KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ GENE ĐỀ KHÁNG NHÓM BETALACTAM VÀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐỀ KHÁNG NHÓM BETALACTAM PHỔ RỘNG TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI

************** HUỲNH THỊ XUÂN THẲM KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ GENE ĐỀ KHÁNG NHÓM BETA-LACTAM VÀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐỀ KHÁNG NHÓM BETA-LACTAM PHỔ RỘNG TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI

**************

HUỲNH THỊ XUÂN THẲM

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ GENE

ĐỀ KHÁNG NHÓM BETA-LACTAM VÀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐỀ KHÁNG NHÓM BETA-LACTAM PHỔ RỘNG

TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 1/2012

**************

HUỲNH THỊ XUÂN THẲM

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA MỘT SỐ GENE

ĐỀ KHÁNG NHÓM BETA-LACTAM VÀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐỀ KHÁNG NHÓM BETA-LACTAM PHỔ RỘNG

TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI

NHÓM BETA-LACTAM VÀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐỀ KHÁNG NHÓM BETA-LATAM PHỔ RỘNG TRONG CHẤT THẢI CHĂN NUÔI

HUỲNH THỊ XUÂN THẲM

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: TS NGUYỄN TẤT TOÀN

Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

2 Thư ký: TS TRẦN THỊ QUỲNH LAN

Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3 Phản biện 1: TS PHẠM HÙNG VÂN

Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh

4 Phản biện 2: TS VÕ THỊ TRÀ AN

Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

5 Ủy viên: TS HỒ THỊ KIM HOA

Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

Tôi tên là Huỳnh Thị Xuân Thẳm sinh năm 1984 tại huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang Con ông Huỳnh Văn Toàn và Bà Nguyễn Thị Thuận

Tốt nghiệp trung học phổ thông tại Trường trung học phổ thông Tân Phước, tỉnh Tiền Giang, năm 2002

Tốt nghiệp Đại học ngành Thú Y hệ Chính Qui tại Đại Học Cần Thơ, Thành Phố Cần Thơ

Sau đó, tôi làm việc tại Thành Phố Hồ Chí Minh

Tháng 9 năm 2008 theo học Cao học ngành Thú Y tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, Thành Phố Hồ Chí Minh

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này hoàn toàn trung thực và là một phần trong đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ do TS Hồ Thị Kim Hoa làm chủ nhiệm Các số liệu, kết quả của luận văn được công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài

Huỳnh Thị Xuân Thẳm

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm, Khoa Chăn Nuôi Thú Y và Phòng Sau Đại Học đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa học này

Xin chân thành cám ơn các thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tận tình hướng dẫn và giảng dạy cho tôi nhiều kiến thức quí báu và bổ ích trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn TS Hồ Thị Kim Hoa đã giúp đỡ, động viên và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi làm đề tài

Xin chân thành cảm ơn BSTY Lê Hữu Ngọc và các anh chị, các bạn và các

em ở phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thú sản, môi trường và sức khỏe vật nuôi đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình lấy mẫu và phân lập vi khuẩn

Xin chân thành cảm ơn TS Lê Đình Đôn - Viện trưởng Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh, các anh chị ở Viện đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình phân tích PCR

Xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn trong lớp Cao Học Thú Y khóa học 2008 – 2011 đã luôn luôn động viên và giúp tôi vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học tại trường

Xin gửi lời cảm ơn vô vàn đến cha, mẹ – người đã nuôi nấng, dạy dỗ và dành tất cả tình yêu thương bao la cho con để con có thể vượt qua được những khó khăn khi học tập xa nhà Cám ơn tất cả các thành viên trong gia đình đã hỗ trợ, động viên con về tinh thần và vật chất để con có thể hoàn thành tốt khóa học này

Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Hải đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập và làm đề tài tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn các bạn bè gần xa luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt khóa học này

Đề tài: “Khảo sát sự hiện diện của một số gene đề kháng nhóm beta-lactam

và các chủng vi khuẩn đề kháng nhóm beta-lactam phổ rộng trong chất thải chăn nuôi” được thực hiện từ tháng 3/2010 đến tháng 9/2011 Tổng số 45 mẫu gồm chất thải trại heo chưa xử lý (15 mẫu), nước thải biogas (15 mẫu) và phân gà (15 mẫu) được thu thập tại các trại khác nhau ở Thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương và Đồng Nai

Kết quả phân tích 45 mẫu bằng kỹ thuật PCR, có 37 mẫu chứa gene blaTEM;

4 mẫu chứa blaSHV; không có mẫu nào chứa gene mã hóa CTX-M Các mẫu chứa

gene blaSHV đều có chứa blaTEM

Từ các mẫu dương tính với PCR, có 357 chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MacConkey Các chủng được phân biệt dựa vào kết quả IMViC và kháng sinh đồ Kiểm tra sự đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam và cũng như sự hiện diện ESBL (Extended-spectrum beta-lactamase) bằng phương pháp khuếch tán kép trên thạch Kết quả cho thấy 40,9 % chủng vi khuẩn được phân lập đề kháng với ít nhất 1 kháng sinh và 53 % các chủng vi khuẩn đề kháng từ 2 kháng sinh trở lên Chỉ có 8 chủng có kiểu hình ESBL Phân tích trình tự nucleotide của các chủng

này cho thấy có 4 chủng mang blaTEM-1 - mã hóa cho enzyme beta-lactamase cổ

điển và 4 chủng còn lại mang các gene bla mã hóa cho các beta-lactamase phổ rộng (1 chủng mang gene blaTEM-1b và 3 chủng mang gene blaTEM-104)

Đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu về sự hiện diện của các chủng vi khuẩn mang gene đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam trong chất thải chăn nuôi ở Việt Nam

The study “Detection of some beta-lactam resistant genes and strains

resistant to extended-spectrum beta-lactam antibiotics in animal waste” was

conducted from 3/2010 to 9/2011 Forty-five samples of fresh wastewater (15 samples) and biogas effluent from pig farms (15), and of chicken droppings (15) were collected in Ho Chi Minh City, Binh Dương and Đong Nai Provinces

PCR analysis of 45 samples showed that 37 samples harbored blaTEM; four

samples harbored blaSHV; none were detected with blaCTX-M The samples that were

positive with blaSHV contained blaTEM

From the PCR-positive samples, 357 bacterial strains were isolated by streaking the samples onto MacConkey agar The strains were differentiated by IMViC tests and antibiotic profiling They were examined for their resistance to several extended-spectrum beta-lactam antibiotics as well as for the exhibition of ESBL (extended-spectrum beta-lactamases) using double disk test 40,9% of the strains were found resistant to at least one extended-spectrum beta-lactam antibiotic 53% of the strains were resistant to two or more antibiotics Only eight strains expressed ESBL phenotype Sequencing analysis of PCR products showed that four

samples were homologous to blaTEM-1 - a gene coding for classical beta-lactamases,

three were related to blaTEM-104 and one to blaTEM-1b The two latter encode extended-spectrum beta lactamases

This is the first report of the presence of bacterial strains containing lactam resistant genes in livestock waste in Vietnam

beta- 

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 26 

3.3.1 Khảo sát sự hiện diện một số gene đề kháng nhóm beta-lactam trong mẫu chất

3.3.2 Khảo sát khả năng đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam phổ rộng của các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu chất thải 29 

3.3.3 Phát hiện và phân tích kiểu gene của các chủng mang ESBL 31 

4.1 Phát hiện một số gene đề kháng nhóm beta-lactam trong mẫu chất thải bằng kỹ

4.2 Khả năng đề kháng nhóm beta-lactam của các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu

4.2.1 Phân lập và định danh sơ bộ các nhóm vi khuẩn 37 

4.2.2 Tình hình đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập 38 

4.2.3 Kiểu hình ESBL của các chủng vi khuẩn phân lập 46 

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ESBL : Extended-spectrum beta-lactamase

MRSA : Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

MRSE : Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis

NCCLS : National Committee for Clinical Laboratory Standards PBP : Penicillin Binding Protein

BẢNG TRANG 

Bảng 2.1: Đặc điểm của các kháng sinh nhóm cephalosposin 7 

Bảng 3.2: Đặc điểm các nhóm vi khuẩn trên môi trường MacConkey 29 

Bảng 3.3: Tiêu chuẩn NCCLS đối với các chủng vi khuẩn đường ruột 31 Bảng 4.1: Tình hình mang gene đề kháng nhóm beta-lactam của vi khuẩn trong chất

Bảng 4.3: Tỷ lệ các chủng vi khuẩn đề kháng với từng kháng sinh khảo sát 40 

Bảng 4.4: Tình hình đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập ở các

Bảng 4.5: Tình hình đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập từ heo

HÌNH TRANG

Hình 2.6: Sự thay thế amino acid trên blaTEM-1 (Bradford, 2001) 13 

Hình 2.7: Sự thay thế các amino acid trên blaSHV-1 (Bradford, 2001) 15

Hình 4.1: Sản phẩm PCR đoạn gen blaTEM (a) và blaSHV (b) 35 

Biểu đồ 4.1: Tình hình mang gene đề kháng trên mỗi loài vật nuôi (a) 37 

Biểu đồ 4.2: Tình hình đề kháng trên các nhóm vi khuẩn phân lập (n=146) 39 

Biểu đồ 4.3: Tình hình đa đề kháng trên các chủng vi khuẩn phân lập 42 

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Đặt vấn đề

Kháng sinh thường được sử dụng trong chăn nuôi với mục đích điều trị hoặc phòng bệnh Kháng sinh được cho thêm vào thức ăn với liều thấp để phòng bệnh, kích thích tăng trưởng và cải thiện hiệu quả chăn nuôi Việc sử dụng lạm dụng kháng sinh trong thức ăn động vật có thể dẫn đến sự phát triển hiện tượng đề kháng kháng sinh trong nhóm vi khuẩn đường ruột và sau đó có thể lan truyền cho người qua chuỗi thực phẩm (Sabate và cs, 2008) Phân động vật thường được sử dụng làm phân bón cho nông nghiệp là nguồn phân bón hữu cơ quí giá cho cây trồng cũng như cải tạo đất Tuy nhiên, việc sử dụng chất thải chăn nuôi trong nông nghiệp có thể dẫn đến việc gây ô nhiễm nước mặt, nước ngầm và lan truyền các vi sinh vật gây bệnh hay gây bệnh cơ hội ra cộng đồng (Jongbloed và Lenis, 1998) Nguồn nước ngầm là nguồn gốc tiềm tàng của các mầm bệnh đề kháng với kháng sinh trong chuỗi thực phẩm của con người (Chee-Sanford và cs, 2001) Bên cạnh đó, các

vi sinh vật mang gene đề kháng vào môi trường nước có thể truyền các gene đề kháng này cho các vi sinh vật trong môi trường (Baquero và cs, 2008)

Kháng sinh nhóm beta-lactam là một trong những nhóm kháng sinh quan trọng được sử dụng trong nhân y và thú y Việc sử dụng kháng sinh nhóm beta-lactam trên động vật và người trong nhiều thập kỷ qua đã dẫn đến sự phát triển các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh nhóm này Một trong hai cơ chế đề kháng chính là do các enzyme beta-lactamase gây ra (Li và cs, 2007) Các beta-lactamase làm giảm hiệu quả hoạt động của các kháng sinh beta-lactam bằng cách phá vỡ vòng beta-lactam của kháng sinh Các gene này nằm trên plasmid nên chúng dễ dàng lan truyền giữa các loài vi khuẩn, đồng thời chúng còn có khả năng kết hợp

với các yếu tố đề kháng kháng sinh khác không thuộc nhóm beta-lactam bao gồm fluoroquinolone, aminoglycoside và trimethoprim-sulfamethoxazole (Schwaber và

cs, 2005) Sự phát triển các chủng vi khuẩn đề kháng dẫn đến sự ra đời và đưa ra thị trường các thế hệ kháng sinh beta-lactam phổ rộng Và như một hệ quả, ngày càng nhiều chủng vi khuẩn mang các cơ chế đề kháng các kháng sinh thế hệ mới này được phát hiện Có khoảng trên 300 gene mã hóa các enzyme beta-lactamase khác nhau đã được tìm thấy Trong đó, có khoảng trên 130 biến thể TEM, 50 biến thể SHV và hơn 40 dạng CTX-M đã được biết (Jacoby và Bush, 2005)

Hiện nay, các chủng vi khuẩn đường ruột mang ESBL được phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn Độ, Anh, Mỹ, Austria (Liebana và cs, 2004; Batchelor và cs, 2005; Manchanda và Singh, 2003; và Apfalter và cs, 2007) Các nước trong khu vực như Trung Quốc, Đài Loan và Thái Lan cũng đã có nhiều báo cáo về sự hiện diện của các chủng vi khuẩn này trên người và động vật (Yan và cs, 2006; Kiratisin và cs, 2008; và Tian và cs, 2009) Ở Việt Nam, các chủng vi khuẩn đường ruột mang ESBL cũng được phát hiện ở nhiều bệnh viện với các tỷ lệ khác nhau Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về sự hiện diện của các vi khuẩn mang gene

đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam và sự hiện diện ESBL trong chất thải vật

nuôi Do đó đề tài: “Khảo sát sự hiện diện của một số gene đề kháng nhóm lactam và các chủng vi khuẩn đề kháng nhóm beta-lactam phổ rộng trong chất thải chăn nuôi” đã được thực hiện

beta-1.2 Mục tiêu của đề tài

Khảo sát sự hiện diện các chủng vi khuẩn mang một số gene đề kháng nhóm beta-lactam và beta-lactam phổ rộng trong chất thải chăn nuôi

1.3 Yêu cầu của đề tài

Để đạt được mục tiêu đề ra ở trên, đề tài cần tiến hành các nội dung sau:

- Xác định sự hiện diện của một số gene đề kháng kháng sinh nhóm

beta-lactam blaTEM,blaSHV và blaCTX-M bằng kỹ thuật PCR

- Xác định kiểu hình đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam và beta-lactam phổ rộng của các vi khuẩn phân lập từ các mẫu chất thải có kết quả PCR dương tính

- Khảo sát kiểu gene đề kháng nhóm beta-lactam phổ rộng trong các chủng

vi khuẩn có kiểu hình ESBL

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Kháng sinh nhóm beta-lactam và beta-lactam phổ rộng

2.1.1 Penicillin

Cấu tạo hóa học

Cấu trúc cơ bản của kháng sinh này là vòng thiazolidine nối với vòng lactam (amid nội vòng), vòng này lại được gắn với đuôi R (carbohydrate) Sự thay đổi R tạo ra các kháng sinh khác nhau trong nhóm

beta-Gốc amid của penicillin bị hư hỏng bởi enzyme amidase của vi khuẩn Khi gốc này được thay thế bằng nhóm benzyl (penicillin M, penicillin A) thì kháng sinh bền trong môi trường acid của dạ dày, đồng thời kháng được enzyme beta-lactamase do vi khuẩn staphylococi (penicillin M) hoặc Gram âm (penicillin A) sinh

ra (Võ Thị Trà An, 2010)

Hình 2.1: Cấu trúc vòng beta-lactam Hình 2.2: Cấu trúc của penicillin Các nhóm penicillin phổ biến

Nhóm G: Penicillin G (benzyl penicillin) và penicillin V (phenoxymethyl

penicillin) là các kháng sinh có hoạt lực cao đối với vi khuẩn Gram dương, nhưng

bị thủy phân bởi các enzyme penicillinase Do đó, chúng không có hiệu quả với hầu

Nhóm A: Amoxicillin và ampicillin có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn

Gram dương và Gram âm (Haemophilus influenza, E coli và P mirabilis), nhưng

không kháng được penicillinase Do đó chúng thường được phối hợp với các chất

ức chế beta-lactamase như clavulanic acid, sulbactam

Nhóm M: Nhóm này gồm các kháng sinh methicillin, oxacillin, cloxacillin

và floxacillin Đây là các penicillin bán tổng hợp, có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram dương và Gram âm, bền trong môi trường acid và kháng penicillinase

Tuy nhiên sự lan tràn của các chủng vi khuẩn S aureus, S epidermic kháng methicillin đang là một báo động trong nhân y trên toàn thế giới

Nhóm kháng sinh phổ rộng: Các kháng sinh nhóm này chỉ được sử dụng

trong nhân y, bao gồm carbenicillin, ticarcillin, mezlocillin, azlocillin và piperacillin Carbenicillin và ticarcillin có hoạt tính kháng khuẩn rộng với cả

Pseudomonas spp., Enterobacter spp và Proteus spp Các kháng sinh này có hiệu

lực kém hơn ampicilin trong việc chống lại cầu khuẩn Gram dương và Listeria

monocytogenes, kém hơn piperacillin trong điều trị bệnh do Pseudomonas spp

Mezlocillin, azlocillin và piperacillin có khả năng chống Pseudomonas spp.,

Klebsiella spp và một số vi khuẩn Gram âm rất tốt Chúng có hiệu quả tương

đương ampicillin trong việc chống lại vi khuẩn Gram dương và L monocytogenes

(Võ Thị Trà An, 2010)

Cơ chế tác động

Các penicillin ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách tác động đến các enzyme transpeptidase - có vai trò quan trọng trong tạo sự liên kết với chuỗi peptidoglycan Các enzyme này liên kết với một nhóm protein gọi là PBP (penicillin - binding protein) nằm ở trên màng sinh chất Như vậy, điểm tác động của kháng sinh nhóm beta-lactam chính là PBP Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mức độ gắn kết với PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào và khả năng kháng được các enzyme beta-lactamase Cơ chế chính xác tại sao vi khuẩn Gram âm ít nhạy cảm với penicillin hơn so với vi khuẩn Gram dương vẫn chưa sáng tỏ Người ta cho rằng lượng peptidoglycan nhiều ở vi

khuẩn Gram dương là yếu tố làm nhóm vi khuẩn này nhạy cảm với kháng sinh Nhóm beta-lactam không chỉ ức chế những kết nối cuối cùng của peptidoglycan trong tiến trình tổng hợp thành vi khuẩn mà còn tăng tiết lipoteichoic acid gây phản ứng tự ly giải hay tự sát của vi khuẩn do hư hỏng peptidoglycan (Võ Thị Trà An, 2010)

2.1.2 Cephalosporin

Cấu tạo hóa học

Các kháng sinh nhóm cephalosporin cũng thuộc nhóm beta-lactam, cũng có vòng dihydrothiazine nối với vòng beta-lactam (Hình 2.3) Các cephalosporin thường được nhận biết bởi tiếp đầu ngữ cepha hoặc cef trong tên hoạt chất (Bảng 2.1)

Hình 2.3: Cấu trúc của cephalosporin

Cơ chế tác động

Các cephalosporin có cơ chế tác động tương tự penicillin Do có cấu trúc vòng beta-lactam, một số cephalosporin cũng có thể bị vô hoạt bởi nhóm enzyme beta-lactamase Ngoài ra, kháng sinh này cũng có thể bị vô hoạt bởi các cephalosporinase – enzyme không tác động đến các penicillin (Võ Thị Trà An, 2010)

Bảng 2.1: Đặc điểm của các kháng sinh nhóm cephalosposin

kỵ khí,

Pseudomonas

Phổ rộng, Gram dương (tương tự thế

hệ I), P aeruginosa

Các cephalosporin đại

diện

Cephalothin Cephapirin Cefadroxil Cephalexin Cefazolin Cefatrizine Cephaloridine Cephradine

Cefaclor Cefamandole Cefmetazole Cefonicid Cefotetan Cefoxitin Cefprozil Cefuroxime

Ceftazidime Cefsulodin Cefoperazone Cefdinir Cefetamet Ceftibuten Cefixime Cefpodoxime Ceftriaxone Cefotaxime Ceftizoxime

Cefepime Cefpirome

(Nguồn: Võ Thị Trà An, 2010 và Pichichero, 2005)

2.1.3 Carbapenem và penem

Carbapenem là các kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, có vòng dihydropyrrole nối với vòng beta-lactam (Hình 2.4) Các kháng sinh nhóm này có phổ kháng khuẩn rộng, tác động trên các vi khuẩn Gram dương cũng như các vi

khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, P aeruginosa và Bacteroides spp Các kháng sinh này đề kháng cao với các enzyme beta-lactamase Đây là nhóm kháng sinh

mới được phát triển từ thienamycin - một sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên từ

Streptomyces cattleya sinh ra (Birnbaum và cs, 1985) Các carbapenem phổ biến là

imipenem, meropenem, ertapenem và doripenem

Penem là một nhóm kháng sinh cũng thuộc nhóm beta-lactam, có vòng dihydrothiazole liên kết với vòng beta-lactam (Hình 2.5) Cấu trúc của penem cũng tương tự như carbapenem Tuy nhiên, penem chứa một phân tử lưu huỳnh trong cấu trúc còn carbapenem chứa phân tử carbon khác trong cấu trúc của chúng Nhóm

kháng sinh này cũng là nhóm kháng sinh phổ rộng, tác động lên cả vi khuẩn yếm khí (Milazzo và cs, 2003) Đây là nhóm kháng sinh tổng hợp, không có trong tự nhiên Đại diện cho nhóm kháng sinh này là faropenem

Hình 2.4: Cấu trúc của carbapenem Hình 2.5: Cấu trúc của penem 2.1.4 Nhóm monobactam và nhóm ức chế enzyme beta-lactamase

Nhóm monobactam: Các kháng sinh nhóm này chỉ chứa một nhân

beta-lactam, có khả năng chống lại các vi khuẩn Gram âm Các monobactam phổ biến là aztreonam, tigemonam, nocardicin A và tabtoxinine-beta-lactam (Fuchs và cs, 1988)

Nhóm ức chế enzyme beta-lactamase: Thành phần của nhóm này bao gồm

các kháng sinh nhóm penicillin kết hợp với một chất ức chế enzyme beta-lactamase

Sự kết hợp này làm tăng hoạt động kháng khuẩn trên các chủng S aureus, E coli,

H influenza và các loài thuộc giống Proteus, Klebsiella và Bacteroides Phổ biến

nhất là amoxicillin kết hợp với acid clavulanic Ngoài ra còn có tazobactam kết hợp với piperacillin và sulbactam kết hợp với ampicillin trong quá trình điều trị bệnh (Holten và Onusko, 2000)

2.2 Sự đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam

2.2.1 Cơ chế đề kháng

Sự đề kháng kháng sinh hiện nay đang là một vấn đề lớn gây khó khăn trong quá trình điều trị bệnh cả trong nhân y và thú y Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách đã dẫn đến sự phát triển các cơ chế đề kháng kháng sinh trong vi khuẩn Một trong những nhóm kháng sinh đang được quan tâm là nhóm beta-lactam Tất cả

O

N

S

các kháng sinh nhóm beta-lactam đều có vòng beta-lactam trong cấu trúc phân tử của chúng Do đó, vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm beta-lactam theo một trong hai cơ chế

Cơ chế mang enzyme beta-lactamase: Một số loài vi khuẩn có thể mang

enzyme lactamase hoặc penicillinase Các enzyme này sẽ phá vỡ vòng lactam của kháng sinh, làm cho kháng sinh này không còn hiệu quả Các gene mã hóa các enzyme này có thể hiện diện trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn hoặc trên plasmid Vi khuẩn mang enzyme beta-lactamase bao gồm các vi khuẩn Gram dương

beta-(S aureus và S epidermidis), Gram âm (H influenzae, Neisseria gonorrhoeae,

Moraxella catarrhalis, E coli, các loài Proteus, Serratia, Pseudomonas và Klebsiella),và các loài vi khuẩn yếm khí (Holten và Onusko, 2000)

Cơ chế thay đổi điểm PBP: Vi khuẩn mang các enzyme thay thế PBP trong

quá trình tổng hợp thành tế bào, làm cho kháng sinh không gắn kết được Do đó, việc điều trị bệnh không hiệu quả Các enzyme thay thế PBP liên quan đến sự đề

kháng với methicillin ở staphylococci, Streptococcus pneumonia Cả resistant S aureus (MRSA) và methicillin-resistant S epidermidis (MRSE) đều là

methicillin-những tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện Điều trị các nhiễm trùng này rất khó vì

cả MRSA và MRSE thường đa đề kháng và chỉ nhạy cảm với một số ít kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2010)

2.2.2 Enzyme beta-lactamase

Enzyme beta-lactamase được tìm thấy đầu tiên trên E coli làm vô hoạt

penicillin trong quá trình điều trị (Abraham và Chain, 1940) Sự đề kháng penicillin

xuất hiện nhanh chóng trên các chủng S aureus bởi các gen mã hóa enzyme

penicillinase nằm trên plasmid Các beta-lactamase này nhanh chóng lan truyền

trong hầu hết các chủng S aureus lâm sàng cũng như các loài staphylococci khác

Hy Lạp, vì thế enzyme này được đặt tên là TEM (Medeiros, 1984) Các gene mã hóa TEM-1 nằm trên plasmid và transposon nên chúng dễ dàng lan truyền giữa các

loài vi khuẩn khác nhau Trong một thời gian ngắn, blaTEM-1 đã lan truyền rộng khắp thế giới và được tìm thấy trên nhiều loài vi khuẩn khác nhau thuộc họ

Enterobacteriaceae, hay các loài P aeruginosa, H influenza và N gonorrhoeae

Một beta-lactamase phổ biến khác được tìm thấy trên K pneumonia và E coli là SHV-1 (do có biến thể ở vị trí sulphydryl) Gene blaSHV-1 mã hóa enzyme SHV-1

nằm trên nhiễm sắc thể ở đa số các chủng K pneumonia nhưng nằm trên plasmid ở

E coli (Bradford, 2001)

Hơn 20 năm qua, nhiều thế hệ kháng sinh beta-lactam mới đã xuất hiện và được sử dụng rộng rãi Có thể do áp lực lựa chọn trong việc sử dụng quá mức và không đúng cách các kháng sinh mới trong điều trị bệnh đã tạo nhiều chủng vi khuẩn có khả năng đề kháng với các kháng sinh nhóm beta-lactam phổ rộng Các chủng vi khuẩn đề kháng với các thế hệ kháng sinh này là do có mang các enzyme beta-lactamase phổ rộng (ESBL - Extended spectrum beta-lactamase) Các ESBL này có khả năng thủy phân các kháng sinh nhóm beta-lactam thế hệ mới Các kháng sinh thế hệ mới này bao gồm cefotaxime, ceftriaxone và ceftazidime (được gọi là oxyimino-beta-lactam), cũng như aztreonam Các kháng sinh này thường được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm trùng nặng do vi khuẩn Gram âm gây

ra Chúng là dẫn xuất từ các gene blaTEM-1, blaTEM-2 và blaSHV-1 bởi các đột biến điểm trên gene làm thay đổi các amino acid ở một số vị trí đặc biệt, mã hóa các ESBL Các kháng sinh nhóm beta-lactam phổ rộng dễ bị thủy phân bởi các ESBL này Ngoài ra, các ESBL không phải TEM hoặc SHV cũng đã được báo cáo (Emery

và Weymouth, 1997)

Phân loại enzyme beta-lactamase

Các enzyme beta-lactamase được phân loại theo Bush và cs (1995), gồm có bốn nhóm dựa trên cấu trúc phân tử Nhóm một là cephalosporinase, có cấu trúc phân tử lớp C và không bị ức chế bởi clavulanic acid Nhóm hai gồm các penicillinase và cephalosporinase, thuộc cấu trúc phân tử lớp A Cả hai đều bị ức

chế bởi clavulanic acid, bao gồm các enzyme TEM và SHV Tuy nhiên, các lactamase có dẫn xuất từ TEM và SHV ngày càng gia tăng về số lượng nên nhóm 2b có thể được phân ra thành 2 tiểu nhóm nhỏ 2be và 2br Nhóm 2be là nhóm enzyme phổ rộng, có sự hiện diện của ESBL, có thể bất hoạt các cephalosporin thế

beta-hệ thứ 3 (ceftazidime, cefotaxime và cefpodoxime) cũng như các monobactam (aztreonam) Nhóm 2br là nhóm đề kháng với chất ức chế, cấu trúc phân tử lớp A Nhóm enzyme thứ ba được thêm vào là nhóm 2f, nhóm enzyme này có khả năng thủy phân carbapenem, bởi vì có gốc serine gắn vào vị trí hoạt động và bị ức chế bởi clavulanic acid Nhóm ba là metallo-beta-lactamase do có gốc zinc hoặc metallo gắn vào beta-lactamase, thuộc cấu trúc phân tử lớp B, không bị ức chế bởi clavulanic acid Các nhóm enzyme này có thể thủy phân penicillin, cephalosporin

và carbapenem Nhóm bốn là penicillinase, không bị ức chế bởi clavulanic acid, cấu trúc phân tử chưa xác định

Ngoài ra, các beta-lactamase cũng được phân loại dựa vào trình tự nucleotide

và amino acid của các enzyme này, bao gồm có 4 lớp phân tử từ A đến D dựa trên phổ kháng khuẩn và sự đáp ứng với các chất ức chế Các beta-lactamase lớp A, C

và D có gốc serine gắn ở vị trí hoạt động còn lớp B thì có gốc zinc hoặc metallo gắn vào, cần thiết cho hoạt động của chúng (Ambler và cs, 1991)

Bảng 2.2: Phân loại enzyme beta-lactamase

khuẩn Gram âm, MIR-1

định

CA: clavulanic acid

Các enzyme beta-lactamase phổ biến

TEM

TEM-1 là enzyme beta-lactamase phổ biến trên các vi khuẩn Gram âm Trên

90 % E coli mang TEM-1 có khả năng đề kháng với ampicillin và penicillin (Livermore, 1995) Enzyme này cũng được tìm thấy trên H infuenzae và N

gonorrhoeae Ngoài ra, enzyme này cũng có khả năng thủy phân các cephalosporin

như cephalothin và cephaloridine TEM-2 là dẫn xuất đầu tiên của blaTEM-1, có một

sự thay thế amino acid đơn từ các beta-lactamase gốc TEM-3, được báo cáo vào năm 1989, là beta-lactamase TEM đầu tiên có kiểu hình ESBL (Bradford, 2001) Hiện nay, có trên 130 enzyme TEM được tìm thấy (Jacoby và Bush, 2005) Trong

đó, TEM-10, TEM-12, TEM-16 thường gặp nhất ở Bắc Mỹ và Nam Mỹ (Jacoby và Munoz-Price, 2005)

Hình 2.6: Sự thay thế amino acid trên blaTEM-1 (Bradford, 2001)

Sự thay thế amino acid ở một số vị trí đặc biệt trên blaTEM-1 thể hiện kiểu hình ESBL Các vị trí thay đổi amino acid bao gồm lysine thay thế cho glutamate ở

vị trí 104; serine thay thế cho glycine ở vị trí 238 và lysine thay thế cho glutamate ở

vị trí 240 (Hình 2.6) Thêm vào đó, các beta-lactamase từ TEM-1 đến TEM-92 được biểu diễn trong Hình 2.6 và Bảng 2.3 là các enzyme xảy ra trong tự nhiên Các enzyme này được hình thành do có sự thay thế amino acid hoặc sự xóa bỏ của một amino acid không được chú ý trên các enzyme TEM khác (Perilli và cs, 1997)

Bảng 2.3: Đặc điểm của TEM

Enzyme Kiểu enzyme

Phổ hẹp ESBL Đề kháng CA TEM-1 X

TEM-2 X

TEM-30, TEM-31, TEM-35, TEM-36, TEM-37, TEM-38, TEM-41,

TEM-45, TEM-51, TEM-73, TEM-74

CA: Clavulanic acid

(Nguồn: Bradford, 2001 và Jacoby và Bush, 2005)

SHV

SHV-1 là beta-lactamase được tìm thấy trên các chủng K pneumonia, có khả

năng đề kháng với ampicillin và được mã hóa bởi gene blaSHV-1 nằm trên plasmid

Có 68 % các amino acid trên blaSHV-1 giống với blaTEM-1 Cũng như TEM, các SHV

có một hoặc nhiều sự thay thế amino acid ở một số vị trí đặc biệt Hiện nay, hơn 50

dạng khác nhau của SHV đã được miêu tả (Jacoby và Bush, 2005) SHV thường gặp nhiều nhất ở Châu Âu và Châu Mỹ Trong đó, SHV-5 và SHV-12 là hai thành viên thường gặp nhất của họ này (Jacoby và Munoz-Price, 2005)

Trong nhiều chủng K pneumonia, gene blaSHV hoặc các gene có liên quan đã

được chèn vào trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn Không giống như blaTEM, một vài

dẫn xuất của blaSHV-1 có mối liên quan với nhau (Bảng 2.4) Hơn nữa, các thay đổi

được quan sát trên gene blaSHV xuất hiện nhiều biến thể xảy ra trên một vài điểm trong cấu trúc gene (Hình 2.7)

Hình 2.7: Sự thay thế các amino acid trên blaSHV-1 (Bradford, 2001)

Các biến thể chính của SHV có kiểu hình ESBL được xác định bởi sự thay thế serine cho glycine ở vị trí 238 Ngoài ra, SHV-5 còn có thêm sự thay thế lysine cho glutamate ở vị trí 240 Một điều thú vị là cả hai thay đổi amino acid ở vị trí glycine ở vị trí 238 thành serine và glutamate ở vị trí 240 thành lysine được tìm thấy

trên blaSHV (Hình 2.7) Việc thay thế serine ở vị trí 238 là ảnh hưởng đến sự thủy phân ceftazidime và việc thay thế lysine ở vị trí 240 ảnh hưởng đến hiệu quả thủy

phân cefotaxime (Huletsky và cs, 1993)

CA: Clavulanic acid

(Nguồn: Bradford, 2001 và Jacoby và Bush, 2005)

CTX-M

Trong những năm gần đây, có một nhóm ESBL mới xuất hiện, có khả năng

thủy phân cefotaxime, được gọi là CTX-M Chúng được tìm thấy chủ yếu trên các

chủng S enterica serovar Typhimurium và E coli, nhưng cũng được miêu tả trên

các loài khác của họ Enterobacteriacae (Bảng 2.5)

Các enzyme này không có tương quan chặt chẻ với beta-lactamase TEM

hoặc SHV, mà chỉ có khoảng 40 % cấu trúc của các enzyme này tương ứng với hai

beta-lactamase phổ biến trên (Tzouvelekis và cs, 2000) Hầu hết các enzyme có

tương quan chặt chẻ với các gia đình này thì được xếp vào cephalosporinase lớp A,

được mã hóa bởi các gene nằm trên nhiễm sắc thể và đã được tìm thấy trên các loài

K oxytoca, C diversus, P vulgaris và S fonticola (Bauernfeind và cs, 1996a và

Bonnet và cs, 1999) Các enzyme được tìm thấy với số lượng ngày càng tăng gồm

enzyme AmpC trên Kluyvera ascorbata (Klu-1 và Klu-2) và các enzyme CTX-M

(Bonet và cs, 2000)

Nhiều nghiên cứu cho thấy beta-lactamase CTX-M có khả năng thủy phân

cephalothin hoặc cephaloridine tốt hơn benzylpenicillin và chúng cũng thích hợp để

thủy phân cefotaxime hơn ceftazidime Việc thêm serine ở vị trí 237 trên các

enzyme CTX-M đóng một vai trò quan trọng trong các hoạt động phổ rộng của các

enzyme này Việc thêm agrinine ở vị trí 276 tương tự như agrinine ở vị trí 244 trên các enzyme TEM và SHV cũng đóng một vai trò quan trọng việc thủy phân oxyimino-cephalosprin (Gazouli và cs, 1998) Hiện nay, có khoảng hơn 40 dạng CTX-M đã được biết (Jacoby và Bush, 2005) Trong đó, CTX-M-14, CTX-M-3 và CTX-M-2 là thường gặp nhất (Jacoby và Munoz-Price, 2005)

Bảng 2.5: Đặc điểm của CTX-M

(Nguồn: Bradford, 2001 và Jacoby và Bush, 2005)

OXA

Enzyme OXA thuộc nhóm enzyme khác trong gia đình ESBL, cấu trúc phân

tử lớp D và thuộc nhóm 2d (Bush và cs, 1995) Các beta-lactamase OXA đề kháng với ampicillin và cephalothin Nhóm enzyme này có khả năng thủy phân oxacillin

và cloxacillin Hầu hết, các enzyme này đề kháng tương đối với chất ức chế

clavulanic acid (Bush và cs, 1995) Chúng được tìm thấy chủ yếu trên P

aeruginosa (Bảng 2.6) và được phát hiện ngày càng nhiều như OXA-10, OXA-11,

OXA-14 và OXA-16 (Danel và cs, 1999; Danel và cs, 1995; Hall và cs, 1993; Mugnier và cs, 1998) OXA-14 khác OXA-10 bởi việc thay thế một amino acid,

OXA-11 và OXA-16 khác OXA-10 ở hai amino acid, OXA-13 và OXA-19 khác OXA-10 ở 9 amino acid (Bảng 2.6) Trong các enzyme liên quan đến OXA-10, có

sự thay thế asparagine thành serine ở vị trí 73 hoặc asparagine thành glycine ở vị trí

157 Đặc biệt, sự thay đổi asparagine thành glycine ở vị trí 157 có thể dẫn đến sự đề kháng cao với ceftazidime (Danel và cs, 1999)

Bảng 2.6: Đặc điểm của OXA

beta-lactamase Biến thể Vị trí thay thế amino acid so với

OXA-10

Phát hiện Các loài vi khuẩn

phát hiện

Asn73Ser, Thr107Ser, Tyr174Phe, Glu229Gly, Ser245Asn, Glu259Ala

OXA-18 OXA-9,

OXA-12

Thr107Ser, Gly157Asp, Tyr174Phe, Glu229Gly, Ser245Asn, Glu259Ala

Trp154Gly, Gly157Asp, Tyr174Phe, Glu229Gly, Ser245Asn, Glu259Ala

(Afazal-Các ESBL khác

Trong khi các ESBL chủ yếu là dẫn xuất của TEM và SHV, một vài ezyme beta-lactamase không có liên quan mật thiết với các thành viên trong gia đình

ESBL Các enzyme beta-lactamase PER-1 được báo cáo đầu tiên trên các chủng P

aeruginosa và được phân lập trên những bệnh nhân ở Thổ Nhĩ Kỳ (Nordman và cs,

1993) Sau đó, các enzyme này được tìm thấy trên các chủng S enterica serovar Typhimurium và Acinetobacter baumanii (Vahaboglu và cs, 1997) Enzyme PER-1

đã lan truyền rộng khắp ở Thổ Nhĩ Kỳ và có đến 60 % các chủng A baumanii đề

kháng với ceftazidime (Vahaboglu và cs, 1997) Enzyme PER-2 có 86 % amino

acid tương đồng với PER-1, được tìm thấy trên các chủng S enterica serovar

Typhimurium ở Argenetina (Bauernfeind và cs, 1996b)

Các enzyme khác có liên quan với PER-1 là VEB-1 (Poirel và cs, 1999),

được tìm thấy trên các chủng E coli phân lập từ các bệnh nhân ở Việt Nam Tuy nhiên, chúng thường được tìm thấy trên các chủng P aeruginosa phân lập từ các

bệnh nhân ở Thái Lan (Naas và cs, 1999) Các enzyme khác như CME-1 được tìm

thấy trên các chủng Chryseobacterium meningosepticum (Rossolini và cs, 1999) và TLA-1 được tìm thấy trên E coli phân lập từ các bệnh nhân ở Mexico (Silva và cs,

2000) Các enzyme PER-1, PER-2, VEB-1, CME-1 và TLA-1 có khoảng 40 - 50 % tương đồng với nhau Tất cả các enzyme này đề kháng với oxyimino-cephalosporin, đặc biệt là ceftazidime và aztreonam (Rossolini và cs, 1999)

2.3 Tình hình đề kháng beta-lactam và beta-lactam phổ rộng

2.3.1 Trên người

Tình hình đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam do vi khuẩn mang ESBL trên người hiện nay đang là một vấn đề rất được quan tâm Năm 1997, Rasheed và

cs đã đánh giá sự đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam trên 9 chủng E coli được

thu thập từ 7 mẫu máu, trong thời kỳ 3 tháng, từ một bệnh nhân nữ 19 tháng tuổi bị

nhiễm trùng huyết Bằng phương pháp PCR, các tác giả đã phát hiện gene blaTEM và

blaSHV trên tất cả các chủng phân lập Giải trình tự nucleotide phát hiện một chủng

mang gene blaSHV-1 đề kháng ceftazidime và một chủng mang gene blaSHV mới,

được đặt tên là blaSHV-8

Năm 2003, Pitout và cs đã phát hiện các gene đề kháng nhóm beta-lactam

trên các chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae mang AmpC Các chủng vi

khuẩn này được phân lập từ các bệnh nhân ở bệnh viện Pelonomi, thuộc Nam Phi

Sử dụng phương pháp khuếch tán kép trên thạch, các tác giả đã phát hiện kiểu hình

ESBL trên 212 chủng E cloacae, E aerogenes, S marcescens và C freundii

Paterson và cs (2003) đã khảo sát ESBL trong 455 mẫu máu có chứa K

pneumonia từ 12 bệnh viện ở 7 quốc gia Nhiều vi khuẩn mang kiểu hình ESBL

được tìm thấy Trong đó, SHV là ESBL phổ biến nhất, chiếm 67,1 % (49/73 chủng) Ngược lại, các ESBL TEM (chủ yếu là TEM-10, TEM-12, TEM-26 và TEM-63) chỉ chiếm 16,4 % (12/73 chủng) Trong đó, TEM-10 và TEM-12 là các beta-lactamase được tìm thấy đầu tiên ở Nam Mỹ Ở Thổ Nhỹ Kỳ, người ta đã phát hiện

5/9 chủng mang ESBL PER (đề kháng phổ rộng với Pseudomonas) và 2 chủng mang SHV-2 và SHV-5 Các gene blaCTX-M-2 và blaCTX-M-3 cũng được tìm thấy chiếm tỷ lệ 23,3 % (17/73 chủng) Bên cạnh đó, Paterson và cs cũng đã phát hiện các ESBL ở 4 quốc gia mà trước đây chúng chưa được miêu tả như Australia, Bỉ, Thổ Nhỹ Kỳ và Nam Phi

Manchanda và Singh (2003) đã xác định sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn Gram âm chứa enzyme AmpC tại một bệnh viện ở Delhi, Ấn Độ Trong 135 chủng

vi khuẩn Gram âm được kiểm tra, có 37 % các chủng mang AmpC Sự xuất hiện

của các AmpC được tìm thấy trên các chủng Acinetobacter spp (chiếm 42,8 %) và các chủng K pneumonia (chiếm 33,3 %) Các chủng không chứa AmpC nhạy cảm

với cefoxitin

Năm 2004, Liebana và cs đã báo cáo về một trường hợp bệnh nhân nhi bị

nhiễm S enterica serotype Infantis Kết quả cho thấy, các chủng này mang 4 gene

blaTEM-1b, blaSHV-5, bla CTX-M-15 và blaCMY-2 đề kháng với các kháng sinh nhóm

beta-lactam, ngoại trừ imipenem Đây là báo cáo đầu tiên trên các chủng Salmonella

mang enzyme CTX-M và AmpC ở Mỹ Đồng thời, đây cũng là báo cáo đầu tiên về

gene blaCMY-2 trên Salmonella serotype Infantis và blaCTX-M-15 trên các chủng

Salmonella

Năm 2005, Batchelor và cs đã phát hiện các gene blaCTX-M trên các chủng

Salmonella phân lập trên người ở Anh và xứ Wales từ năm 1992 đến năm 2003

Trong 106 chủng được chọn từ 278 308 chủng Salmonella đã phân lập đề kháng với ampicillin và cephalosporin, có 14 chủng cho kết quả PCR blaCTX-M dương tính

Phân tích trình tự nucleotide cho thấy có sự hiện diện của các gene blaCTX-M-9,

blaCTX-M-15, blaCTX-M-17 và blaCTX-M-8 Các gene bla CTX-M nằm trên plasmid có trọng lượng phân tử từ 63, 105 và lớn hơn 148 kb Đây là nghiên cứu đầu tiên về gene

blaCTX-M trên Salmonella ở Anh, gene blaCTX-M trên S enterica serotype Stanley và gene blaCTX-M-15 trên S enterica serotype Anatum, Enteritidis và Typhimurium

Năm 2006, Gover và cs đã nghiên cứu sự đề kháng cefepime (cephalosporin

thế hệ thứ tư) trong quá trình điều trị bệnh do K pneumonia gây ra Các chủng vi

khuẩn này được phân lập trên các bệnh nhân ở bệnh viện Safdariung, New Delhi, qua 2 khoảng thời gian từ tháng 10/2001 đến tháng 9/2002 (trước khi sử dụng cefepime) và từ tháng 8/2003 đến tháng 7/2004 (sau khi sử dụng cefepime) Kết quả cho thấy, ở giai đoạn đầu có 71/108 chủng (chiếm 65,72 %) và ở giai đoạn sau có 87/99 chủng (chiếm 88 %) mang ESBL Các chủng vi khuẩn này đề kháng cao với cephalosporin Bằng phương pháp khuếch tán kép trên thạch, E - test và PCR, các tác giả đã phát hiện 32 chủng vi khuẩn mang ESBL (15 chủng ở giai đoạn đầu và 17 chủng ở giai đoạn sau) Điều này cho thấy, việc sử dụng kháng sinh cephalosporin

thường xuyên trong quá trình điều trị bệnh do K pneumonia đã dẫn đến gia tăng nguy cơ mang ESBL trên các chủng K pneumonia ở quốc gia này

Ở Đài Loan, Yan và cs đã điều tra sự mang ESBL và enzyme ampC được mã

hóa từ các gene nằm trên plasmid ở 291 chủng E coli và 282 chủng K pneumonia

tại 7 trung tâm y học ở Đài Loan Kết quả cho thấy, các chủng vi khuẩn này mẫn cảm với các cephalosporin phổ rộng Trong đó, các enzyme CTX-M và SHV là phổ biến nhất trong các ESBL và các enzyme CMY-2, DHA-1 phổ biến trong các AmpC

Năm 2007, Apfalter và cs đã xác định sự mang ESBL trên các chủng

Enterobacter spp ở bệnh viện của một trường đại học ở Vienna, Austria, bằng

phương pháp khuếch tán trên thạch Kết quả cho thấy trong 208 chủng Enterobacter

có đến 95 % (197/208) chủng được xác định mang enzyme AmpC Tất cả các chủng

vi khuẩn phân lập được đề kháng với cefuroxime và cefodoxime, trên 90 % đề kháng với cefotaxime (71/76 chủng) và ceftazidime (74/76 chủng) Trong đó, có 8

chủng Enterobacter (chiếm 4 %) mang ESBL

Ở Thái Lan, Kiratisin và cs (2008) đã nghiên cứu về các đặc điểm phân tử và

dịch tể học của các ESBL trên các chủng E coli và K pneumonia gây nhiễm trùng

ở bệnh viện Kết quả cho thấy vi khuẩn E coli và K pneumonia mang ESBL lan

truyền rộng khắp và nghiêm trọng trong các trường hợp nhiễm trùng ở bệnh viện

Các ESBL này được mã hóa từ các gene bla là: blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaVEB, blaOXA, blaPER và blaGES Trong đó, gene blaCTX-M là nổi bật trên các chủng E coli,

chiếm 99,6 % mã hóa các enzyme CTX-M-14, CTX-M-15, CTX-M-27, CTX-M-40

và CTX-M-55 và chiếm 99,2 % trên các chủng K pneumonia mã hóa các enzyme

CTX-M-3, CTX-M-14, CTX-M-15, CTX-M-27 và CTX-M-55 Đây là nghiên cứu đầu tiên phát hiện các enzyme CTX-M-3, CTX-M-27, CTX-M-40, SHV-27, SHV-

71 và SHV-75 tại Thái Lan

Ở Việt Nam, các chủng vi khuẩn đường ruột mang ESBL cũng được phát hiện ở nhiều bệnh viện với các tỷ lệ khác nhau Năm 1997, bệnh viện Chợ Rẫy đã theo dõi mức độ đề kháng kháng sinh trên các chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu

bệnh phẩm Các chủng vi khuẩn phân lập nhiều nhất là P aeruginosa, E coli,

Enterobacter spp., và S aureus Trong đó, S aureus đề kháng với vancomycine

chiếm 44 %, Enterobacter spp mang ESBL chiếm 6,3 % và P aeruginosa đề

kháng với cefotaxime (62,5 %) và ceftazidime (38,9 %) Tuy nhiên, chưa phát hiện

ESBL trên các chủng E coli (Võ Thị Chi Mai, 1998)

Năm 2007, Trần Thị Ngọc Anh đã phân lập được 2.738 chủng vi khuẩn từ

các mẫu bệnh phẩm ở bệnh viện Nhi Đồng 2 Trong đó, E coli chiếm 14,6 %, đề

kháng cao với trimethoprime/sulfamethoxazol (79,95 %), cefuroxime (61,31 %),

cefotaxime (51,4 %) và gentamycine (47,5 %) Các chủng K pneumonia phân lập

được chiếm 11,7 %, đề kháng cao với ceftazidime (53,07 %), genetamycine (63,58

%), cefotaxime (64,2 %), ceftriaxone (65,26 %), cefuroxime (71,23 %) và trimethoprim/sulfamethoxazol (73,97 %) (Trần Thị Ngọc Anh, 2008)

Năm 2008, Nguyễn Tuấn Minh đã nghiên cứu vi khuẩn mang ESBL gây nhiễm khuẩn hô hấp trên các bệnh nhân thở máy Kết quả cho thấy các chủng vi

khuẩn mang ESBL chiếm 26,03 % Trong đó, K pneumonia chiếm 20,55 % và E

coli chiếm 5,48 %. Các chủng vi khuẩn mang ESBL đề kháng 100 % với

cephalosporin, chiếm 93,33 % trên K pneumonia và 100 % trên E coli.Các chủng

P aeruginosa và A baumannii không những kháng với các kháng sinh nhóm

cephalosporin mà còn kháng cả với carpapenem ở mức cao, chiếm 80 % trên các chủng P aeruginosa và 64,7 % ở A baumannii

Năm 2010, Nguyễn Thanh Tùng đã nghiên cứu về sự đề kháng kháng sinh

của vi khuẩn E coli phân lập từ các bệnh phẩm, phân, máu đàm và nước tiểu của

bệnh nhân ở bệnh viện nhân dân Gia Định và bước đầu nghiên cứu về sự hiện diện của ESBL trên thịt heo ở lò mổ và chi cục Thành phố Hồ Chí Minh Bằng phương

pháp khuếch tán trên thạch, kết quả cho thấy có 86,3 % gốc E coli phân lập có kiểu hình đa đề kháng Các chủng E coli từ thịt heo có tỉ lệ đề kháng 90,5 % cao hơn so với E coli từ người bệnh (80,3 %) Kiểm tra ESBL, tác giả phát hiện 5 gốc E coli

(chiếm 2,5 %) mang ESBL và các gốc vi khuẩn này đều có nguồn gốc từ người bệnh Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về sự hiện diện ESBL trên động vật và chất thải chăn nuôi

2.3.2 Trên động vật

Vấn đề đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn có mang enzyme ESBL ngày càng gia tăng kể từ báo cáo đầu tiên ở Châu Âu vào năm 1983 Trong suốt những năm

1990, chúng đã được miêu tả chủ yếu là enzyme beta-lactamase TEM và SHV trên

K pneumonia gây ra các ổ dịch truyền nhiễm Ngày nay, cơ chế đề kháng này được

tìm thấy trên E coli với số lượng ngày càng gia tăng Phổ biến là các enzyme TEM

(TEM-24, TEM-4, TEM-52), SHV (SHV-5, SHV-12) và M (M-9, M-3, CTX-M-14 và CTX-M-15) (Coque và cs, 2008)

CTX-Các nước trong khu vực cũng đã có nhiều báo cáo về sự hiện diện của các chủng vi khuẩn này trên người và động vật Liebana và cs (2006) đã xác định các

gene đề kháng beta-lactam trên E coli được phân lập vào năm 2004 tại một trại chăn nuôi bò Kết quả, có 2 chủng E coli đề kháng với beta-lactam (bao gồm

amoxicillin – clavulanic acid và cefotaxime) Bằng kỹ thuật PCR và phân tích trình

tự DNA, các tác giả đã xác định được các gene blaCTX-M-14/17 và blaTEM-35 Đây là

báo cáo đầu tiên về gene blaCTX-M trong chăn nuôi ở Anh và báo cáo này cũng chứng minh dịch tể học phức tạp của ESBL Kết quả này cho thấy, các gene đề kháng này nằm trên plasmid và dễ dàng lan truyền trong quần thể vi sinh vật

Năm 2009, Abatih và cs đã phân tích khuynh hướng đề kháng kháng sinh

theo mùa, theo vùng và theo thời gian trên các chủng E coli phân lập từ heo tại một

lò mổ ở Đan Mạch, giữa năm 1997 đến 2005 Kết quả cho thấy các chủng E coli đề

kháng với ampicillin có khuynh hướng tăng theo thời gian trong tất cả các mùa, ngoại trừ mùa đông Ngược lại, sự đề kháng streptomycin có khuynh hướng giảm vào những tháng mùa xuân, mùa hè và mùa đông

Cùng năm này, Tian và cs đã phát hiện các enzyme CTX-M-15, CTX-M-22

và SHV-2 trên các chủng E coli phân lập từ các mẫu phân heo, thuộc hai trại heo ở

Tứ Xuyên, Trung Quốc Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang ESBL gia tăng từ 2,2 % đến

10,7 % trong thời kỳ nghiên cứu, từ năm 2002 - 2007 Sự gia tăng này hầu hết liên

quan đến sự phổ biến của các ESBL CTX-M trong các chủng E coli Đây là nghiên cứu đầu tiên xác định blaCTX-M-22 từ sản phẩm động vật Gene mã hóa CTX-M nằm trên plasmid nên các gene này nhanh chóng lan truyền giữa các trại heo

2.3.3 Trong nước thải

Từ năm 1970, hoạt động chăn nuôi có xu hướng ngày càng ổn định và mở rộng hơn Việc mở rộng và phát triển các hoạt động chăn nuôi trên quy mô lớn ở

Mỹ đã đặt ra một vấn đề quan trọng về ô nhiễm môi trường và sức khỏe cộng đồng

bị ảnh hưởng bởi phân động vật thải ra môi trường nước bề mặt và lan truyền trong

mạch nước ngầm gần khu chăn nuôi heo quy mô lớn và chăn nuôi gia cầm (Jongbloed và Lenis, 1998)

Năm 2002, Campagnolo và cs đã đánh giá sự hiện diện của các thành phần kháng sinh trong nước thải động vật, nguồn nước bề mặt và nước ngầm gần các trại chăn nuôi heo và gia cầm ở Mỹ Kết quả cho thấy các loại kháng sinh được tìm thấy trong tất cả các mẫu phân heo, với hàm lượng khá cao xấp xỉ 1 mg/l Sự đề kháng kháng sinh phổ biến trên các mẫu nước gần trại heo (chiếm 31 %) và gần trại gà (chiếm 67 %) Điều này cho thấy việc sử dụng chất thải chăn nuôi làm phân bón cho cây trồng có thể là nguồn gốc của việc tồn dư kháng sinh trong môi trường

Năm 2003, Roe và Pillai đã nghiên cứu mối liên hệ giữa việc sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp và sự đề kháng kháng sinh trong các bệnh truyền nhiễm trên người Những vi sinh vật đề kháng kháng sinh từ chất thải động vật và con người xâm nhập trong quần thể người và động vật qua nhiều con đường như nguồn nước trong tự nhiên, nước tưới, nước uống, rau cải và thực phẩm

Năm 2008, Sabate và cs đã phân lập được 85 chủng E coli từ mẫu nước thải

người và động vật Kết quả cho thấy 55 % chủng đề kháng với nalidixic acid, 38 % chủng đề kháng với ciprofloxacin và 12 % chủng mang ESBL Các chủng có nguồn gốc từ gia cầm đề kháng với quinolone, fluoroquinolone và có sự hiện diện của ESBL, trong khi các chủng trên người thì mẫn cảm với fluoroquinolone

Tình hình đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam có khuynh hướng ngày càng gia tăng cả trên người và vật nuôi ở nhiều quốc gia trên thế giới Ngày càng nhiều gene mã hóa các enzyme beta-lactamase khác nhau đã được báo cáo Trong

đó, một số gene mã hóa các ESBL, gây khó khăn trong việc phòng và trị bệnh trong nhân y và thú y, nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2010 đến tháng 9/2011

Mẫu nước thải và phân động vật khảo sát được lấy từ các trại heo và trại gà ở Thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương và Đồng Nai Việc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Việc xác định gene đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam và sự hiện diện ESBL được thực hiện tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Mẫu sản phẩm PCR được gửi giải trình tự (Công ty Macrogen, Hàn Quốc)

3.2 Nội dung nghiên cứu

Luận văn có 3 nội dung nghiên cứu chính:

- Khảo sát sự hiện diện một số gene đề kháng nhóm beta-lactam trong mẫu chất thải bằng kỹ thuật PCR

- Khảo sát khả năng đề kháng nhóm beta-lactam và beta-lactam phổ rộng của các vi khuẩn đường ruột phân lập từ mẫu chất thải

- Tìm hiểu kiểu gene đề kháng của các chủng vi khuẩn có kiểu hình ESBL

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Cách lấy mẫu: Mẫu nước thải tươi (15 mẫu) được lấy tại hố lắng của các

trại, mẫu nước thải biogas (15 mẫu) được lấy ở đầu ra của hầm ủ biogas và các mẫu này được chứa trong các bình nhựa có nắp đậy Mẫu phân gà (15 mẫu) được thu thập từ những mẫu phân tươi trên nền của trại (do trên gà không có nước thải nên đề tài lấy mẫu phân), và các mẫu phân này được chứa trong các túi plastic Các mẫu

nước thải và phân gà được thu thập từ 45 trại khác nhau ở Thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương và Đồng Nai Các mẫu này được trữ trong bình đá, sau đó vận chuyển

về phòng thí nghiệm

Xử lý mẫu: Mỗi mẫu phân gà được trộn đều và trộn với canh PBS

(phosphate buffered saline, pH 7,2) (5 g phân trong 45 ml dung dịch đệm) Các mẫu nước thải trại heo và phân gà đã trộn với dung dịch PBS được dập bằng máy stomacher khoảng 1 phút

3.3.1 Khảo sát sự hiện diện một số gene đề kháng nhóm beta-lactam trong mẫu chất thải bằng kỹ thuật PCR

Nhằm mục đích đánh giá toàn diện khả năng các vi khuẩn trong chất thải chăn nuôi có mang gene đề kháng (tránh nhược điểm của phương pháp nuôi cấy phân lập), mẫu sẽ được tăng sinh trong canh TSB, sau đó DNA của mẫu canh tăng sinh được ly trích và phân tích tìm các gene đề kháng bằng kỹ thuật PCR

Ngay sau khi mẫu phân gà được trộn với dung dich PBS; 0,1 ml mẫu được cấy chuyển trong ống nghiệm có chứa 10 ml canh TSB, ủ ở 35 oC trong 24 giờ

Ly trích DNA

Các ống canh khuẩn được vortex và 400 µl canh khuẩn của mỗi mẫu được lấy cho vào 1 ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút Một ml nước cất hai lần vô trùng được cho vào mỗi ống eppendorf có chứa cặn vi khuẩn Mẫu được pipette lên xuống nhiều lần để làm tan kết tủa thành huyễn dịch và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút (rửa kết tủa) Sau đó, 1 ml nước cất 2 lần vô trùng được cho vào mỗi ống eppendorf có chứa cặn vi khuẩn và pipette lên xuống nhiều lần để làm tan kết tủa thành huyễn dịch Ngâm ống eppendorf có chứa huyễn dịch vi khuẩn vào nước sôi ở 96 oC và để khoảng 10 phút Sau đó, mẫu được để trên đá khoảng 20 phút Ly tâm mẫu ở 16.000 vòng/phút ở 4 oC trong 20 phút Các ống được nhẹ nhàng lấy ra khỏi máy ly tâm, 500 µl nước phía trên (có chứa DNA của mẫu) được lấy ra và chuyển sang một ống eppendorf khác Mẫu này được cất tủ lạnh khoảng 4 oC, sau đó tiến hành phân tích bằng kỹ thuật PCR