NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.)

 MAI THỊ PHƯƠNG HOA NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY THANH HAO ARTEMISIA ANNUA L... 



MAI THỊ PHƯƠNG HOA

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG

VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG

ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO

CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 12/2011



MAI THỊ PHƯƠNG HOA

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG

VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG

ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO

CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG

VÀ CHẤT CẢM ỨNG NHẰM NÂNG CAO HÀM LƯỢNG ARTEMISININ TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO

CÂY THANH HAO (ARTEMISIA ANNUA L.)

MAI THỊ PHƯƠNG HOA

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Đại học Nông Lâm TP.HCM

Đại học Nông Lâm TP.HCM

3 Phản biện 1: PGS.TS BÙI VĂN LỆ

Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM

4 Phản biện 2: PGS.TS DƯƠNG TẤN NHỰT

Phân viện Sinh Học Tây Nguyên

Đại học Nông Lâm TP.HCM

Từ tháng 10/2009, theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học tại Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đến nay

Tình trạng gia đình: độc thân

Địa chỉ liên lạc: số nhà 7Kb, đường số 3, phường Cát Lái, quận 2

Điện thoại: 0982368215

Email: phuonghoa11886@yahoo.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Mai Thị Phương Hoa

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình theo học tại trường

Cám ơn PGS.TS Trần Văn Minh đã hết lòng giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

Cảm ơn công lao to lớn của cha mẹ đã không ngại cực khổ để nuôi con khôn lớn và cho con được ăn học tới ngày hôm nay

Cảm ơn cô Bùi Thị Tường Thu, các anh chị và các bạn trong Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

Cám ơn các anh chị trong lớp cao học Công nghệ Sinh học khóa 2009 và bạn

bè thân yêu của tôi đã chia sẻ cùng tôi bao khó khăn trong lúc thực tập

Học viên thực hiện

Mai Thị Phương Hoa

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và chất cảm ứng nhằm

nâng cao hàm lượng artemisinin trong nuôi cấy mô sẹo cây Thanh Hao (Artemisia

annua L.)” được tiến hành tại phòng nghiên cứu trọng điểm phía Nam (Viện Sinh

Học Nhiệt Đới) từ tháng 8/2010 đến 9/2011

Artemisinin là 1 sesquyterpene lactone có cầu nối endoperoxide được ly trích

từ Artemisia annua L., có tác dụng đối với kí sinh trùng sốt rét Plasmodium

falciparum kháng và nhạy cảm với chloroquyne, có hiệu quả trong điều trị các

trường hợp kháng thuốc của bệnh sốt rét và ung thư Hàm lượng artemisinin trong cây Thanh Hao tự nhiên tương đối thấp (0,01 - 1%), trong khi bệnh nhân sốt rét ngày càng gia tăng Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau để tăng năng suất artemisinin như tổng hợp hóa học, ứng dụng kỹ thuật di truyền nhưng các kỹ thuật thực hiện phức tạp và chi phí cao Nghiên cứu nuôi cấy tế bào là hướng mới cải tiến năng suất artemisinin dễ dàng thực hiện với chi phí thấp Artemisinin là một trong các hợp chất thứ cấp nên bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như chất điều hòa sinh trưởng

BA, NAA, ánh sáng, đường sucrose, NH4+/NO3-, nitơ tổng số, KH2PO4 và cường độ ánh sáng kết hợp với các chất cảm ứng, thế hệ tế bào nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng tích lũy artemisinin trong quá trình nuôi cấy tế bào Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại

Qua quá trình thực hiện, chúng tôi ghi nhận được các kết quả như sau:

- Lá cây Thanh Hao phát sinh mô sẹo xanh tốt nhất Môi trường phát sinh mô sẹo là môi trường LV bổ sung BA (1,0 mg/l), NAA (1,0 mg/l), sucrose (30 g/l) tỉ lệ phát sinh 100% trong 12 ngày Môi trường thạch LV bổ sung BA (0,5 mg/l), NAA (0,5 mg/l), casein hydroxylate (0,5 mg/l) và sucrose (30 g/l) giúp cho quá trình tăng sinh khối tế bào tối ưu 19,36 g

- Chất cảm ứng (yeast extract và chitosan) ảnh hưởng đến khả năng tích lũy artemisinin của mô sẹo xanh Thanh Hao Nồng độ chất cảm ứng tối ưu là 100 mg/l YE,

100 mg/l chitosan khả năng tích lũy artemisinin 0,0462% trọng lượng khô tế bào

- Yeast extract và chitosan được bổ sung vào ngày thứ 14 đến ngày thứ 21 (trong 6 ngày) Nồng độ của các yếu tố tăng khả năng tích lũy artemisinin trong mô sẹo xanh Thanh Hao là: đường sucrose 30 g/l, NH4+/NO3- 20/40, nitơ tổng số 40

mM, KH2PO4 200 mg/l, cường độ ánh sáng là 2.000 lux khả năng tích lũy artemisinin tăng 0,074% trọng lượng khô tế bào

Thế hệ tế bào mô sẹo xanh cây Thanh Hao ảnh hưởng đến khả năng tích lũy artemisinin trong tế bào Thế hệ tế bào mô sẹo Thanh Hao tích lũy artemisinin tốt nhất là thế hệ thứ 10 (F10), nồng độ artemisinin tích lũy là 0,0762% trọng lượng khô tế bào

Nghiên cứu là tiền đề cho sản xuất artemisinin từ nuôi cấy mô tế bào cây

Thanh Hao (Artemisia annua L.)

ABSTRACT

The name of thesis: “Studying the influences of the minerals and Elicitors on

the cell growth and artemisinin accumulation in callus cultures of Artemisia annua

L.” This thesis was carried out at Southern Key Laboratory for Plant Cell Technology (Institute for Tropical Biology) from 8/2010 to 9/2011

Artemisinin, a sesquyterpene lactone containing endoperoxide brigde, from

Artemisia annua L has a marked activity against chloroquyne - resistant and

chloroquyne - sensitive strains of Plasmodium falciparum and has proven very

effectively in treatment of cerebral malaria and cancer Artemisinin content in

Artemisia annua L is very low (0,01 - 1% dry weight, DW) due to influence of

climatic condition together with time of planting and harvesting of Artemisia annua

L., while the demand for artemisinin is increasing along with the increasing of many people suffering from malaria There are many different approaches to enhance artemisinin production such as chemical synthesis, genetic engineering but these methods has not been unfeasible because of the high cost or complex nature of the gene regulation and expression in artemisinin biosynthetic pathway A new, cheaper and more convenient approach is studies of metabolite pathway in cell culture to improve Artemisinin production

Artemisinin, a kind of secondary metabolite, may be influenced plant hormones such as BA and NAA, nutrient factors, total nitrogen (NH4+/NO3-), inorganic phosphate (KH2PO4), stress agents such as sucrose, light intensity and elicitors The generation of cell cultures affects on accumulation of artemisinin production in cell culture process as well Therefore we studied the influences of nutrients, phytohormones and elicitors on the cell growth and artemisinin

accumulation in green callus cultures of Artemisia annua L

These experiments were designed in randomized complete design (RCD) with three replication

In this study, we obtained the following results:

- Green callus which was inducted from leaf pieces of in vitro plantlets of

Artemisia annua L on Livay (LV) medium supplemented with 8 g/l agar, BA (1

mg/l), NAA (1 mg/l) is the best with 100% callus - induced explants in 12 days Livay (LV) medium supplemented with 8 g/l agar, BA (0,5 mg/l), NAA (0,5 mg/l), casein hydroxylated (0,5 mg/l) and sucrose (30 g/l) enhanced highest cell biomass (19,36 g)

- Elicitors (yeast extract and chitosan) affected the ability of artemisinin

accumulation of green callus cultures of Artemisia annua L Optimal elicitor

concentrations which enhanced artemisinin accumulation (0,0462% dry weight of cell) were 100 mg/l YE and 100 mg/l chitosan Elicitors were added on day 14 until day 21 (in 6 continuous days), the artemisinin content in the callus and cell biomass are the highest

- Optimal level of factors enhanced artemisinin accumulation of green callus

cultures of Artemisia annua L.: 30 g/l sucrose, 20/40 NH4+/NO3-, 40 mM total nitrogen, 200 mg/l KH2PO4 and light intensity 2.000 lux

- The generation of green callus culture of Artemisia annua L affected the

ability to produce artemisinin Generation 10th (F10) of Artemisia annua L cell line

produced the best artemisinin content with 0,076% dry weight of cell

This study provided a potential protocol for Artemisinin production from in

vitro Artemisia annua L tissue culture

MỤC LỤC

Trang

Trang chuẩn y i

Lí lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm ơn iv

Tóm tắt v

Abstract vii

Mục lục ix

Danh sách các bảng xiv

Danh sách các hình xv

Danh sách chữ viết tắt……… xvi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung đề tài 2

4 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Bệnh sốt rét 3

1.1.1 Lịch sử phát triển bệnh 3

1.1.2 Muỗi chuyền bệnh sốt rét 3

1.1.3 Kí sinh trùng gây bệnh sốt rét (KSTSR) 5

1.1.4.Tình hình nghiên cứu chống bệnh sốt rét 7

1.1.5 Nguyên nhân kháng thuốc 7

1.1.6 Artemisinin và các nghiên cứu hiện nay 8

1.1.6.1 Artemisinin là công cụ hữu hiệu 8

1.1.6.2 Các nghiên cứu mới về bệnh sốt rét hiện nay 9

1.2 Cây Thanh Hao (Artemisia annua L.) 9

1.2.1 Lịch sử phát triển của Thanh Hao 9

1.2.2 Phân loại 9

1.2.3 Đặc điểm phân bố 10

1.2.4 Đặc điểm hình thái 10

1.2.5 Đặc điểm sinh thái 12

1.2.5.1 Điều kiện sống 12

1.2.5.2 Vòng đời 12

1.2.5.3 Thành phần hóa học 13

1.2.5.4 Kỹ thuật nhân giống cây Thanh Hao 14

1.3 Artemisinin và các nghiên cứu thu nhận artemisinin 15

1.3.1 Lịch sử phát triển 15

1.3.2 Artemisinin và tính chất của artemisinin 16

1.3.3 Đặc tính dược học của artemisinin 17

1.3.4 Cơ chế tác động của artemisinin 18

1.3.5 Sinh tổng hợp artemisinin từ cây Thanh Hao 19

1.3.6 Một số nghiên cứu artemisinin từ Thanh Hao 20

1.3.6.1 Nghiên cứu ở Việt Nam 20

1.3.6.2 Nghiên cứu ở nước ngoài 21

1.4 Nuôi cấy mô sẹo 23

1.4.1 Khái niệm 23

1.4.2 Đường cong sinh trưởng 24

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phát sinh mô sẹo 25

1.4.4 Nuôi cấy mô tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp 25

1.4.5 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 26

1.4.5.1 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 27

1.4.5.2 Phương pháp cố định tế bào 28

1.4.5.3 Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao 28

1.4.5.4 Cung cấp tiền chất 29

1.4.5.5 Chất kích kháng bảo vệ thực vật (chất cảm ứng) 29

 Dịch chiết nấm men (yeast extract - YE) 30

 Chitosan 31

1.5 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 33

1.5.1 Nguyên tắc 34

1.5.2 Hệ thống sắc kí lỏng cao áp 34

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu 35

2.2 Điều kiện nuôi cấy 35

2.3 Phương pháp nghiên cứu 36

2.3.1 Khảo sát môi trường nuôi cấy phát sinh mô sẹo xanh Thanh Hao 37

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng BA, NAA đến khả năng phát sinh mô sẹo 37

2.3.2 Khảo sát quá trình nhân sinh khối mô sẹo xanh Thanh Hao 39

Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ BA và NAA 39

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pepton, malt và casein 40

Thí nghiệm 4: Khảo sát động thái nhân sinh khối mô sẹo xanh Thanh Hao 41

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng (yeast extract, chitosan) 41

Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng 41

Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bổ sung chất cảm ứng 43

Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của đường sucrose 43

Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của NH4+/NO3- 44

Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của nitơ tổng số 45

Thí nghiệm 10: Khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4 45

Thí nghiệm 11: Khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sáng 46

Thí nghiệm 12: Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến thời gian tích lũy 47

Thí nghiệm 13: Khảo sát ảnh hưởng của các thế hệ tế bào Thanh Hao 47

2.4 Xác định hàm lượng artemisinin bằng phương pháp HPLC 48

2.4.1 Xử lí mẫu 48

2.4.2 Phương pháp 48

2.4.3 Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp 49

2.4.4 Xây dựng đường chuẩn 50

2.5 Phương pháp phân tích thí nghiệm 51

2.6 Phương pháp xử lí thống kê 51

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường nuôi cấy phát sinh mô sẹo xanh 52

3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát quá trình nhân sinh khối mô sẹo cây Thanh Hao 58

3.2.1 Khảo sát sự ảnh hưởng BA và NAA 58

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pepton, malt và casein 60

3.2.3 Khảo sát đường cong sinh trưởng mô sẹo xanh cây Thanh Hao 62

3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng 64

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng 65

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bổ sung chất cảm ứng 69

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của đường sucrose 70

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của NH4+/NO3- 72

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nitơ tổng số 73

3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4 74

3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của cường độ ánh sáng 76

3.3.8 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố và chất cảm ứng đến thời gian 79

3.3.9 Khảo sát ảnh hưởng của các thế hệ tế bào 80

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

PHỤ LỤC 91

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu về nhân giống cây Thanh Hao 15

Bảng 2.1: Ảnh hưởng của môi trường MS, LV và BA, NAA 37

Bảng 2.2: Ảnh hưởng BA và NAA trong nhân sinh khối mô sẹo xanh 39

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pepton, malt extract và casein hydroxylate 40

Bảng 2.4: Đường cong sinh trưởng của mô sẹo xanh Thanh Hao 41

Bảng 2.5: Ảnh hưởng của chất cảm ứng 42

Bảng 2.6: Ảnh hưởng của thời gian bổ sung chất cảm ứng 43

Bảng 2.7: Ảnh hưởng của đường sucrose 43

Bảng 2.8: Ảnh hưởng của NH4+/NO3- 44

Bảng 2.9: Ảnh hưởng của nitơ tổng số 45

Bảng 2.10: Ảnh hưởng của KH2PO4 46

Bảng 2.11: Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng 46

Bảng 2.12: Ảnh hưởng của các yếu tố và chất cảm ứng đến thời gian tích lũy 47

Bảng 2.13: Ảnh hưởng của các thế hệ tế bào 48

Bảng 3.1: Ảnh hưởng môi trường MS, LV và BA, NAA 54

Bảng 3.2: Ảnh hưởng BA và NAA trong quá trình tăng sinh khối mô sẹo 58

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pepton, malt extract và casein hydroxylate 60

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các chất cảm ứng 66

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian bổ sung chất cảm ứng 69

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của đường sucrose 71

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của NH4+/NO3- 72

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nitơ tổng số 73

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của KH2PO4 75

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng 77

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của các yếu tố và chất cảm ứng đến thời gian tích lũy 79

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của các thế hệ tế bào 80

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 1.1 Muỗi Anophele 4

Hình 1.2 Ký sinh trùng Plasmodium falciparum 5

Hình 1.3 Chu trình của bệnh sốt rét lây nhiễm 6

Hình 1.4 Bảng giải mã chromosome 3 của Plasmodium falciparum 8

Hình 1.5 Cây Thanh Hao 06 tháng tuổi ở Lâm Đồng 10

Hình 1.6 Hình thái hoa Thanh Hao 11

Hình 1.7 Hình lá và hoa Thanh Hao ngoài tự nhiên 12

Hình 1.8 Các cấu trúc của dẫn xuất artemisinin 14

Hình 1.9 Cấu trúc artemisinin 16

Hình 1.10 Tinh thể artemisinin tách từ cây Thanh Hao 17

Hình 1.11 Cơ chế hoạt động của artemisinin 19

Hình 1.12 Con đường sinh tổng hợp artemisinin 20

Hình 1.13 Cấu trúc của chitosan 31

Hình 1.14 Hệ thống máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 34

Hình 2.1 Cây Thanh Hao (Artemisia annua L.) in vitro 35

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quan thí nghiệm 36

Hình 2.3 Đường chuẩn tuyến tính nồng độ artemisinin 50

Hình 3.1 Mẫu lá và thân cây Thanh Hao tạo mô sẹo 53

Hình 3.2 Mẫu mô sẹo Thanh Hao sau 3 lần cấy chuyền 53

Hình 3.3 Các hình thái mẫu lá Thanh Hao phát sinh mô sẹo sau 21 ngày 57

Hình 3.4 Mô sẹo xanh Thanh Hao sau 5 lần cấy chuyền 59

Hình 3.5 Mô sẹo xanh Thanh Hao trên môi trường LV + BA (0,5 mg/l) + NAA (0,5 mg/l) và các chất bổ trợ 61

Hình 3.6 Đồ thị đường cong sinh trường của mô sẹo xanh Thanh Hao 63

Hình 3.7 Mô sẹo xanh Thanh Hao trên môi trường LV + BA (0,5 mg/l) + NAA (0,5

mg/l) + casein (0,5 g/l) + sucrose (30 g/l) 64

Hình 3.8 Mô sẹo Thanh Hao bổ sung 100 mg/l YE và 100 mg/l chitosan 69

Hình 3.9 Mô sẹo xanh cây Thanh Hao ảnh hưởng bởi cường độ ánh sáng 78

Hình 3.10 Mẫu thu nhận phân tích HPLC 81

cđhst: Chất điều hòa sinh trưởng

NAA: α - naphthaleneneacetic acid

Suc: Đường sucrose

YE: Yeast extract (dịch chiết nấm men)

1 Đặt vấn đề

Sốt rét là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất trên thế giới đặc biệt ở các nước nhiệt đới, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Mỗi năm có tới 500 triệu người bị nhiễm bệnh sốt rét, trong đó số tử vong từ 2 - 2,7 triệu người (Rinaldi, 2004) Nguyên nhân chính do khả năng kháng thuốc quynoline

của kí sinh trùng Plasmodium falciparum đã làm cho bệnh sốt rét ngày càng trở nên

khó kiểm soát Hiện nay, artemisinin được chiết suất từ cây Thanh Hao(Artemisia

annua L.) đã trở nên phổ biến được xem như là phương thức chữa sốt rét hiệu quả

và an toàn

Tuy nhiên, hàm lượng artemisinin có trong cây ngoài tự nhiên thấp (ElSholy

và ctv, 1988; Liersch và ctv, 1986) phụ thuộc vào mùa, cá thể và các yếu tố ngoại cảnh (côn trùng, nấm mốc, vi khuẩn ) Artemisinin tổng hợp nhân tạo lại phức tạp, không có hiệu quả kinh tế Để giải quyết những vấn đề này các nhà khoa học đã nghiên cứu mở ra nhiều triển vọng mới trong sản xuất artemisinin

Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật Từ những nghiên cứu phát triển sử dụng các công cụ di truyền như tế bào mô sẹo nhỏ có khả năng phân chia nhanh và tích lũy các hoạt chất trong quá trình sinh trưởng đến sự hiểu biết sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất ở quy mô thương mại

Bên cạnh đó nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y - dược ngày càng cao nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn

Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp Vì vậy,

các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần

thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp Có rất nhiều nghiên cứu khác nhau

như tối ưu thành phần tỉ lệ của môi trường dinh dưỡng, các tác nhân hóa học, vật lí

là điều kiện để tối ưu khả năng tích lũy của các hoạt chất sinh học cao nhất trong tế

bào (Dominick và ctv, 1993) Đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trên thị trường, làm giảm giá

thành sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ thực vật

Vì vậy dựa vào các cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh

hưởng của thành phần khoáng và các chất cảm ứng nhằm nâng cao hàm lượng

artemisinin trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thanh Hao (Artemisia annua L.)”

2 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu tỉ lệ của thành phần khoáng và chất cảm ứng nhằm nâng cao hàm

lượng artemisinin tích lũy trong nuôi cấy mô sẹo xanh (tế bào có diệp lục tố) cây

Thanh Hao (Artemisia annua L.).

3 Nội dung đề tài

- Khảo sát môi trường phát sinh và tăng sinh mô sẹo xanh cây Thanh Hao

(Artemisia annua L.)

- Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng (yeast extract và chitosan) đến khả

năng tích lũy artemisinin của mô sẹo xanh Thanh Hao

- Khảo sát ảnh hưởng của đường sucrose, NH4+/NO3-, nitơ tổng số, KH2PO4 và

cường độ ánh sáng kết hợp với chất cảm ứng đến khả năng tích lũy artemisinin

- Khảo sát ảnh hưởng của các thế hệ tế bào mô sẹo xanh Thanh Hao đến khả

năng tích lũy artemisinin

- Đánh giá khả năng tích lũy hàm lượng artemisinin của mô sẹo xanh Thanh

Hao bằng phương pháp HPLC

4 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về công nghệ

tế bào thực vật (Viện Sinh Học Nhiệt Đới) thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện từ tháng 8/2010 đến 9/2011

Giới hạn của đề tài: các thí nghiệm được thực hiện trên quy mô pilot

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Bệnh sốt rét

Sốt rét còn gọi là ngã nước là một chứng bệnh gây ra bởi kí sinh trùng loại

protozoa có tên là Plasmodium, lây truyền từ người bệnh sang người khỏe mạnh khi

bị muỗi đốt Bệnh phổ biến ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Mỹ, châu Á và châu Phi Mỗi năm có khoảng 515 triệu người mắc bệnh, từ 1 - 3 triệu người tử vong (90% số ca tử vong) đa số là trẻ em ở khu vực phía nam sa mạc Sahara, châu Phi Bệnh thường đi kèm với đói nghèo, lạc hậu và là một cản trở lớn đối với sự phát triển kinh tế (Butler và ctv, 1997)

1.1.1 Lịch sử phát triển bệnh

Cách đây trên 10.000 năm, bệnh sốt rét đã có ở Châu Phi Cách đây khoảng 5.000 - 10.000 năm, bệnh có ở Mesopotamia, bán đảo Ấn Độ và Đông Nam Á Từ thế kỷ 19, bệnh sốt rét có mặt trên khắp thế giới Đến đầu thế kỷ 20, hàng triệu người trên khắp thế giới đã chết vì loại bệnh này Tuy nhiên, vào những năm đầu thập niên 1950, bệnh sốt rét hầu như đã biến mất khỏi Bắc Mỹ và Châu Âu, hiện

nay chủ yếu là ở Châu Phi

Năm 1880, thầy thuốc người Pháp là Alphonce Laveran (1845 - 1922) đã phát hiện ra vi trùng gây bệnh sốt rét (giải Nobel - năm 1907)

Năm 1897, Ronald Ross (1857 - 1932), bác sĩ người Anh nghiên cứu về côn trùng học khi nghiên cứu muỗi truyền bệnh sốt rét, đã phát hiện ra kí sinh trùng

bệnh này trong muỗi Anophele Năm 1902, ông đã được trao giải Nobel

1.1.2 Muỗi chuyền bệnh sốt rét

Có khoảng 2.500 loài muỗi nhưng chỉ có các loài Anophele mới truyền KSTSR Plasmodium cho loài hầu, khỉ, người và các động vật có vú Có hơn 60 loài, trong khoảng 400 loài Anophele đã biết, là vector chính truyền Plasmodium; các

Hình 1.1 Muỗi Anophele (Breman, 2008)

loài khác coi như vector phụ tùy địa phương

Vòng đời: trứng muỗi nổi từng chiếc trên mặt nước, hình thon dài khoảng 1mm, có hai phao hai bên, nở sau 2 - 3 ngày thành bọ gậy Bọ gậy ăn các hạt hữu cơ nhỏ Ở vùng nhiệt đới, từ khi trứng nở tới muỗi trưởng thành khoảng 11 - 13 ngày

Tập tính: muỗi Anophele hoạt động từ khi mặt trời lặn đến khi mặt trời mọc

Mỗi loài khác nhau về giờ đốt mồi cao điểm và địa điểm đốt mồi Muỗi thường nghỉ trong suốt thời gian cần thiết để tiêu máu và phát triển trứng ngay trong nhà hay ở các bụi cây và đẻ trứng ở các vũng trũng đọng nước có nước chảy chậm

Các loài Anophele khác nhau

Những điểm phân biệt muỗi Anophele là: chiều dài của pan bằng chiều dài của

vòi Ở tư thế nghỉ, vòi và thân muỗi thường hợp thành với mặt phẳng muỗi đậu một góc nhọn Góc này thay đổi tùy loài, từ nhọn - gần 90° Ngoại trừ loài Anophele

culicifacies, thân hầu như song song với mặt bằng muỗi đậu

Người bệnh có thể chết sau khi có các triệu chứng nguy hiểm 12 giờ Biểu hiện lâm sàng của bệnh: sốt rét run vã mồ hôi, thiếu máu, gan to, lách to Sốt cách nhật

do Plasmodium vivax (hay Plasmodium ovale ở Châu Phi), Plasmodium falciparum không tái phát khi rời vùng dịch; sốt cách 2 ngày do Plasmodium malariae có thể tái phát Sốt rét do Plasmodium falciparum thường có nhiều biến chứng nặng: sốt

rét ác tính, sốt nôn ra mật, đái ra hemoglobin gây tử vong cao

Người bị sốt rét nhiều lần sẽ xuất hiện hệ thống miễn dịch lại vi khuẩn chỉ trong 1 - 2 năm sau khi nhiễm bệnh Hiện nay bệnh vẫn chưa có vaccin phòng ngừa

Ở Việt Nam, có hơn 60 loài Anophele gồm muỗi Anophele minimus, Anophele

dirus và Anophele sundaicus mang hai KSTSR (Plasmodium falciparum và

Plasmodium vivax) Các loại muỗi này có nhiều ở Ðông Nam Á Kí sinh trùng Plasmodium vivax xuất hiện giới hạn ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long, trong

khi Plasmodium falciparum thường có ở các vùng núi và cao nguyên như Tây

Nguyên, Hoàng Liên Sơn, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Tĩnh, nơi đã xảy ra dịch sốt rét

trong 1980 - 1990 Một số loài muỗi khác được nghi ngờ ở Việt Nam là Anophele

campestris, Anophele culicifacies, Anophele lesteri

1.1.3 Kí sinh trùng gây bệnh sốt rét (KSTSR)

Sốt rét do KSTSR thuộc giống Plasmodium gây nên Ở người, do 4 loài

Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae và Plasmodium ovale Trong đó, Plasmodium falciparum là loại gây sốt rét ác tính, có tỉ lệ tử vong

cao, nhất là ở trẻ em; Plasmodium vivax và Plasmodium ovale gây sốt cách nhật lành tính Đôi khi, Plasmodium vivax cũng gây sốt rét ác tính

Hình 1.2 Ký sinh trùng Plasmodium falciparum xâm nhập và phá vỡ hồng cầu

Plasmodium có thể sống trong cơ thể muỗi Bệnh lây truyền ở nơi có nhiệt độ trung bình trên 14,5°C nên nước ta thuộc vùng nhiệt đới bệnh lan truyền quanh năm Tuy nhiên, muỗi Anophele lại phát triển theo mùa nên có 2 điểm cao là tháng

4 - 6 và tháng 8 - 11

Nhiệt độ tốt nhất để KSTSR phát triển trong cơ thể muỗi là từ khoảng 28 -

30°C Ở 28°C, Plasmodium falciparum cần hơn 9 ngày; Plasmodium vivax cần hơn

7 ngày; nếu ở 30°C thì Plasmodium falciparum cần hơn 8 ngày, Plasmodium vivax

cần hơn 6 ngày để hoàn thành giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi từ thể giao bào

ở dạ dày đến thể thoa trùng ở tuyến nước bọt và truyền bệnh Muỗi là trung gian

Hình 1.3 Chu trình của bệnh sốt rét lây nhiễm

truyền bệnh từ người sang người

Bệnh sốt rét đã trở thành vấn đề toàn cầu, là căn bệnh thường thấy ở 105 quốc gia, phổ biến ở nhiều vùng thuộc châu Á, châu Phi, Trung Mỹ và Nam Mỹ Hàng năm, có 300 - 500 triệu người trên thế giới bị nhiễm bệnh và hơn một triệu người chết Tình trạng mắc bệnh và tử vong, đặc biệt ở trẻ em và thai phụ đang trở nên báo động mạnh Du khách là một trong những nguyên nhân khiến bệnh sốt rét lan truyền khắp thế giới

Mỗi ngày tại châu Phi có đến 3.000 trẻ em tử vong vì sốt rét (năm 2003), nghĩa

là cứ mỗi 30 giây lại có một em chết vì căn bệnh này Muỗi Anophele gambiae và

Anophele funesus là nguyên nhân chính gây thiệt hại khoảng 12 tỉ USD/năm cho

châu Phi, chiếm đến 40% ngân sách phục vụ sức khỏe cộng đồng (medical.net/health/what-is-Malaria.aspx)

www.news-Việt Nam cũng nằm trong khu vực sốt rét nặng của thế giới Khoảng 60 năm trước, mỗi năm có gần 1 triệu người bệnh, chiếm 5% dân số, tỉ lệ tử vong 20%

Khoảng 45 triệu dân tập trung ở vùng rừng núi phía Bắc, ven dọc Trường Sơn, cao nguyên miền Trung, khu vực Đông Nam, Tây Nam và miền duyên hải chiếm 3/4 diện tích cả nước

Theo www.nature.com/cgitaf/DynaPage.taf?file=/nature/journal/v400/n6744/

hơn do chiều hướng kháng thuốc của KSTSR và chiều hướng kháng thuốc diệt côn trùng của muỗi đang gia tăng Vì thế, hiện nay sốt rét vẫn là một căn bệnh khó tiêu diệt Các nhà khoa học vẫn không ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra một loại thuốc mới điều trị sốt rét hiệu quả hơn Theo báo cáo của Viện Y học (IOM), bệnh sốt rét đang tái phát ở mức độ cao và nhấn mạnh việc bổ sung nguồn thuốc cấp bách với giá thành rẻ có thể thay thế các thuốc trị sốt rét cũ đã bị đề kháng

1.1.4 Tình hình nghiên cứu chống bệnh sốt rét

Trong hai thập niên 1950 - 1960, chiến dịch tiêu diệt muỗi và bệnh sốt rét, chủ yếu dùng thuốc DDT (dichlorodiphenyltrichloroethane) và chloroquynine, đã được thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới với sự trợ giúp của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Năm 1998, với sự hợp tác của ngân hàng thế giới (WB), quỹ liên hiệp quốc vì trẻ em (UNICEF) và chương trình vì sự phát triển của Liên hiệp quốc (UNDP), WHO đã ra chương trình "Ðẩy lùi sốt sét" (RBM - Roll Back Malaria) để đẩy mạnh nghiên cứu, hy vọng đẩy lùi được bệnh giảm 1/2 số tử vong cho đến năm 2010 Năm 1998, chương trình tìm thuốc chống sốt rét (MMV - Medicines for Malaria Venture) được thành lập tại Geneva, nhằm gây quỹ để khám phá và phát triển ít nhất một loại thuốc mới trị sốt rét mỗi 5 năm Hiện MMV có 7 chương trình nghiên cứu các loại thuốc mới Ở Mỹ năm 1999, chương trình chế tạo thuốc chủng ngừa sốt rét (MVI - Malaria Vaccine Initiative) được thành lập

Tuy nhiên, sự xuất hiện của muỗi kháng DDT và kí sinh trùng Plasmodium

falciparum kháng chloroquynine bắt đầu từ Đông Nam Á và Nam Mỹ sau đó lan ra

các vùng khác, sự hữu hiệu của giải pháp đã giảm đi Hiện nay, trong 4 KST gây

bệnh, chloroquynine chỉ còn có tác dụng hiệu quả duy nhất với Plasmodium ovale

1.1.5 Nguyên nhân kháng thuốc

Tháng 10/2002, hai tạp chí khoa học Science và Nature đã công bố toàn bộ bộ

gen của KST Plasmodium falciparum (loại KST nguy hại nhất) và muỗi Anophele

gambiae, loại muỗi chủ yếu ở Phi châu mang cả 4 loại KST trên

Sử dụng bản đồ gen để so sánh phản ứng của các KST khi tiếp xúc với các loại thuốc chống sốt rét khác nhau, các nhà khoa học đã xác định được một vùng gen mới lạ có liên quan rất lớn đến việc kháng lại thuốc chloroquyne Kết quả cho thấy

rằng các mẫu KST Plasmodium falciparum ở Châu Phi có sự biến đổi DNA lớn hơn

rất nhiều so với các mẫu ở Châu Á và Châu Mỹ

1.1.6 Artemisinin và các nghiên cứu hiện nay

1.1.6.1 Artemisinin là công cụ hữu hiệu

Để diệt KSTSR từ nhiều năm nay là các thuốc hóa học dựa vào hợp chất thiên nhiên như chloroquynine từ vỏ cây Quyna - Quyna gốc ở Nam Mỹ Hiện nay, thuốc trị KSTSR tốt và hiệu nghiệm nhất là artemisinin hoạt chất chính của cây Thanh Hao (QuyngHao) mà Trung Quốc đã tìm ra đầu thập niên 1970

Hình 1.4 Bảng giải mã chromosome 3 của Plasmodium falciparum

Năm 1979, Trung Quốc thử nghiệm artemisinin thành công trên 2.099 bệnh nhân sốt rét Ngoài ra, artemisinin dùng trên 143 bệnh nhân sốt rét với KST đã nhờn thuốc chloroquyne và 141 bệnh sốt rét màng não cũng cho kết quả khả quan

Ở Việt Nam, hai danh y Tuệ Tĩnh và Hải Thượng Lãn Ông cũng đã dùng Thanh Hao trị bệnh sốt rét, đổ mồ hôi trộm Năm 1984, Thanh Hao đã dùng để trích

ra các hợp chất artemether, artemisinin và artesunate Năm 1993, thử nghiệm trên

638 bệnh nhân, dùng artemisinin trong vòng 24 giờ, kết quả 98% KSTSR biến mất

1.1.6.2 Các nghiên cứu mới về bệnh sốt rét hiện nay

Dùng muỗi biến đổi gen: sử dụng kỹ thuật di truyền có nhiều triển vọng tạo ra giống muỗi mới bằng cách biến đổi gen giống muỗi gây bệnh để chúng không thể gây bệnh Muỗi biến đổi gen cho ra môi trường chúng có thể sống vượt trội, cạnh tranh tiêu diệt hay làm giảm mật độ muỗi truyền bệnh qua kết hợp Từ đó, các thế

hệ sau của chúng sẽ có gen không mang KSTSR

Đầu năm 2002, Đại học Cleveland (Ohio) đã cấy thành công một gen mới vào

bộ gen loại muỗi Anophele stephensi kháng lại được KSTSR WHO đã đặt chương

trình muỗi biến đổi gen là một trong những ưu tiên lớn nhất để chống sốt rét

Dùng vi nấm “thuần hóa” muỗi truyền bệnh: hội thảo về sốt rét châu Phi lần

IV, các nhà khoa học Hà Lan, Tanzania và Anh đã sử dụng vi nấm tại Đông Phi lây

nhiễm sang côn trùng và muỗi Anophele, làm vòng đời của muỗi giảm đi 2/3 Ngay

sau khi muỗi bị nhiễm nấm, nó lập tức ngừng hút máu chỉ hút nước hay nước quả Đồng thời khi bị nhiễm nấm, chúng làm cho KSTSR không phát triển

1.2 Cây Thanh Hao (Artemisia annua L.)

1.2.1 Lịch sử phát triển của Thanh Hao

- Năm 1820, phát hiện ra thuốc chống sốt rét đầu tiên có nguồn gốc từ Quynin

- Năm 1945, chloroquyne ra đời và đến năm 1970 là pyrimethamin

- Năm 1972, nhà khoa học Tu Youyou (Trung Quốc) đã tìm ra artemisinin

trong lá khô của cây Artemisia annua L (đặt tên là Thanh Hao hoa vàng)

Hình 1.5 Cây Thanh Hao 06 tháng tuổi ở Lâm Đồng cao 1,5 m

Tên khoa học: Artemisia annua Linn

Tên tiếng Anh: (Sweet/annual) Wormwood, sweet Annie (E)

Tên thông thường: Thanh Hao hoa vàng, Thanh Cao, Thảo Cao, Ngải Si, Ngải Hôi, Ngải Đắng

Hiện nay, cây Thanh Hao được trồng phổ biến ở vùng ôn đới ẩm, cận nhiệt đới

và nhiệt đới Bắc bán cầu, gồm các nước Đông Âu, Bắc Mỹ, Tây Nam Á và Đông Á

Ở Châu Á: phía nam Liên Xô cũ, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và Việt Nam Ở Việt Nam, Viện dược liệu đã phát hiện cây mọc tự nhiên ở 4 tỉnh năm 1986

- 1990 Trong 15 loài thuộc chi Artemisia, có 4 loài rất giống nhau về hình thái là:

Artemisia apiaceae, Artemisia capillaris, Artemisia campetris và Artemisia annua;

trong đó chỉ có Artemisia annua có artemisinin (Ferreira và Janick,1995)

1.2.4 Đặc điểm hình thái

Thanh Hao là cây thân thảo mọc đứng, sống hàng năm, phân cành nhiều Thân hình trụ, có rãnh dọc, màu lục hoặc hơi tím, cao 0,5 - 2 m có khi hơn Cây mọc hoang thường cao từ 1,5 - 2 m Cây trồng được chăm bón tốt thường cao từ 3 - 4 m,

có mùi thơm nhẹ

Hình 1.6 Hình thái hoa Thanh Hao (Ferreira và Janick, 1995)

A Hoa đầu; B Đài hoa với các lá bắc xếp chồng lên nhau (b), đế hoa (r), hoa cái (p), hoa lưỡng tính (h); C Các lá bắc xếp lợp lên nhau; D Hoa nhỏ chưa nở chỉ hướng của lông tiết; E Lông tiết phát triển hoàn toàn, căng phồng lên; F Hoa lưỡng tính với bao phấn có thùy đính vào phần gốc của tràng hoa (c), nhụy có núm nhụy chẻ đôi (s), vòi nhụy (st), và bầu nhụy (o); G Hạt phấn có ba rãnh gồm các gai đã tiêu giảm, đặc tính của những loài thụ tinh nhờ gió, và lỗ mầm (gp) lồi ra từ

Lá kép mọc so le, lá ở giữa thân cành thường xẻ 3 lần lông chim thành những thùy nhỏ, sâu, dài 4 – 7 cm, rộng 2 - 4 cm; lá ở phía ngọn lúc cây sắp ra hoa thường hẹp, xẻ 1 - 2 lần lông chim, mặt trên màu lục nhạt, hai mặt có lông nhỏ mịn Lá già vàng rồi chết khô, không rụng vì cuống lá rất dai Lá vò ra có mùi thơm đặc biệt Cụm hoa đầu hình cầu, cuống rất ngắn, đường kính 1,5 mm Các đầu tụ hợp thành thùy ở ngọn thân và đầu cành; bao gồm các lá bắc hình sợi chỉ thuôn không lông, xếp thành 2 - 3 hàng; hoa vàng, dạng ống, dài không quá 1 mm, ngoài là hoa cái, trong là hoa lưỡng tính; tràng của hoa cái có tuyến trong ống, ống tràng hơi loe

ở đỉnh, rồi chia thành 4 thùy nhọn, vòi nhụy xẻ; tràng của hoa lưỡng tính rộng và xẻ thành 5 thùy; nhị 5, bao phấn ngắn Mỗi cụm hoa có 25 - 35 hoa, trong đó có 20 -

25 hoa lưỡng tính ở giữa Hoa cái có 5 - 8 hoa ở xung quanh Kích thước hoa rất nhỏ, vỏ có rãnh dọc có các tuyến tinh dầu (1 gam hạt khô có 20.000 - 22.000 hạt) Quả bế, hình xoan hoặc hình trứng ngược, có vân dọc, dài từ 0,4 - 0,5 mm, có chất dầu, mùa ra hoa từ tháng 9 - 11 hàng năm

1.2.5 Đặc điểm sinh thái

Hình 1.7 Hình lá và hoa Thanh Hao ngoài tự nhiên

1.2.5.1 Điều kiện sống

- Khí hậu: Thanh Hao có biên độ sinh thái rộng, sinh trưởng được ở các vùng

ôn đới ẩm và cả ở vùng nhiệt đới gió mùa nóng ẩm Việt Nam

- Ánh sáng: là loại cây ưa sáng và ẩm Trong tự nhiên, có thể thấy cây chịu bóng khi mọc lẫn với một số cây cỏ và cây bụi ở vùng đồi và chân núi đá vôi Theo

“Trung dược thông báo” tập 11, số 7, 1986 chế độ chiếu sáng ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng artemisinin trong lá; độ che bóng càng cao thì hàm lượng hoạt chất càng giảm Bên cạnh đó còn có các yêu cầu về đất như: phạm vi thích ứng rộng, dinh dưỡng, thoát nước, tưới tiêu thuận tiện, pH đất = 5,0 - 6,5

1.2.5.2 Vòng đời

Hàng năm, từ giữa tháng 2 - 3 hạt Thanh Hao nảy mầm Trong thời gian từ 2 - 2,5 tháng đầu, cây con sinh trưởng chưa có hoạt chất Vào 3,5 - 4 tháng tuổi cây sinh trưởng mạnh 15,3 - 17,7 cm/tháng hàm lượng hoạt chất trong lá tăng rất nhanh, cho đến khi bắt đầu có hoa được xem là cực điểm Đến cuối tháng 7 - 8 cây sinh trưởng chậm lại; số lá xanh trên cây giảm đi Hoa nở từ dưới lên trên và từ ngoài vào trong Quả già và chín từ giữa tháng 10 - 11 Vào giữa tháng 11, cây tàn lụi, hạt giống được phát tán ra xung quanh Hạt Thanh Hao tồn tại trên mặt đất qua mùa đông từ 3 - 3,5 tháng Tuy nhiên, khả năng nảy mầm của hạt giảm nhanh theo thời gian bảo quản

- Các lipid gồm: nonacosanol, 2 - methyltricosan - 8 - on - 23 - ol, hentriacontanyl - tricontanoat và 2, 29 - dimethyltriacontan

Các hợp chất flavonoid gồm quercetagetin 3 methylether; quercetagetin

-6, 7 - tetramethylether; quercetagetin - -6, 7 - 4’ - trimethyl ether; 3, 5 - dihydroxy - 3’, 4’ - 6, 7 - tetramethoxyflavon; 3,3’,5’ - dioxyflavon; kaempferol; quercetin; 6 -

methoxy kaempferol; artemetin; casticin; chrysopletin Các dẫn chất polyacetylen là auadiepoxyd và ponticaepoxyd

Hình 1.8 Các cấu trúc của dẫn xuất artemisinin (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Tinh dầu Thanh Hao Việt Nam chứa  - pinen, camphen, sabinen,  - pinen,  - myrcen 4,38%, p - cymen, 1 - 8 cineol 15,44%, artemisiaceton, linalol, limonen oxyd, camphor 23,75%, artemisialcol, 4 - terpineol, 2 - methylen - 5 - isopropenylcyclohexanol, geranyl acetat,  - cubeben,  - cubebon -  - caryophylen 6,29%,  - farnesen,  - cadinen

Theo Woerdenbag và ctv (1994), lá Thanh Hao có hàm lượng artemisinin (0,86%) cao nhất, acid artemisinic (0,16%) và artennuin B (0,08%) vào thời điểm

cây được 5 tháng tuổi Tinh dầu đạt hàm lượng tối đa (1%) trước khi cây ra hoa Lúc này, tinh dầu chứa monoterpen 55% và sesquyterpen 45%

1.2.5.4 Kỹ thuật nhân giống cây Thanh Hao

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về nhân giống cây Thanh Hao

Hoang dại Thân MS + (0,05 - 2 mg/l) IBA/NAA Tạo rễ Nair và

định Lá

MS/B5 + (0,5 - 2 mg/l) 2,4-D+ (0,5 - 2 mg/l) NAA + (0,025-0,1 mg/l) BA Mô sẹo

Abasile và ctv,

1993 Việt Nam

(hạt) Lá, thân MS+ (0,2 mg/l) BAP + (0,05 mg/l) NAA Nhân chồi

Woerdenbag

và ctv,1993 Không xác

MS + (3 mg/l) BA + (0,2 mg/l) NAA Mô sẹo Không xác

định Thân (0,5 mg/l) Ki + (0,2 mg/l) IAA + cotton fiber Chồi

Moraes Cerdeira,1995 Không xác

Việc nuôi cấy in vitro cây Thanh Hao để tổng hợp artemisinin đã thực hiện trên mô

sẹo, tế bào dịch huyền phù, chồi, và rễ (He và ctv, 1983; Tawfiq và ctv, 1989; Weathers

và ctv, 1994; Paniego, Giulietti, 1996; Liu và ctv, 2006; Nair và ctv, 1986; Teo và ctv, 1995) Mức độ phân hóa của mô ảnh hưởng đến sự tổng hợp Artemisinin (Ferreira, Janick, 1995)

1.3 Artemisinin và các nghiên cứu thu nhận artemisinin

1.3.1 Lịch sử phát triển

Năm 1971, nhà khoa học Tu (Trung Quốc) đã tách từ cây Thanh Hao một hợp

chất chữa lành cho chuột nhiễm kí sinh trùng Plasmodium berghei Năm 1972, tinh

chất kết tinh của hợp chất trên được các nhà khoa học Trung Quốc cô lập và xác định cấu trúc: là một sesquyterpene lactone với một cầu nối peroxide bên trong được gọi là artemisinin, hoạt chất chính của cây Thanh Hao Năm 1979: cấu trúc artemisinin được xác định bằng tia X

Tại Việt Nam từ thế kỷ 14, Tuệ Tĩnh đã dùng Thanh Hao để chữa sốt rét Năm

1989, Đinh Huỳnh Kiệt và công tác viên công bố kết quả phân tích thành phần hóa học của Thanh Hao mọc hoang và chiết suất artemisinin để chữa sốt rét cho bộ đội Thập kỷ 90, Công ty Dược liệu TWI đã trồng hàng trăm hécta cây Thanh Hao Chiết suất hàng tấn artemisinin với hiệu suất cao và bán tổng hợp các loại thuốc chống sốt rét từ artemisinin như artesunat, artemether, arteether, đã sản xuất hàng triệu liều thuốc chống sốt rét cung cấp cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu, thu về hàng triệu đô la Mỹ mỗi năm (Nguyễn Thượng Doong, 2001)

1.3.2 Artemisinin và tính chất của Artemisinin

Hình 1.9 Cấu trúc artemisinin, đánh số theo Merck Index và Chemical Abstract

Hình 1.10 Tinh thể artemisinin tách từ cây Thanh Hao

(Phòng Thí Nghiệm Trọng Điểm Phía Nam về Công Nghệ Tế Bào Thực)

Artemisinin là một endoperoxide sesquyterpene lactone thuộc nhóm isoprenoid Phân tử artemisinin có 15 nguyên tử carbon và 5 nguyên tử oxy tạo hệ thống 4 vòng liên hợp A, B, C, D Vòng A là vòng cyclohexan ở dạng ghế, vòng D là một delta-lacton và vòng B, C là dị vòng no chứa oxy

- Tính chất artemisinin: là tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, vị hơi đắng, ít tan trong nước, tan được trong cloroform, ete dầu hỏa và axeton; điểm nóng chảy 156 - 157°C Artemisinin tinh khiết khá bền vững dưới tác dụng của nhiệt độ,

có thể tinh chế bằng phương pháp thăng hoa Artemisinin dễ bị phân hủy trong môi trường acid, kiềm

Artemisinin trong Thanh Hao có tác dụng diệt KSTSR trong hồng cầu Ngoài

ra, artemisinin cũng có khả năng chữa ung thư vú và bệnh bạch cầu Đặc biệt artemisinin và các dẫn chất của nó ít ảnh hưởng lên trên tế bào lành xung quanh cũng như gây độc hại cho phụ nữ có thai và người suy gan, thận.Artemisinin và dẫn xuất artesunate còn có khả năng ức chế một số virus như Cytomegalovirus (CMV)

và các thành viên khác của họ Herpesviridae (Herpes simplex virus type 1 và

Epstein - Barr virus), virus viêm gan B, C, virus gây tiêu chảy ở bò

Theo Chương Trình Phát Triển Trị Liệu của Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ

hợp như artesunate được nghiên cứu tại Đức có khả năng diệt trên 55 loại tế bào ung thư Artesunate có hoạt tính mạnh nhất diệt được các tế bào Leukemia và tế bào ung

thư ruột già, hoạt tính tương đối yếu với các tế bào ung thư phổi và trung bình với các

tế bào ung thư Melanoma, vú, buồng trứng, tuyến nhiếp hộ Đặc biệt vẫn có tác dụng trên các tế bào CEM Leukemia đã kháng doxorubicin, vincristin, methotrexate

1.3.3 Đặc tính dược học của artemisinin

- Hoạt tính chống sốt rét: artemisinin có tác dụng ức chế sự tổng hợp protein

ở KSTSR Plasmodium falciparum Artemisinin gây hủy hoại các cơ phận, nhân của

KSTSR đồng thời gây ra sự phù trương ty thể ở khỉ

Khi so sánh với mefloquyne: artemisinin có tác dụng nhanh hơn và ức chế

mạnh hơn trên sự trưởng thành của KSTSR Trong các trường hợp sốt rét ác tính thể

não, artemisinin làm sạch KSTSR trong máu nhanh hơn chloroquyne, quynine và

không gây phản ứng phụ Để “tối ưu hóa” điều trị sốt rét, artemisinin đã được thử phối hợp với các thuốc trị sốt rét khác:

- Trên loài gặm nhấm bị nhiễm Plasmodium berghei, thử nghiệm in vivo ghi

nhận artemisinin kết hợp với mefloquyne, tetracycline và spiramycine: tăng cường hoạt tính của primaquyne, thêm tác dụng với chloroquyne, đồng thời đối kháng hoạt tính của dapsone, sulfadiazine, pyrimethamine, sulfadoxine

- Sử dụng trích tinh Artemisia annua L có tác dụng diệt Plasmodium

falciparum tăng gấp 3,5 lần so với sử dụng artemisinin tinh khiết trên chó Ngoài ra

artemisinine còn chống lại các KST, vi trùng và các giun móc như sán máng

Schistosoma japonicum trên chuột và thỏ; KST sán lá gan Clonorchis sinensis trên

chuột, hoạt tính còn chống lại KST Leishmania major trên cả cây in vitro và in vivo

Những hoạt tính miễn nhiễm: artemisinin gia tăng hoạt động thực bào nhưng lại ức chế sự biến đổi tế bào lympho Làm tăng đáp ứng miễn nhiễm do tế bào lympho T làm trung gian trên chuột bình thường, đồng thời gia tăng sự tái tạo miễn nhiễm nơi chuột được ghép tủy sống

1.3.4 Cơ chế tác động của artemisinin

KSTSR xâm nhập tế bào máu hồng huyết cầu và tiêu thụ 25% chất hemoglobin trong hồng huyết cầu, tuy vậy chúng không phân hóa phân tử heme (chứa Fe) mà chứa phân tử Fe ở một dạng polymer là hemozoin Khi artemisinin phản ứng với Fe

ở hemozoin, chất Fe biến artemisinin thành một độc tố, sinh ra các gốc hóa học tự

do phản ứng nhanh chóng giết chết KST

Theo các nghiên cứu tại Anh giải thích cơ chế tác động của artemisinin: KSTSR có nhiều hemin nên artemisinin có thể tác động chuyên biệt Cơ chế tác động bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn thứ nhất khởi động, Fe trong KSTSR xúc tác

sự phân cắt cầu nối peroxide nội bào và tạo ra các gốc tự do; giai đoạn 2 có phản ứng alkyl hóa, các gốc tự do chuyển hóa tạo các nối nhị giá với protein của KSTSR Artemisinin được sử dụng hiện tại chưa có KST nhờn thuốc chủ yếu do khả năng phá hủy nhanh chóng và triệt để KSTSR không cho chúng cơ hội đột biến

1.3.5 Sinh tổng hợp artemisinin từ cây Thanh Hao

Wang và ctv (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của gen fpf1 (flowering promoting factor1) ở thời điểm Thanh Hao ra hoa, mối liên hệ giữa việc nở hoa và quá trình tổng hợp artemisinin không là yếu tố cần thiết cho sự gia tăng hàm lượng artemisinin; thời điểm thu hoạch tốt nhất là cuối giai đoạn sinh trưởng và tạo chồi

Hình 1.11 Cơ chế hoạt động của artemisinin (Liu, 2005)

Hình 1.12 Con đường sinh tổng hợp artemisinin Artemisinin thuộc nhóm isoprenoid nên con đường sinh tổng hợp quan trọng nhất ở thực vật là con đường isoprenoid Terpenoid được tạo nên bởi isopentenyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) Ở thực vật cấp cao có hai con đường sinh tổng hợp độc lập nhau dẫn đến việc hình thành IPP: con đường mevalonate trong cytosol và mevalonate trong thể hạt (Liu và ctv, 2005)

Mới đây, hai gen mã hóa cho deoxy - dxylulose - 5 - phosphate synthase (DXPS) và deoxy - d - xylulose - 5 - phosphate reductoisomerase (DXPR) được tách từ rễ cây Thanh Hao chuyển gen đã chứng minh được rằng con đường sinh tổng

hợp terpenoid diễn ra trong thể hạt (Krushkal và ctv, 2003; Souret và ctv, 2002) Do

đó, con đường mevalonate không phải là duy nhất để tổng hợp artemisinin

Akhila và ctv (1990) đề nghị con đường sinh tổng hợp từ acid mevalonic và IPP Tiếp theo là sự tổng hợp farnesyl pyrophosphate (FPP), germacrane skeleton, dihydrocostunolide, cadinanolide, arteannuin B và artemisinin Hàm lượng của acid artemisinic gấp 8 - 10 lần so với artemisinin ở cây Thanh Hao Vì thế, có giả thuyết cho rằng acid artemisinic là tiền chất cho sự sinh tổng hợp artemisinin B và artemisinin Sangwan và ctv (1993) cho rằng có sự biến đổi acid artemisinic thành artemisinin B và artemisinin có cả ở cây tự nhiên và trong nuôi cấy tế bào

Theo Bertea và ctv (2005) đã xác định được chất trung gian và các enzyme liên quan đến sự tổng hợp artemisinin ở Thanh Hao như 3 - hydroxy - 3 -methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR), farnesyl diphosphate synthase (FPPS) và Sesquyterpene Synthase (SES) (Liu, 2006)

1.3.6 Một số nghiên cứu Artemisinin từ Thanh Hao

1.3.6.1 Nghiên cứu ở Việt Nam

Nghiên cứu hàm lượng artemisinin, các sesquytecpen và tinh dầu trong cây Thanh Hao trồng và mọc hoang ở Việt Nam Chiết xuất đồng thời artemisinin và một số nhóm chất từ lá Thanh Hao của Bùi Thị Bằng và ctv, 1995 Chiết suất artemisinin từ đài hoa cây Thanh Hao của Nguyễn Thượng Doong và Nguyễn Gia Chấn, 1995 Hay bán định lượng và định lượng artemisinin trong lá Thanh Hao của Nguyễn Kim Cẩn, Lê Nguyệt Nga Xây dựng quy trình kỹ thuật trồng cây Thanh Hao lấy lá và chọn lọc giống cho năng suất và hàm lượng artemisinin cao năm 1987 -

1990 của Phạm Thị Lượt, Nguyễn Gia Chấn và ctv Nghiên cứu ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng đến năng suất và chất lượng dược liệu Thanh Hao của Phạm Văn Ý

và ctv năm 1987 – 1990 (Nguyễn Thượng Doong, 2001)

- Nghiên cứu bán tổng hợp β - dihydro artemisinin ethyl ether (arteether) của Trần Mạnh Bình, nghiên cứu giải phóng hấp thu artesunat của Phạm Thanh Trúc, Nguyễn Minh Khai và ctv trong chương trình KY02 năm 1991 - 1995

1.3.6.2 Nghiên cứu ở nước ngoài

- Artemisinin sản xuất theo con đường cấy nấm: theo Jay Keasling và ctv đã sản xuất thuốc artemisinin qua vi trùng tại Đại Học Berkeley California, cấy nấm

Saccharomyces cereviseae vào 3 loại cây có thể sản xuất acid artemisinic, một bước

tiến tiếp nối sản xuất thuốc trị sốt rét artemisinin Nghiên cứu gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đầu là thay đổi một số gen của men bằng đột biến để gia tăng sản xuất farnesyl pyrophosphate (FPP), giai đoạn 2 là mang gen amorphadiene synthase (ADS) của cây Thanh Hao vào men để tổng hợp FPP thành amorphadiene, giai đoạn 3 là mang gen cytochrome P450 của cây Thanh Hao vào men để oxid hóa qua 3 bậc chuyển amorphadiene thành acid artemisinic

Sản xuất artemisinin bằng cấy nấm có phân hóa tố P450 biến chuyển từ amorphodiene sang acid artemisinic dễ dàng (www.artemisininproject.org) Phương pháp bảo đảm giá thành, rẻ và không phụ thuộc các điều kiện ngoại cảnh

- Artemisinin có thể sản xuất theo con đường khác: Dae - Kyu Ro và ctv (2006) đã tách được 2 gen từ Thanh Hao để tổng hợp acid artemisinic tạo

artemisinin Sau đó chuyển 2 gen này vào tế bào men rượu (Saccharomyces

cereviseae) sản xuất artemisinin giúp giảm giá thành so với phương pháp truyền thống

Parshikov và ctv (2004) đã nuôi cấy thành công dòng Cunningham elegans tái

tổ hợp sản xuất artemisinin bằng con đường biến đổi sinh học 7 - O - hydroxy

artemisinin Yuan - Tay Shyu (2005) nuôi cấy rễ Thanh Hao in vitro để chiết xuất artemisinin Weathers và ctv (1994), đã nuôi cấy Artemisia annua L lây nhiễm với các dòng Agrobacterium rhizogenes khác nhau kích thích quá trình tăng sinh rễ

trong nuôi cấy và artemisinin sinh ra tương quan thuận với tần suất sinh rễ

Samad và ctv (2005), nuôi cấy tái sinh từ lá tạo ra hàm lượng artemisinin hơn hẳn loại trồng trọt khác trên cùng giống Chan và Nallamai (2004) nuôi cấy mô tế bào sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, ổn định về mặt hoạt tính, không gây phản ứng phụ Nuôi cấy tế bào cho thấy hàm lượng sản xuất ra cao gấp 2 - 3 lần so với phương pháp canh tác truyền thống trong cùng một chu kỳ canh tác trên đồng ruộng (Ferreira và Janick, 1995) Ngoài ra còn có sự thành công trong nuôi cấy tế bào