NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU GIỐNG VỪNG (Sesamum spp.) Ở PHÍA NAM VIỆT NAM SỬ DỤNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

Sử dụng phần mềm Popgen 1.32 để phân tích các chỉ số đa dạng di truyền và phần mềm Alerquin 3.1 phân tích biến động di truyền trong mỗi mẫu giống vừng và giữa 13 mẫu giống với nhau.. Để

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

KHOA NÔNG HỌC

**************

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU GIỐNG

VỪNG (Sesamum spp.) Ở PHÍA NAM VIỆT NAM SỬ DỤNG

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ

SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 03/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

**************

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU GIỐNG

VỪNG (Sesamum spp.) Ở PHÍA NAM VIỆT NAM SỬ DỤNG

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI `VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ

SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU GIỐNG

VỪNG (Sesamum spp.) Ở PHÍA NAM VIỆT NAM SỬ DỤNG

ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ

SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: GS.TS MAI VĂN QUYỀN

Viện CN Sau thu hoạch

2 Thư ký: TS PHẠM THỊ MINH TÂM

Trường Đại học Nông Lâm TPHCM

3 Phản biện 1: PGS TRỊNH XUÂN VŨ

Trung tâm CNSH TP.HCM

4 Phản biện 2: TS VÕ THÁI DÂN

Trường Đại học Nông Lâm TPHCM

5 Ủy viên: TS BÙI MINH TRÍ

Trường Đại học Nông Lâm TPHCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Nguyễn Thị Thùy Dương, sinh ngày 16 tháng 12 năm 1983 tại quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ; là con của ông Nguyễn Văn Nở và bà Nguyễn Thị Thảnh

Tốt nghiệp Tú tài tại Trường Trung học phổ thông chuyên Lý Tự Trọng, quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ

Tốt nghiệp Đại học ngành Công Nghệ Sinh Học, hệ chính quy tại Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, năm 2005

Sau đó làm việc tại Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Tháng 9 năm 2007 theo học Cao học ngành Nông học tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Tình trạng gia đình:

Năm kết hôn: 2007

- Chồng: Hà Mạnh Hùng

- Con: Hà Nam, sinh năm 2009

Địa chỉ liên lạc: Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Điện thoại cá nhân: 0935 54 3377

Điện thoại cơ quan: 08-37220294

Email: duongby@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của tôi Các số liệu, kết quả được nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được bất cứ ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

Nguyễn Thị Thùy Dương

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh;

- Các Thầy Cô trong Khoa Nông học cùng các Thầy Cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt 2 năm cao học vừa qua, cám ơn các Thầy Cô đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng gửi lời biết ơn đến:

- TS Bùi Minh Trí đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như tạo điều kiện tốt nhất cho việc thực hiện và hoàn tất đề tài tốt nghiệp

- Cô Nguyễn Thị Xuyến, trường Cao đẳng Nông nghiệp Nam Bộ, tỉnh Tiền Giang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian trồng và thu thập mẫu vừng ngoài đồng

- TS Phạm Đức Toàn đã hết lòng chỉ dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

- Em Huỳnh Quốc Thái đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc thực hiện thí nghiệm trồng vừng ngoài đồng ruộng

- Chương trình hợp tác nghiên cứu Việt Nam - Thụy Điển (SIDA/SAREC)

đã hỗ trợ tài chính thực hiện đề tài này

- Gia đình, các bạn, đồng nghiệp đã động viên, chia sẻ và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

TP HCM, tháng 03 năm 2012

Nguyễn Thị Thùy Dương

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đa dạng di truyền một số mẫu giống vừng

(Sesamum spp.) ở phía nam Việt Nam sử dụng đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử

SSR (simple sequence repeats)” được tiến hành tại khu thực nghiệm trường Cao đẳng Nông nghiệp Nam Bộ, tỉnh Tiền Giang và tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật – Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, thời gian thực hiện từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 10 năm 2009

Nghiên cứu được thực hiện trong đề tài bao gồm:

- Bố trí thí nghiệm ngoài đồng cho 13 mẫu giống vừng thu thập từ các tỉnh phía nam Việt Nam Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) một nhân tố với 13 nghiệm thức (tương đương 13 mẫu giống vừng), 3 lần lặp lại tương ứng với 3 khối Theo dõi và ghi nhận các số liệu về 14 đặc điểm hình thái, sử dụng phần mềm Statgraphics XV phân tích số liệu và xây dựng cây phân nhóm di truyền dựa trên các đặc điểm hình thái

- Phân tích sự đa dạng di truyền của 13 mẫu giống vừng thí nghiệm với 10 cặp mồi SSR Sử dụng phần mềm Popgen 1.32 để phân tích các chỉ số đa dạng di truyền và phần mềm Alerquin 3.1 phân tích biến động di truyền trong mỗi mẫu giống vừng và giữa 13 mẫu giống với nhau Xây dựng cây phân nhóm di truyền theo phương pháp UPGMA bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 kết hợp phân tích độ tin cậy của sự phân nhóm thông qua hệ số Bootstrap (sử dụng phần mềm Freetree kết hợp Treeview 3.2)

Kết quả thu được như sau:

1 Có sự khác biệt rõ rệt về các đặc điểm hình thái giữa 13 mẫu giống vừng (p<0,05) (trừ tính trạng ngày thu hoạch (p>0,05))

2 Kết quả xây dựng cây phân nhóm di truyền dựa vào đặc điểm hình thái cho

ta 2 nhóm lớn: Nhóm I bao gồm 2 mẫu giống vừng 26CT và 107CABO; Nhóm II bao gồm các mẫu giống vừng còn lại

3 Sử dụng 10 cặp mồi phát hiện các chỉ thị SSR, kết quả thu được 63 băng, đều

là các băng đa hình (tỉ lệ băng đa hình chiếm 100%)

4 Kết quả phân tích cho thấy chỉ số đa hình (PIC) của các mồi dao động trong khoảng từ 0,1 đến 0,9, trung bình 0,6 Trong đó, mồi Sesame-09 cho PIC cao nhất (0,9), còn mồi GBssr-sa-33 cho PIC thấp nhất (0,1) Chỉ số Nm (gene flow) dao động trong khoảng từ 0,02 đến 0,296, trung bình khoảng 0,14

5 Chỉ số dị hợp tử HE (Expected heterozygosity) nằm trong khoảng 0,1 đến 0,9, trung bình khoảng 0,6; HO (observed heterozygosity) trung bình 0,4, dao động trong khoảng 0,03 (mồi GBssr-sa-33)-0,80 (mồi GBssr-sa-08) Còn chỉ

số dị hợp tử trung bình (Ave-HE) của mỗi mồi trên 13 mẫu giống vừng khá thấp, dao động từ 0,02-0,45, trung bình khoảng 0,21

6 Trắc nghiệm AMOVA thể hiện phần trăm biến động di truyền giữa 13 mẫu giống vừng thí nghiệm khá cao (64,1%), còn sự biến động di truyền trong mỗi mẫu giống vừng thí nghiệm là khá thấp (35,9%)

7 Cây phân nhóm di truyền dựa vào các chỉ thị SSR chia 13 mẫu giống vừng làm 3 nhóm: nhóm I gồm mẫu giống 54CABO; nhóm II gồm mẫu giống 107 CABO; nhóm III bao gồm 11 mẫu giống còn lại

The thesis “Combination of morphological and SSR (Simple Sequence

Repeats) markers in genetic diversity analysis of seasame accessions (Sesamum indicum L.) in the South of Vietnam” was carried out at the reseach station of

Southern Agricultural College in Tien Giang and in plant biotechnology laboratory, Reseach Insitute of Biotechnology and Enviroment, University of Agriculture and Forestry in Ho Chi Minh City Experiments were carried out from March 2008 to October 2009

Thirteen sesame accessions used in this study were collected from various regions in southern Vietnam and Cambodia The field layout was based on Randomized Complete Block Design with three replications Fourteen agronomic traits were recorded, then the data were calculated using Microsoft excel and Statgraphics XV while phylogenetic relationship between accessions were estimated using group average cluster analysis Ten SSR markers were used to estimate genetic diversity of the 13 accessions Genetics variation and genetic structure were computed with the POPGEN software version 1.32 Analysis of molecular variance (AMOVA) was generated using Alerquin software version 3.1 UPGMA dendrogram was built by using NTSYSpc 2.1 software, bootstrap analysis was done using Freetree and Treeview 3.2 softwares The ontained results indicated that among 13 sesame accessions, there were significant differences between the accessions for almost characters (p ≤ 0.05) (accept the harvest day (p>0.05) Cluster analysis for phylogenetic relationship between accessions showed that sesame accessions grouped into two main clusters: the first group consisted 26CT and 107CABO, while the second group included all of the remaining accessions

SSR analysis with ten primers gave 63 amplicons Rate of polymorphics was 100% The polymorphism information contents (PIC) of markers varied from 0.10

to 0.90 with an average of 0.60 The marker “Sesame-09” revealed a highest PIC of 0.90, while the marker “GBssr-sa-33” had the lowest PIC of 0.10 Gene flow (Nm) was found of 0.14 on average and ranged from 0.02 to 0.29 Expected heterozygosity (HE) ranged from 0.10 to 0.90 with a mean of 0.60 Average of

observed heterozygosity (HO) was 0.4 and ranged between 0.03 (GBssr-sa-33) and 0.80 (GBssr-sa-08) Average heterozygosity (Ave-HE) of each locus was low among

13 sesame accessions with an average of 0.21 and ranged from 0.02 to 0.45 The results from analysis of molecular variance (AMOVA) of 13 sesame accessions displayed a high percentage of genetic variation among populations (64.1%) and percentage of genetic variation within population was as low as 35.9% Dendrogram based on UPGMA analysis grouped the 13 sesame accessions into three main groups Group I and group II had only one accession (54CABO and 107CABO accession, respectively) Cluster III was the biggest group and included 11 accessions

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm tạ iv

Tóm tắt v

Summary vii

Mục lục ix

Danh sách các chữ viết tắt xiii

Danh sách các bảng xv

Danh sách các hình xvi

1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu, yêu cầu và giới hạn của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.2.3 Giới hạn đề tài 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nguồn gốc và phân bố 3

2.2 Công dụng và giá trị kinh tế 3

2.2.1 Giá trị dinh dưỡng trong hạt vừng 3

2.2.2 Công dụng 4

2.3 Tình hình sản xuất trong và ngoài nước 5

2.4 Phân loại và đặc điểm thực vật học 7

2.4.1 Phân loại 7

2.4.2 Đặc điểm thực vật học cây vừng 8

2.5 Sự sinh trưởng và phát triển của cây vừng 11

2.6 Điều kiện sinh thái 13

2.6.1 Điều kiện nhiệt độ 13

2.6.2 Điều kiện ánh sáng 13

2.6.3 Yêu cầu về lượng nước 13

2.6.4 Cao độ 14

2.6.5 Gió 14

2.6.6 Đất đai 14

2.7 Một số nghiên cứu trên cây vừng 15

2.8 Đa dạng di truyền và một số kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di

truyền 18

2.8.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học 18

2.8.2 Sự đa dạng về di truyền 18

2.8.3 Các kỹ thuật được sử dụng để nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền 20

2.8.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 20

2.8.3.2 Các chỉ thị được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền 21

2.9 Giới thiệu về kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) hay Microsatellites 23

2.9.1 Khái niệm về SSR 23

2.9.2 Vai trò của SSR 23

2.9.3 Kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị phân tử SSR (kỹ thuật SSR) 24

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm 26

3.2 Nội dung 1: Khảo sát đa dạng di truyền dựa trên đặc điểm hình thái 13 mẫu mẫu giống vừng trồng thực nghiệm 26

3.2.1 Vật liệu 26

3.2.2 Bố trí thí nghiệm 27

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.2.3.1 Ghi nhận các đặc điểm hình thái 28

3.2.3.2 Phân tích số liệu 29

3.3 Nội dung 2: Khảo sát đa dạng di truyền 13 mẫu mẫu giống vừng bằng kỹ thuật SSR 29

3.3.1 Vật liệu 29

3.3.2 Hóa chất và thiết bị phản ứng SSR 30

3.3.3 Thiết bị và dụng cụ 31

3.3.4 Phương pháp nghiên cứu 32

3.3.4.1 Quy trình ly trích DNA 32

3.3.4.2 Phản ứng PCR-SSR 33

3.3.4.3 Phản ứng SSR 33

3.3.4.4 Phân tích số liệu 34

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Khảo sát đa dạng di truyền dựa trên đặc điểm hình thái 13 mẫu giống vừng trồng thực nghiệm 36

4.1.1 Chiều cao cây 37

4.1.2 Độ dài lóng 37

4.1.3 Sự phân nhánh 38

4.1.4 Tổng số lá trên cây 43

4.1.5 Sự hình thành trái 44

4.1.6 Số trái trên vòng lá 46

4.1.7 Các tính trạng liên quan đến năng suất các mẫu giống vừng 47

4.1.8 Một số hiện tượng khác thường quan sát được trong quá trình gieo trồng ngoài đồng 49

4.1.9 Xây dựng cây phân nhóm dựa vào các tính trạng hình thái 51

4.2 Khảo sát đa dạng di truyền 13 mẫu giống vừng trồng thực nghiệm bằng kỹ

thuật SSR 53

4.2.1 Kết quả ly trích DNA 53

4.2.2 Kết quả điện di trên máy giải trình tự ABI3100 của các sản phẩm PCR 53

4.2.3 Đánh giá sự đa dạng gen của các mẫu giống vừng thí nghiệm 54

4.2.4 Đánh giá sự biến thiên trong quần thể các mẫu giống vừng thí nghiệm 57

4.2.5 Đánh giá mối quan hệ di truyền của 13 mẫu giống vừng thí nghiệm 57

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62

5.1 Kết luận 62

5.2 Đề nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 67

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified fragment length polymorphism (Kỹ thuật đa hình về chiều dài các

đoạn DNA được nhân bản)

AMOVA: the analysis of molecular variance (Phân tích nguồn biến lượng phân tử) ANOVA: analysis of variance (phân tích nguồn biến lượng)

ASPAC: The Australasian Soil & Plant Analysis Council (Hội đồng phân tích đất

và cây trồng Úc)

Ave-HE: Average heterozygosity (Chỉ số dị hợp tử trung bình)

bp: base pair (cặp bazơ)

DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

EB: extraction buffer (dịch ly trích)

EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông Lương Thế giới)

H: Shannon's Information index (Chỉ số Shannon)

HE: expected heterozygosity (Hệ số dị hợp tử mong đợi)

HO: observed heterozygosity (Hệ số dị hợp tử quan sát)

Na: number of alleles (Số alen)

Ne: Effective number of alleles (Số ellen thực tế)

Nm: gene flow (Dòng chảy gen hay Di nhập gen)

NTSYS: Numercial Taxonomy System

OD: Optical density (Mật độ quang)

PCA: Principal coordinate analysis

PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng nhân bản DNA in-vitro)

PIC: polymorphism information content (Chỉ số đa hình)

RAPD: Random amplified polymorphic DNA (Đa hình các đoạn DNA được nhân

bản ngẫu nhiên)

RCBD: Randomized Complete Block Design (Kiểu bố trí thí nghiệm khối hoàn

toàn ngẫu nhiên)

RFLP: Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài các đoạn

DNA cắt giới hạn)

SDS: Sodium Dodecyl Sulfat

SSCP: Single-strand conformation polymorphism (Đa hình trong mạch đơn của

DNA)

SSRs: Simple Sequence Repeats (Đoạn trình tự lặp lại đơn giản)

Ta: Annealing temperature (Nhiệt độ bắt cặp)

Taq-polymerase: Thermus aquaticus polymerase

TBE: Tris – borate – EDTA

TE: Tris – EDTA

Tm: Melting temperature (Nhiệt độ nóng chảy)

UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic (Phương pháp tính

khoảng cách trung bình với giá trị số đại số)

WWF: The World Wide Fund for Nature (Quỹ quốc tế bảo vệ thiên nhiên)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng ở các nước trồng vừng chính 2007 6

Bảng 2.2 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển cây vừng 12

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu mẫu giống vừng sử dụng trong thí nghiệm 27

Bảng 3.2 Các chỉ tiêu theo dõi và cách thu thập số liệu ngoài đồng 28

Bảng 3.3 Danh sách mồi sử dụng trong phản ứng PCR-SSR 31

Bảng 3.4 Thành phần hoá chất sử dụng trong phản ứng PCR-SSR 33

Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR-SSR 33

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất điện di sản phẩm SSR bằng máy giải trình tự gen ABI 3100 34

Bảng 4.1 Kết quả thống kê về chiều cao cây, số nhánh và độ dài lóng của 13 mẫu giống vừng 38

Bảng 4.2 Kết quả thống kê về sự phân nhánh của 13 mẫu giống vừng 39

Bảng 4.3 Kết quả thống kê về tổng số lá trên cây của 13 mẫu giống vừng 44

Bảng 4.4 Kết quả thống kê về ngày ra hoa, ra trái đầu tiên, kích thước trái, số trái/vòng lá của 13 mẫu giống vừng thí nghiệm 44

Bảng 4.5 Các chỉ tiêu về năng suất trên 13 mẫu giống vừng trồng thí nghiệm 48

Bảng 4.6 Sản phẩm khuyếch đại của 10 cặp mồi sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền của 13 mẫu giống vừng 54

Bảng 4.7 Kết quả phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm POPGEN 3.2 56

Bảng 4.8 Kết quả phân tích biến động di truyền (AMOVA) của 13 mẫu giống vừng thí nghiệm bằng chỉ thị phân tử SSR 57

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hạt vừng đen (Sessamum indicum L.) và vừng vàng (Sesamum oriental

L.) .7

Hình 2.2 Rễ vừng có dạng cọc và nhiều rễ phụ 8

Hình 2.3 Các dạng trái khi thu hoạch 10

Hình 2.4 Một số dạng kích cỡ và màu sắc của hạt vừng 11

Hình 2.5 Nguyên tắc phản ứng PCR 21

Hình 2.6 Nguyên tắc của kỹ thuật SSR 25

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 27

Hình 4.1 Thử tỷ lệ nảy mầm trong đĩa petri (A) và trong bầu đất (B) 36

Hình 4.2 Đất được cải tạo và xử lý thuốc diệt cỏ trước khi bố trí thí nghiệm 37

Hình 4.3 (a) Các kiểu phân nhánh ở các mẫu giống vừng thí nghiệm 40

Hình 4.3 (b) Các kiểu phân nhánh ở các mẫu giống vừng thí nghiệm (tt) 41

Hình 4.3 (c) Các kiểu phân nhánh ở các mẫu giống vừng thí nghiệm (tt) 42

Hình 4.3 (d) Các kiểu phân nhánh ở các mẫu giống vừng thí nghiệm (tt) 43

Hình 4.4 (a) Số trái trên vòng lá ở một số mẫu giống vừng 46

Hình 4.4 (b) Số trái trên vòng lá ở một số mẫu giống vừng (tt) 47

Hình 4.5 Hiện tượng kết chùm trong quá trình sinh trưởng của cây 50

Hình 4.6 Dạng trái nhiều khía ghi nhận được ở mẫu giống vừng 134CABO 51

Hình 4.7 Biểu đồ phân nhóm 13 mẫu giống vừng dựa trên các chỉ tiêu hình thái 52

Hình 4.8 Kết quả điện di DNA 53

Hình 4.9 Biểu đồ phân nhóm 13 mẫu giống vừng dựa trên các chỉ thị SSR 58

Hình 4.10 Biểu đồ PCA- 2D của 13 mẫu giống vừng dựa trên các chỉ thị SSR 58

Hình 4.11 Biểu đồ PCA-3D của 13 mẫu giống vừng dựa trên các chỉ thị SSR 59

Chương 1

GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cây vừng (Sesamum spp.) là một loại cây trồng có dầu quan trọng ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới Hàm lượng dầu trong hạt vừng rất cao (từ 50% tới 60% dầu trên trọng lượng hạt), vì vậy mà chúng được biết đến như là vua trong các loại cây có dầu

Vừng là loài cây chịu hạn rất tốt, có thể sinh trưởng trên các loại đất khác nhau và rất thích hợp trong luân canh gối vụ Hiện nay, cây vừng đã được trồng rộng rãi khắp nơi, đem lại nhiều lợi nhuận cho người canh tác Hạt vừng còn được dùng trực tiếp trong các thực phẩm truyền thống khác nhờ vào giá trị dinh dưỡng cao, chất lượng dầu tốt, ít bị oxi hóa, đồng thời cũng có thể là nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel Vì vậy, việc gia tăng diện tích canh tác cũng như nâng cao kỹ thuật trồng vừng ngày càng được quan tâm Theo ghi nhận của FAO, có hơn 7,5 triệu hecta vừng được trồng trên thế giới vào năm 2008 và sản xuất được khoảng 3,6 triệu tấn Mặc dù tiềm năng và triển vọng của cây vừng là khá lớn, nhưng hiện tại cây vừng ở Việt Nam chưa được chú trọng nên diện tích, năng suất và sản lượng chưa cao Nguyên nhân do hiện nay công tác đầu tư cho nghiên cứu và ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất vừng còn chưa đúng mức, nên năng suất vừng nước

ta vẫn còn thấp, chưa đạt hiệu quả kinh tế cao Bên cạnh đó, thông tin về tài nguyên

di truyền ở cây vừng còn giới hạn, chỉ có một vài nghiên cứu về đa dạng kiểu hình

Vì thế, việc xác định đa dạng di truyền các giống vừng sẽ là sự đóng góp to lớn cho

sự thành công các chương trình giống; đồng thời xác định được biến động di truyền góp phần mang lại hiệu quả trong việc quản lý và sử dụng nguồn gen

Để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị phân tử (RFLP, RAPD, AFLP, SSR, SSCP) Tuy nhiên, để đánh giá đa hình một cách chính xác và tăng hiệu quả chọn lọc cần dùng kỹ thuật phân tích gen bằng các chỉ thị phân tử Những kỹ thuật này đều có ưu, khuyết điểm riêng, và đều

có tiềm năng xác định đa hình dựa vào sự khác biệt của các đoạn DNA Trong các chỉ thị phân tử, chỉ thị SSR cho kết quả đáng tin cậy và tính đa hình cao giữa các cá thể, đồng thời SSR là một chỉ thị phân tử đồng trội có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử Đây là lý do để chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên

cứu đa dạng di truyền một số mẫu giống vừng (Sesamum spp.) ở phía Nam Việt

Nam sử dụng đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeats)”

1.2 Mục tiêu, yêu cầu và giới hạn của đề tài

1.2.1 Mục tiêu

Sử dụng sự khác biệt về kiểu hình và các chỉ thị phân tử SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của các mẫu giống vừng ở phía Nam Việt Nam làm tiền đề cho việc đánh giá tài nguyên giống vừng ở Việt Nam

đa dạng di truyền trên cây vừng tại Việt Nam Mặt khác, do đề tài chỉ thực hiện trên

13 mẫu giống vừng ở phía Nam Việt Nam nên kết quả cũng chỉ phản ánh sơ bộ mức

độ đa dạng của 13 mẫu giống vừng trong phạm vi nghiên cứu của đề tài

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc và phân bố

Cây vừng có tên khoa học là Sesamum spp., có nguồn gốc từ châu Phi Nhiều

ý kiến cho rằng Êtiopi là nguyên sản của giống vừng hiện nay Tuy nhiên, cũng có ý kiến cho rằng vùng Afghan-Persian mới là nguyên sản của các giống vừng trồng Cây vừng là loại cây có dầu được trồng rất lâu đời (vào khoảng 2000 năm trước công nguyên), sớm phát triển ở vùng phía Tây Á, dần dần được phân bố đến Ấn Độ, Trung Quốc và Nhật Bản Những nơi này được xem như là trung tâm phân bố của cây vừng

Hiện nay, vừng đã được gieo trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới

và thông qua việc chọn tạo giống thì một số giống có thể trồng thích hợp ở một số nước ôn đới (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.2 Công dụng và giá trị kinh tế

2.2.1 Giá trị dinh dưỡng trong hạt vừng

Vừng có giá trị dinh dưỡng cao, trong hạt vừng chứa: 45 - 55% dầu, 19 - 20% protein, 8 - 11% đường, 5% nước, 4 - 6% chất tro Ngoài các thành phần trên trong hạt vừng còn có 2 hợp chất: sesamin và sesamolin thuộc về nhóm chất xơ đặc biệt được gọi là lignan có tác dụng giảm cholesterol ở người, điều trị cao huyết áp, sesamin còn bảo vệ gan không bị oxi hóa

Thành phần acid hữu cơ chủ yếu của dầu vừng là hai loại acid béo chưa no acid olecic (chiếm 45,5 – 49,4%) và acid linoleic (chiếm 37,7 – 41,2%) Ngoài ra còn có acid palmitic, acid stearic, acid arachidic, sesamol, vitamin E, lecithin (0,65%), planteose, sesamose, cytochrome C, acid nicotinic (0,48%), acid folic

(18,45%), sucrose (0,64%), các loại protein: alpha-glubolin, beta-glubolin, glubolin, albumin, glutelin, pedaliin, phytosterol, acid linolenic, acid sinapic, sesame lectin và nhiều loại amino acid (Brar và Ahuja, 1979; Ashri, 1989)

Bên cạnh đó, hạt vừng còn có một lượng chất khoáng rất dồi dào, trong 100

g hạt có 1200 mg canxi; 379 mg photpho; 10 mg flo; 0,03 mg carotein; 0,3 mg vitamin B1; 0,15 mg vitamin B2 (Trần Thị Kim Ba, 2003)

là vừng đen), giúp mọc tóc (Phạm Hoàng Hộ, 2003)

Dầu vừng chứa vitamin E và một vài chất chống ôxy hóa quan trọng như sesaminol và sesamolinol Tương tự, các chất chống oxy hoá như sesamolin và sesamol cũng đã tìm thấy trong dầu vừng Cooney và cộng sự (2001) đã ghi nhận rằng dầu vừng có chứa gamma tocopherol, chất này cùng với sự hoạt động của vitamin E được tin là giúp ngăn ngừa bệnh ung thư và bệnh tim mạch

Trong kỹ nghệ, dầu vừng được sử dụng để bôi trơn máy móc cao cấp, máy bay, máy dùng trong khoa học kỹ thuật, dầu dùng để pha sơn, pha vecni rất tốt vì có màu láng bóng Khô dầu vừng được dùng chế biến thức ăn gia súc và làm phân bón rất tốt

Ở châu Phi người ta đã dùng hoa vừng để sản xuất ra nước hoa, trong đó nước hoa Cologne đã được sản xuất ra từ chính hoa vừng Các hoạt chất li trích từ vừng đã được dùng cho các mục đích khác nhau Ví dụ, acid myristic được dùng trong mỹ phẩm và ngăn ngừa ung thư Sesamin và sesamolin được dùng như là chất

hỗ trợ trong thuốc diệt khuẩn, diệt côn trùng Năm 2000, Hasan và cộng sự báo cáo chất chlorosesamone sinh ra từ rễ cây vừng có chất kháng nấm và nó đã được dùng như là một chất diệt nấm

Dầu vừng còn được sử dụng làm nguyên liệu trong sản xuất biodiesel - một loại nhiên liệu có tính chất tương đương với nhiên liệu dầu diesel nhưng không phải được sản xuất từ dầu mỏ mà từ dầu thực vật hay mỡ động vật Ngày nay, nhu cầu năng lượng ngày càng gia tăng trên thế giới trong khi nguồn năng lượng hoá thạch ngày càng cạn kiệt Vì thế dầu thực vật sẽ là tiềm năng có thể thay thế dầu mỏ trong tương lai Vừng và các cây có dầu khác là một sự hứa hẹn cung cấp nguồn năng lượng mới, sạch và thân thiện với môi trường Tiềm năng của một số cây có dầu có thể dùng để sản xuất biodiesel (Phạm Đức Toàn, 2009)

2.3 Tình hình sản xuất trong và ngoài nước

Về mặt sản xuất, cây vừng có khả năng thích ứng rộng, dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, rất thích hợp trong việc thâm canh tăng vụ, nâng cao thu nhập trên một đơn vị diện tích đất, nhất là trên đất trồng lúa Nhu cầu dầu vừng trên thế giới ngày càng tăng cũng tạo điều kiện tốt cho việc mở rộng trồng vừng trong thời gian tới (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Hiện nay, tuy với diện tích không nhiều, vừng đã được trồng khắp các châu lục trên thế giới Sản lượng vừng hàng năm trên thế giới theo FAO (2007) là hơn 3 triệu tấn Trong đó chủ yếu là châu Á chiếm gần 60%, còn lại là châu Mỹ, châu Phi (18-20%) Ngoài ra, châu Âu và châu Đại Dương cũng có trồng rãi rác nhưng không đáng kể

Các nước trồng vừng nhiều là Ấn Độ, Trung Quốc, Sudan, Mexico, sau đó là Myanmar, Thái Lan, Nigeria, Colombia Năng suất trung bình trên thế giới khoảng 0,3 - 0,4 tấn/ha Ở Mỹ năng suất vừng vùng Texas lên tới 2 tấn, ở Trung quốc năng suất vừng là 1 tấn/ha Tại Trung Quốc, Thái Lan vừng là cây có giá trị xuất khẩu cao (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Ở Việt Nam, vừng được trồng ở khắp các vùng sinh thái trong cả nước từ Bắc tới Nam Theo thống kê của FAO năm 2007, diện tích cây vừng ở Việt Nam khoảng 45000 ha với sản lượng là 22000 tấn Tại vùng Châu Phú - An Giang, năng suất đạt từ 400 - 600kg/ha Nếu áp dụng biện pháp thích hợp, năng suất vừng có thể đạt 1 tấn/ha Ở Việt Nam, vừng được trồng lâu đời nhất là ở miền Bắc, nhưng diện

tích không mở rộng được vì điều kiện khí hậu và đất đai không thích hợp cho cây phát triển Các tỉnh đang trồng vừng nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long gồm: Cần Thơ (4.700 ha), Đồng Tháp (1.200 ha), An Giang (600 ha), Long An (400 ha) (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

Bảng 2.1: Diện tích, năng suất và sản lượng ở các nước trồng vừng chính 2007

(FAOSTAT, 2007)

Quốc gia Diện tích

(1000 ha)

Sản lượng (1000 tấn)

Năng suất (Tấn/ha)

2.4 Phân loại và đặc điểm thực vật học

2.4.1 Phân loại

Cây vừng thuộc bộ Tubiflorae, họ Pedaliacea, có 16 chi và khoảng 60 loài

Trên thế giới giống Sesamum gồm khoảng 30 loài khác nhau, vừng được trồng là Sesamum indicum L có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 26

Vừng có nhiều giống và dòng khác nhau về thời gian sinh trưởng, màu sắc của hạt và dạng cây Hiện nay, phân loại giống vừng dựa vào những đặc tính thực vật như sau:

- Thời gian sinh trưởng: phân loại giống có thời gian sinh trưởng dài ngày (trên 100 ngày) hoặc giống sinh trưởng ngắn ngày (dưới 100 ngày) Cách phân loại này quan trọng khi chọn giống để luân canh với cây trồng khác như lúa, bắp, đậu, khoai

- Số khía trên trái vừng: phân loại các giống vừng bốn khía, sáu khía, tám khía, phân loại này dùng để chọn cỡ hạt nhỏ lại

- Trái bị nứt khi thu hoạch hay không bị nứt: phân loại này giúp cho việc thu hoạch đồng loạt hay không

- Màu hạt: Đây là cách phân loại phổ biến nhất Phân biệt hai loại vừng (hình

2.2): vừng đen (Sesamum indicum L.) và vừng vàng (Sesamum orientale L.)

Ngoài các cách phân loại trên, người ta còn phân loại vừng theo thời vụ trồng, số hoa ở nách lá, sự phân cành trên thân

Hình 2.2: Rễ vừng có dạng cọc và nhiều rễ phụ

(Nguồn Langham, 2008)

Thân: Thân vừng thuộc thân thảo, thân thường có hình 4 cạnh với những tiết

diện vuông và những rãnh dọc Tuy nhiên có những dạng thân rất rỗng hình chữ nhật Thân có thể tròn, trên thân có nhiều lóng hoặc ít lóng Đặc tính này cũng dùng

để phân biệt giống Màu sắc của thân thay đổi từ màu xanh nhạt đến màu tím, phổ biến nhất là màu xanh đậm Thân cao từ 60 - 120 cm (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007) Trong điều kiện hạn thân có thể thấp hơn, nhưng cũng

Các dạng thân ngắn, đâm cành ít, thường chín sớm, cây cao thường chín trễ

và có khuynh hướng chịu hạn khá hơn Các giống dài ngày thường phát triển chậm

ở giai đoạn cây con, nhưng tăng trưởng nhanh ở giai đoạn sau

Lá: Lá vừng rất biến đổi về dạng và kích thước trên cùng một cây và giữa

các giống Lá dưới thường rộng, đôi khi có thùy, mép hình răng cưa hướng ra ngoài,

lá mọc đối hay luân phiên tuỳ giống, cách sắp xếp lá ảnh hưởng đến số hoa mang trên nách lá và năng suất hạt trên cây Lá mọc đối tạo điều kiện có nhiều hoa Kích thước của lá thay đổi từ 3 - 17,5 cm chiều dài và 1 - 1,5 cm chiều rộng Lá có màu xanh đậm, nhạt tuỳ thuộc vào giống Mặt trên của lá có lông tơ bao phủ và mật độ lông trên bề mặt cũng là đặc tính để phân biệt các giống (Tạ Quốc Tuấn và Trần

Văn Lợt, 2006)

Cành: Xuất phát từ thân chính, cành có thể mọc cách hay mọc đối nhau, cành sẽ mang hoa và trái, trên các cành chính còn có cành cấp hai Sự phân cành trên thân chính cũng là một yếu tố để phân biệt các giống vừng, thường màu của

cành trên thân giống thân chính

Hoa: Hoa vừng có hình chuông Cuống hoa ngắn, tràng hoa gồm 5 cánh hợp thành hình chuông Đài hoa màu xanh, 5 cánh cạn Ống hoa dài 3 - 4 cm Hoa mọc

ở nách lá thành chùm Mỗi chùm có 4 - 8 hoa Nhị đực 5 nhưng có 1 bất dục Bầu nhụy nằm trên đài hoa, có hai ngăn với nhiều vách giả

Trái: Là loại trái nang, tiết diện hình chữ nhật, có rãnh sâu, có đầu nhọn hình tam giác ngắn (Hình 2.3) Hình dạng của trái cũng là một yếu tố để phân biệt các giống, chiều dài trái thay đổi từ 2,5 - 8 cm, đường kính trái thay đổi từ 0,5 - 2 cm,

số vách ngăn từ 1 - 12 trái thường có lông tơ bao phủ Trái mở ra bằng cách chẻ dọc vách ngăn từ trên xuống Khi thu hoạch trái sẽ có các dạng mở hoặc đóng (hình 2.3) Tùy theo dạng sẽ có ảnh hưởng đến năng suất khác nhau, trong đó dạng bung

và bung mạnh gây thất thoát năng suất cao nhất

Hình 2.3: Các dạng trái khi thu hoạch (Nguồn Langham, 2008)

Chất lượng trái cũng khác nhau tùy vị trí trái Thường trái ở vị trí thấp có hạt lớn hơn ở vị trí cao (Trần Thị Kim Ba, 2003)

Siêu bung : bung khi còn

xanh, shock để thu hạt hàng

ngày

Bung : dạng này thường được thu hoạch khi cây còn xanh, phơi khô và thu hoạch

khép: không mở khi khô, thu hoạch tác động mạnh sẽ ảnh hưởng đến hạt

đóng: dạng không mở khi

khô và không bị tổn thương

hạt khi thu hoạch

nứt hay mở: dạng hạt được giử lại trên cây khi khô, phóng thích khi thu hoạch

trái mở không hoàn toàn:

tương tự dạng mở nhưng giử hạt tốt hơn

Hạt: Hạt vừng là loại hạt hai lá mầm Cấu tạo hạt có nội phôi nhủ Hạt vừng

nhỏ và thường có hình trứng, hơi dẹp, trọng lượng 1000 hạt từ 2 - 4 g Vỏ láng hoặc nhăn màu đen, trắng, vàng, nâu đỏ hay xám, cũng có hạt màu xám nâu, xanh olive

và màu nâu đậm Hạt vừng tương đối mảnh và chứa rất nhiều dầu (Trần Thị Kim

Ba, 2003)

Hình 2.4: Một số dạng kích cỡ và màu sắc của hạt vừng

(Nguồn http://www.sesamegrowers.org/sesame-recipes.htm)

2.5 Sự sinh trưởng và phát triển của cây vừng

Theo Langham (2008), chu kỳ sinh trưởng của vừng chia làm 11 giai đoạn trong 4 pha chính: pha sinh trưởng, pha sinh sản, pha chín và pha khô (bảng 2.2) Ở mỗi giai đoạn sẽ có dấu hiệu kết thúc và những điểm cần chú ý trong quá trình canh tác vừng, thời gian kết thúc ở các giai đoạn sẽ khác nhau tùy vào dòng vừng

Bảng 2.2: Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển cây vừng (Langham, 2008)

1 Giai đoạn nảy

2 Giai đoạn cây

mầm

Cặp lá thật thứ 3 có chiều dài bằng cặp thứ 2

Khó nhìn thấy, tăng trưởng rất chậm, khó chăm sóc cần kiên nhẫn, tránh ẩm ướt nhưng không để cây mầm quá khô

3 Giai đoạn cây con Ra nụ hoa đầu tiên Có thể kiểm soát tăng trưởng, tưới nước

đều nhưng không quá nhiều có thể gây stress

4 Giai đoạn tiền

5 lóng thân có trái Cung cấp nước phân bón, hoa trổ sớm

và rụng vào buổi chiều

6 Giai đoạn trổ hoa

giữa

Nhánh ngừng trổ hoa Hơn 70% hoa trổ vào 2 tuần đầu tiên

của giai đoạn này

7 Giai đoạn trổ hoa

cuối

90% cây không trổ hoa nữa

Tưới lần cuối, lá nhạt bắt đầu rụng

Có thể thu hoạch ở cuối giai đoạn này

10 Giai đoạn khô ban

2.6 Điều kiện sinh thái

2.6.1 Điều kiện nhiệt độ

Vì cây vừng có nguồn gốc nhiệt đới nên nhiệt độ trung bình thích hợp khoảng 25 – 30oC Nhiệt độ thích hợp cho hạt nảy mầm, sinh trưởng, các bộ phận dinh dưỡng và sự hình thành hoa khoảng 25 - 27oC Nhiệt độ thích hợp cho sự nở hoa và sự phát triển trái vào khoảng 28 - 32oC Nếu nhiệt độ dưới 20oC kéo dài thời gian nảy mầm Nhiệt độ dưới 18oC sẽ gây khó khăn cho sự phát triển và nếu nhiệt

độ dưới 10oC cây ngừng phát triển và chết Thời kỳ trái chín gặp nhiệt độ thấp sẽ giảm tỉ lệ và chất lượng dầu của hạt (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Nhiệt độ trên 40oC vào thời gian ra hoa sẽ cản trở sự thụ phấn, thụ tinh, tăng

tỷ lệ hoa rụng và do đó làm giảm số hoa

2.6.2 Điều kiện ánh sáng

Vừng là cây ngày ngắn Trong điều kiện thời gian chiếu sáng dưới 10 giờ/ngày sẽ rút ngắn thời gian sinh trưởng của vừng Vừng sẽ ra hoa sớm hơn 15 -

20 ngày trong điều kiện tự nhiên (12 giờ/ngày)

Cường độ ánh sáng, số giờ nắng trong ngày ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất của vừng Trong thời gian sinh trưởng, nhất là sau khi trổ hoa, vừng cần khoảng 200 - 300 giờ nắng/tháng cho đến khi trái chín

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy: cường độ ánh sáng trong thời gian kết trái đến khi chín 28.000 lux thích hợp nhất cho quá trình hình thành dầu Hàm lượng dầu trong hạt giảm 8% nếu cường độ ánh sáng giảm xuống 7000 lux (Trần Thị Kim Ba, 2003)

2.6.3 Yêu cầu về lượng nước

Là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến năng suất vừng Vừng tương đối chịu hạn nhưng cho năng suất thấp khi đất có ẩm độ dưới 70% Vừng ít cần nước mưa, vừng cho năng suất cao ở lượng mưa 500 - 650 mm Trong điều kiện có tưới tổng lượng nước cần lên tới 900 - 1000 mm

Vừng yêu cầu lượng nước phân bố đều trong vụ: thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng 34%, thời kỳ ra hoa kết trái 45%, và thời kỳ chín là 21% Độ ẩm đất thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển và cho năng suất của vừng khoảng 70 - 80%

Mưa lúc thu hoạch sẽ làm giảm phẩm chất vừng do bệnh Vừng rất dễ mẫn cảm với nước, nếu mưa liên tục sẽ làm cây đổ ngã và chết Trong lúc gieo hạt mưa nhiều hạt sẽ không nảy mầm (Trần Thị Kim Ba, 2003)

2.6.4 Cao độ

Vừng thích hợp ở độ cao dưới 1.250 m tuy nhiên vẫn thấy có những trường hợp trồng ở độ cao khoảng 1.000 m, vừng trồng ở vùng này thường cây nhỏ, không phân cành, chỉ có một hoa dưới nách lá do đó năng suất thấp

Ở Ấn Độ và Venezuela, người ta thấy rằng cùng một giống nếu đem trồng ở nhiều độ cao khác nhau thì càng lên cao năng suất càng giảm (Trần Thị Kim Ba, 2003)

2.6.5 Gió

Vừng rất dễ bị thiệt hại do gió mạnh, nhất là khi thân chính phát triển, gió cũng làm mất hạt khi trái bị nứt Khi chọn thời vụ trồng vừng người ta thường tránh thời gian mưa to gió lớn Ở Pháp người ta không trồng vừng ở miền Nam do vùng này có gió mạnh Ở thung lũng Kasmia của Ấn Độ vừng bị thiệt hại nặng do gió mạnh từ miền núi thổi qua Do đó, khi canh tác thường chọn những giống có lóng ngắn, thân ngắn cho nhiều trái, và phải chú ý vun gốc cho cây (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.7 Một số nghiên cứu trên cây vừng

Năm 2002, Ercan cùng cộng sự tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền trên

52 giống vừng ở Thổ Nhĩ Kỳ sử dụng các tính trạng nông học Kết quả 52 giống được phân làm 4 nhóm chính dựa trên mức độ tương đồng Trong đó, các quần thể thuộc vùng phía Nam, Đông nam, phía Tây có xu hướng tập trung thành nhóm trên cây tương đồng; riêng quần thể thuộc vùng Đông bắc phân nhóm không phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý Nghiên cứu này giúp các nhà chọn giống hiểu hơn về cấu trúc

di truyền của quần thể vừng ở Thổ Nhĩ Kỳ từ đó thuận tiện chọn việc lựa chọn cá thể bố mẹ cho công tác lai tạo giống

Năm 2010, Phạm Đức Toàn cùng cộng sự tiến hành đánh giá các giống vừng

có nguồn gốc địa lý khác nhau dựa trên 15 đặc điểm hình thái 17 giống vừng được thu thập từ El Salvador, Tanzania, Kenya, Ấn Độ, Campuchia và Việt Nam; thí nghiệm được thực hiện ở vùng đồng bằng châu thổ sông Mekong thuộc Việt Nam Nhận thấy, các giống thuộc Châu phi và trung Mỹ cho cây có kích thước lớn, ra hoa chậm và năng suất kém; các giống thuộc Campuchia, Việt Nam cho năng suất cao

và phát triển tốt ở vùng châu thổ sông Mekong Năng suất hạt được sắp xếp theo thứ tự sau Tanzanian < El Salvadoran < Kenyan < Ấn độ < Việt Nam < Campuchia Một vài giống Việt Nam và Campuchia cho năng suất cao được đánh giá có tiềm năng cho công tác chọn tao giống

Năm 2010, Furat và Uzun đã dựa trên 21 tính trạng nông học để đánh giá đa dạng di truyền của 103 giống vừng lấy từ các vùng trồng vừng ở Thổ Nhĩ Kỳ Trong đó, tác giả nhận thấy các tính trạng liên quan đến sự nảy mầm, ra hoa, tạo trái

và năng suất hạt là những yếu tố chính xác định sự đa dạng di truyền trong bộ giống nghiên cứu Qua phân tích phân nhóm, 103 giống được chia làm 8 nhóm chính và không thấy có sự tương quan về sự phân nhóm và nguồn gốc địa lý của các giống

Arriel và cộng sự (2007) đã sử dụng 30 tính trạng hình thái và đặc tính nông học để đánh giá đa dạng di truyền của 108 dòng vừng ở Brazil Kết quả cho thấy có

sự đa hình cao giữa các giống, trong đó, tính trạng số trái/ cây và năng suất dòng thể hiện sự khác biệt rõ rệt nhất

Ali và cộng sự (2007) đã sử dụng kỹ thuật AFLP phân tích đa dạng di truyền

96 giống vừng thu thập từ các nơi trên thế giới, với 21 cặp mồi thu được tổng cộng

445 sản phẩm khuếch đại, trong đó có 157 sản phẩm là đa hình (chiếm 35%) Đồng thời, sử dụng kỹ thuật phân tích phân nhóm UPGMA dựa trên hệ số tương đồng tác giả đã phân 96 giống vừng thí nghiệm thành 2 nhóm: nhóm 1 bao gồm các giống có nguồn gốc Đông Á, nhóm 2 bao gồm các giống có nguồn gốc Nam Á

Với kỹ thuật RAPD, Ercan và ctv (2004) đã phân tích đa dạng di truyền trên

38 giống vừng (Sesamum indicum L.) ở 4 vùng địa lý khác nhau thuộc Thổ Nhĩ Kỳ

Kết quả thu được tổng cộng 61 băng, trong đó có 78% là băng đa hình Phân tích biến động quần thể (AMOVA) cho thấy phần trăm biến động giữa các quần thể rất cao (91,9%), đồng thời các chỉ số Shannon's index cho thấy có sự đa dạng di truyền rất cao giữa các giống thuộc vùng Đông Bắc Thổ Nhĩ Kỳ (CV = 7,7; H0 = 0,304) và

sự đa dạng thấp hơn giữa các giống ở vùng Tây Nam Thổ Nhĩ Kỳ (CV = 2,6; H0 =

0,068)

Năm 2008, Phạm Đức Toàn và cộng sự đã sử dụng 10 mồi RAPD nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên 22 dòng vừng ở Việt Nam và Campuchia, kết quả cho thấy có sự đa dạng cao giữa các giống vừng nghiên cứu (10 mồi RAPD cho tổng cộng 107 sản phẩm khuếch đại, trong đó có 88 sản phẩm thể hiện sự đa hình (chiếm 83%))

Năm 2008, Abdellatef và cộng sự sử dụng kỹ thuật RAPD đánh giá đa dạng

di truyền 10 giống vừng thu thập từ các vùng khác nhau ở Sudan Kết quả nhận thấy

có sự đa hình rất cao giữa các giống thu thập Cụ thể sau khi chạy RAPD thu được tổng cộng 75 băng trong đó có 64 băng đa hình Số băng/mồi là 4 - 13 băng, số băng đa hình/mồi dao động từ 2 – 12 băng, chiếm 66,6% tổng số băng thu được Ghi nhận có một băng xuất hiện trên 10 giống ở cả 10 mồi, phân nhóm UPGMA chia 10 giống thành 2 nhóm

Dixit và cộng sự (2005) đã chọn lọc từ ngân hàng gen cây vừng (Sesamum indicum L.) 50 trình tự SSR, sau khi khảo sát, Dixit đã chọn sử dụng 10 cặp mồi

SSR để xác định đa dạng di truyền giữa 16 giống vừng ở Hàn Quốc Kết quả thu

được các đoạn khuếch đại có kích thước 150 - 307 bp, số allel/locus dao động trong khoảng 3 – 6, trung bình 4,6 allel/locus Chỉ số dị hợp tử (HE) và chỉ số đa hình (PIC) lần lượt là 0,437 – 0,858 và 0,34 – 0,80

Năm 2006, Laurentin và Karlovsky đã sử dụng kỹ thuật AFLP để thực hiện nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 32 giống vừng trong bộ sưu tập giống ở Venezuela (với nguồn gen xuất phát từ 5 vùng: Ấn Độ, Châu Phi, Trung Quốc-Hàn Quốc-Nhật Bản, Trung Á và Tây Á) Kết quả nhận thấy có sự đa dạng di truyền rất lớn trong bộ sưu tập giống này bao gồm 457 chỉ thị AFLP được ghi nhận với tỉ lệ đa hình là 93% Hệ số tương đồng Jaccard giữa các giống từ 0,38 – 0,85; nhánh cây tương đồng UPGMA đã chia 32 giống này thành 25 nhóm, không thấy có sự tương quan giữa kiểu gen và nguồn gốc địa lý do các giống Ấn Độ, châu Phi và Trung Quốc-Hàn Quốc-Nhật Bản phân bố rải rác trên nhánh cây tương đồng Kết quả phân tích AMOVA về đa dạng di truyền giữa năm nhóm giống theo nguồn gốc địa lý chỉ đạt 20%, đa dạng trong mỗi nhóm giống là 5%

Năm 2010, Parsaeian và cộng sự đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền trên 24 giống vừng (bao gồm 18 giống thu thập từ các vùng trồng tại Iran và 6 giống lấy từ một số nước Châu Á) dựa trên tính trạng nông học và chỉ thị phân tử ISSR Kết quả cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giống về những tính trạng nghiên cứu, dựa vào tính trạng hình thái, các giống nghiên cứu được chia lam 5 nhóm Kết quả phân tích ISSR với 13 mồi cho tổng cộng 170 băng, trong đó có 130 băng đa hình (chiếm 76,47%) Nhánh cây tương đồng dựa trên dữ liệu ISSR chia các giống nghiên cứu làm 7 nhóm, hệ số tương đồng giữa các giống là 0,09 – 0,55

Bằng cách chiếu xạ tia gamma (Co60) trên cây vừng đen, các nhà nghiên cứu Việt Nam đã tạo ra được giống vừng đột biến với tính trạng có lợi như nhiều quả, không giảm chất lượng dầu trong vừng (Đoàn Phạm Ngọc Ngà, 2008) Đối với biến

dị nhiều trái, nghiên cứu cho thấy, đây là loại biến dị có triển vọng theo hướng lai tạo để tạo ra giống vừng mới

2.8 Đa dạng di truyền và một số kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền

2.8.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái

Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gen chứa đựng trong các loài và là những

hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường”

Đa dạng sinh học được xem xét trên 3 mức độ:

- Đa dạng hệ sinh thái: Là sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các loài sinh sống và các hệ sinh thái nơi mà các loài cũng như các quần thể sinh vật tồn tại

và cả sự khác biệt của mối tương tác giữa chúng với nhau

- Đa dạng loài: Gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật

- Đa dạng di truyền: Là sự khác biệt về gen giữa các loài, giữa các quần thể sống cách ly về địa lý cũng như giữa các cá thể cùng chung sống trong một quần thể (Phạm Bình Quyền, 2002) Đây là mức độ được sử dụng để xét đa dạng trong phạm

vi nghiên cứu của đề tài

2.8.2 Sự đa dạng về di truyền

Đa dạng di truyền là một bộ phận của đa dạng sinh học, đo lường sự biến động của một quần thể hay một hệ sinh thái nhờ vào tổng số các đặc điểm di truyền

Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên

sự khác biệt của các cá thể trong quần thể và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng

là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài

Đa dạng di truyền do biến động của gen trong loài, sự biến động di truyền trong quần thể sinh vật cuối cùng tập trung vào trong 4 loại base cấu thành DNA, cũng như mã di truyền

Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thường bị ảnh hưởng bởi những tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối được với nhau tạo ra con lai hữu thụ, trong loài bao gồm một hay nhiều quần thể

Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gen khác nhau Sự đa dạng về bộ gen này là do các cá thể có các gen khác nhau, dù chỉ là rất ít Gen là đơn vị di truyền cùng với nhiễm sắc thể đặc trưng cho những protein riêng biệt

Đa dạng di truyền của một quần thể có thể được đánh giá bởi các đơn vị đo lường sau:

- Mức độ đa dạng gen (gene diversity) là tỷ lệ sự đa hình của loci trên genome

- Mức độ dị hợp tử (heterozygosity) là số trung bình cá thể có sự đa hình loci

- Số alen trên locus (alleles in locus) được sử dụng để biểu hiện cho sự biến động

(Nguồn: http://www.en.wikipedia.org/geneticdiversity)

Đa dạng di truyền giữ một vai trò quan trọng đối với khả năng đối phó, tồn tại của loài và quần thể trước những yếu tố môi trường thay đổi Tính đa dạng càng cao thì khả năng thích ứng với sự biến đổi của điều kiện môi trường càng lớn Đa dạng di truyền giúp cho các loài sinh vật đảm bảo sự sinh sản, chống chịu với bệnh tật và các điều kiện bất lợi Trong công tác giống, đa dạng di truyền tạo ra sự khác biệt về nguồn gen trong quần thể Những allen khác nhau từ bố mẹ sẽ tạo ra các cá thể có kiểu gen dị hợp tử Sự khác biệt về gen giúp tạo ra con lai có được các đặc tính tốt phục vụ cho cuộc sống con người

2.8.3 Các kỹ thuật được sử dụng để nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền 2.8.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR do K B Mullis phát minh ra năm 1983 Đây là phương pháp invitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban đầu rất nhỏ Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chẩn đoán, di truyền quần thể và phân tích pháp y

Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999), kỹ thuật PCR được thực hiện dựa trên sự xúc tác của enzyme để nhân bản một đoạn DNA nhờ sự hiện diện của các mồi (oligonucleotide) Các oligonucleotide được dùng làm mồi này cho phép DNA mẫu được nhân bản nhờ sự xúc tác của DNA - polymerase Quá trình này gồm 3 giai đoạn:

 Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép được tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 -

Hình 2.5: Nguyên tắc phản ứng PCR

(nguồn: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/seq.html)

2.8.3.2 Các chỉ thị được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền

Chỉ thị hình thái (morphological marker)

Là phương pháp truyền thống được sử dụng để đánh giá sự biến dị Phương pháp này đơn giản và dễ ghi nhận Sự giống nhau một vài đặc điểm nổi bật về mặt vật lý (hình dạng, cấu trúc, màu sắc) của một sinh vật, một quần thể hoặc các thành phần của nó thường được chấp nhận là có quan hệ di truyền

Chỉ thị phân tử (molecular marker)

Chỉ thị phân tử có thể là một protein, một gen hoặc một trình tự DNA có thể được sử dụng để xác định một sinh vật, một loài, một giống hoặc kiểu hình có liên quan đến nó Chỉ thị phân tử đã thay thế hoặc bổ sung cho những phương pháp dựa vào kiểu hình truyền thống, từ đó chúng mở ra một triển vọng thật sự không giới hạn Đối tượng nghiên cứu chỉ chịu sự chi phối của bộ gen mà không ảnh hưởng của môi trường và tốn ít thời gian hơn Mỗi một chỉ thị có những ưu điểm và hạn chế của nó Do đó, ứng dụng kỹ thuật phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền phải cân nhắc xem kỹ thuật có phù hợp với mục đích nghiên cứu hay không (Karp và ctv, 1997) Chỉ thị phân tử được chia làm 2 loại chính:

- Chỉ thị phân tử dựa vào protein còn được gọi là chỉ thị sinh hóa (biochemical marker)

- Chỉ thị phân tử dựa vào DNA (DNA marker)

 Chỉ thị phân tử dựa vào protein

Cả những protein là enzyme và không phải là enzyme đều được sử dụng Những protein không phải là enzyme thường được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide một hoặc hai chiều và tạo trên gel những băng hoặc những spot biểu thị sự khác nhau của những protein khảo sát (Aga, 2005)

Trong trường hợp protein là những enzyme, nhờ vào hoạt tính chuyên biệt của các enzyme này để phân tích nhằm phát hiện ra chúng (Aga, 2005)

Những chỉ thị dựa vào protein có những tiến bộ là chi phí thấp và không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, chúng thường cho chỉ thị đồng trội nên hay dùng trong nghiên cứu đồng hợp tử và dị hợp tử Tuy nhiên, chỉ thị này có những hạn chế là số lượng các hệ thống enzyme có giới hạn, phải sử dụng phương pháp chuyên biệt cho mỗi enzyme, và chỉ những vùng mã hóa trên bộ gen biểu hiện protein mới phân tích được, nên kết quả đa hình thường thấp (Aga, 2005)

 Chỉ thị phân tử dựa vào DNA (DNA marker)

Năm 1983, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ra đời đã mở đầu cho cuộc cách mạng với hàng loạt chỉ thị DNA mới nhanh chóng thay thế các loại chỉ