PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN 10 DÒNG VÔ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR (INTERSIMPLE SEQUENCE REPEATS)

Một số kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu quan hệ di truyền và nhận diện giống cây trồng .... Inter-simple Sequence Repeats ISSR là một trong số các chỉ thị DNA được ứng d

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

*****************

HOÀNG THỊ LIỄU

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN

10 DÒNG VÔ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR

(INTER-SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN

10 DÒNG VÔ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR (INTER-SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

HOÀNG THỊ LIỄU

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: TS ĐỖ NGỌC DIỆP

Công ty Cổ phần Đường Biên Hòa

2 Thư ký: PGS.TS TRẦN VĂN MINH

Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM

3 Phản biện 1: TS NGUYỄN HỮU HỔ

Viện Sinh học Nhiệt đới TP HCM

4 Phản biện 2: TS VÕ THÁI DÂN

Đại học Nông Lâm TP HCM

5 Ủy viên: PGS TS PHAN THANH KIẾM

Đại học Nông Lâm TP HCM

Tháng 9 năm 2009, theo học Cao học ngành Trồng trọt tại Trường Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: 1543 Đại lộ Bình Dương, phường Hiệp An, thị xã Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

Điện thoại: Cơ quan: 06503.564596; Di động: 0907499262

Email: rrivhoanglieu@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hoàng Thị Liễu

LỜI CẢM TẠ

Lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ đã sinh thành và nuôi dạy con trưởng thành Lời cảm ơn chân thành đến chồng, con trai và gia đình bên chồng đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện trong quá trình học tập

Lời tri ân sâu sắc xin gởi đến Thầy - TS Bùi Minh Trí, đã dìu dắt, giúp đỡ cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập từ Đại học đến Cao học, và cũng là người hướng dẫn khoa học cho tôi thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm tạ đến:

- ThS Lại Văn Lâm - Viện trưởng Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam (VCS)

và Ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện nghiên cứu và cấp kinh phí đào tạo

- ThS Lê Mậu Túy - Trưởng Bộ môn Giống cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Bộ Môn Giống - VCS đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học và luận văn tốt nghiệp

- ThS Lê Thị Thùy Trang - Phụ trách Phòng thí nghiệm CNSH, VCS đã giúp tôi xây dựng đề cương, dự toán kinh phí và thiết lập các thí nghiệm trong đề tài

- Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo Sau Đại học, các quý thầy cô khoa Nông học - Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học thuận lợi

Cuối cùng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và động viên của anh, chị, em, bạn bè, đồng nghiệp và toàn thể thành viên lớp CHTT - 09

TÓM TẮT

Đề tài "Phân tích mối quan hệ di truyền và nhận diện 10 dòng vô tính cao su bằng kỹ thuật ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)” được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương, thời gian từ tháng 06/2010 đến tháng 2/2011 Mục tiêu của đề tài là phân tích mối quan hệ di truyền và nhận diện 10 dvt cao su trong bảng cơ cấu giống khuyến cáo giai đoạn 2006 - 2010

Đề tài sử dụng kỹ thuật ISSR dựa trên quy trình của Weising và ctv (2005), trong

đó thành phần phản ứng PCR được điều chỉnh phù hợp với vật liệu và điều kiện thí nghiệm

Kết quả thu được là thành phần phản ứng PCR đã được điều chỉnh phù hợp

với nồng độ Taq 1,25 U và nồng độ mồi là 1 M Hai mươi mồi ISSR qua sàng lọc

đã thu được 6 mồi gồm T28, T30, T31, T33, T34 và T38 cho sản phẩm đa hình và

ổn định trên 10 dvt cao su nghiên cứu Phân tích PCR với 6 mồi này trên 10 dvt đã tạo ra được 53 băng DNA dao động trong khoảng 180 - 2600 bp, trong đó có 26 băng đa hình, chiếm tỷ lệ 49,1 % Hệ số tương đồng di truyền giữa các dvt dao động trong khoảng 0,810 đến 0,937, trung bình là 0,873 Kết quả phân tích mối quan hệ

di truyền dựa trên hệ số DICE bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 cho thấy, ở mức tương đồng đi truyền 0,876, các dvt chia làm 3 nhóm: nhóm I gồm các dvt có phổ

hệ gần gũi: LH 88/236, LH 88/72 và RRIC 121; nhóm II gồm 2 dvt có cùng phổ hệ

là LH 90/952 và LH 90/1094; nhóm III gồm các dvt LH 83/85, LH 83/87, RRIM

600 và PB 260 Bên cạnh đó, dvt IAN 45/873 tách ra khỏi 3 nhóm trên ở mức tương đồng 0,848 Kết quả trên cho thấy sự phân bố các dvt ở các nhóm có liên quan đến phổ hệ, nguồn gen và xuất xứ của chúng Các dvt cao su nghiên cứu có mối quan hệ

di truyền gần gũi, tuy nhiên giữa chúng vẫn có sự khác biệt, điều này thể hiện rõ qua kết quả phân tích 3D - PCA Sự khác biệt dựa trên cơ sở hình ảnh về kích thước

và vị trí băng DNA của 10 dvt cao su với 6 mồi ISSR cũng chính là cơ sở để nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu Qua đó, quy trình nhận diện 10 dvt cao su bằng kỹ thuật ISSR cũng đã được xây dựng

ABSTRACT

The study “Genetic relationships and clonal identification among 10 rubber clones using ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)” was carried out at Rubber Research Intitute of Vietnam, from June, 2010 to February, 2011 The objectives of this study were to evaluate the genetic relationships among 10 elite clones, selected from breeding recomendation classes of the period 2006 - 2010 and to identify them The ISSR technique based on an earlier published ISSR protocol by Weising

et al., 2005 was applied to do the study

The contents of PCR were optimized with levels 1.25 U of Taq and 1 M of

primer Twenty ISSR primers were screened and 6 primers including T30, T31, T34, T33, T28 and T38 produced clear, stable and polymorphic fragments of all samples A total of 53 amplified fragments ranging from 180 - 1600 bp were detected on 10 clones, of which 26 were polymorphic (49.1 %) The Dice similarity coefficient values ranged from 0.810 - 0.937; the mean of values was 0.873 UPGMA cluster analysis based on Dice genetic similarity segregated the studied clones into 3 clusters at the value 0.876 The cluster I is formed from 3 clones having close relatives: LH 88/236, LH 88/72 and RRIC 121 The cluster II consist

of two clones having the same parents: LH 90/952 and LH 90/1094 The cluster III

is formed by the others Besides, the clone IAN 45/873 separated from all the three above-mentioned clusters at 0.848 The dendrogram indicated that the distribution

of clones in groups related to genetic resources, genealogy and locations of all clones Although the studied clones had close relative, genetic difference among them (as expressed by size and number of DNA bands) indicated by the results of 3D - PCA analysis was quite clearly Based on data of bands DNA with 6 primers that would be trusted evident for identification of the 10 clones, the identification protocol of rubber clones by ISSR was built

MỤC LỤC

TRANG Trang tựa Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Cảm tạ iv

Tóm tắt v

Abstract vi

Mục lục vii

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các hình và sơ đồ xii

Danh sách các bảng xiii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Phạm vi đề tài 3

Chương 2 TỔNG QUAN 4

2.1 Giới thiệu tổng quát về cây cao su 4

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.3 Điều kiện sinh thái 6

2.1.4 Đặc điểm di truyền cây cao su 6

2.1.5 Nguồn gen cây cao su trên thế giới 6

2.1.5.1 Nguồn gen cao su Đông Nam Á (Wickham) 6

2.1.5.2 Nguồn gen cao su Amazon 7

2.1.6 Tình hình sản xuất cao su trên thế giới 8

2.1.7 Tình hình sản xuất cao su ở Việt Nam 9

2.2 Giới thiệu về các loại chỉ thị di truyền 10

2.2.1 Chỉ thị hình thái 10

2.2.2 Chỉ thị phân tử 10

2.3 Một số kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu quan hệ di

truyền và nhận diện giống cây trồng 11

2.3.1 Kỹ thuật điện di Isozyme 11

2.3.2 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 12

2.3.3 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 13

2.3.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 13

2.3.5 Kỹ thuật PCR 14

2.3.6 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) 16

2.3.7 Kỹ thuật ISSR (Inter-simple Sequence Repeats) 17

2.3.8 So sánh giá trị một số loại chỉ thị DNA 20

2.4 Các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền và nhận diện giống cao su 22

2.4.1 Nghiên cứu về quan hệ di truyền trên cây cao su trong và ngoài nước 22 2.4.2 Nghiên cứu nhận diện giống cao su ngoài nước 25

2.4.2.1 Nghiên cứu nhận diện giống cao su bằng chỉ thị hình thái 25

2.4.2.2 Nghiên cứu nhận diện giống cao su bằng chỉ thị isozyme 26

2.4.2.3 Nghiên cứu nhận diện giống cao su bằng chỉ thị DNA 27

2.4.3 Nghiên cứu nhận diện giống cao su trong nước 28

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1 Thời gian và địa điểm 30

3.2 Vật liệu nghiên cứu 30

3.2.1 Các dòng vô tính cao su nghiên cứu 30

3.2.2 Mồi và hóa chất thí nghiệm 31

3.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm 32

3.3 Phương pháp nghiên cứu 32

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 32

3.3.2 Phương pháp ly trích, định tính và định lượng DNA 34

3.3.3 Thành phần hóa chất và chương trình nhiệt cho phản ứng PCR - ISSR 34

3.3.4 Phương pháp phân tích kết quả 37

3.3.4.1 Sàng lọc các mồi cho đa hình 37

3.3.4.2 Đánh giá tính ổn định của kỹ thuật PCR - ISSR 37

3.3.4.3 Phân tích mối quan hệ di truyền của 10 dvt cao su nghiên cứu 37

3.3.4.4 Nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu 38

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Ly trích DNA của các dvt cao su nghiên cứu 39

4.2 Điều chỉnh thành phần phản ứng PCR - ISSR 41

4.3 Kết quả phân tích ISSR 43

4.3.1 Đánh giá tính đa hình của các mồi ISSR nghiên cứu 43

4.3.2 Đánh giá khả năng lặp lại của kỹ thuật ISSR 44

4.3.3 Mối quan hệ di truyền của 10 dvt cao su nghiên cứu 46

4.3.4 Nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu 52

4.3.4.1 Cơ sở dữ liệu 52

4.3.4.2 Tiến trình nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu 53

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Đề nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 63

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

 A, C, G, T : Adenine, Cystosine, Guanine, Thymine

 AC: Acre ; RO: Rondonia; MT: Matto Grosso: Các Bang của BraZil

 AGROINFO (Agronomical Information): Trung tâm Thông tin Phát triển

 NN PTNT: Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

 AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

 ALP: Amplified Length Polymorphism

 AP - PCR: Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction

 BMG: Bộ môn Giống

 Bp: Base pair

 CIRAD: Center International Research Agriculture Development

 CTAB: Cetyltrimethyl Amonium Bromide

 IRSG (International Rubber Study Group): Tập đoàn Nghiên cứu Cao su Quốc tế

 IRCA (Institut de Recherches sur le Caoutchouc en Afrique): Viện Nghiên cứu Cao su Côte d’Ivoire

 IRRDB (International Rubber Reserch Development Board): Hiệp hội Nghiên cứu và Phát triển Cao su Thế giới

 ISSR: Inter-simple Sequence Repeats

 KDT: Kiểu di truyền

 LH: Lai hoa

 L: 100 bp Molecular Ladder

 MWL: Molecular Weight Ladder

 NST: Nhiễm sắc thể

 OD: Optical density

 PCR: Polymerase Chain Reaction

 PB (Prang Bersar): Một bang của Malaysia

 QTL (Quatitative trait loci): Các locus qui định tính trạng số lượng

 RAPD: Random amplified polymorphic DNA

 RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

 RNA: Ribonucleic acid

 RRIC (Rubber Research Institute of Ceylon): Viện Nghiên cứu Cao su Sri-Lanka

 RRII (Rubber Research Institute of India): Viện Nghiên cứu Cao su Ấn Độ

 RRIM (Rubber Research Institute of Malaysia): Viện Nghiên cứu Cao su Malaysia

 RRIV (Rubber Research Institute of Viet Nam): Viện Nghiên cứu Cao su VN

 SN: Kí hiệu vườn lưu trữ quỹ gen cây cao su

 SSR: Simple Sequence Repeats

 SSCP: Single-strand Conformation Polymorphism

 ST: Sơ tuyển

 Ta (Anealing temperature): Nhiệt độ bắt cặp

 TAE: Tris - Acetate - EDTA

 TE: Tris - EDTA

 Tm (Melting temperature): Nhiệt độ tan chảy

 U (unit): Đơn vị hoạt tính

 VN: Việt Nam

 W: Wickham

 WA: Wickham x Amazon

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Một số đặc điểm hình thái cây cao su 5 Hình 2.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR 15 Hình 2.3 Ví dụ về việc phát hiện microsatellites 16 Hình 2.4 Kỹ thuật ISSR primer đơn (AG)8, unanchored (a), 3’-anchored (b) và

5’-anchored (c) 18

Hình 3.1 100 bp molecular ladder (L) 36 Hình 4.1 Kết quả định tính 30 mẫu DNA của 10 dvt cao su nghiên cứu 39

Hình 4.2 Kết quả PCR với mồi T29 ở 5 nồng độ Taq trên dvt IAN 45/873 (a) và

Hình 4.6 Phân nhóm di truyền của 10 dvt theo phương pháp UPGMA dựa trên hệ

số DICE, phân tích bằng chương trình SAHN trong phần mềm

NTSYSpc 2.1 48

Hình 4.6 Phân nhóm di truyền của 10 dvt theo phương pháp UPGMA dựa trên hệ

số DICE, phân tích 2D - PCA bằng chương trình EIGEN của phần mềm NTSYSpc 2.1 51

Sơ đồ 4.1 Quy trình nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu 54

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Sản lượng cao su thiên nhiên thế giới và một số nước sản xuất chính

(đơn vị 1000 tấn) 8

Bảng 2.2 Diện tích và năng suất cao su tại một số nước năm 2007 8

Bảng 2.3 Diện tích và sản lượng cao su của Việt Nam qua các giai đoạn 9

Bảng 2.4 Các cách gọi khác nhau của kỹ thuật ISSR - PCR và kỹ thuật tương tự 19 Bảng 2.5 So sánh chi phí và lĩnh vực áp dụng của một số loại chỉ thị phân tử 21

Bảng 3.1 Một số đặc điểm của 10 dvt cao su nghiên cứu 30

Bảng 3.2 Đặc điểm của 20 mồi ISSR nghiên cứu 31

Bảng 3.3 Nơi thu thập mẫu của 10 dvt cao su nghiên cứu 33

Bảng 3.4 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR - ISSR (Weising và ctv, 2005) 35

Bảng 4.1 Kết quả định lượng DNA của 30 mẫu lá li trích 40

Bảng 4.2 Nồng độ thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với các mồi ISSR 43

Bảng 4.3 Kết quả đánh giá tính đa hình của 6 mồi ISSR trên 10 dvt nghiên cứu 44

Bảng 4.4 Hệ số tương đồng di truyền của 10 dvt cao su nghiên cứu 48

Bảng 4.5 Giá trị Eigen của các dvt cao su nghiên cứu qua phân tích 3D - PCA 52

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) là loại cây trồng có giá trị kinh tế

cao, cung cấp nguyên liệu thiết yếu cho phát triển công nghiệp, có đặc tính phù hợp cho trồng rừng và xóa đói giảm nghèo nên được nhà nước quan tâm đầu tư Vì thế, diện tích trồng cao su nước ta không ngừng tăng trong những năm qua Và vấn đề giống đã trở thành mối quan tâm hàng đầu trong việc đầu tư thâm canh cây cao su Trong công tác lai tạo và tuyển chọn giống cao su tại các Viện Nghiên cứu Cao su, phần lớn các dòng vô tính làm bố mẹ lai được chọn chủ yếu dựa vào các tính trạng kinh tế (trong đó, sản lượng, sinh trưởng và khả năng chống chịu bệnh hại được ưu tiên hàng đầu) nhằm mong muốn tạo ra các con lai có sản lượng cao, sinh trưởng khỏe và chống chịu được các loại bệnh hại Chính vì vậy, quần thể giống được lai tạo ra sẽ có những đặc tính chung về di truyền Những thông tin về quan hệ

di truyền của quần thể này trên cơ sở DNA sẽ góp phần hỗ trợ các nhà lai tạo giống trong việc hoạch định các tổ hợp lai nhằm hạn chế khả năng xói mòn gen có thể xảy

ra do lai tạo có định hướng Do đó, việc sử dụng chỉ thị phân tử để phân tích mối

quan hệ di truyền của quần thể giống đang được sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất là thực sự cần thiết

Bên cạnh đó, vấn đề quản lý tập đoàn giống trong nghiên cứu và sản xuất cũng không kém phần quan trọng Sự nhầm lẫn giống trong nghiên cứu cũng như sản xuất sẽ dẫn đến những thiệt hại về công sức và chi phí đầu tư Ngoài ra, vấn đề bảo hộ giống cây trồng cũng đang được quan tâm đặc biệt đối với các nước trồng cao su Hiện nay có nhiều phương pháp nhận diện giống cao su và mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng và phạm vi ứng dụng riêng Trong đó,

phương pháp sử dụng các loại chỉ thị DNA để nhận diện giống đã được chứng minh

là cho kết quả chính xác và đáng tin cậy hơn các phương pháp khác

Inter-simple Sequence Repeats (ISSR) là một trong số các chỉ thị DNA được ứng dụng phổ biến trên cây trồng do có nhiều ưu điểm như: cho tính đa hình cao, có khả năng lặp lại, dễ thực hiện, kết quả nhanh, không cần biết trước thông tin di truyền của đối tượng nghiên cứu và có khả năng phân biệt các cá thể gần gũi nhau

về di truyền Mặt khác, kỹ thuật ISSR có chi phí phân tích vừa phải, có độ tin cậy

và dễ thực hiện nên được khuyến cáo ở các phòng thí nghiệm có trang bị vừa phải

và hiện được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu mối quan hệ di truyền và nhận diện giống trên nhiều loài cây trồng (Akagi và ctv, 1996; Sankar và Moore, 2000; Reddy và ctv, 2002; Armau và ctv, 2003)

Với những vấn đề đặt ra và tính khả thi của kỹ thuật ISSR, đề tài: “Phân tích mối quan hệ di truyền và nhận diện 10 dòng vô tính cao su bằng kỹ thuật ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)” thực sự cần thiết và phù hợp với điều kiện cũng như chiến lược nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Phân tích mối quan hệ di truyền 10 dvt cao su có thành tích nông học xuất sắc trong bảng cơ cấu giống khuyến cáo giai đoạn 2006 - 2010 nhằm góp phần hỗ trợ công tác lai tạo giống cao su

- Lập cơ sở dữ liệu ISSR tham chiếu cho việc nhận dạng 10 dvt cao su nghiên cứu để phục vụ cho công tác quản lý tập đoàn giống trong nghiên cứu và sản xuất

1.3 YÊU CẦU

Phản ứng PCR với các mồi ISSR có khả năng lặp lại, các mồi ISSR cho các băng DNA đa hình và đặc trưng để phân biệt được các dvt nghiên cứu

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU 2.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Theo Campagnon (1986), cây cao su loài Hevea brasiliensis thuộc chi

Hevea, họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) Trong chi Hevea, còn có 9 loài khác đều cho

mủ cao su nhưng chỉ có loài Hevea brasiliensis là có ý nghĩa về kinh tế và được

trồng rộng rãi nhất Tất cả các loài thuộc chi Hevea đều là loài bản địa của vùng

Amazon, Nam Mỹ và phân bố trong tự nhiên trên một vùng rộng lớn nằm giữa vĩ độ

60 Bắc và 150 Nam, giữa kinh độ 460 Tây đến 770 Đông, bao trùm các nước: Brazil,

Bolivia, Peru, Colombia, Ecuador, Venezuela, Guiyane thuộc Pháp Ngoài vùng

xuất xứ trên, người ta không tìm thấy cây cao su xuất hiện ở các nơi khác trên thế

giới (trích dẫn bởi Trần Thị Thúy Hoa, 1998)

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) là loại cây trồng lâu năm, có chu

kì khai thác 25 - 30 năm Cây cao su có một số đặc điểm hình thái như sau:

- Cao su là loài thân gỗ, sinh trưởng nhanh, trong tình trạng hoang dại cây có

thể cao 30 - 50 m, vanh thân lên tới 5 - 7 m Tuy nhiên, trong điều kiện sản xuất,

chiều cao cây tối đa từ 25 - 30 m

- Vỏ cây cao su có 3 lớp, lớp ngoài cùng gọi là tầng mộc thiêm, kế đến là lớp

trung bì có nhiều tế bào đá và một ít ống mủ, trong cùng là lớp nội bì cấu tạo bởi tế

bào libe và hệ thống ống mủ

- Mủ cao su là dung dịch thể keo, có màu trắng sữa hoặc hơi vàng tùy giống

- Lá cao su là lá kép gồm có 3 lá chét với phiến lá nguyên mọc cách Cây có thời kì rụng lá qua đông, lá rụng hoàn toàn sau đó ra bộ lá mới

- Hoa cao su nhỏ, hình chuông, màu vàng, đơn tính đồng chu, khó tự thụ do hoa đực và hoa cái không chín cùng lúc Cây cao su ra hoa khi được 5 - 6 tuổi và bắt đầu ra hoa vào tháng 2 - 3 trong điều kiện Việt Nam

- Quả dạng quả nang gồm 3 - 4 ngăn, chứa 3 - 4 hạt, quả tự khai, hạt khá lớn, kích thước thay đổi từ 2 - 3,5 cm Vỏ hạt cứng, đầu hạt có lỗ nảy mầm Trong hạt

có chứa nhiều dầu, dễ mất sức nảy mầm Cây cao su rụng trái trong tháng 8 - 9 hàng năm

- Bộ rễ của cây cao su rất phát triển, rễ cọc có thể dài đến 10 m khi trưởng thành và gặp đất có cấu trúc tốt, 80 - 85 % rễ bàng tập trung chủ yếu ở tầng đất mặt

0 - 30 cm (Nguyễn Thị Huệ, 2006)

Hình 2.1 Một số đặc điểm hình thái cây cao su

Hạt

Thân

Cao su rụng lá qua đông

2.1.3 Điều kiện sinh thái

Vùng sinh thái tự nhiên của cây sao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm, khá đa dạng Cây cao su thích hợp với vùng có lượng mưa trung bình từ 1500 đến 2000 mm/năm, không có mùa khô hoặc mùa khô từ 1 đến 5 tháng, nhiệt độ thích hợp nhất là 25 - 30 0C Cây trưởng thành có sức chịu hạn tốt, phát triển trong điều kiện tối thiểu 1600 - 1700 giờ nắng/năm và điều kiện gió nhẹ (1 - 3 m/s) Nếu tốc độ gió lớn hơn 17 m/s thì cây sẽ bị gãy đổ Cây cao su ưa đất hơi chua, độ pH khoảng 4,5 - 5,5 và không chịu ngập Đất trồng cao su yêu cầu phải có tầng đất mặt dày, không úng, địa hình ít dốc là tốt nhất (Nguyễn Thị Huệ, 2006)

2.1.4 Đặc điểm di truyền cây cao su

Cây cao su có bộ nhiễm sắc thể 2n = 36 Các đặc tính như sinh trưởng, sản lượng, khả năng kháng bệnh đều là những tính trạng đa gen, di truyền theo phương thức cộng hợp và khả năng phối hợp chung quan trọng hơn khả năng phối hợp riêng (Tan và ctv, 1975) Cho đến nay, chưa có bằng chứng về sự tự bất tương hợp ở cây cao su, mặc dù thường khi giao phấn chéo cho tỉ lệ đậu trái cao hơn tự thụ Hiện nay, nghiên cứu đặc điểm di truyền ở cây cao su qua thống kê sinh học (di truyền định lượng) tuy bắt đầu muộn hơn các nghiên cứu khác, nhưng đã có những đóng góp cho việc định hướng chương trình cải tiến giống cao su Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm hỗ trợ cho công tác cải tiến giống cao

su đã được thực hiện, dẫn đầu là CIRAD (Center International Research Agriculture Development) - Pháp, Ấn độ, Malaysia và Thái Lan

2.1.5 Nguồn gen cây cao su trên thế giới

2.1.5.1 Nguồn gen cao su Đông Nam Á (Wickham)

Cây cao su trở thành cây trồng từ khi Henry Wickham, nhà thực vật học người Anh, đã thu 70000 hạt cao su năm 1876 từ vùng quanh sông Tapojos, hữu ngạn sông Amazon và chuyển về công viên hoàng gia Anh ở Kiew, trong đó chỉ có

4 % hạt nảy mầm, được khoảng 2700 cây Sau 2 tháng, 1919 cây được chuyển sang

Sri Lanka và sống khoảng 90 %, 18 cây chuyển sang Indonesia chỉ sống được 2 cây,

50 cây chuyển sang Singapore nhưng không sống Năm 1877, một đợt chuyển 22 cây từ Kiew sang Singapore đã thành công và sau đó phát triển rộng khắp Mã Lai

Từ năm 1833, cây cao su ở Sri - Lanka và Mã Lai có hạt và trở thành nguồn giống cung cấp cho nhiều nước ở Châu Á và Châu Phi Nguồn vật liệu do Wickham sưu tập được xem là thủy tổ của hầu hết diện tích cao su Châu Á và Châu Phi (Baulkwill, 1989) Nguồn gen cao su do Wickham thu thập để hình thành đồn điền

ở các nước phương Đông chỉ thuộc một vùng rất nhỏ ở hạ lưu sông Amazon giáp với nhánh sông Tapajoz nên phần lớn các con lai có quan hệ họ hàng với nhau, khó tiếp tục lai tạo vì cận huyết thống (Ong và ctv, 1983)

2.1.5.2 Nguồn gen cao su Amazon

Nhận thức được vấn đề vốn di truyền hạn hẹp, xói mòn gen qua quá trình dòng vô tính hoá sẽ là một hạn chế lớn cho tương lai công tác cải tiến giống cao su nên các nước trồng cao su trên thế giới đã cố gắng khắc phục bằng cách di nhập bổ

sung nguồn di truyền loài Hevea brasiliensis từ vùng nguyên quán Amazon Nhìn

chung, những đợt sưu tập nguồn di truyền mới trong những năm 1950 từ vùng nguyên quán Amazon sau đợt giống Wickham chỉ mang tính rời rạc và hiệu quả sử dụng chưa cao Đến năm 1981, các Viện nghiên cứu cao su thuộc IRRDB đã hợp tác thực hiện một đợt thám hiểm vùng rừng rậm Amazon để sưu tập quỹ gen cây cao su

và đây là một sự kiện quan trọng nhất trong lịch sử về sưu tập giống cao su Cuộc thám hiểm được tiến hành ở vùng thuộc các bang phía Tây Brazil là Acre (AC), Rondonia (RO) và Matto Grosso (MT) (Ong và ctv, 1983) Năm 1984, các nguồn gen này được phân phối cho các nước thành viên ở Châu Á và Châu Phi Từ Malaysia, nguồn gen này đã được phép nhân giống ở Guadeloupe để kiểm dịch bệnh rụng lá Nam Mỹ (South American Leaf Blight: SALB) trước khi chuyển về 2 trung tâm trên

và phân bố cho các nước thành viên của hiệp hội từ năm 1984 (Ong và Tan, 1987)

2.1.6 Tình hình sản xuất cao su trên thế giới

Theo tổng hợp của Trung tâm thông tin - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (AGROINFO) (2008), các nước sản xuất cao su thiên nhiên lớn trên thế giới gồm có: Thái Lan, Indonesia, Malaysia và Việt Nam Năm 2008, Thái Lan tiếp tục dẫn đầu về sản lượng cao su thiên nhiên, Indonesia là nước đứng thứ 2 và kế đến là Malaysia (xem Bảng 2.1) Sản lượng cao su thiên nhiên trên thế giới chủ yếu do tiểu điền nắm giữ, với tỉ lệ 76 - 78 %, phần còn lại là sản xuất cao su quốc doanh (đại điền) Hiện trên thế giới, các nước có năng suất cao su bình quân dẫn đầu đó là Ấn

Độ, Thái Lan, Việt Nam và Malaysia Trong đó, Ấn Độ là nước có năng suất cao su bình quân cao nhất với 1767 kg/ha/năm (xem Bảng 2.2)

Bảng 2.1 Sản lượng cao su thiên nhiên thế giới và một số nước sản xuất chính

(đơn vị 1000 tấn)

Thế giới, quốc gia/Năm 2006 2007 2008

Thái Lan 3137 3056 3100 Indonesia 2797 2797 2860 Malaysia 1284 1200 1260 Việt Nam 522 549 644

(Nguồn: AGROINFO, tổng hợp từ số liệu của IRSG, 2008)

Bảng 2.2 Diện tích và năng suất cao su tại một số nước năm 2007

Quốc gia Diện tích

2.1.7 Tình hình sản xuất cao su ở Việt Nam

Quá trình sản xuất cây cao su ở Việt Nam đã có nhiều biến động trong suốt 2

thập kỷ qua Ở Việt Nam, diện tích và sản lượng cây cao su liên tục tăng qua các

giai đoạn (xem Bảng 2.3) Với mức sản lượng của năm 2008, sản xuất cao su ở Việt

Nam hiện đứng thứ 5 trên thế giới (chiếm khoảng 5,4 % sản lượng cao su thế giới),

chỉ sau Thái Lan, Indonesia, Malaysia và Ấn Độ (AGROINFO, 2008) Định hướng

phát triển cao su đến 2015 là tiếp tục quy hoạch và mở rộng diện tích cả nước để đạt

được 850 nghìn ha Đến năm 2020, việc đầu tư phát triển cây cao su chủ yếu tập

vào thâm canh tăng năng suất trên diện tích đã có, thay thế các giống cũ bằng những

giống mới có tiềm năng năng suất cao trên diện tích trồng tái canh (AGROINFO,

2008) Bên cạnh đó, thị trường xuất khẩu cao su cũng có nhiều thuận lợi Hiện nay,

Việt Nam xuất khẩu cao su trên hơn 70 nước và vùng lãnh thổ trên thế giới với thị

trường xuất khẩu lớn nhất là Trung Quốc Năm 2008, kinh ngạch xuất khẩu sang thị

trường Trung Quốc đạt 952,5 triệu USD, thị trường Hàn Quốc đạt 40,3 triệu USD,

kế đến là thị trường Đài Loan, Malaysia, Đức, Mỹ, Nhật Bản

Bảng 2.3 Diện tích và sản lượng cao su của Việt Nam qua các năm

Năm Diện tích

(ha)

Diện tích tăng (ha)

Diện tích khai thác

(ha)

Sản lượng (tấn)

2.2 GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOẠI CHỈ THỊ DI TRUYỀN

Các loại chỉ thị di truyền đã và đang được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu

di truyền và chọn giống hiện đại Trong phân tích nguồn di truyền và cải tiến giống cây trồng, kỹ thuật sử dụng chỉ thị được ứng dụng để nghiên cứu và tìm kiếm các dấu hiệu di truyền (genetic marker) cho từng cá thể, từng giống, loài Các loại chỉ thị được di truyền theo các định luật di truyền của Mendel và thông qua sự liên kết của chúng với những gen quan trọng và giúp dễ dàng trong việc phát hiện những khác biệt trong thông tin di truyền của từng cá thể (Lefebvre và ctv, 1995) Có hai loại chỉ thị di truyền: chỉ thị hình thái (morphological marker) và chỉ thị phân tử (molecular marker), trong đó, chỉ thị phân tử gồm có chỉ thị sinh hóa (biochemical marker) và chỉ thị DNA

2.2.1 Chỉ thị hình thái

Những chỉ thị hình thái thông thường tương ứng với các tính trạng chất lượng (qualitative trait) mà ta có thể ghi nhận bằng mắt thường Một tính trạng hình thái được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ, có thể được sử dụng như một chỉ thị di truyền Chỉ thị hình thái dễ dàng phát hiện và sự xuất hiện của chúng cho chúng ta biết về một giai đoạn phát triển hay một trạng thái sinh lý của cây trồng (Lefebvre

và ctv, 1995) Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của chỉ thị này là nó chịu tác động của môi trường

định hơn chỉ thị hình thái Chỉ thị isozyme đã được ứng dụng hiệu quả trong nhận diện giống và phân tích đa dạng di truyền trên cây cao su, tuy nhiên có một số hạn

chế như: số lượng chỉ thị ít (14 loci trong loài Hevea brasiliensis) và mức đa hình

thấp nên khó có thể nhận biết sự khác biệt giữa các giống gần nhau về mặt di truyền (Leconte ctv, 1994; Seguin ctv, 1995)

 Chỉ thị DNA

Chỉ thị DNA là một đoạn DNA sử dụng để đánh dấu hay truy theo một vị trí (locus) trên nhiễm sắc thể (NST) Những chỉ thị DNA mang đầy đủ các đặc tính của một chỉ thị di truyền điển hình Dựa trên chuỗi phản ứng polymerase gọi là PCR (Polymerase Chain Reaction) và trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA, chỉ thị DNA được chia làm 2 nhóm: (1) nhóm chỉ thị DNA dựa trên PCR gồm: ALP, AFLP, SSR, RADP, AP - PCR hay ISSR; (2) nhóm chỉ thị DNA dựa trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai giữa DNA gồm RFLP, minisatellite (Semagn và ctv, 2006) Chỉ thị DNA có ưu điểm hơn chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme do: (1) đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền; (2) có nhiều chỉ thị trong quần thể; (3) không ảnh hưởng của môi trường; (4) nhanh, kỹ thuật đơn giản dễ ứng dụng; (5) có thể áp dụng với nhiều đối tượng; (6) cần một lượng nguyên liệu tối thiểu; (7) có vị trí trên bản đồ di truyền; (8) cho lượng thông tin cao, đáng tin cậy (Satoni và ctv, 2000)

2.3 MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN GIỐNG CÂY TRỒNG

2.3.1 Kỹ thuật điện di isozyme

Isozyme là các protein xúc tác cùng một phản ứng enzyme, được qui định bởi các allen khác nhau trên cùng một locus Các protein này có khối lượng phân tử khác nhau và điểm đẳng điện khác nhau, vì thế chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường, từ đó, chúng tạo ra những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và hiển thị bằng phương pháp nhuộm màu Việc sử dụng chỉ thị isozyme khá rẻ tiền, cho kết quả nhanh, vật liệu có thể sử dụng trong một thời gian dài, không phụ thuộc tác động của môi trường nên trước đây, chỉ thị này được sử dụng

phổ biến Tuy nhiên, có thể nhận thấy rằng: trong phần lớn trường hợp, sự đa hình của các chỉ thị isozyme khá nghèo nàn trong những loài cây trồng (Lefebvre và ctv, 1995) Từ những năm cuối thế kỷ 20, kỹ thuật điện di isozyme đã được phát triển trên cây cao su tại các Viện nghiên cứu cao su trên thế giới Kỹ thuật này được sử dụng đầu tiên trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền những quần thể cây cao su thuần hóa (Wickham) và vật liệu di truyền từ các chuyến du khảo đến vùng Amazon (Chevalier và cvt, 1988) Trong suốt giai đoạn này, isozyme được coi là kỹ thuật có hiệu quả trong nhận diện giống cây cao su Tuy nhiên, do có nhiều điểm hạn chế hơn các chỉ thị DNA, nên kỹ thuật isozyme đang dần được thay thế bởi các kỹ thuật phân tử có độ tin cậy cao như: RAPD, AFLP, RFLP, SSR, ISSR, STS trong nghiên cứu cao su (Venkatachalam và ctv, 2007)

2.3.2 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật RFLP sử dụng các enzyme giới hạn cắt DNA hệ gen ở những vị trí nhất định cho các đoạn DNA dài ngắn khác nhau, được nhận biết sau khi điện di và lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang Chỉ thị RFLP thể hiện tất

cả những tính chất của một chỉ thị di truyền tốt Chúng là chỉ thị đồng trội dominant) nên có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử RFLP là chỉ thị cho tính ổn định và chính xác cao mà không phải đọc trình tự

(co-Tuy nhiên, việc thiết lập kỹ thuật RFLP đòi hỏi chi phí và tính kỹ thuật cao, không tự động hóa được Khối lượng DNA để phân tích là khá lớn (50 - 250 microgram) và thời gian cho kết quả dài, ít nhất cũng mất vài ngày và có thể kéo dài một vài tuần (Botstein và ctv, 1980; Lefebvre và ctv, 1995) RFLP là chỉ thị đầu tiên được sử dụng để thay thế chỉ thị isozyme trong nghiên cứu đa dạng di truyền và nhận diện cây cao su Đặc biệt, nó là chỉ thị có giá trị được sử dụng trong nghiên cứu lập bản đồ gen cây cao su (Besse và ctv, 1993; Besse và ctv, 1994; Lespinasse

và ctv 2000)

2.3.3 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP là chỉ thị có độ nhạy cao trong việc đánh dấu (fingerprinting) DNA hệ gen cây trồng, người, động vật và vi sinh vật Kỹ thuật này sử dụng các enzyme cắt giới hạn cắt các đoạn DNA của hệ gen sau đó khuếch đại bằng PCR với các adapter

và mồi tương ứng (Vos và ctv, 1995) Ưu điểm của kỹ thuật này là lượng DNA cần cho phản ứng ít, tạo ra nhiều chỉ thị với khả năng lặp lại cao, ổn định, kết quả cho

độ tin cậy cao, đa hình Cũng như RAPD, những chỉ thị AFLP chủ yếu là trội Rất nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng AFLP (Lefebvre

và ctv, 1995; Semagn và ctv, 2006) Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật cao và phải sử dụng đồng vị phóng xạ, do đó phần nào hạn chế khả năng sử dụng của nó

Kỹ thuật AFLP đã được Cirad (Pháp), Indonesia, Malaysia và Ấn Độ sử dụng trong nghiên cứu lập bản đồ gen cây cao su (Venkatachalam và ctv, 2007)

2.3.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RADP là chỉ thị được mô tả lần đầu tiên bởi Williams và ctv (1990) Kỹ thuật này sử dụng PCR với một đoạn mồi đơn, ngẫu nhiên khoảng 10 nucleotide bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên DNA tạo ra các băng DNA khác nhau khi điện di trên gel agarose Kỹ thuật RAPD đơn giản, không cần sự phân giải DNA, không cần phép lai và không cần biết trước trình tự nucleotide Và nó dựa trên nền tảng PCR nên cho kết quả rất nhanh, đòi hỏi ít DNA và có thể tự động hóa được (Satoni và ctv, 2000) RAPD là một trong những kỹ thuật đơn giản và chi phí thấp Nó cho phép nhân bản nhiều vị trí trong hệ gen và cho phép phát hiện những đột biến hiếm giữa các mẫu có quan hệ gần Tuy nhiên, khi sử dụng kỹ thuật RAPD thường xuất hiện những vấn đề về khả năng lặp lại Ngoài ra RADP là chỉ thị trội (dominant) nên không phân biệt được cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử Hơn nữa, các đoạn DNA cùng kích thước chưa chắc được nhân lên từ một vị trí (Lefebvre và ctv, 1995) Hiện nay, nghiên cứu sử dụng RADP phổ biến trên cây cao su trong việc nhận diện, phát hiện sự đa dạng và biến lượng di truyền (Venkatachalam và ctv, 2002; Venkatachalam và ctv, 2007; Lâm và ctv, 2007)

2.3.5 Kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ “Polymerase Chain Reaction”, là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme chịu nhiệt Polymerase do Kal Mullis và ctv phát

minh năm 1985 (William và ctv, 1990) Thực chất, đây là phương pháp tạo dòng in

- vitro nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác

định không cần sự hiện diện của tế bào, dựa trên đặc tính của DNA bị tách thành hai chuỗi đơn khi đun nóng trong dung dịch Mỗi đoạn mạch đơn sẽ được bổ sung các nucleotides bắt đầu từ những vị trí mà đoạn mồi (primer) phát hiện được những

chuỗi bổ sung trong mẫu DNA nhờ xúc tác của một enzyme chịu nhiệt (Taq polymeraza, phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus) Mồi có thể là

những chuỗi được tổng hợp một cách ngẫu nhiên hoặc là những chuỗi được xác định rõ từ một chuỗi đã biết trước và quyết định tính đặc hiệu của các bản sao được tạo ra Phản ứng PCR cho phép nhân số lượng một đoạn gen mục tiêu từ một vài bản sao ban đầu thành hàng triệu bản sao và được thực hiện bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại liên tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:

- Bước 1 (denaturation): đoạn gen (DNA) đang ở trạng thái mạch kép được đun ở nhiệt độ cao để tách thành mạch đơn Chỉ ở trạng thái mạch đơn đoạn gen mới có chức năng làm khuôn cho phản ứng trùng ngưng

- Bước 2 (annealing): nhiệt độ của phản ứng được hạ thấp để các mồi gắn được vào khuôn

- Bước 3 (extension): nhiệt độ được tăng lên giá trị tối ưu cho hoạt tính của enzyme Trong bước này, phản ứng trùng ngưng xảy ra, một bản sao mới của đoạn gen được tạo ra từ một khuôn ban đầu (xem Hình 2.2)

Sau 3 bước của một chu kỳ, số lượng bản sao của đoạn gen được tăng lên 2 lần Như vậy, số lượng bản sao được tạo ra trong phản ứng PCR là hàm mũ cơ số hai của số lượng chu kỳ lặp lại trong phản ứng Thời gian thực hiện PCR là vài giờ, với chương trình tự động hóa nên không tốn công sức Các phản ứng PCR được thực hiện trong những ống nghiệm bằng nhựa nhỏ, trong một dung tích rất nhỏ ở mức µl (microlite) Nhiệt độ trong ống được tự động điều chỉnh ứng với từng bước

trong mỗi chu kỳ bằng một thiết bị gọi là máy điều chỉnh nhiệt theo chu kỳ (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Newton và ctv, 1997)

Sử dụng các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì đơn giản hơn rất nhiều so với kỹ thuật dòng hoá gen (cloning) để nhân bản sao và thu nhận một số lượng lớn đoạn gen mục tiêu Phương pháp này có tính chuyên biệt rất cao Trong hỗn hợp phản ứng chứa nhiều đoạn gen khác nhau, chỉ nhân bản sao của đoạn gen có đoạn mồi chuyên biệt tương ứng Nó có độ nhạy cao và cho phép phát hiện được đoạn gen mục tiêu chỉ hiện diện với số lượng bản sao ban đầu rất nhỏ Phương pháp PCR không đòi hỏi DNA với lượng lớn nên có thể sử dụng trực tiếp DNA mẫu để làm khuôn mà không cần phải nuôi cấy (trường hợp vi sinh vật), do vậy loại trừ ảnh hưởng của vật chủ và môi trường lên đối tượng nghiên cứu Đối với phản ứng PCR, tính vô trùng phải được lưu ý, tránh lẫn tạp nhiều loại DNA khác nhau Hiện nay, các kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử DNA chủ yếu dựa trên kỹ thuật PCR, trong đó gồm có các chỉ thị: ALP, AFLP, SSCP, SSR, RADP, AP - PCR hay ISSR

Hình 2.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR (nguồn: Andy Vierstraete, 1999)

2.3.6 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats)

Microsatellites là các đoạn DNA mang các trình tự ngắn (short DNA sequence motif) được lặp lại nhiều lần Chúng phân bố rộng khắp trong bộ gen của sinh vật nhân chuẩn (eukaryotic) nên rất có giá trị trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt giúp thiết lập các bản đồ di truyền có độ phân giải cao Những chuỗi microsatellites được hình thành từ những sự lặp lại nối tiếp nhau theo những motif

1, 2, 3 hoặc 4 nucleotide Những dạng thường gặp là (AT)n, (GT)n, (TAT)n, (GATA)n, giá trị của n đi từ vài đơn vị đến vài chục (Semagn và ctv, 2006) Kỹ thuật SSR dựa trên sự khuếch đại các trình tự microsatellite bằng các mồi đặc hiệu

có khả năng bổ sung vào hai đầu locus microsatellite Các mồi được thiết kế dựa vào trình tự các vùng có chứa các microsatellite (xem Hình 2.3)

Hình 2.3 Ví dụ về việc phát hiện và thiết kế mồi microsatellites

(Nguồn: Leonardi, 2000)

Theo phương pháp này, các nhà nghiên cứu phải thực hiện một ngân hàng gen và kiểm tra kỹ càng để tìm ra những dòng chứa các motif microsatellite Những dòng này sẽ được xác định thứ tự chuỗi, từ đó những đoạn mồi sẽ được xác định và những điều kiện về khuếch đại và phát hiện sự đa hình sẽ được tiến hành Sản phẩm cuối cùng của phương pháp SSR là các đoạn DNA có kích thước chênh lệch nhau rất nhỏ và chúng được phân tách trên gel polyacrylamide

SSR nằm trong số những chỉ thị mạnh nhất để phát hiện sự đa hình Chúng ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền, định danh, kiểm tra phả hệ và lập bản đồ di truyền trên cây trồng và động vật Chúng là chỉ thị di truyền chuyên biệt locus và đồng trội (co-dominant), cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử và có khả năng lặp lại (Satoni và ctv, 2000) Tuy nhiên, việc xác định những đoạn mồi bọc chuyên biệt là một công việc khá nặng nề đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ thuật cao Hơn nữa kỹ thuật này đòi hỏi chi phí rất cao

và không phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm nhỏ (Gupta và ctv, 1999)

2.3.7 Kỹ thuật ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)

ISSR là một trong các loại chỉ thị microsatellite sử dụng nguyên tắc của RAPD với mồi hình thành từ phần của chuỗi microsatellite và phần bazơ ngẫu nhiên có độ dài khoảng 16 - 25 bp (Reddy và ctv, 2002) Các mồi sử dụng có thể là non-anchored hay còn gọi là MP - PCR (microsatellite primed PCR) (Meyer và ctv, 1993; Gupta và ctv, 1994, ) hoặc là anchored ở vị trí 5’ hoặc 3’ với 1 - 4 base (Zietkiewicz và ctv, 1994) Về nguyên tắc, PCR sẽ khuếch đại những đoạn sườn (nằm kế cận) các motif microsatellite (xem Hình 2.4) Trong những điều kiện khuếch đại phù hợp, kỹ thuật ISSR cho phép sản sinh vài chục sản phẩm có chiều dài trong khoảng 200 - 2000 bp, do đó chúng có thể được điện di trên trên gel agarose hay gel acrylamide (Reddy và ctv, 2002) Sự đa hình được phát hiện chủ yếu thuộc dạng xuất hiện hoặc không xuất hiện như đối với RAPD nhưng đôi khi tương ứng với sự khác nhau trong độ dài các đoạn như đối với microsatellite

Hình 2.4 Kỹ thuật ISSR mồi đơn (AG)8, non-anchored (a), 3’-anchored (b) và

5’-anchored (c) (Nguồn: Reddy và ctv, 2002) Những chỉ thị ISSR được phát hiện rất đa hình ISSR có ưu điểm hơn RAPD

do sử dụng mồi có kích thước dài hơn nên các điều kiện trong giai đoạn annealing

có sự nghiêm ngặt cao, hạn chế được hiện tượng mismatch priming dẫn đến khả năng lặp lại (reproductible) cao hơn RAPD (Zietkiewicz và ctv, 1994; Bornet và Branch, 2001; Reddy và ctv, 2002; Weising và ctv, 2005) Nghiên cứu về khả năng lặp lại của ISSR cho thấy 92 - 95 % các băng DNA được khuếch đại từ cùng mẫu DNA của cùng một giống Những băng mờ nhạt, không rõ mới không có khả năng lặp lại Hơn nữa, kỹ thuật này thực hiện đơn giản, ít tốn thời gian và chi phí không cao so với các chỉ thị phân tử khác (Reddy và ctv, 2002) Các tác giả Bornet và

Branch (2001), Arnau và ctv (2002) khi nghiên cứu sử dụng ISSR trên cây bông cải

và cây dâu tây đều cho biết chỉ thị ISSR có khả năng lặp lại cao và đáng tin cậy

Trong hầu hết trường hợp, ISSR là chỉ thị mang tính trội (dominant) (Gupta

và ctv, 1994; Tsumura và ctv, 1996; Ratnaparkhe và ctv, 1998; Wang và ctv, 1998)

Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nó là chỉ thị đồng trội (co-dominant) có thể

phân biệt được cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử (Akagi và ctv, 1996; Sankar and

Moore, 2000) Hiện nay, kỹ thuật ISSR và các kỹ thuật có nguyên tắc hoạt động

tương tự được sử dụng rộng rãi trên rất nhiều loại cây trồng trong nghiên cứu nhận

diện di truyền, đa dạng di truyền, lập bản đồ genome, xác định gen trong chọn giống

cây trồng và nghiên cứu tiến hoá sinh học với các tên gọi khác nhau (xem Bảng 2.4)

(Reddy và ctv, 2002)

Bảng 2.4 Các cách gọi khác nhau của kỹ thuật ISSR - PCR và kỹ thuật tương tự

1 ISSR, Microsatellite primed PCR (refers to non-anchored mồi) Meyer và ctv, 1993

2 SSR - anchored PCR, Inter - SSR amplification Zietkiewicz và ctv, 1994

3 SPAR (single mồi amplification reaction) Gupta và ctv, 1994

4 RAMPs (random amplified microsatellite

5 RAMs (randomly amplified microsatellites) Hantula và ctv, 1996

6 AMP - PCR (anchored microsatellite primed PCR) Weising và ctv, 1998

7 ASSR (anchored simple sequence repeats) Wang và ctv, 1998

(Nguồn: Reddy và ctv, 2002)

 Các bước thực hiện kỹ thuật ISSR

- Tách DNA hệ gen

- Chạy PCR với DNA hệ gen với mồi đơn là các microsatellite

- Phân tách các đoạn DNA được khuếch đại trên gel agarose

- Nhuộm gel và chụp ảnh

- Phân tích số liệu

 Một phản ứng ISSR chuẩn

- Thành phần hóa chất (cho một phản ứng thể tích 25 µl): Taq DNA

polymerase (1 - 2 unit), PCR buffer, MgCl2, dNTP, mồi (5 µM - 5 pmol/µl), DNA mẫu (5 - 20 ng/µl) và nước cất siêu sạch Tỷ lệ và nồng độ hóa chất của phản ứng PCR thay đổi tùy thuộc mồi sử dụng

- Chương trình nhiệt: chương trình nhiệt được thiết kế tùy thuộc vào các mồi

sử dụng Các mồi giàu GC (25 - 50 % GC) thường sử dụng nhiệt độ ở giai đoạn lai

từ 50 - 58 0C Các mồi giàu TA sử dụng nhiệt độ giai đoạn lai có thể từ 40 - 48 0C Thiết kế các chương trình nhiệt cần lưu ý thời gian chuyển đổi giữa giai đoạn lai và giai đoạn kéo dài thấp nhất là 90 giây (Weising và ctv, 2005)

2.3.8 So sánh giá trị một số loại chỉ thị DNA

Các loại chỉ thị DNA được lựa chọn phù hợp cho một nghiên cứu phụ thuộc vào mức độ đa hình trong loài cây trồng trong những tổ hợp lai đặc biệt (Lefebvre

và ctv, 1995) Những kiểu gen đã được xác định cho các cá thể phân tích phải có thể lặp lại được (reproductible), nếu không nó sẽ không có ý nghĩa di truyền Sự thiếu khả năng lặp lại có nguồn gốc từ sự lấy mẫu, từ việc li trích DNA, những vấn đề kỹ thuật, sự thích nghi của phương pháp tiến hành hoặc các sai sót do con người Một vài dạng chỉ thị mẫn cảm hơn những dạng khác chỉ với một số biến động thí nghiệm nhỏ mà chúng ta khó có thể tránh khỏi (Satoni và ctv, 2000; Bornet và Branchard, 2001) Vì vậy, tùy lĩnh vực nghiên cứu, chi phí và nguyên lí kỹ thuật cũng như tính chuyên biệt của từng loại chỉ thị mà giá trị ứng dụng của chúng khác nhau (xem Bảng 2.5)

Bảng 2.5 So sánh chi phí và lĩnh vực áp dụng của một số loại chỉ thị phân tử

Chỉ tiêu so sánh

Các loại chỉ thị RFLP SSR AFLP ISSR RAPD

Chi phí phân tích (trên 1 locus

đến cao

Trung bình Cấu trúc và sự khác biệt di

2.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN GIỐNG CAO SU

2.4.1 Nghiên cứu về quan hệ di truyền trên cây cao su trong và ngoài nước

Các nghiên cứu về quan hệ di truyền được thực hiện trên các nguồn gen từ quỹ gen cây cao su Nguồn quỹ gen này đã được mở rộng đáng kể sau đợt sưu tập quốc tế năm 1981 của IRRDB tại vùng nguyên quán Amazon nhằm mục đích cải thiện nguồn di truyền vốn hạn hẹp của tập đoàn giống Wickham (W) (Ong and Ramli, 1992; Clement và ctv, 2001) Ngoài các chỉ tiêu sinh học, nông học và hình thái, isozyme và chỉ thị DNA đã được sử dụng nghiên cứu đa dạng và cấu trúc di truyền của quỹ gen phong phú này

Phân tích isozyme cho thấy tập đoàn IRRDB’81 có tới 67 allen thuộc 14 locus đa hình trong khi chỉ có 35 allen thuộc 11 locus đa hình được tìm thấy trong nhóm Wickham (Chevallier, 1988; Clement và ctv, 2001)

Năm 2005, Lại Văn Lâm và ctv đã ứng dụng điện di isozyme trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quỹ gen cây cao su khi khảo sát 12 locus isozyme Kết quả cho thấy trong số 62 allen được phát hiện có tới 60 allen hiện diện trong tập đoàn IRRDB’81trong khi nhóm Wickham chỉ có 26 allen Mặc dù, isozyme cho kết quả phân nhóm di truyền tốt hơn chỉ thị hình thái nhưng giá trị ứng dụng của nó vẫn

bị giới hạn do số lượng locus và allen đa hình không nhiều Chỉ thị DNA đa hình hơn isozyme, có số lượng locus nhiều hơn và phân bố khắp hệ gen nên chúng phản ánh tốt hơn cấu trúc đa dạng di truyền của quần thể nghiên cứu (Tanksley, 1983)

RFLP là loại chỉ thị DNA đầu tiên được vận dụng trong nghiên cứu đa dạng

di truyền quỹ gen cây cao su (Besse, 1993; Besse và ctv, 1994; Seguin và ctv, 1995) RFLP cũng cho một số kết quả thống nhất với isozyme Tuy nhiên, RFLP cho thấy sự cách biệt rõ ràng hơn giữa các nhóm di truyền trong tập đoàn IRRDP’81, trong đó 2 nhóm AC và RO cách biệt nhau chứ không trùng nhau như trường hợp phân tích isozyme Tuy có nhiều tiến bộ hơn isozyme nhưng kỹ thuật RFLP có nhiều mặt hạn chế do tính chất phức tạp, tốn kém và mất nhiều thời gian phân tích (Seguin và ctv, 1995)

Trong khi đó, microsatellite được coi là loại chỉ thị DNA có giá trị trong phân tích đa dạng di truyền cây cao su Chúng rất đa hình và phân bố khắp hệ gen với số lượng allen trên mỗi locus nhiều nhất trong các loại chỉ thị di truyền (Seguin

và ctv, 2001) Ngoài ra, microsatellite mang ưu điểm đơn giản và kinh tế của công nghệ PCR Lekawipat và ctv (2003) sử dụng 12 microsatellite để khảo sát đa dạng

di truyền của 40 kiểu di truyền Wickham và 68 phân nhóm của tập đoàn IRRDB’81 Kết quả phân tích cũng xác nhận: tập đoàn IRRDB’81 đa dạng hơn Wickham và được chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào vị trí địa lí của nơi sưu tập Ngoài ra,

đa hình theo microsatellite cũng được phát hiện trong nhóm Wickham mặc dù nhóm này được xem là có vốn di truyền rất hạn hẹp Kết quả nghiên cứu này chứng minh rằng chỉ sử dụng một số lượng nhỏ micosatllite cũng đủ cho việc đánh giá chính xác cấu trúc di truyền của quỹ gen cây cao su

Chỉ thị ISSR và RAPD cũng đã được Zewei và ctv (2005) sử dụng nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 14 kiểu di truyền cao su hoang dại và 37 dvt thương mại Kết quả cho thấy hai chỉ thị này đều cho tỉ lệ băng đa hình tương đương và có giá trị trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây cao su

Năm 2007, Kitijuntaropas và Wansomnuk đã sử dụng 20 chỉ thị ISSR để

nghiên cứu biến lượng di truyền các giống cao su loài Hevea brasiliensis và đưa ra

kết luận: việc sử dụng chỉ thị ISSR trong nghiên cứu biến lượng di truyền cao su cho đa hình rất cao

Năm 2008, tại Thái Lan, Nakkanong và ctv đã sử dụng chỉ thị RAPD và microsatellite để nhận diện và đánh giá biến lượng di truyền của 50 dvt có nguồn gốc nguyên sơ (trên 50 năm tuổi), được sưu tập từ các vùng địa lí khác nhau Cũng với nghiên cứu này, mối quan hệ di truyền giữa 50 dvt có nguồn gốc nguyên sơ và

30 dvt thương mại cũng đã được đánh giá: các dvt nguyên sơ có sự đa dạng di truyền rộng hơn các dvt sản xuất

Chỉ thị RAPD cũng được Viện Nghiên cứu cao su Việt Nam sử dụng nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quỹ gen cây cao su Kết quả cho thấy nguồn gen Amazon cho tính đa dạng di truyền truyền cao Trong khi nguồn gen Wickham lại

hạn hẹp (Lâm và ctv, 2007) Năm 2009, chỉ thị RAPD cũng được Lại Văn Lâm và ctv ứng dụng nghiên cứu biến lượng di truyền nguồn gen Amazon và con lai cây cao su Wickham x Amazon Nghiên cứu này cũng cho kết quả tương tự nghiên cứu trước, trong đó, nhóm Wickham có tính đa dạng di truyền hạn hẹp và có quan hệ di truyền gần gủi với nhóm Amazone xuất xứ từ bang Mato Grosso (MT) Năm 2010, Lại Văn Lâm và ctv đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 8 đoạn mồi ngẫu nhiên được dùng để đánh giá biến lượng di truyền trong quần thể cây cao su lai có kiểm soát giữa dòng PB 260 (Wickham) và 5 dòng Amazon Tám primer khuếch đại được 101 đoạn DNA có kích thước 180 - 2300 bp từ 147 con lai và 6 dòng bố mẹ Phân tích biến lượng phân tử đã chỉ ra rằng: 62 % biến lượng di truyền là do sự khác biệt giữa

cá thể trong tổ hợp còn sự khác biệt tổ hợp lai có đóng góp 38 % Phân nhóm dựa trên hệ số đồng dạng di truyền đã chia quần thể con lai thành 4 nhóm và sự phân bố của con lai trong các nhóm không phụ thuộc vào tổ hợp Nghiên cứu này cho thấy biến lượng di truyền trong quần thể cây cao su lai Wickham x Amazon là khá rộng,

dù là lai tạo có định hướng, và có thể được cải thiện bằng cách lai tạo giữa các bố

2.4.2 Nghiên cứu nhận diện giống cao su ngoài nước

2.4.2.1 Nghiên cứu nhận diện giống cao su bằng chỉ thị hình thái

Kể từ khi kỹ thuật ghép mắt được áp dụng thành công trên cây cao su cho tới nay, phần lớn các vườn cao su được trồng bằng cây ghép Do hệ số nhân giống của phương pháp ghép mắt cao nên việc định danh giống trong vườn nhân được đặc biệt quan tâm, nhằm giảm thiểu tác hại về kinh tế cho vườn cây do các sai sót về giống gây ra Các phương pháp nhận diện giống cao su bằng các chỉ thị hình thái đã được xây dựng ở nhiều nước trồng cao su

Sự kiện các giống được nhân dòng vô tính được đưa vào sản xuất những năm thập niên 1900 đã mở đầu cho việc sử dụng chỉ thị hình thái trong nhận diện giống cao su Năm 1915, Sprecher đã nhận diện các cây cao su trưởng thành dựa vào đặc điểm của các mẫu hạt được sưu tập Giai đoạn 1931 - 1933, nhận diện giống cao su dựa vào đặc tính của những cây ghép còn nhỏ, phản ứng màu sắc của mủ cao su hay đặc điểm của vỏ cây cao su bốn năm tuổi Năm 1951, Dijkman dựa trên việc mô tả đặc điểm của lá, thân và tầng lá để nhận diện 14 dvt cao su thương mại Năm 1961, Viện nghiên cứu cao su Srilanka (IRCA) lần đầu tiên đưa ra 19 chỉ tiêu một cách hệ thống để mô tả đặc tính của cành giống trên vườn nhân gỗ ghép và vẫn sử dụng các hình vẽ để mô tả hình dạng toàn cây, cành, tán Hình dạng hạt được mô tả qua các ảnh chụp thực tế Viện nghiên cứu cao su Malaysia (RRIM) cũng đã đưa ra những thông tin về đặc điểm hình thái các giống mới khi khuyến cáo trồng đại trà CIRAD (Pháp) cũng đưa ra các hình ảnh về đặc điểm hình thái các giống để hướng dẫn nông dân tiểu điền phân biệt giống (Trích dẫn bởi Mercycutty và ctv, 2002) Năm

2002, Viện nghiên cứu cao su Ấn Độ (RRII) cũng đã sử dụng hệ thống các đặc điểm hình thái để nhận diện các giống cao su ở cả giai đoạn cây con và cây trưởng thành (Mercycutty và ctv, 2002)

Cho đến nay, phương pháp nhận diện giống dựa trên chỉ thị hình thái vẫn còn được áp dụng phổ biến và có độ tin cậy Tuy nhiên, phương pháp này phụ thuộc rất lớn vào kỹ năng của các kỹ thuật viên lành nghề cũng như các chỉ thị hình thái chịu ảnh hưởng rất lớn của các tác động môi trường

2.4.2.2 Nghiên cứu nhận diện giống cao su bằng chỉ thị isozyme

Các chỉ thị sinh hóa, đặc biệt là chỉ thị isozyme, đã được nghiên cứu và sử dụng để nhận diện giống ở rất nhiều loài cây trồng khác nhau Dựa trên sự biến thiên di truyền của nguồn gen được thể hiện thông qua biến thiên isozyme, kỹ thuật điện di isozyme cho phép thiết lập những dấu ấn di truyền thực sự ở mức độ enzyme Các izozyme là sản phẩm của gen nên không chịu tác động của môi trường Kỹ thuật điện di isozyme cũng đã được xây dựng để nhận diện giống cao su

Kỹ thuật isozyme cho phép nhận biết một cách hiệu quả những dòng đã được mô tả

và xắp xếp vào trong cơ sở dữ liệu chuẩn dùng trong nhận diện giống cao su Ngày nay, cơ sở dữ liệu này, bao gồm dạng mã hóa trên cơ sở 12 isozyme của 254 KDT chọn lọc (114 KDT Wickham, 81 KDT IRCA và 59 KDT Nam Mỹ), đã được thực hiện CIRAD đã đơn giản hóa kỹ thuật này bằng cách phát triển bộ điện di xách tay

sử dụng 13 hệ thống enzyme và chuyển giao cho các nước trồng cao su (Leconte ctv, 1997) Bộ môn cây dài ngày của CIRAD sử dụng kỹ thuật này hàng ngày để kiểm soát sự chuẩn xác của giống trong các vườn gỗ ghép, trước khi nhân giống vô

tính bằng nuôi cấy in - vitro và đối với việc kiểm tra sự chính thống của các con lai

tạo ra trong các phép lai chọn lọc có kiểm soát Và phương pháp này được sử dụng phổ biến tại các nước trồng cao su từ những cuối năm thập niên 1980 (Venkatachalam và ctv, 2007) Tuy nhiên, do còn nhiều hạn chế nên những năm đầu thế kỉ 21, kỹ thuật này ít được sử dụng