XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS, VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR

HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ HỒNG KIỂN XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS, VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ... XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

********************

NGUYỄN THỊ HỒNG KIỂN

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ

GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS,

VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ HỒNG KIỂN

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ

GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS,

VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN VÀ PHÁT HIỆN MỘT SỐ

GEN ĐỘC LỰC CỦA VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS, VIBRIO VULNIFICUS TRÊN TÔM, NHUYỄN THỂ

Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3 Phản biện 1: TS HỒ THỊ KIM HOA

Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

4 Phản biện 2: TS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN

Hội Thú y

5 Ủy viên: TS TRẦN THỊ QUỲNH LAN

Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Họ và tên: Nguyễn Thị Hồng Kiển

Ngày sinh: 23/08/1974

Nơi sinh: Tiền Giang

Họ tên Cha: Nguyễn Văn Hai

Họ tên Mẹ: Nguyễn Thị Huỳnh Mai

-Tháng 10/1998: làm việc tại Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang

-Tháng 11/1999: đến nay làm việc tại Trạm Thú y thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương -Tháng 10/2009: Học Cao học ngành Thú y tại Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc

Số nhà 13/21 Kp Thắng Lợi 2, P Dĩ An, thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương

Email: kiennguyen74@gmail.com

Điện thoại: 0909.209.903

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một phần trong đề tài cấp bộ mã số B2010 – 12 – 95 do PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận văn được phép công bố với sự đồng

ý của chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Thị Hồng Kiển

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian được học tại trường

Con mãi luôn ghi nhớ và biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Ngọc Tuân, người thầy đã tận tình dạy dỗ, động viên, hướng dẫn con thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Trân trọng cảm ơn Phòng thực tập Kiểm nghiệm thú sản và Môi trường sức khỏe vật nuôi, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh; Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á, Bình Dương đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để cho tôi thực hiện và hoàn thành đề tài này

Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y Bình Dương, Chi bộ Phòng Kinh tế, Trạm Thú y Dĩ An và các anh em đồng nghiệp tạo điều kiện, thông cảm và chia sẻ công việc để cho tôi được theo học và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Chân thành cám ơn các anh chị lớp Cao học Thú y khóa 2009 cùng tất

cả các bạn bè và anh em trong phòng thực hành Kiểm nghiệm thú sản và Môi trường sức khỏe vật nuôi, Công ty CPCN Việt Á đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đợt thực hiện đề tài

Và con mãi khắc ghi công ơn trời biển của Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người và cho con có được ngày hôm nay Cảm ơn chồng, các con và Cô Mai đã thông cảm, chia sẻ, động viên để có được niềm tin, nghị lực vượt qua những khó khăn trong cuộc sống và học tập

Nguyễn Thị Hồng Kiển

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

ASPW Alkaline saline peptone water: nước muối peptone kiềm

bp base pairs

BLAST Basic Local Aligment Search Tool

CDC Centers for Disease Control and Prevention: trung tâm kiểm soát

phòng bệnh CFU Colony Forming Unit

FDA Food and Drug Administration

ISO International Organization for Standardization

ISSC Interstate Shellfish Sanitation Conference

MPN Most Probable Number

NCBI National Center For Biotechnology Information

PCR Polymerase Chain Reaction

TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salt

TDH Thermostable direct hemolysin: yếu tố gây dung huyết trực tiếp

chịu nhiệt TLH Thermolabile direct hemolysin: yếu tố gây dung huyết kém chịu

nhiệt TRH Thermostable - related direct hemolysin

WHO World Health Organization: tổ chức sức khỏe thế giới

TÓM TẮT

Xác định sự hiện diện và phát hiện một số gen độc lực của Vibrio

parahaemolyticus, Vibrio vulnificus trên tôm, nhuyễn thể bằng kỹ thuật PCR

Vibrio parahaemolyticus là một trong những nguyên nhân gây viêm dạ dày – ruột trên người liên quan đến các vụ ngộ độc thức ăn thủy hải sản Vibrio vulnificus gây tổn thương mô mềm và nhiễm trùng máu Mục tiêu của đề tài là phát hiện sự hiện diện của V parahaemolyticus, V vulnificus trên tôm và nhuyễn

thể hai mảnh vỏ cũng như một số gen độc lực của chúng bằng phương pháp PCR

và nuôi cấy truyền thống, so sánh giữa hai phương pháp phát hiện

Đề tài đã thu thập và xử lý 240 mẫu tôm, nhuyễn thể ở địa bàn tỉnh Đồng Nai và TP Hồ Chí Minh Mẫu được tăng sinh trong môi trường nước muối peptone kiềm, bổ sung polymycin B 50UI với hai nồng độ muối khác nhau 3% (môi trường 1) và 6% (môi trường 2) Các phản ứng PCR được thực hiện trực

tiếp từ dung dịch tăng sinh để phát hiện V parahaemolyticus, V vulnificus và

một số gen độc lực của chúng Ngoài ra các gốc khuẩn lạc thu từ môi trường tăng sinh được thử sinh hóa và khẳng định lại bằng m-PCR1 Một số gốc của hai loài vi khuẩn này được thử tính đề kháng với một số kháng sinh

Phản ứng m-PCR1 trực tiếp từ DNA của mẫu tăng sinh đã phát hiện được

V parahaemolyticus ở môi trường 1 là 30,42% (73/240 mẫu) và 27,92% (67/240 mẫu) ở môi trường 2 Phương pháp sinh hóa phát hiện được V parahaemolyticus ở hai môi trường lần lượt là 24,58% (59/240 mẫu) và 8,33% (20/240 mẫu) Tuy nhiên, đối với những gốc đã thử sinh hóa là V parahaemolyticus thì m-PCR1 xác nhận được 58/165 gốc (35,15%) ở môi trường 1

Tương tự, m-PCR1 phát hiện được V vulnificus là 26,67% (64/240 mẫu)

ở môi trường 1 và 20,42% (49/240 mẫu) ở môi trường 2 Trong khi đó, phương pháp sinh hóa phát hiện được 16,25% (39/240 mẫu) và 7,5% (13/240 mẫu) ở môi

trường 1 và 2 Đối với những gốc đã thử sinh hóa là V vulnificus thì m-PCR1

xác nhận được 19/65 gốc (29,23%) ở môi trường 1

Phản ứng m-PCR2 trực tiếp từ DNA của dung dịch tăng sinh dương tính

và các gốc đã xác nhận dương tính với m-PCR1 là V parahaemolyticus thì tất

cả đều mang gen tlh

Phản ứng PCR3 trực tiếp từ DNA của dung dịch tăng sinh dương tính

hoặc các gốc đã xác nhận dương tính với m-PCR1 thì gen vvp chỉ chiếm khoảng

Các gốc V parahaemolyticus đề kháng hoàn toàn với amoxicillin,

polymycin B, vancomycin (100%) và nhạy cảm cao với chloramphenicol,

gentamicin, ciprofloxacin (100%) và tetracycline (88,89%) Các gốc V vulnificus

đề kháng hoàn toàn với amoxicillin, polymycin B, erythromycin (100%) và nhạy cảm cao với gentamicin, chloramphenicol, ciprofloxacin, tetracycline và vancomycin (100%)

SUMMARY

Identification of the presence and detection of some virulence genes of Vibrio

V parahaemolyticus is one of the most common causes of seafood-borne bacterial gastroenteritis in human V vulnificus may cause fatal wound infections and septicemia The objectives of this study were to detect the presence of V parahaemolyticus and V vulnificus as well as some their virulence genes in shrimp and shellfish by using multiplex PCR (m-PCR) and traditional method and the comparision between two methods was used Total 240 shrimp and shellfish samples were collected from Dong Nai Province and HoChiMinh City Samples were grown in alkaline peptone water (APW) supplemented with polymycin B

extracted from enriched samples to identify V parahaemolyticus and V vulnificus by m-PCR1, virulence genes of V parahaemolyticus by m-PCR2 and vvp gene of V vulnificus by PCR3 Besides, isolates from enriched media were

examined using conventional method and were confirmed by m-PCR1 The

isolates of V parahaemolyticus and V vulnificus were tested for antibiotic

resistances

By m-PCR1 reaction, V parahaemolyticus was detected from 30.42% of

the enriched samples in medium No 1 and 27.92% of the enriched samples in medium No 2 While, the bacteria were isolated from only 24.58% and 8.33% of the

samples, respectively However, only 35.15% of V parahaemolyticus isolates (medium No 1) confirmed by m-PCR1 after biochemical analysis was used

Similarly, the rates of V vulnificus of the medium No 1 (26.67%) and the

medium No 2 (20.42%) using m-PCR2 were also higher than those of the medium

No 1 (16.25 %) and the medium No 2 (7.50 %) using biochemical identification In

the other hand, there was 29.23% of V vulnificus isolates confirmed by m-PCR1

from medium No 1 after the usage of biochemical analysis

No pathogenic V parahaemolyticus tdh or trh strains were found in the

infected with V parahaemolyticus In addition, the presence of vvp virulence gene

was ranged from 30% to 40%

Comparison of the two methods highlighted that PCR techniques is more fast, sensitive and less expensive than traditional method In addition, the medium No 1

supplemented 3% salt is more suitable for the growing of these two Vibrio species

All isolates of V parahaemolyticus were resistant to amoxicillin,

polymycin B and vancomycin and sensitive to chloramphenicol, gentamicin,

ciprofloxacin and tetracycline V vulnificus showed 100% resistance to

amoxicillin, polymycin B and erythromycin and 100% sensitivity to gentamicin, chloramphenicol, ciprofloxacin, tetracycline and vancomycin

MỤC LỤC

Trang chuẩn y .……… i

Lý lịch cá nhân ……… ii

Lời cam đoan ……… iii

Lời cảm ơn ……… iv

Danh sách các từ viết tắt ……… v

Tóm tắt ……… vi

Summary ……… viii

Mục lục ……… x

Danh sách các bảng ……… xi

Danh sách các hình ……… xiii

MỞ ĐẦU ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ……… 3

1.1 Phân loại ……….……… 3

1.2 Đặc điểm……… ……… ……… 3

1.3 Nuôi cấy phân lập………… ……… ……… 4

1.4 Khả năng gây bệnh ……….……… 4

1.4.1 V parahaemolyticus …… ……….………….…… 4

1.4.2 V vulnificus ……….……… ……… 6

1.4.3 Triệu chứng, bệnh tích …… ……….……… 8

1.4.3.1 Đối với động vật thủy sản ……….……….……… 8

1.4.3.2 Đối với người……… ……… 8

1.4.4 Nguồn nhiễm khuẩn ……… ……… 9

1.4.4.1 Trên động vật thủy sản ……… 9

1.4.4.2 Trên người ……… ……… 9

1.4.5 Điều trị và phòng ngừa ……… 10

1.4.5.1 Đối với động vật thủy sản ……… 10

1.4.5.2 Đối với người ……… 10

1.5 Tình hình ngộ độc thực phẩm do V parahaemolyticus và V vulnificus gây ra 11

1.5.1 V parahaemolyticus ………… ……… 11

1.5.2 V vulnificus ……… 12

1.6 Những phương pháp phát hiện Vibrio ………… ……… 13

1.6.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống ……… 13

1.6.1.1 Định tính ……… 13

1.6.1.2 Định lượng bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN - Most Probable Number)……… 13

1.6.2 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ……… 14

1.6.3 Phương pháp lai DNA.……… ……… 15

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ……… 16

2.1 Thời gian và địa điểm … ……… 16

2.1.1 Thời gian ………… ……… 16

2.1.2 Địa điểm …… ……… ……… 16

2.2 Nội dung thực hiện … ……… 16

2.3 Các chỉ tiêu theo dõi … ……… 16

2.4 Vật liệu … ……… 17

2.4.1 Dụng cụ ………… …… ……… 17

2.4.2 Môi trường và hóa chất sử dụng … …….……… 17

2.4.2.1 Môi trường nuôi cấy ……… ……… 17

2.4.2.2 Hóa chất sử dụng …….………… ……… 17

2.5 Phương pháp tiến hành … ……… 17

2.5.1 Thu thập và bảo quản mẫu ……… ……… 17

2.5.2 Xử lý mẫu ……… ……… 17

2.5.3 Nuôi cấy và phân lập ……… 18

2.5.4 Phương pháp ly trích DNA ……… ……… 21

2.5.5 Phương pháp PCR…… …… ……….……… 21

2.5.6 Thử nghiệm kháng sinh đồ……… 25

2.5.7 Xử lý số liệu ……… ……… ……… 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……….……… 26

3.1 Kết quả về tỷ lệ nhiễm ……… 26

3.1.1 So sánh tỷ lệ phát hiện V parahaemolyticus hoặc V vulnificus giữa phương pháp sinh hoá và m-PCR ……… 26

3.1.1.1 V parahaemolyticus ……….……… ……… 26

3.1.1.2 V vulnificus ……….……… ……… 27

3.1.2 Kết quả phát hiện gen độc lực tlh, tdh, trh của V parahaemolyticus và vvp của V vulnificus ………….……… 30

3.1.2.1 Gen độc lực của V parahaemolyticus……….… 30

3.1.2.2 Gen độc lực của V vulnificus ……….……… ……… 31

3.1.3 Kết quả thử kháng sinh đồ ……… 32

3.2 Thảo luận ……… 33

3.2.1 Thảo luận kết quả phát hiện V parahaemolyticus và V vulnificus ……… 33

3.2.2 Thảo luận kết quả phát hiện gen độc lực tlh, tdh, trh và vvp ……… …… 38

3.2.2.1 V parahaemolyticus ……….………….……… 38

3.2.2.2 V vulnificus ……….……… 40

3.2.3 Thảo luận kết quả thử kháng sinh đồ ……… ……… ……… 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……… 43

Kết luận ……… ……… 43

Đề nghị ……… ……… 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 44

PHỤ LỤC ……… 55

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của các loài Vibrio spp ………… ……… 05

Bảng 1.2 Một số biện pháp phòng và trị bệnh cho tôm…… ……… 10 Bảng 2.1 Phân bố mẫu khảo sát ………… ………… ……… 18

Bảng 2.2 Các phản ứng sinh hóa dùng để định danh V parahaemolyticus và V

vulnificus … 19

Bảng 2.3 Các primer trong phản ứng PCR ……….… ………… 22 Bảng 3.1 So sánh tỷ lệ phát hiện V parahaemolyticus giữa phương pháp sinh

hóa và phương pháp m-PCR ……… 28

Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ phát hiện V vulnificus giữa phương pháp sinh hóa và

phương pháp m-PCR ……… … ……… 29

Bảng 3.3 Tỷ lệ phát hiện gen độc lực của V parahaemolyticus từ dung dịch

tăng sinh dương tính với m-PCR1……… …… 30

Bảng 3.4 Kết quả phát hiện V parahaemolyticus và gen độc lực của V

parahaemolyticus từ các gốc đã thử sinh hóa ……… 31

Bảng 3.5 Tỷ lệ phát hiện gen độc lực vvp của V vulnificus từ dung dịch tăng

sinh dương tính với m-PCR1……… …… 31

Bảng 3.6 Kết quả phát hiện V vulnificus và gen vvp của V vulnificus từ các

gốc đã thử sinh hóa ……… ……… ……… 32

Bảng 3.7 Kết quả thử kháng sinh đồ ……… 33

liên quan đến các vụ ngộ độc thức ăn thủy hải sản ở Mỹ (Mead và cs, 1999; Daniels

và cs, 2000), châu Âu, châu Á (Feldhusen, 2000), và chiếm ít nhất 25% trong những

vụ ngộ độc thức ăn ở Đài Loan, Nhật Bản, Việt Nam (Chowdhury và cs, 2004) và các nước Đông Nam Á (Bhuiyan và cs, 2002) Người tiêu dùng ăn hải sản chưa nấu

chín nhiễm V parahaemolyticus thường có biểu hiện viêm dạ dày ruột Trong khi

đó, một loài khác của Vibrio là V vulnificus được phát hiện năm 1970, thường

không gây ra các đợt dịch tiêu chảy Trên những người có tiền sử bệnh gan hoặc

bệnh suy giảm miễn dịch, khi bị nhiễm V vulnificus đã có tỷ lệ chết cao với triệu

chứng tổn thương mô mềm và nhiễm trùng máu (Daniels và Shafaie, 2000; Oliver

và Kaper, 2001)

Hiện nay, ở Việt Nam đã có những ghi nhận về tình trạng ngộ độc thực phẩm

từ những người ăn thủy hải sản bị nhiễm V parahaemolyticus (Tuyet và cs, 2002) Tuy nhiên, chưa ghi nhận tình trạng nhiễm trùng do V vulnificus nhưng đây cũng là một trong những loài Vibrio gây bệnh cho người Nguồn lây nhiễm chính cho người

được xác định là do ăn phải thực phẩm mang trùng như tôm cua, hàu, sò, ốc còn sống hoặc trong quá trình chế biến, nấu chưa chín, đông lạnh thực phẩm không đúng, nhiễm chéo giữa các loại thực phẩm với nhau (Nolan và cs, 1984; Rippey, 1994; Kaysner, 2000) Mặt khác, vi khuẩn sống trong môi trường nước ô nhiễm có thể xuyên qua da khi bị trầy sướt và gây bệnh (Rippey, 1994)

Vì thế, phát hiện các Vibrio này đòi hỏi phải nhanh và chính xác, nên việc

ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử được sử dụng ngày càng rộng rãi

Để góp phần vào việc tầm soát V parahaemolyticus và V vulnificus trên tôm và

nhuyễn thể, được sự đồng ý của Khoa Chăn nuôi – Thú y, Phòng đào tạo sau đại học và dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài: “Xác định sự hiện diện và phát hiện một số gen độc lực của

Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus trên tôm, nhuyễn thể bằng kỹ thuật

PCR ”

Mục đích

Góp phần nâng cao hiệu quả phát hiện nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

do Vibrio trên người tại Việt Nam

Mục tiêu cụ thể

(1) Xác định sự hiện diện Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus trên

tôm và nhuyễn thể bằng phương pháp nuôi cấy và PCR, so sánh hai phương pháp phát hiện này

(2) Phát hiện các gen độc lực tlh, tdh, trh của V parahaemolyticus và gen vvp của V vulnificus trên tôm và nhuyễn thể bằng phương pháp PCR

(3) Xác định tính nhạy cảm của một số gốc V parahaemolyticus, V vulnificus định danh được đối với một số loại kháng sinh

Giới hạn của đề tài

Đề tài chỉ thu thập mẫu tại điểm thu mua và các chợ ở tỉnh Đồng Nai và TP

Hồ Chí Minh

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Phân loại

Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus thuộc ngành Proteobacteria, lớp Gamma Proteobacteria, bộ Vibrionales, họ Vibrionaceae, giống Vibrio Đến

nay đã có 72 loài được phát hiện, trong đó 12 loài được ghi nhận là có khả năng gây

bệnh cho người, đáng lưu ý là V alginolyticus, V cholerae, V parahaemolyticus và

V vulnificus (FAO, 2002) Những loài gây bệnh cho động vật thủy sản thường gặp là: V alginolyticus, V anguillarum, V ordalii, V salmonicida, V parahaemolyticus,

V harvey, V vulnificus (Buller, 2004)

1.2 Đặc điểm

Vibrio là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, di động nhờ một hoặc nhiều tiêm mao mảnh và không hình thành bào tử Chúng có kích thước 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 m, phần lớn các loài sống kỵ khí tùy nghi ở những vùng nước biển ấm hoặc cửa sông (Bùi Quang Tề, 2006) Vi khuẩn có khả năng sống ở 5 -

430C, nhưng tốt nhất là 370C Chúng thường chết khi nhiệt độ dưới 50C, bị bất hoạt trên 650C/ 1 phút; 550C/ 5 phút hay 500C/ 10 phút (Andrews và cs, 2000) Trong điều kiện tối ưu, số lượng vi khuẩn có thể phát triển trong 9 - 10 phút, và tăng nhanh gấp 13 - 26 lần so với ban đầu sau 24 giờ ở nhiệt độ 260C (Kaufman và cs, 2003) pH tối ưu là 7,8 - 8,6, chúng có thể tồn tại trong khoảng pH 4,8 - 11 Tuy nhiên, sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị dừng lại nếu có sự hiện diện của 0,1% acetic acid (pH = 5,1) Chúng có thể phát triển trong môi trường có muối 0,5 - 10%, nhưng nồng độ muối tối ưu là 3% (FDA, 2004)

Giống như những vi khuẩn Gram âm khác, Vibrio có thể phát triển trong môi

trường có muối mật tương đối cao Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy nghi và

phát triển rất tốt trong môi trường kiềm Hầu hết các loài của Vibrio đều phát triển

trong môi trường nước biển Na+ rất cần thiết cho việc kích thích sự phát triển của

tất cả các loài Vibrio Chúng không có khả năng sinh H2S, có khả năng lên men đường Việc phân lập vi khuẩn từ thực phẩm thường được thực hiện nhờ vào môi trường tăng sinh nước peptone kiềm (APW-Alkaline peptone water) Môi trường sử

dụng để kiểm tra phản ứng sinh hóa của V parahaemolyticus được thêm 2% hoặc

3% NaCl Dựa vào một số phản ứng sinh hóa khác nhau bao gồm cả hoạt động của

β-galactosidase (ONPG) mà người ta có thể chẩn đoán phân biệt V parahaemolyticus, V vulnificus (Elliot và cs, 1995) (Hình 1.1.)

1.3 Nuôi cấy phân lập

Môi trường chọn lọc thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) thích hợp cho

sự phát triển những loài Vibrio và đồng thời ức chế các loài vi khuẩn không thuộc Vibrio Môi trường nuôi cấy tối ưu cho V parahaemolyticus và V vulnificus ở 3%

NaCl và mức nồng độ muối tối thiểu là 0,5% (Elliot và cs, 1995)

1.4 Khả năng gây bệnh

V parahaemolyticus và V vulnificus là một trong những loài Vibrio có khả năng gây bệnh cho người và động vật thủy hải sản (Buller, 2004) V parahaemolyticus gây viêm dạ dày ruột ở người ăn hải sản bị nhiễm vi khuẩn này

Chúng thường xuất hiện lúc thời tiết ấm trong môi trường nuôi thủy hải sản như cá, tôm, cua, sò, hàu… (Liston, 1990)

1.4.1 V parahaemolyticus

Tất cả các chủng V parahaemolyticus đều có chung một kháng nguyên lông

H, 12 kiểu kháng nguyên thân O và trên 70 kiểu kháng nguyên vỏ K đã được mô tả

(Sakazaki và cs, 1963; Miwatani và cs, 1976) Hầu hết những chủng gây bệnh của V parahaemolyticus đều có khả năng gây dung huyết do gen tdh (thermostable direct

hemolysin) đảm nhiệm (Yeung và Boor, 2004) Độc lực chủ yếu của V parahaemolyticus là độc tố hemolysin gây dung huyết beta trên môi trường

Wagatsuma với vòng halo sáng rõ xung quanh khuẩn lạc sau 18-24 giờ nuôi cấy ở

370C Phản ứng này được đặt tên là phản ứng Kanagawa (Takeda, 1983) Ngoài ra, Taniguchi và cs (1986) đã chứng minh rằng sự hiện diện của gen gây dung huyết

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của các loài Vibrio spp

V algi- nolyticus

metschni-V

mimicus

V

parahae- molyticus

V

vulnificus

P shigel- loides**

TCBS agar Vàng Vàng Vàng Vàng Không Vàng Xanh Xanh Xanh Xanh mCPC agar Không Tím Không Không Không Không Không Không Vàng Không

CC agar Không Tím Không Không Không Không Không Không Vàng Không AGS KA Ka KK KK Ka KK KA KA KA nd

Sinh

acid từ

Sucrose + + + + − + − − − − D-

Cellobiose − − + − − − − V + − Lactose − − − − − − − − + − Arabinose − − + + + − − + − − D-

Mannose + + + + + + + + + − D-

Mannitol + + + + − + + + V −

Voges-

Proskauer + V − − − + − − − − Gelatinase + + + + − + + + + − Urease − − − − − − − V − −

** Plesiomonas shigelloides

(FDA, 2004) Chữ viết tắt: TCBS: thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose; mCPC: modified cellobiose-polymyxin B-colistin; AGS: arginine-glucose slant; nd: không làm; V: có thể thay đổi; R: đề kháng; KK: kiềm / kiềm; KA: kiềm/acid; Ka: kiềm/acid(ít)

kém chịu nhiệt (thermolabile hemolysin, tlh) được tìm thấy trong chủng này Do đó, gen độc lực tdh được xem là gen quan trọng và nó đã được dùng để phát hiện vi

khuẩn V parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR hoặc những kỹ thuật khác (Okuda

và cs, 1997; Bej và cs, 1999; Cook và cs, 2002) Protein TDH do gen tdh sản sinh

có 165 axit amin, khối lượng phân tử là 44.000 Dalton (Miyamoto và cs, 1980)

Đoạn gen tdh được nhân dòng lần đầu bởi Kaper và cs, (1984) và xác định trình tự vào năm 1985 (Nishibuchi và Kaper, 1995) Ngoài gen tdh, vi khuẩn này còn mang gen tdh-related hemolysin (trh) được phát hiện từ bệnh nhân ngộ độc thực phẩm với triệu chứng viêm dạ dày ruột tại Cộng hòa Maldives năm 1985 Gen trh tương đồng 60% với gen tdh, có vai trò gây viêm dạ dày ruột ở người nhiễm V parahaemolyticus (Honda và cs, 1988) Tuy nhiên, những chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh lâm sàng cho người đã được chứng minh sự hiện diện của cả hai gen tdh và trh nhưng khi nuôi cấy vi khuẩn này lại không biểu hiện gen trh (Bej và cs, 1999) Đến nay, cả hai gen tdh và trh được xem là những gen độc lực của V parahaemolyticus gây bệnh cho người

Một yếu tố độc lực quan trọng khác của vi khuẩn Gram âm là yếu tố kết dính

tế bào biểu mô vật chủ Yamamoto và Yokota (1989) cho rằng V parahaemolyticus

có khả năng sản sinh yếu tố gây ngưng kết hồng cầu Thêm vào đó, tiêm mao vi khuẩn cũng đóng vai trò kết dính với thụ thể tế bào biểu mô ruột Có ý kiến cho

rằng quá trình kết dính liên quan đến tình trạng bệnh do V parahaemolyticus

(Nakasone và Iwanaga, 1990)

1.4.2 V vulnificus

Cho đến ngày nay, những dấu hiệu đặc biệt liên quan đến đặc tính về di

truyền và hình thái của vi khuẩn V vulnificus vẫn chưa được hiểu rõ trong cơ chế

gây bệnh cho người Tuy nhiên, dựa vào đặc tính kiểu hình, phản ứng huyết thanh, phản ứng sinh hóa và khả năng gây bệnh trên các loài vật chủ khác nhau mà người

ta chia chúng ra thành ba biotype (Tison và cs, 1982): biotype 1 có thể gây bệnh cho người, biotype 2 thường gây bệnh cho lươn châu Á và châu Âu (và cũng là tác nhân gây bệnh cơ hội cho người); gần đây một biotype thứ 3 (hay còn gọi là type Israeli) được phát hiện ở Isarel, đã gây ra các vụ ngộ độc ở Isarel vào năm 1996-1997 (Bisharat và cs, 1996;1999) Đây là kiểu gen trung gian của biotype 1 và 2 Phân

tích gen, người ta thấy rằng gen có độ dài 33kb chỉ hiện diện ở biotype 1 Một số gen định vị trong quần thể gen này liên quan đến cơ chế gây bệnh cho người Bất kỳ

chủng V.vulnificus nào mang quần thể gen này đều có khả năng tăng tính độc lực

của chúng (Cohen và cs, 2007) Độc lực của biotype 2 này thường liên quan đến

LPS và cho phản ứng âm tính với indol

Trong đó, capsular polysaccharide (CPS) là độc lực quan trọng nhất của V

vulnificus vì nhờ vào lớp này mà vi khuẩn có khả năng tránh được sự thực bào

(Strom và Paranjpye, 2000) Những vi khuẩn bị đột biến vỏ, thường không có khả năng gây bệnh trên chuột và người (Wright và cs, 1990) Sự hiện diện của vỏ liên quan đến hình thái của khuẩn lạc, những khuẩn lạc có vỏ thường mờ đục, trong khi những vi khuẩn không có vỏthường trong suốt (Wright và cs, 1999) Zuppardo và Siebeling (1998) lần đầu tiên xác định gen mã hóa enzyme epimerase là thành phần

chủ yếu hình thành vỏ và yếu tố độc lực Wright và cs (2001) sau đó đã xác định hệ

thống tổng hợp vỏ tương tự như biotype 1 và đã đề xuất cơ chế di truyền của việc biến đổi vi khuẩn không có vỏ và có vỏ Việc xác định những gen khác liên quan đến quá trình biến dưỡng đường đã cho thấy việc sinh tổng hợp LPS

V vulnificus có khả năng sản sinh một loại enzym ngoại bào,

thermolysin-like metalloperoxidase, khối lượng phân tử 45 KDa, đây là một enzyme có khả năng thủy phân reticulin và collagen (Miyoshi và cs, 1987) Những enzyme này

cần kẽm cho quá trình hoạt động và được gọi là metalloprotease (vvp) (Miyoshi và

cs, 1987) Metalloprotease được cho là yếu tố độc lực, đặc biệt là gây xuất huyết làm tổn thương da thông qua việc phân giải màng đáy của mạch máu, tăng cường tính thấm thành mạch và phù thủng Chuột thực nghiệm sẽ chết với những biểu hiện hoại tử da khi được tiêm yếu tố độc lực này vào tĩnh mạch, trong xoang bụng hay

dưới da (Kothary và Kreger, 1987; Miyoshi và cs, 1998) Metalloprotease của V vulnificus do gen empV và vvp thì tương đồng cao với những protease của các loài khác chẳng hạn như V anguillarium, V cholerae, V proteolyticus (Chang và cs,

1996; 1997; Miyoshi, 1997) Watanabe và cộng sự (2004) cũng cho rằng

metalloprotease được ly trích từ chủng V.vulnificus gây bệnh cho người thì tương đồng với chủng V.vulnificus gây bệnh cho lươn

1.4.3 Triệu chứng, bệnh tích

1.4.3.1 Đối với động vật thủy sản

V.vulnificus gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá chình, V parahaemolyticus gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú Ngoài ra, V parahaemolyticus, V vulnificus còn

gây bệnh đỏ thân ở tôm sú thịt, ăn mòn vỏ giáp xác, gây vón cục máu ở cua, bệnh

ấu trùng trên nhuyễn thể Tôm bị nhiễm bệnh thường ở trạng thái không bình thường như nổi lên mặt ao, dạt bờ, kéo đàn bơi lòng vòng, hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn

Tôm biến đổi thành màu đỏ hay xanh Vỏ tôm cua bị mềm và xuất hiện các vết hoại tử, ăn mòn vỏ và các phần phụ Ấu trùng tôm và tôm giống có hiện tượng

phát sáng khi nhiễm V parahaemolyticus (Bùi Quang Tề, 2006)

1.4.3.2 Đối với người

Người bị nhiễm V parahaemolyticus, thời gian ủ bệnh từ 4-74 giờ, trung

bình là 12-46 giờ với các triệu chứng tiêu chảy nước và vọp bẻ bất thường Đôi khi

có triệu chứng buồn nôn, ói mửa và sốt Triệu chứng thường kéo dài từ 1-7 ngày, trung bình 2,5 ngày, thỉnh thoảng có khi lâu hơn Thông thường, người mắc bệnh sẽ

tự khỏi và không có những tổn thương nghiêm trọng, chỉ khoảng 7% người mắc

bệnh nhập viện (Lake và cs, 2003) Ngược lại, V vulnificus thường gây triệu chứng bệnh trầm trọng nhất và tỷ lệ chết lên đến 50% trong tổng số ca bệnh V vulnificus

là loại vi khuẩn chuyên gây hoại tử màng cân, được gọi là khuẩn ăn thịt người (flesh

- eating) do vi khuẩn này nhanh chóng phá hủy mô mềm Theo Hongkong News, Baltimore Sun, Science Daily (8/2005), mỗi năm, toàn khu vực Maryland (Mỹ) có hơn 100 trường hợp nhiễm khuẩn do ăn hải sản tươi sống và 38% trường hợp bị

nhiễm V vulnificus Tỷ lệ nhiễm bệnh tăng lên khi thời tiết ấm hơn Các nhà khoa học cho rằng V vulnificus không phải là hậu quả của sự ô nhiễm môi trường Thời gian từ tháng 6 đến tháng 10 là thời gian thích hợp nhất cho V vulnificus phát triển

vì thời tiết lúc này ấm áp V vulnificus có thể gây nhiễm trùng máu và tử vong chỉ

trong một ngày, đặc biệt là những người có bệnh lý về gan và suy giảm miễn dịch

Những người khỏe mạnh cũng có nguy cơ lây nhiễm V vulnificus qua vết thương

hở Sau khi bị nhiễm khuẩn, người bệnh sẽ có triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau

bụng Ở người có bệnh lý về gan và hệ miễn dịch, V vulnificus gây nhiễm trùng

máu và đe dọa đến tính mạng với các triệu chứng như sốt cao, ớn lạnh rùng mình, vết thương ở da thêm nghiêm trọng, sốc nhiễm trùng Nhóm người này có nguy cơ nhiễm khuẩn cao gấp 80 lần người bình thường và nguy cơ tử vong cao gấp 200 lần

1.4.4 Nguồn nhiễm khuẩn

1.4.4.1 Trên động vật thủy sản

Vibrio spp thường gây bệnh ở động vật thủy sản nước mặn và nước ngọt

như cá, giáp xác, nhuyễn thể… Khi có những yếu tố bất lợi gây stress như thay đổi nhiệt độ môi trường hoặc bị nhiễm những tác nhân khác như virus, nấm và ký sinh trùng Động vật thủy sản bị giảm sức đề kháng, nên khi nhiễm các loài vi khuẩn

Vibrio spp cơ hội sẽ bị bệnh nặng hơn dẫn đến động vật thủy sản chết rải rác hoặc hàng loạt Mùa xuất hiện bệnh tùy theo loài và địa điểm nuôi V parahaemolyticus

và V vulnificus là loại vi khuẩn sống tự do trong môi trường nước biển và cửa sông,

phổ biến vào mùa xuân và mùa hè Chúng hiện diện khắp nơi trên thế giới hay trong

nước bể ươn tảo, bể ươn ấu trùng, bể ươn Artemia Trong bể ươn, mật độ Vibrio

thường tăng theo thời gian nuôi Chúng tụ nhiều trong thức ăn của các loài hải sản

vỏ cứng như tôm cua, nghêu sò, hàu và ốc (Bùi Quang Tề, 2006)

1.4.4.2 Trên người

Vi khuẩn sống trong môi trường nước ô nhiễm có thể xuyên qua da khi da

người bị trầy sướt (Rippey, 1994)

Người bị nhiễm vi khuẩn khi ăn phải các thực phẩm mang trùng như tôm cua, hàu, ốc còn sống hoặc trong quá trình chế biến, nấu chưa chín, đông lạnh thực phẩm không đúng, nhiễm chéo giữa các loại thực phẩm với nhau (Nolan và cs, 1984; Rippey, 1994; Kaysner, 2000)

1.4.5 Điều trị và phòng ngừa

1.4.5.1 Đối với động vật thủy sản

Các trại sản xuất tôm cần thực hiện một số biện pháp phòng nhiễm khuẩn và điều trị bệnh cho ấu trùng tôm theo bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số biện pháp phòng và trị bệnh cho tôm

Thuốc Hàm lượng Mục đích

Formalin 20-25ppm/30-60 phút Phòng nhiễm khuẩn cho tôm bố, mẹ

Oxytetracyline 30-50ppm/1-2 phút Xử lý tảo

Chlorin 10-15 ppm/1 giờ Xử lý artemia

EDTA 2-5 ppm Kìm hãm sự phát triển vi khuẩn

Oxytetracyline 1-2 ppm Phòng bệnh zoes và mysis

1.4.5.2 Đối với người

Để hạn chế khả năng nhiễm bệnh, khi tắm biển hoặc những người thường xuyên tiếp xúc nước biển, nên tránh để vết thương hở Phải rửa sạch những vết thương và băng bó cẩn thận; đeo găng tay khi chế biến hải sản; nấu chín hải sản trước khi ăn; đối với những hải sản có vỏ hoặc mai, cần luộc thêm 5 phút sau khi vỏ

bệnh và hạn chế được sự mất nước

1.5 Tình hình ngộ độc thực phẩm do V parahaemolyticus, V vulnificus gây ra 1.5.1 V parahaemolyticus

Ngày nay, ngộ độc do V parahaemolyticus được xem là vấn đề toàn cầu vì

nó thường xảy ra trên thế giới bao gồm châu Mỹ, (CDC 2006; Gil và cs, 2007),

châu Á (Lee, 2007), và châu Âu (Pinto, 2007)

♦ Ở Châu Á

V parahaemolyticus được xem là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ

biến ở nhiều quốc gia châu Á (Wong và cs, 2000)

Ở Việt Nam, có 548 trường hợp nhiễm V parahaemolyticus vào giữa năm

1997 và 1999 do ăn hải sản sống hoặc chưa được nấu chín ở Nha Trang, Khánh Hòa

Ở Nhật, vụ ngộ độc lớn đầu tiên với 272 người mắc bệnh và 20 người chết

do ăn cá mòi bị nhiễm vi khuẩn này vào năm 1951 (Alam và cs, 2002) Kể từ đó,

nó luôn được xem là nguyên nhân dẫn đầu cho các vụ ngộ độc liên quan đến việc tiêu thụ thức ăn hải sản (Daniel và cs, 2000) Vi khuẩn này gây ra những vụ ngộ độc thực phẩm do ăn cá sống (Okabe, 1974) Trong tổng số các ca bệnh ngộ độc thực

phẩm thì có đến 1/4 các ca bệnh liên quan V parahaemolyticus (Morris, 1999)

Ở Đài Loan, có 1.028 ca ngộ độc thực phẩm, chiếm 69% do V parahaemolyticus trong tổng số 1.495 trường hợp, xảy ra vào giữa năm 1981 và

2003 (Anon, 2005) Tương tự ở Trung Quốc, chiếm 31,1% của 5.770 vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra giữa 1991 và 2001 (Liu và cs, 2004)

♦ Ở Châu Âu

Khác với châu Á, V parahaemolyticus rất hiếm xảy ra ở châu Âu Tuy nhiên

cũng xảy ra lác đác ở Tây Ban Nha và Pháp

Ở Tây Ban Nha có 8 trường hợp do ăn phải cá và giáp xác nhiễm V parahaemolyticus gây viêm dạ dày ruột (Molero và cs, 1989), 64 trường hợp do ăn

hàu sống xảy ra vào năm 1999 ở Galicia (Lozano và cs, 2003) Tháng 7/2004 có 80

ca nhiễm xảy ra ở nhà hàng tổ chức tiệc cưới (Martinez và cs, 2005)

Ở Pháp, vào năm 1997 có 44 ca bệnh xảy ra, nguyên nhân là do sử dụng tôm nhập khẩu từ châu Á vào Pháp (Robert và cs, 2004)

♦ Ở Châu Mỹ

Ở Mỹ, trận dịch đầu tiên xảy ra năm 1971, tại Maryland có 425 người bệnh

do ăn cua nấu không kỹ (Molenda và cs, 1972) Vào giữa năm 1973 – 1998, có 40

trường hợp ngộ độc do ăn giáp xác sống dẫn đến viêm dạ dày ruột do V parahaemolyticus (Daniels và cs, 2000) 700 ca nhiễm xảy ra vào năm 1997-1998

do sử dụng hàu sống nhiễm V parahaemolyticus ở Gulf Coast, vùng tây bắc Thái

Bình Dương và bắc Đại Tây Dương Tương tự, vào mùa hè 2006, cũng có 177 ca nhiễm Qua những trận dịch này, chính phủ Mỹ đặc biệt quan tâm đến việc tiêu thụ hàu sống ở Washington, California (CDC, 2006)

1.5.2 V vulnificus

Mặc dù V vulnificus không gây những trận dịch bệnh, nhưng nó là nguyên

nhân gây sốc nhiễm trùng huyết thường được tìm thấy ở một số vùng của Mỹ và một số nước khác và thường gây chết với tỷ lệ 50-60% trong các trường hợp nhiễm (Tison và cs, 1986; Oliver, 1989; Tamplin, 1992) Ở Mỹ, có 20-40 trường hợp/ năm

bị nhiễm trùng huyết sơ cấp với tỷ lệ chết khoảng 50% ở bệnh nhân bị bệnh gan có triệu chứng tăng nồng độ sắt trong huyết thanh (Shapiro và cs, 1998) Ở Mỹ, từ năm

1981 đến năm 1992, có 125 người nhiễm V vulnificus, và có đến 44 người chết

chiếm tỷ lệ 35% (DePaola và cs, 1994)

1.6 Những phương pháp phát hiện Vibrio

1.6.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống

1.6.1.1 Định tính

Theo tiêu chuẩn quốc tế (ISO, 1990), phương pháp nuôi cấy cũng được sử dụng phổ biến ở các nước châu Âu Mẫu được tăng sinh trong môi trường nước

muối peptone kiềm có bổ sung polymycin B, ủ ở 350C/7-8h, được cấy trên môi trường chuyên biệt TCBS Những khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu xanh lá được xác định

dương tính Để phân biệt V pharahaemolyticus và V vulnificus bằng các phản ứng

sinh hóa như lên men đường lactose, L-arabinose, phản ứng oxidase, ONPG, ADH, ODC, LDC và khả năng chịu mặn Phương pháp này dễ thực hiện, chi phí chấp nhận được nhưng tốn nhiều thời gian 4-5 ngày Tuy nhiên, cũng có thể thử phản ứng sinh hóa bằng cách dùng các bộ kít sẽ cho kết quả nhanh chóng trong vòng 4-

18 giờ nhưng chi phí lại cao hơn như kít API 20E, API NE (FDA, 2004)

1.6.1.2 Định lượng bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN-Most Probable Number)

Đây là phương pháp định lượng Vibrio parahaemolyticus và V vulnificus

dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau trong môi trường nước muối peptone kiềm có bổ sung polymycin

B Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp Dựa vào kết quả biểu kiến (độ đục) chứng minh sự tăng trưởng của

vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm, số lượng ống nghiệm dương tính

ở từng độ pha loãng sẽ được tra bảng Mac Crady Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng, số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn (FDA, 2004; ISO, 2007; Luan và cs, 2008) Tuy nhiên, phương pháp này tốn nhiều thời gian và công

sức và điều bất lợi ở đây là không thể phân biệt giữa V parahaemolyticus và V vulnificus, vì trên môi trường TCBS đều cho khuẩn lạc màu xanh, nên các gốc này

được khẳng định dương tính bằng các phản ứng sinh hóa và cho kết quả trong vòng 3-5 ngày (FDA, 1998)

thế giới nhờ khả năng cho kết quả nhanh, chính xác và thao tác thực hiện tương đối

dễ dàng giúp ích cho việc chẩn đoán bệnh nhanh trên người và động vật nên thường được ưa chuộng Tuy nhiên, mẫu trước khi PCR phải được tăng sinh trong môi trường nước muối peptone kiềm có bổ sung polymycin B, nhằm tăng khả năng phát hiện chúng, hạn chế được hiện tượng âm tính giả do số lượng vi khuẩn trong mẫu quá ít, không đủ DNA khuôn mẫu để khuếch đại (FDA, 2004; ISO, 2007)

♦ Nguyên lý của phương pháp PCR

Phương pháp này được thực hiện in vitro với sự hiện diện của enzyme DNA

polymerase để tổng hợp một sợi DNA mới từ sợi khuôn với sự có mặt của những mồi chuyên biệt Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn biến tính (denaturation) : ở giai đoạn này sử dụng điều kiện nhiệt

độ để biến tính, thường ở 900C- 950C trong 30-60 giây, làm đứt và tách DNA sợi đôi tạo thành hai sợi đơn để đóng vai trò như khuôn mẫu trong quá trình tổng hợp DNA

Giai đoạn bắt cặp (annealation) thường được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ

400C-700C trong 30-60 giây tùy thuộc vào primer sử dụng cho phản ứng Ở nhiệt độ này, primer sẽ tiến hành gắn kết với DNA mẫu Việc xác định nhiệt độ lai rất quan trọng, nó quyết định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR Nếu nhiệt độ lai trong giai đoạn này quá thấp sẽ dẫn đến sự bắt cặp không đặc hiệu làm cho kết quả khuếch đại bị sai Nếu nhiệt độ lai quá cao sẽ dẫn đến độ nhạy của phản ứng kém vì primer sẽ không bắt cặp được

Giai đoạn kéo dài (elongation) thường được tiến hành ở nhiệt độ 720C-740C trong 30 giây đến vài phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần tổng hợp Điều kiện

này sẽ giúp cho Taq polymerase (là enzyme chịu nhiệt được tách chiết từ một loại

vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus) hoạt động và tiến hành tổng hợp sợi

DNA mới (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Để tăng tính hiệu dụng trong việc phát hiện nhiều gen mục tiêu trong một phản ứng PCR, kỹ thuật m-PCR được hình thành Ưu điểm của phương pháp này là

giảm lượng mẫu cần thiết ban đầu, gia tăng số lượng thí nghiệm, giảm tiêu tốn hóa chất phản ứng Tuy nhiên, khi thực hiện m-PCR cần phải xem xét một số yếu tố trong thiết kế cũng như sử dụng các đoạn mồi Các mồi phải có nhiệt độ lai tương tự nhau sai khác nhau không quá 50C để tránh các mồi bắt cặp bổ sung lẫn nhau, kích thước mỗi đoạn mồi không được quá khác nhau (Nguyễn Văn Thành, 2007)

1.6.3 Phương pháp lai DNA

Ngoài phương pháp PCR còn sử dụng phương pháp lai DNA để phát hiện

loài V parahaemolyticus Nishibuchi và cs (1986) sử dụng đầu dò P32 phát hiện gen

tdh của V parahaemolyticus qua quá trình lai Yamamoto và cs (1992) dùng enzym đánh dấu với probe, sau đó thực hiện lai để xác định hai gen tdh và trh của V parahaemolyticus Ngoài ra, sử dụng phương pháp lai trên màng HGMF (hydrophobic grid membrane filters) V parahaemolyticus được phát hiện thông qua

sự lai giữa DNA được cố định trên màng lai HGMF với đầu dò chuyên biệt DIG

phát hiện gen tlh (Banerjee và cs, 2002) Phương pháp này có độ đặc hiệu cao,

nhưng cần có thiết bị chuyên biệt, cần bước pre-PCR để khuếch đại (chuẩn bị cặp mồi, gốc vi khuẩn để lai, ly trích DNA, tổng hợp đầu dò DIG), đánh dấu sản phẩm khuếch đại và sau đó là bước lai

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm

Xử lý mẫu, nuôi cấy và phân lập tại Phòng thực hành Kiểm nghiệm thú sản

và Môi trường sức khỏe vật nuôi, khoa Chăn nuôi Thú y

PCR được thực hiện tại Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á, phường Bình Đường, thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương

2.2 Nội dung thực hiện

(1) Phân lập V parahaemolyticus và V vulnificus trên tôm, nhuyễn thể bằng

phương pháp nuôi cấy và thử sinh hóa

(2) Phát hiện sự hiện diện V parahaemolyticus và V vulnificus trên tôm,

nhuyễn thể bằng kỹ thuật multiplex PCR

(3) Xác định gen độc lực tlh, tdh, trh của V parahaemolyticus và gen vvp của V vulnificus trên tôm, nhuyễn thể bằng kỹ thuật PCR

(4) Xác định tính nhạy cảm của một số gốc V parahaemolyticus và V vulnificus đã định danh được đối với một số loại kháng sinh

2.3 Các chỉ tiêu theo dõi

(1) Tỉ lệ mẫu dương tính với Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus trên

tôm và nhuyễn thể

(2) Tỉ lệ mẫu dương tính V parahaemolyticus mang gen độc lực tlh, tdh, trh của và V vulnificus mang gen vvp

(3) Tỉ lệ nhạy cảm của các gốc V parahaemolyticus và V vulnificus đã định

danh được đối với một số loại kháng sinh

2.4 Vật liệu

2.4.1 Dụng cụ

Tủ cấy vô trùng, máy ly tâm, tủ -700C, tủ -200C, tủ lạnh

Máy vi sóng, máy chụp gel, máy PCR, máy vortex

Bộ nguồn và bồn điện di

Micropipette, đầu típ và eppendorf

2.4.2 Môi trường và hóa chất sử dụng

2.4.2.1 Môi trường nuôi cấy

Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS), alkaline saline peptone water (ASPW), triple sugar iron agar (TSI), nutrient broth (NB), nutrient agar (NA), brain heart infusion (BHI), Mueller – Hinton Agar (MHA)

2.4.2.2 Hóa chất sử dụng

Dung dịch Tris-EDTA (Tris-HCl 10mM, Na2EDTA 1mM)

Phenol, chloroform, isoamyl alcohol (25:24:1)

Isopropanol; ethanol tuyệt đối; TE 1X; ethanol 70%

Master mix, ethidium bromide, thang chuẩn (ladder) và agarose được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á

2.5 Phương pháp tiến hành

2.5.1 Thu thập và bảo quản mẫu

Mẫu được thu thập phải còn tươi Mẫu sau khi lấy được đựng trong những bao nylon vô trùng riêng biệt, ghi tên mẫu, sau đó cho vào thùng đá bảo quản chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (FDA, 2004) (bảng 2.1.)

2.5.2 Xử lý mẫu

Dùng kéo tiệt trùng cắt nhỏ toàn bộ con tôm (cả vỏ và nội tạng) Đối với mẫu nghêu, sò rửa sạch vỏ qua vòi nước máy, dùng dao vô khuẩn tách vỏ nghêu, sò Sau đó, cho toàn bộ thịt và dịch bên trong vào cốc mỏ quạ vô trùng

và cắt mẫu nhỏ thành huyễn dịch cho vào hai môi trường tăng sinh nước muối

Tôm 25 13 20 13 71 Nhuyễn thể 45 44 40 40 169 Tổng 70 57 60 53 240

peptone kiềm (alkaline saline peptone water-ASPW) khác nhau là môi trường 1

(bổ sung 3% NaCl và polymycin B 50UI) và môi trường 2 (bổ sung 6% NaCl

và polymycin B 50UI)

2.5.3 Nuôi cấy và phân lập

Lấy 10g mẫu sau khi xử lý cho vào bình tam giác chứa 90ml dung dịch tăng

sinh, được trộn đều (vortex), ủ ở 41,50C trong 12-18 giờ Mục đích của việc bổ sung

polymycin B và NaCl là tăng khả năng phân lập V parahaemolyticus và V

vulnificus, vì chúng có khả năng đề kháng với polymycin B và khả năng chịu mặn

cao

Sau khi tăng sinh, hút 1ml dung dịch cho vào ống eppendorf vô trùng để ly

trích DNA DNA được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR Đồng thời từ dung

dịch mẫu tăng sinh được sử dụng để phân lập, định danh V parahaemolyticus và V

vulnificus bằng cách cấy sang môi trường chuyên biệt TCBS, ủ ở 370C/24h Đối

với mỗi mẫu, trên thạch TCBS, chọn 4 - 5 khuẩn lạc màu xanh điển hình cho mỗi

loài Vibrio khảo sát (V parahaemolyticus cho khuẩn lạc màu xanh hoặc hơi xanh,

tròn, tâm đục, đường kính 2-3 mm; V vulnificus cho khuẩn lạc màu xanh, tròn,

nhẵn, tâm đục, đường kính 1-2mm) Mỗi khuẩn lạc được chọn chuyển vào môi

trường chứa 2ml BHI (Brain heart infusion), ủ ở 370C/24 giờ Sau đó, từ môi trường

BHI chia ra 2 phần cho vào ống eppendorf vô trùng Một ống dùng để ly trích

DNA làm khuôn mẫu cho m-PCR1 phát hiện sự hiện diện của V

parahaemolyticus hoặc V vulnificus; m- PCR2 hoặc PCR3 để phát hiện gen độc

lực Ống còn lại bổ sung 30% glycerol để giữ gốc ở - 20oC Nếu các gốc cho kết