiễm cá với vi khuẩn gây bệnh ở nồng độ 106 CFU/ml

Từ nguồn vi khuẩn gốc tiến hành pha loãng trong 10 lít nước để được dung dịch vi khuẩn 106 CFU/ml Sau đó ngâm cá vào dung dịch vi khuẩn ở nhiệt độ phòng Sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn được 30 phút, chuyển cá trở lại bể và theo dõi tỉ lệ chết trong vòng 2 tuần ở điều kiện có sục khí và ở nhiệt độ phòng

3.4.2.3.Thu thập số liệu và ghi nhận kết quả

Sau khi ngâm cá với dung dịch vi khuẩn, cá được đưa vào các bể nuôi có sục khí để theo dõi và ghi nhận tỉ lệ chết Khi cá bắt đầu chết, tiến hành lấy mẫu để phân lập vi khuẩn xác định xem nguyên nhân cá chết có phải do vi khuẩn không Đồng thời cũng phải quan sát những dấu hiệu của cá chết như xuất huyết, gan thận

có mủ, sưng to