KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LOẠI BỎ LINDANE BẰNG HÓA HỌC VÀ VI SINH VẬT TỰ NHIÊN

Nội dung đề tài bao gồm xác định hàm lượng lindane trong mẫu bùn, đất bằng phương pháp sắc ký khí, đánh giá tổng số vi sinh vật hiện diện trong mẫu bùn, đất bằng phương pháp nuôi cấy tru

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*************************

ĐOÀN BÌNH MINH

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LOẠI BỎ LINDANE BẰNG

HÓA HỌC VÀ VI SINH VẬT TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*************************

ĐOÀN BÌNH MINH

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LOẠI BỎ LINDANE BẰNG

HÓA HỌC VÀ VI SINH VẬT TỰ NHIÊN

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LOẠI BỎ LINDANE BẰNG HÓA HỌC VÀ VI SINH VẬT TỰ NHIÊN

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

3 Phản biện 1: TS LÊ QUỐC TUẤN

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

4 Phản biện 2: TS LÊ QUANG LUÂN

TRUNG TÂM HẠT NHÂN TP.HCM

5 Ủy viên: PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

Từ 2007 - 2008 làm việc tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

Từ 2009 đến nay học cao học tại trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Tình trạng gia đình: Độc thân

Địa chỉ liên lạc: 998 Quốc Lộ 1A, P Linh Trung, Q Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh

Điện thoại: 0919.848.148

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

LỜI CẢM TẠ

Con cảm ơn ba mẹ đã sinh ra và nuôi con ăn học đến ngày hôm nay

Tôi chân thành cảm ơn đến Quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập

Đặc biệt, gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Lê Đình Đôn đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Cảm ơn Cô Phùng Võ Cẩm Hồng, Cô Hoa và các bạn ở Viện CNSH và MT trường ĐH Nông Lâm Tp HCM đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn Thầy Cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Phòng Sau đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành chương trình học

Cảm ơn em người luôn giúp đỡ anh, bạn Quân, Minh Anh và các anh chị em trong lớp Cao học CNSH 2008 đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Chào trân trọng

Tác giả

Đoàn Bình Minh

TÓM TẮT

Đề tài "Khảo sát khả năng loại bỏ lindane bằng phương pháp hóa học và vi sinh vật tự nhiên" được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Đề tài thực hiện với mục tiêu xác định phương pháp tối ưu để phân hủy lindane có trong đất và bùn Nội dung đề tài bao gồm xác định hàm lượng lindane trong mẫu bùn, đất bằng phương pháp sắc ký khí, đánh giá tổng số vi sinh vật hiện diện trong mẫu bùn, đất bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống và khảo sát khả năng phân hủy lindane bằng phương pháp hóa học, vi sinh vật, hóa học kết hợp với vi sinh vật ở điều kiện kỵ khí và hiếu khí trong phòng thí nghiệm

Kết quả cho thấy vi sinh vật trong đất (hiệu suất phân hủy lindane của nhóm vi sinh vật hiếu khí khoảng 5,33% và nhóm kỵ khí khoảng 1,33%) và bùn (hiệu suất phân hủy lindane của nhóm vi sinh vật hiếu khí khoảng 5,33% và nhóm kỵ khí khoảng 25,67%) đều có khả năng phân hủy lindane, ngoại trừ vi sinh vật kỵ khí trong đất không có khả năng phân hủy lindane Trong đất, hiệu quả phân hủy lindane của nhóm

vi sinh vật hiếu khí tốt hơn nhóm kỵ khí, trong bùn nhóm kỵ khí phân hủy lindane tốt hơn nhóm hiếu khí Hiệu quả phân hủy lindane của phương pháp hóa học (FeS2 và Fe0) đạt 12,67 – 63,67%, trong đó Fe0 (hiệu quả phân hủy lindane trong đất khoảng 52,67%

và bùn khoảng 63,67%) phân hủy lindane tốt hơn FeS2 (hiệu quả phân hủy lindane trong đất khoảng 12,67% và bùn khoảng 14,33%) cả trong đất và bùn Hiệu quả phân hủy lindane của phương pháp hóa học kết hợp với vi sinh vật (FeS2 kết hợp với nhóm

vi sinh vật hiếu khí và Fe0 kết hợp với nhóm kỵ khí) đạt 15,67 – 67,33%, FeS2 kết hợp với nhóm vi sinh vật hiếu khí (hiệu quả phân hủy lindane trong đất khoảng 15,67% và bùn khoảng 38,33%) phân hủy lindane thấp hơn Fe0 kết hợp với nhóm vi sinh kỵ khí (hiệu quả phân hủy lindane trong đất khoảng 57,00% và bùn khoảng 67,33%)

Trong ba phương pháp phân hủy lindane bằng hóa học, vi sinh vật, hóa học kết hợp với vi sinh vật đã được sử dụng thì phương pháp hóa học kết hợp với vi sinh vật cho kết quả phân hủy lindane hiệu quả nhất Trong đó, Fe0 kết hợp với nhóm vi sinh vật kỵ khí là cách tối ưu nhất để phân hủy lindane trong đất, bùn

ABSTRACT

Studying “Survey capable of removing lindane by chemical and natural microorganism” was performed in Research Institute for Biotechnology and Environment, Nong Lam University This is a study to find optimal methods to decompose lindane in soil and sediment Content studying include determine the amount

of lindane in the sediment, soil samples by gas chromatographic methods, estimating the total number of microorganisms present in the sediment, soil samples using traditional culture methods and survey capable degradation of lindane by three methods: method of chemical, microorganisms, microorganisms combined with chemical in anaerobic conditions and aerobic laboratory

Results showed that microorganisms in soil (lindane degradation efficiency of aerobic microorganisms groups about 5,33% and anaerobic groups about 1,33%) and sediment (lindane degradation efficiency of aerobic microorganisms groups about 5.33% and anaerobic groups about 25,67%) are degradable lindane, except anaerobic microorganisms in soil are not degradation lindane In soil, lindane degradation efficiency

of aerobic microorganisms groups better group of anaerobic and in sediment, the group of anaerobic decompose lindane better group of aerobic Lindane degradation efficiency in the method of chemical (FeS2 and Fe0) about 12,67 – 63,67%, which Fe0 (lindane degradation efficiency in soil about 52,67%, in sediment about 63,67%) decompose lindane better than FeS2 (lindane degradation efficiency in soil about 12,67%, in sediment about 14,33%) both in soil and sediment Lindane degradation efficiency in method of chemical combined with microorganisms (FeS2 combined with group of aerobic and Fe0

combined with group of anaerobic) about 15,67 – 67,33%, FeS2 combined with group of aerobic (lindane degradation efficiency in soil about 15,67%, in sediment about 38,33%) decompose lindane weaker than Fe0 combined with group of anaerobic (lindane degradation efficiency in soil about 57,00%, in sediment about 67,33%)

In three methods decompose lindane by chemical, microorganism, chemical combination with microorganisms have been used, method of chemical combined with microorganism decompose lindane is most effective In particular, Fe0 combined with anaerobic microorganisms is the best way to remove lindane in soil, sediment

MỤC LỤC

Trang tựa i

Trang chuẩn y ii

Lý lịch cá nhân iii

Lời cam đoan iv

Cảm tạ v

Tóm tắt vi

Abstract vii

Mục lục viii

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các hình x

Danh sách các bảng xi

Chương 1 Mở Đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và mục đích đề tài 2

1.3 Nội dung và đối tượng nghiên cứu 2

Chương 2 Tổng quan 3

2.1 Thông tin về lindane 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Tính chất hóa học và vật lý của lindane và các đồng phân HCH khác 4

2.1.3 Tình hình sử dụng lindane 5

2.1.4 Lindane và các đồng phân khác trong môi trường 5

2.1.5 Tác hại của lindane 8

2.2 Phương pháp phân hủy 9

2.2.1 Phân hủy sinh học 9

2.2.1.1 Phân hủy sinh học kỵ khí 10

2.2.1.2 Phân hủy sinh học hiếu khí 11

2.2.2 Phân hủy hóa học 13

2.3 Thông tin về lindane ở Việt Nam 14

Chương 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 15

3.1 Nội dung nghiên cứu 15

3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 15

3.3.1 Các bước để xác định hàm lượng lindane 16

3.3.2 Đánh giá mật số vi sinh vật hiện diện trong bùn, đất 17

3.3.3 Khảo sát khả năng loại bỏ lindane bằng phương pháp hóa học, vi sinh vật 18

3.3.4 Phương pháp đánh giá kết quả 21

Chương 4 Kết quả và thảo luận 22

4.1 Đặc điểm mẫu đất, bùn trước khi tiến hành thí nghiệm 22

4.1.1 Kết quả kiểm tra hàm lượng lindane trước thí nghiệm 22

4.1.2 Kết quả kiểm tra vi sinh trước thí nghiệm 24

4.2 Kết quả kiểm tra hàm lượng lindane ở ngày bắt đầu và kết thúc thí nghiệm 26

4.2.1 Hàm lượng lindane trong đất ở ngày bắt đầu và kết thúc thí nghiệm 26

4.2.2 Hàm lượng lindane trong bùn ở ngày bắt đầu và kết thúc thí nghiệm 27

4.3 Kết quả kiểm tra vi sinh sau thí nghiệm 28

4.4 Kết quả phân hủy lindane sau thí nghiệm 31

4.5 Hiệu quả phân hủy lindane 33

4.5.1 Đánh giá kết quả thí nghiệm loại bỏ lindane bằng phương pháp hóa học 35

4.5.2 Đánh giá kết quả thí nghiệm loại bỏ lindane bằng phương pháp vi sinh vật 36

4.5.3 Đánh giá kết quả thí nghiệm loại bỏ lidane bằng hóa học kết hợp vi sinh vật 38

4.5.4 Đánh giá kết quả thí nghiệm so sánh hiệu quả phân hủy lidane của phương pháp vi sinh vật, hóa học và hóa học kết hợp với vi sinh vật 40

4.6 Thảo luận chung 42

Chương 5 Kết luận và đề nghị 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

Tài liệu tham khảo 45

Phụ lục 51

PCA: Plate Count Agar

PSS: Peptone Saline Solution

PW: Peptone water

Tb: Trung bình

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

YEA: Yeast Extract Agar

LLL: Lần lặp lại

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc các đồng phần α-, β-, γ-, δ-HCH 3

Hình 2.2 Ô nhiễm lindane do nhiều nguyên nhân và quá trình biến đổi khác nhau trong môi trường 6

Hình 2.3 Con đường phân hủy kỵ khí HCH 10

Hình 2.4 Con đường thủy phân hiếu khí γ-HCH bởi Sphingomonas paucimobilis UT26 12

Hình 2.5 Cơ chế loại bỏ lindane bằng hóa học 13

Hình 2.6 Cơ chế loại bỏ clo trong lindane của sắt 13

Hình 2.7 Ba cơ chế khử lindane đơn giản của sắt 14

Hình 4.1 Vi sinh hiện diện trong mẫu trước khi thí nghiệm 24

Hình 4.2 Vi sinh vật hiện diện trong mẫu sau thí nghiệm 28

Hình 4.3 Hiệu quả phân hủy lindane ở mẫu đất sau thí nghiệm 34

Hình 4.4 Hiệu quả phân hủy lindane ở mẫu bùn sau thí nghiệm 34

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tính chất hóa học và vật lý của lindane và các đồng phân HCH 4

Bảng 2.2 Những ảnh hưởng của độc tố lindane lên sinh vật 9

Bảng 2.3 Danh sách vi sinh vật phân hủy HCH 9

Bảng 4.1 Nồng độ lindane trong mẫu bùn, đất trước thí nghiệm 22

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát dư lượng thuốc trừ sâu 23

Bảng 4.3 Tổng số nấm men nấm mốc, vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí trước thí nghiệm 25

Bảng 4.4 Nồng độ lindane trung bình của các phương pháp xử lý ở mẫu đất 26

Bảng 4.5 Nồng độ lindane trung bình của các phương pháp xử lý ở mẫu bùn 27

Bảng 4.6 Tổng số nấm men nấm mốc, vi khuẩn kỵ khí, hiếu khí trong mẫu đất sau thí nghiệm 29

Bảng 4.7 Tổng số nấm men nấm mốc, vi khuẩn kỵ khí, hiếu khí trong mẫu bùn sau thí nghiệm 30

Bảng 4.8 Kết quả phân hủy lindane trung bình của các phương pháp xử lý ở mẫu đất 31

Bảng 4.9 Kết quả phân hủy lindane trung bình của các phương pháp xử lý ở mẫu bùn 32 Bảng 4.10 So sánh hiệu quả phân hủy lindane trong mẫu đất giữa điều kiện kỵ khí và hiếu khí sau thí nghiệm 33

Bảng 4.11 So sánh hiệu quả phân hủy lindane trong mẫu bùn giữa điều kiện kỵ khí và hiếu khí sau thí nghiệm 33 

Bảng 4.12 So sánh hiệu quả phân hủy lindane trong mẫu đất của phương pháp hóa học 35

Bảng 4.13 So sánh hiệu quả phân hủy lindane trong mẫu bùn của phương pháp hóa học 36

Bảng 4.14 So sánh hiệu quả phân hủy lindane trong mẫu đất của phương pháp vi sinh vật 37

Bảng 4.15 So sánh hiệu quả phân hủy lindane trong mẫu bùn của phương pháp vi sinh vật 38

Bảng 4.16 So sánh hiệu quả phân hủy lindane trong mẫu đất của phương pháp hóa học kết hợp với vi sinh vật 39

Bảng 4.17 So sánh hiệu quả phân hủy lindane trong mẫu bùn của phương pháp hóa

ra các ảnh hưởng cấp tính đến sức khỏe như phỏng do hóa chất, buồn nôn, hay co giật (Smith, 1991)

Một khi thuốc trừ sâu được sử dụng, sự tồn tại của nó là không kiểm soát được nữa Tùy thuộc vào lọai thuốc và điều kiện môi trường như oxy, ánh sáng mặt trời, gió, nhiệt độ, độ ẩm, họat tính của đất, lọai đất Thuốc trừ sâu được phát tán đi rất xa nơi

nó được sử dụng bởi gió, hơi nước, nước mưa, nước ngầm, suối và sông, và trong các

mô cơ thể người và động vật Sau khi sử dụng, thuốc trừ sâu thường bị biến đổi thành một hoặc nhiều chất chuyển hóa mà các chất này có thể có tính chất hóa học và độc tính khác với hợp chất ban đầu Trong nhiều trường hợp, các chất chuyển hóa bền vững và độc hơn lọai thuốc trừ sâu sử dụng ban đầu (Takeoka và ctv, 1991)

Trước những năm 1940 phần lớn thuốc trừ sâu là các hợp chất của arsen, thủy ngân, đồng hoặc chì Các hợp chất của arsen, thủy ngân, đồng hoặc chì không dễ tan trong nước và tồn tại trong thực phẩm mới là mối quan tâm xa hơn Thuốc trừ sâu hữu

cơ tổng hợp được giới thiệu trong Thế chiến thứ II và đã bị nhận định nhầm lẫn cả về khía cạnh an toàn và tính hiệu quả trong phòng và trị bệnh cho cây trồng Thuốc trừ sâu thuộc nhóm này bao gồm các hydrocarbon có chứa clo như DDT, aldrin, dieldrin, chlordane, heptachlor, lindane, dendrin, và toxaphene Do đặc tính khó tan trong nước

và có khuynh hướng gắn kết với các hạt đất theo con đường hóa học, các hợp chất trên hiếm khi thâm nhập vào nước ngầm nhưng thường xuyên được phát hiện làm ô nhiễm nguồn nước mặt Hiện nay, các loại thuốc trừ sâu gốc clo được người nông dân sử dụng rất nhiều trong việc phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng và việc kiểm soát gặp nhiều khó khăn, hơn nữa các loại thuốc trừ sâu gốc clo đặc biệt là DDT, lindane … rất độc hại cho người và động vật, phân hủy rất chậm và tích tụ lâu dài trong môi trường,

do đó làm ô nhiễm đất trong một thời gian dài (Mertens, 2006)

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Khảo sát khả năng loại bỏ lindane

bằng hóa học và vi sinh vật tự nhiên” được thực hiện

Tìm ra phương pháp tối ưu để loại bỏ lindane trong đất, bùn

1.3 Nội dung và đối tượng nghiên cứu

1.3.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định hàm lượng lindane trong mẫu bùn, đất bằng kỹ thuật sắc

ký khí

Nội dung 2: Đánh giá tổng số vi sinh vật hiện diện trong mẫu bùn, đất bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống

Nội dung 3: Khảo sát khả năng loại bỏ lindane bằng các phương pháp hóa học,

vi sinh vật, hóa học kết hợp với vi sinh vật

1.3.2 Đối tượng nghiên cứu

Lindane

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Một số thông tin về lindane

2.1.1 Nguồn gốc lindane

Lindane chính là đồng phân γ hexachlorocyclohexane, còn gọi là γ-HCH Chất hóa học γ-HCH được tổng hợp lần đầu vào 1825 nhưng đến 1940 mới được sử dụng khi nhà khoa học Hà Lan Teunis van der Linden khám phá ra đặc tính trừ sâu của nó (Hardie, 1964)

Sản phẩm thương mại lindane được bắt đầu sử dụng vào 1945 Thuốc trừ sâu được tổng hợp bằng clo hóa benzene dưới tia cực tím (IARC, 1973) Trên thực tế, kết quả quá trình này tạo ra HCH tổng hợp, là một hỗn hợp có các đồng phân HCH khác nhau như α-HCH (60 - 70%), β-HCH (5 - 12%), γ-HCH (10 - 15%) và δ-HCH (6-10%) Những đồng phân khác nhau ở vị trí nguyên tử clo (Kutz và ctv, 1991)

Lindane thương mại (>99% γ-HCH) được tinh sạch từ HCH tổng hợp bằng cách chiết xuất phức tạp với methanol Mặc dù γ-HCH là đồng phân duy nhất có đặc tính trừ sâu nhưng HCH tổng hợp thường được ứng dụng như là một thuốc trừ sâu từ quá trình tinh sạch nhằm giảm chi phí sản xuất γ-HCH

Hình 2.1 Cấu trúc các đồng phần α-, β-, γ-, δ-HCH (Mertens và ctv, 2006)

Do có nhiều ứng dụng trong phòng trừ sâu hại nên từ thập niên 50, lindane tổng

hợp đã được thương mại hóa dưới những tên sản phẩm khác nhau như lindaterra, lindagranox, lovigram, gallogama, lintox, BoreKil, Kwell và Ben-Hex Thuốc trừ sâu được sử dụng cho cây trồng và trong bảo quản nông sản như là phương pháp thông dụng để kiểm soát sâu bọ ký sinh

Lindane cũng thường được sử dụng trong gia đình như nhúng, xịt và rắc lên thú

nuôi và vật cưng trong gia đình Ngành lâm nghiệp cũng sử dụng lindane để kiểm soát

sâu bọ trên những khúc gỗ mới đốn hạ (Donald và ctv, 1997) Các ứng dụng khác của

lindane bao gồm mỹ phẩm lỏng dùng cho da, kem và dầu gội đầu để kiểm soát chí và

ghẻ ở người (Bintein và Devillers, 1996)

2.1.2 Tính chất hóa học, vật lý của lindane và các đồng phân HCH khác

Bảng 2.1 Tính chất hóa học, vật lý của lindane và các đồng phân HCH

(atm m 3 /mol)

1.4*10 -5 1.06*10 -5 7.43*10 -5 2.1*10 -5

(Nguồn: Mertens và ctv, 2006)

Mặc dù các đồng phân HCH chỉ khác nhau ở vị trí nguyên tử clo, tuy nhiên sự

khác biệt giữa các đồng phân tương đối lớn khi xét về những đặc tính vật lý và hóa học Tuy nhiên, đây không phải là danh sách toàn diện Do đó tài liệu, số liệu về nồng

độ và sự tồn tại của HCH trong các loại môi trường khác nhau vẫn còn đang tranh cãi

Điều này rất có thể do những khoảng nồng độ khác nhau đã được tìm thấy và những tương tác phức tạp của các đồng phân HCH

2.1.3 Tình hình sử dụng lindane

Lượng lindane và HCH tổng hợp sử dụng trên toàn cầu được ước lượng lên đến 720.000 tấn/năm Li đã điều chỉnh số lượng HCH tổng hợp 1999 không ít hơn 11.000.000 tấn/năm (Li, 1999)

Sự quan tâm ngày càng tăng lên về tác động có hại đến sức khỏe và những ảnh hưởng đến môi trường của lindane, do đó lindane bị cấm hoặc hạn chế sử dụng ở một

số nước Hầu hết các nước phương tây bắt đầu hạn chế từ những năm 1970 Vào những năm 1980 một số nước phát triển cũng hạn chế sử dụng lindane và giảm sản xuất trên toàn cầu (Bintein và Devillers, 1996)

Trung Quốc cấm sử dụng lindane lần đầu tiên vào 1983 và tiếp đến Liên Xô cũ cũng cấm sử dụng lindane, sau đó ở Ấn Độ dừng sử dụng lindane cho cây trồng nông nghiệp Năm 2003 có lệnh cấm và hạn chế sử dụng HCH ở 34 nước, hơn nữa HCH tổng hợp là chất nhập khẩu không hợp pháp ở 98 nước Lindane bị cấm và hạn chế sử dụng ở 40 nước và nhập khẩu không hợp pháp ở 65 nước nhưng được miễn thuế khi sử dụng cho trường hợp đặc biệt (Orme và Kegley, 2006)

Năm 2005, UNEP (United Nations Environmental Programme - Chương trình môi trường liên hợp quốc) đã quyết định hoạt động toàn cầu là phải ngăn chặn sự ô nhiễm gây ra trên toàn thế giới do lindane và đặt lindane ở Phụ lục A của Công ước Stockholm về các chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy, còn được gọi là “danh sách đen” trong đó gồm những hóa chất có thể loại bỏ hoàn toàn (Hanson, 2005)

2.1.4 Lindane và các đồng phân khác trong môi trường

Như là hậu quả tất yếu của việc sử dụng lindane và HCH tổng hợp qua một thời gian dài, lindane và những đồng phân của lindane đã phân bố rộng rãi trong nhiều môi trường khác nhau, các quá trình vận chuyển và biến đổi trong môi trường cũng góp phần gây ô nhiễm

Hình 2.2 Ô nhiễm lindane do nhiều nguyên nhân và quá trình biến đổi khác nhau

trong môi trường (Mertens, 2006)

2.1.4.1 HCH trong không khí

Những nguồn đồng phân HCH chính trong không khí là do những hạt bụi phù

du do gió thổi từ đất bị ô nhiễm, bay hơi từ đất nông nghiệp bị phân hủy với lindane và

từ lá cây đã được xịt lindane Thêm vào đó, HCH có thể bay vào không khí trong suốt quá trình sản xuất Sự thoái biến bởi phản ứng quang phân tạo ra gốc hydroxyl là quá trình quan trọng để loại bỏ lindane và HCH khác từ không khí (Unsworth và ctv, 1999) HCH cũng có thể bị loại bỏ khỏi không khí bởi trời mưa do lắng đọng ướt và lắng đọng khô HCH có thể duy trì trong không khí trong một thời gian dài và di chuyển tạo ra mật độ phụ thuộc vào điều kiện môi trường (Atkins và Eggleton, 1971)

Trong không khí, thời gian HCH tồn tại từ 2 đến 4 tháng (Brown, 1978) Thời gian tồn tại kéo dài có thể gây ra sự phát tán rộng HCH Ví dụ, sự bay hơi lindane sau khi sử dụng ở những nước nhiệt đới và cận nhiệt đới và sự khuyếch tán kéo theo bởi không khí và lắng đọng HCH ở tận Bắc Cực (Takeoka và ctv, 1991) Phần lớn γ và α-HCH được tìm thấy trong không khí, mặc dù dễ bay hơi hơn β và δ-HCH Nồng độ trung bình trong không khí của γ-HCH trên toàn cầu là 589 pg/m3, α-HCH là 1.021 pg/m3 được báo cáo bởi Walker và ctv (1999) trong một bài tóm tắt của một vài nghiên

Thủy phân

quang hóa

Lắng tụ khô

Thủy phân trong cây Lắng tụ ướt

ứng dụng

Đổ vào

Bay hơi

Hút bám Hòa tan

Hấp thụ bởi thực vật và động

Chuyển đổi hóa học Chuyển đổi vi sinh vật

Ngấm Nước ngầm

Chuyển động mao quản

Nước bề mặt Thấm

cứu từ 1980 – 1996 Nồng độ đỉnh cao đến 10.000 pg/m3 được phát hiện ở vịnh Bengal

và biển Arbian (Cotham và Bidleman, 1991)

2.1.4.2 HCH trong nước

Từ tính chất vật lý ta thấy rõ ràng HCH hòa tan trong nước tương đối, ít hơn nhiều so với các hợp chất hữu cơ khác (các chất DDT, aldrin, endrin, dieldrin, endosulfan có tính tan < 1mg/l) Suốt quá trình lắng tụ HCH có thể đi tới mạch nước ngầm và làm ô nhiễm bề mặt nước do dòng chảy và sự lắng tụ không khí Tính tan thấp của β-HCH và hằng số hút ẩm bề mặt cao của δ-HCH do đó thường phát hiện γ

và α-HCH trong nước Quá trình thủy phân sinh học γ và α-HCH trong hệ thống nước được xem là quá trình chủ yếu trong cơ chế loại bỏ HCH trong nước Ước lượng chu

kỳ bán rã của HCH trong sông, hồ và mạch nước ngầm là 3-30 ngày, 30-300 ngày và lớn hơn 300 ngày (Zoetemann và ctv, 1980), khoảng nồng độ từ 0,2-400 ng/l và từ 0,4-

100 ng/l (Gregor và Gummer, 1989; WHO, 2005)

2.1.4.3 HCH trong bùn

HCH có thể hút bám lên bùn hoặc những vật liệu huyền phù khác mà đã được chứng minh bởi những giá trị Kow tương đối cao Tốc độ hút bám và tách rời của HCH đối với bùn thì liên quan đến đặc tính vật lý của bùn cũng như hàm lượng carbon hữu

cơ của chúng Theo số liệu USEPA mẫu bùn được thu thập khắp nơi ở Mỹ từ 1978 –

1987, γ-HCH được phát hiện 0,5% của khoảng 600 mẫu bùn với nồng độ trung bình 2,0 µg/kg (Staples và ctv, 1985; Kuntz và Warry, 1983) Thời gian bán rã của lindane trong bùn khoảng 90 ngày (Bintein và Devillers, 1996) Những đồng phân HCH khác cũng thường xuyên được tìm thấy trong những mẫu bùn (Hazdat, 2005)

2.1.4.4 HCH trong đất

Lindane và những đồng phân HCH khác đi vào đất do việc sử dụng thuốc trừ sâu, vứt bỏ rác thải ô nhiễm hoặc lắng đọng khô hay ướt từ không khí Khi ở trong đất, HCH hút bám vào các phân tử đất, bốc hơi lên không khí, hấp thụ bởi cây trồng hoặc lắng xuống mạch nước ngầm HCH hút bám mạnh đối với chất hữu cơ, do đó tương đối bất động trong đất Tuy nhiên, trong đất đặc biệt chứa ít chất hữu cơ hoặc chịu lượng mưa lớn, lindane và những đồng phân HCH khác có thể gây ra nguy cơ ô nhiễm mạch nước ngầm (Wauchope và ctv, 1992) Mặc dù thủy phân HCH bằng cả hiếu khí

và kị khí đã được báo cáo, nhưng HCH vẫn hiện diện cao trong hầu hết các loại đất

Tùy thuộc vào điều kiện, thời gian bán rã ngoài đồng có thể vài ngày hoặc lên đến 3 năm Nồng độ của các đồng phân HCH khác nhau thay đổi từ hàm lượng rất nhỏ (< 0,1 mg/kg) (Albright và ctv, 1974) đến < 1,0 g/kg (WHO, 2005)

Ngoài nguồn ô nhiễm khuếch tán do sử dụng lindane, một vấn đề lớn là do những nguồn đặc biệt từ những kho dự trữ lindane chưa sử dụng ở khắp thế giới Hơn nữa, khi sản xuất 1 tấn lindane có 8 – 12 tấn HCH thặng dư (những đồng phân) Vijgen đã thừa nhận rằng 1 triệu tấn HCH thải ra này vẫn được tìm thấy ở khắp nơi trên thế giới Nồng độ HCH trong đất ở vùng lân cận của các kho dự trữ này có nồng

độ khoảng vài gam trên 1 kg đất hoặc vài mg trên 1 lít nước (Vijgen, 2005)

2.1.5 Tác hại của HCH

Từ khi lindane và những đồng phân HCH khác được tìm thấy trong tất cả môi trường, tất cả sinh vật có thể tiếp xúc với những chất gây ô nhiễm này Những ảnh hưởng phơi nhiễm phụ thuộc vào liều lượng tiếp xúc, thời gian tiếp xúc, sinh lý của sinh vật (Smith, 1991)

2.1.5.1 Những ảnh hưởng đối với con người

Những tác động độc tố cấp tính có thể xuất hiện sau khi con người ăn phải một lượng lindane nhất định Hội chứng độc tố cấp tính ở người bao gồm đau đầu, hoa mắt, động kinh, tiêu chảy, nôn mửa và rát da, mũi, cổ họng và phổi Tiếp xúc lâu dài có thể gây ra tác động độc tố mãn tính Ở người, độc tố mãn tính ảnh hưởng đến đường tiêu hóa, hệ thống tim mạch và cơ xương (Smith, 1991)

Hơn nữa HCH có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và tuyến nội tiết do tác động đến việc sản xuất hormone trong buồng trứng và tinh hoàn Mặc dù chưa có chắc chắn rằng lindane là chất gây đột biến và sinh ung thư, nhưng cả USEPA và IARC xem lindane và HCH khác có thể gây ung thư cho người (Smith, 1991)

2.1.5.2 Những ảnh hưởng đến sinh vật khác

Độc tố cấp tính của những đồng phân HCH giảm theo thứ tự γ<α<δ<β Tuy nhiên độc tính của liều lặp lại giảm theo thứ tự β< α< γ< δ Độc tính trong một thời gian dài của những đồng phân khác nhau có liên quan trực tiếp đến việc tích trữ mô

mỡ và làm chậm quá trình chuyển hóa (Hayes và Laws, 1991)

Bảng 2.2 Những ảnh hưởng của độc tố lindane lên sinh vật

Sinh vật Ảnh hưởng của độc tố Giá trị Phân loại

Vi khuẩn, tảo, protozoa NOEL 1 mg/l Hơi độc

Cá, động vật không xương sống LC50 2-90 µ/l Độc cao đến rất cao

NOEL: không quan sát được mức ảnh hưởng (nồng độ mà ở đó nó không ảnh hưởng)

LD50: Liều gây chết (liều sử dụng mà gây chết 50% vật thí nghiệm)

LC50: nồng độ gây chết (nồng độ trong môi trường mà gây chết 50% vật thí nghiệm)

BW: trọng lượng cơ thể

(Nguồn: EXTOXNET, 1996; WHO, 2005)

2.2 Phương pháp phân hủy lindane

2.2.1 Phân hủy sinh học

Phân hủy lindane bằng sinh học chủ yếu là dựa vào sự phân hủy lindane của vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí và nấm Vi khuẩn hiếu khí phân hủy lindane chủ yếu

là khử và khoáng hóa clo của lindane còn vi khuẩn kỵ khí và nấm phân hủy lindane chủ yếu là khử clo của lindane

Bảng 2.3 Danh sách vi sinh vật phân hủy HCH

Vi sinh vật Đặc tính thủy phân HCH Tài liệu tham khảo

Vi khuẩn : hiếu khí

Bacillus sp Khử clo (dechlorination) (γ -HCH) Yule và ctv (1967)

Escherichia coli Khử clo (γ -HCH) Francis và ctv (1975)

Pseudoraea sp Sử dụng như là nguồn cacbon duy

nhất, Khử clo (γ -HCH)

Okeke và ctv (2002)

Pseudomonas sp Khử clo (γ -HCH) Nawab và ctv (2003)

Pseudomonas vesicularis P59 Sự khoáng hóa α-HCH Huntjens và ctv (1988)

Pseudomonas lindaniclasticus Khử clo (α và γ -HCH) Thomas và ctv (1996)

Sphingomonas paucimobilis B90 Sử dụng như nguồn cacbon duy nhất

Vi khuẩn : kỵ khí

Citrobacter freundii Khử clo (γ -HCH) Jagnow và ctv (1977)

Clostridium rectum S-17 Khử clo (γ -HCH) Ohisa và Yamaguchi (1978)

Phanerochaete sordida Khử clo (γ -HCH) Singh và Kuhad (2000)

Pleurotus eryngii Khử clo (γ -HCH) Arisoy (1998)

Pleurotus sajor-caju Khử clo (γ -HCH) Arisoy (1998)

Trametes hirsutus Khử clo (γ -HCH) Singh và Kuhad (1999)

(Nguồn: Phillips và ctv, 2005)

2.2.1.1 Phân hủy sinh học kỵ khí

Vi khuẩn thủy phân lindane trong điều kiện kỵ khí được phân lập đầu tiên là

Clostridium sphenoides UQM780 (Macrae và ctv, 1969) Sau đó, một vài vi sinh vật thủy phân khác đã được miêu tả như: giống Clostridium sp., Bacillus sp., Enterocateriaceae, vi sinh vật nước mặn Cyanobacteria, vi khuẩn loại bỏ sulphate và

một vài vi sinh vật kỵ khí khác chưa được xác định (Boyle và ctv, 1999; Jagnow và ctv, 1977; Kuritz và Wolk, 1995; Middeldorp và ctv, 1996)

Kết quả thủy phân những đồng phân HCH khác nhau là rất khác nhau, chủ yếu

là do sử dụng loại vi sinh vật và mức độ thích nghi đối với chất gây ô nhiễm (Moreno

và Buitron, 2004) Trong nghiên cứu của Haider và Jagnow (1975), γ-HCH bị thủy phân đến 90% sau 5 ngày, trong khi α và β-HCH khó loại bỏ trong cả điều kiện ổn định methan và giảm sulphate (Bachmann và ctv, 1988)

Trong con đường thủy phân kỵ khí HCH, tetrachlorocyclohexene (TCCH) được nhận biết như là hợp chất trung gian, mặc dù đòi hỏi hợp chất trung gian cơ bản là pentachlorocyclohexane (PCCH), chất này dễ biến động nên khó phát hiện

DeWeerd và ctv (1990) đã báo cáo việc sử dụng β-HCH như một chất nhận điện tử trong phản ứng Stickland bởi một giống Dehalobacter đồng nuôi cấy với

Sedimentibacter sp., thay vì kết hợp khử clo HCH để tạo ra ATP Nuôi cấy tăng sinh

với H2 là cho điện tử và β-HCH nhận điện tử

Hình 2.3 Con đường phân hủy kỵ khí HCH (Middeldorp và ctv, 1996)

2.2.1.2 Phân hủy sinh học hiếu khí

Cách nghiên cứu tốt nhất cho thủy phân sinh học lindane và những đồng phân

HCH khác được tìm thấy ở Sphingomonas paucimobilis UT26, Sphingomonas paucimobilis UT26 là một acid nalidixic chống lại đột biến của Pseudomonas paucimobilis SS86 được phân lập đầu tiên trong đất ở miền núi của Nhật Bản (Imai và

ctv, 1989; Senoo và Wada, 1989) UT26 có khả năng thủy phân hiếu khí α, γ, và HCH và sử dụng γ-HCH như là nguồn carbon duy nhất (Nagasawa và ctv,1993)

δ-Cách thủy phân ở hình 4 liên quan đến một vài enzyme mã hóa bởi gen linA, linB, linC, linD, linE, linF, linR và linX liên quan đến sự khoáng hóa thông qua maleylacetat và β- ketoadipate chuyển hóa chung ở vi sinh vật theo con đường hợp chất thơm Những gene, sản phẩm gene và phản ứng của chúng cần phải được nghiên cứu chi tiết (Imai và ctv, 1991; Nagata và ctv, 1993; Miyauchi và ctv 1998, 1999)

LinA, linB, linD và linE mã hóa cho những enzyme xúc tác nhiều phản ứng, trong khi sản phẩm gen linC (và liên quan linX) chỉ xúc tác một phản ứng Mặc dù linC và linX xúc tác phản ứng giống nhau cụ thể là chuyển 2,5-DDOL thành 2,5-dichlorohydroquinone (2,5-DCHQ) qua phản ứng dehydrogenase phụ thuộc NAD+(Nagata và ctv, 1993), hoạt động linX thấp hơn nhiều và trình tự amino acid giống nhau giữa hai protein chỉ 31% Những gene linA, linB, và linC rải rác trên genome UT26 và được biểu hiện chủ yếu (Nagata và ctv, 1999)

Mặc khác, những gene linD và linE từ một operon và sự biểu hiện của chúng có liên quan đến linR điều hòa phiên mã, trong sự hiện diện của những hợp chất kiểu HQ, chẳng hạn như CHQ, HQ, và 2,5-DCHQ (Miyauchi và ctv, 2002) Liên quan đến linF vừa được mô tả gần đây và cơ chế điểu hóa của linF vẫn còn đang nghiên cứu

Những giống vi sinh vật hiếu khí thủy phân HCH khác cũng được phân lập

Sphingomonas paucimobilis B90 được phân lập từ đất lúa ở Ấn Độ và là vi sinh vật

đầu tiên được báo cáo về thủy phân cả 4 đồng phân HCH (Johri và ctv, 1998; Kumari

và ctv, 2002) Những gene linA, linB và linC tìm thấy ở Sphingomonas paucimobilis B90 có tương đồng với Sphingomonas paucimobilis UT26 Những giống thủy phân α

và γ-HCH khác được phân lập từ đất ở Pháp, Rhodanobacter lindaniclasticus (Nalin

và ctv, 1999) cũng tìm thấy sự biểu hiện 2 gene tương đồng với linA và linB của

Sphingomonas paucimobilis UT26 (Thomas và ctv, 1996)

Một vài giống Sphingomonas thủy phân HCH đã được phân lập từ đất ở miền

bắc Tây Ban Nha (Böltner và ctv, 2005), trong đó sự thủy phân HCH cũng được tìm thấy và được điều hòa bởi những gen lin tương đồng với những gen được tìm thấy ở

Sphingomonas paucimobilis UT26

Hình 2.4 Phân hủy hiếu khí γ-HCH bởi Sphingomonas paucimobilis UT26 (Nagata và ctv, 1999)

2.2.2 Phân hủy hóa học

Lindane bị thủy phân bằng cách loại bỏ clo ở vị trí 1, 2 tạo thành 3, 4, 5, 6 – tetrachlorocyclohexene (TeCCH), sau đó TeCCH tiếp tục bị loại bỏ clo ở vị trí 5, 6 cho ra 3, 4 – dichlorocyclohexadiene (DCCHD), cuối cùng DCCHD loại 2 nguyên tử clo còn lại và sản phẩm của nó là benzene

Sử dụng sắt để loại bỏ lindane trong môi trường sẽ có ba trường hợp xảy ra: Fe0phản ứng trực tiếp với lindane kết quả là khử clo và tạo ra Fe2+, Fe0 phản ứng với nước tạo ra Fe2+ sau đó Fe2+ phản ứng trực tiếp với lindane kết quả là khử clo và tạo ra Fe3+,

Fe0 phản ứng với nước tạo ra H2 sau đó H2 làm chất xúc tác khử clo (hình 2.7)

Hình 2.5 Cơ chế loại bỏ lindane bằng hóa học (Daniel và ctv, 2009)

Hình 2.6 Cơ chế loại bỏ clo trong lindane của sắt (Daniel và ctv, 2009)

2.3 Thông tin về lindane ở Việt Nam

Lindane được sử dụng trong ngành nông nghiệp như thuốc trừ nấm bệnh, sâu

bọ, thuốc bảo quản nông sản, thuốc ngâm hạt giống…Trong ngành y tế, lindane được

sử dụng để diệt các côn trùng truyền bệnh

Năm 2006, lindane nằm trong danh mục thuốc trừ sâu, thuốc bảo quản lâm sản cấm sử dụng ở Việt Nam theo quyết đính số 31/2006/QĐ-BNN ngày 27 tháng 4 năm

2006 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Theo công ước Stockholm, Việt Nam là thành viên thứ 14 trong số các nước tham gia thực hiện công ước thì lindane đứng đầu danh sách các hóa chất cần loại trừ, đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Y tế Việt Nam cấm sử dụng

Tình hình ô nhiễm lindane trong môi trường không khí, đất, nước, bùn ở Việt Nam chưa có số liệu công bố Các nghiên cứu phân hủy lindane cũng rất ít, năm 2004

có đề tài “Ứng dụng công nghệ sinh học để phân huỷ lindane trong môi trường đất” của Nguyễn Thúy Bình ở Viện Khoa học kỹ thuật Hà Nội Theo Đặng Thị Cẩm Hà (2008), công nghệ phân hủy sinh học sẽ được áp dụng để khử độc đất ô nhiễm nặng hỗn hợp POP (các chất gây ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy trong đó có lindane)

Hình 2.7 Ba cơ chế khử lindane đơn giản của sắt (Orme và Kegley, 2006)

-(aq: Aqueous, g: gas, s: solid)

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định hàm lượng lindane trong mẫu bùn, đất bằng kỹ thuật sắc

ký khí

Nội dung 2: Đánh giá tổng số vi sinh vật hiện diện trong mẫu bùn, đất bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống

Nội dung 3: Khảo sát khả năng loại bỏ lindane bằng các phương pháp hóa học,

vi sinh vật, hóa học kết hợp với vi sinh vật

3.2 Thời gian và địa điểm thực hiện

3.2.1 Thời gian thực hiện

Từ 20/03/2009 đến 20/12/2010

3.2.2 Địa điểm thực hiện

Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Cách xác định hàm lượng lindane trong mẫu đất, bùn

Sử dụng kỹ thuật sắc ký khí để xác định được hàm lượng lindane có trong các mẫu thí nghiệm.Cách thực hiện áp dụng theo qui trình phân tích của Viện Nghiên cứu

Công nghệ sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông lâm Tp HCM

Chai thủy tinh 250 ml, 500 ml,

Thiết bị

Hệ thống máy sắc ký Agilent 6890, máy lắc, máy cô quay, máy cất nước

3.3.1.2 Các bước để xác định hàm lượng lindane

Bước 1: Chiết mẫu

Mẫu được đồng nhất, cân 50 g cho vào cốc thủy tinh 250 ml, thêm muối

Na2SO4 (Merck) và cho vào 100 ml dichloromethane (Prolabo), lắc qua đêm

Lọc chân không, rửa phễu lọc và cốc bằng 100 ml dichloromethane

Đem cô quay

Bước 2: Tinh sạch

Lót dưới đáy cột một lớp bông thủy tinh

Ngâm 2,5 g silicagel (Merck) đã hoạt hóa trong hexan (Prolabo) trong 15 phút Cho silicagel (Merck) vào cột và 1 cm Na2SO4 (Merck) phủ lên trên

Vặn van cho hexan chảy ra ngoài đến vạch chất rắn

Tráng bình chứa mẫu bằng 6 ml n - hexan và cho vào cột

Rửa giải cột bằng 20 ml rửa giải (n – hexan + acethylacetate (Merck) tỉ lệ 1:1) Dung dịch rửa giải được đuổi dung môi bằng máy cô quay ở 500C - 550C

Định mức lại bằng 2 ml acetone (Merck)

Tiến hành phân tích trên máy sắc ký khí

Bước 3: Điều kiện chạy máy sắc ký khí (Agilent 6890)

Đầu dò:

Đầu dò ECD Nhiệt độ: 3000C Lưu lượng anode: 6ml/phút

3.3.2 Đánh giá tổng số vi sinh vật hiện diện trong mẫu bùn, đất

Để đánh giá mật số vi sinh vật hiện diện trong các mẫu phân tích Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đã được tiến hành trong phòng thí nghiệm dựa theo TCVN 4884 : 2001

là 10-1 Tiếp tục thực hiện tương tự để có độ pha loãng tiếp theo, sử dụng nồng độ pha loãng từ 10-2, 10-3, 10-4

Hút 1 ml mỗi nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri 9 cm

Đổ 15 ml YEA (Yeast Extract Agar) ở 450C, lắc đều

Để nguội và đem ủ ở 300C

Đọc kết quả sau 72 giờ

3.3.2.2 Đánh giá tổng số vi sinh vật hiếu khí

Được thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại là một đĩa petri cho một nồng độ pha loãng

Cân 10 g đất (bùn) cho vào 90 ml PSS (Pepton saline solution), đem vortex thu

được dung dịch huyền phù có độ pha loãng đồng nhất

Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng giống mục 3.3.2.1

Đổ 15 ml PCA (Plate count agar) ở 450C, lắc đều

Cân 10 g đất (bùn) cho vào 90 ml PSS (Pepton saline solution), đem vortex thu

được dung dịch huyền phù có độ pha loãng đồng nhất

Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng giống mục 3.3.2.1

Đổ 15 ml PCA (Plate count agar) ở 450C, lắc đều

Để nguội sau đó đổ thêm 10 ml PCA lên lớp mặt

Cho vào bình nuôi cấy yếm khí

Đem ủ ở 300C

Đọc kết quả sau 72 giờ

3.3.2.4 Cách tính kết quả

Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ Chọn các đĩa có

số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính kết quả Mật độ khuẩn lạc được tính trong 1g như sau

Trong đó : A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1g

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số đếm lớn hơn 250 kết quả được ghi: > 2,5x107(CFU/g)

Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên đĩa < 25 kết quả được ghi: < 2,5x10-2 (CFU/g)

3.3.3 Khảo sát khả năng loại bỏ lindane bằng các phương pháp hóa học, vi sinh vật, hóa học kết hợp với vi sinh vật

Cách xử lý mẫu bùn và mẫu đất trước khi tiến hành thí nghiệm

- Phơi khô 12 kg bùn, 12 kg đất ở nhiệt độ phòng (khoảng 300C) trong 3 ngày

- Nghiền và sàng để loại bỏ đá và cát

- 7 kg đất và 7 kg bùn đem hấp tiệt trùng cho thí nghiệm hóa học

Thí nghiệm ở điều kiện hiếu khí

- Cân 50 g mẫu đất (mẫu bùn) khô cho vào bình 250 ml (miệng rộng 45 mm x đường kính 62 mm x chiều cao 115 mm)

- Thêm 5 g pyrite (hoặc không thêm pyrite ở thí nghiệm không xử lý)

A (CFU/g) = N

N1Vf1 +…+niVfi

- Hút 0,5 ml dung dịch lindane (Merck) nồng độ 1000 ppm cho vào bình

- Thêm 150 ml nước và đậy nắp lại

- Lắc 40 vòng/phút trong 60 ngày (máy lắc tròn model: SSL1 - Bibby)

Thí nghiệm ở điều kiện kỵ khí

- Cân 100 g mẫu đất (mẫu bùn) khô cho vào bình 500 ml (miệng rộng 45 mm

x đường kính 86 mm x chiều cao 181 mm)

- Thêm 5 g Fe0 (hoặc không thêm Fe0 ở thí nghiệm không xử lý)

- Hút 1,00 ml dung dịch lindane nồng độ 1000 ppm cho vào bình

- Thêm nước vào đến ngập miệng chai và đậy nắp lại

3.3.3.1 Thí nghiệm loại bỏ lindane bằng hóa học

Với mục tiêu là so sánh hiệu quả phân hủy lindane bằng xử lý hóa học và không

xử lý; so sánh hiệu quả phân hủy lindane giữa sắt không (Fe0) và pyrite (FeS2) Thí nghiệm loại bỏ lindane bằng hóa học được thực hiện theo 4 nghiệm thức (NT), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

- Nghiệm thức 1 (NT1): Cân 50 g đất (bùn) khô đã tiệt trùng cho vào chai 250 ml + 5 g pyrite + 0,5 ml dung dịch lindane (1000 ppm) + 150 ml nước; điều kiện thí nghiệm hiếu khí

- Nghiệm thức 2 (NT2): Tương tự NT1 nhưng không thêm pyrite

- Nghiệm thức 3 (NT3): Cân 100 g đất (bùn) khô đã tiệt trùng cho vào chai 500

ml + 5 g Fe0 + 1,00 ml dung dịch lindane (1000 ppm) + cho nước vào ngập miệng chai; điều kiện thí nghiệm kỵ khí

- Nghiệm thức 4 (NT4): Tương tự NT3 nhưng không thêm Fe0

3.3.3.2 Thí nghiệm loại bỏ lindane bằng vi sinh vật

Thí nghiệm loại bỏ lindane bằng vi sinh vật được thực hiện theo 4 nghiệm thức (NT), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

- Nghiệm thức 5 (NT5): Cân 50 g đất (bùn) khô không tiệt trùng cho vào chai

250 ml + 0,5 ml dung dịch lindane (1000 ppm) + 150 ml nước; điều kiện thí nghiệm hiếu khí

- Nghiệm thức 6 (NT6): Tương tự NT5 nhưng tiệt trùng mẫu đất (bùn)

- Nghiệm thức 7 (NT7): Cân 100 g đất (bùn) khô không tiệt trùng cho vào chai

500 ml + 1,00 ml dung dịch lindane (1000 ppm) + cho nước vào ngập miệng chai; điều kiện thí nghiệm kỵ khí

- Nghiệm thức 8 (NT8): Tương tự NT7 nhưng tiệt trùng mẫu đất (bùn)

Mục đích thí nghiệm:

So sánh hiệu quả phân hủy lindane bằng xử lý vi sinh vật và không xử lý

So sánh hiệu quả phân hủy lindane giữa vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí

3.3.3.3 Thí nghiệm loại bỏ lindane bằng hóa học kết hợp vi sinh vật

Thí nghiệm loại bỏ lindane bằng hóa học kết hợp với vi sinh vật được thực hiện

theo 4 nghiệm thức (NT), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mục đích so sánh hiệu quả

phân hủy lindane bằng xử lý vi sinh vật kết hợp với hóa học và không xử lý; so sánh hiệu quả phân hủy lindane giữa vi sinh vật kỵ khí kết hợp với Fe0 và vi sinh vật hiếu khí kết hợp với pyrite

- Nghiệm thức 9 (NT9): Cân 50 g đất (bùn) khô chưa tiệt trùng cho vào chai 250

ml + 5 g pyrite + 0,5 ml dung dịch lindane (1000 ppm) + 150 ml nước; điều kiện thí nghiệm hiếu khí

- Nghiệm thức 10 (NT10): Tương tự NT9 nhưng tiệt trùng mẫu đất (bùn) và không thêm pyrite

- Nghiệm thức 11 (NT11): Cân 100 g đất (bùn) khô chưa tiệt trùng cho vào chai

500 ml + 5 g Fe0 + 1,00 ml dung dịch lindane (1000 ppm) + cho nước vào ngập miệng chai; điều kiện thí nghiệm kỵ khí

- Nghiệm thức 12 (NT12): Tương tự NT11 nhưng tiệt trùng mẫu đất (bùn) và không thêm Fe0

3.3.3.4 Thí nghiệm so sánh hiệu quả phân hủy lindane giữa phương pháp vi sinh vật, phương pháp hóa học và phương pháp hóa học kết hợp vi sinh vật

Thí nghiệm so sánh hiệu quả phân hủy lindane giữa vi sinh vật, hóa học và hóa học kết hợp vi sinh vật được thực hiện theo 8 nghiệm thức (NT), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

- Nghiệm thức 13 (NT13): Cân 50 g đất (bùn) khô chưa tiệt trùng cho vào chai

250 ml + 5 g pyrite + 0,5 ml dung dịch lindane (1000 ppm) + 150 ml nước; điều kiện thí nghiệm hiếu khí

- Nghiệm thức 14 (NT14): Tương tự NT13 nhưng tiệt trùng mẫu đất (bùn)

- Nghiệm thức 15 (NT15): Tương tự NT13 nhưng không thêm pyrite

- Nghiệm thức 16 (NT16): Tương tự NT13 nhưng tiệt trùng mẫu đất (bùn) và không thêm pyrite

- Nghiệm thức 17 (NT17): Cân 100 g đất (bùn) khô chưa tiệt trùng cho vào chai

500 ml + 5 g Fe0 + 1,00 ml dung dịch lindane (1000 ppm) + cho nước vào ngập miệng chai; điều kiện thí nghiệm kỵ khí

- Nghiệm thức 18 (NT18): Tương tự NT17 nhưng tiệt trùng mẫu đất (bùn)

- Nghiệm thức 19 (NT19): Tương tự NT17 nhưng không thêm Fe0

- Nghiệm thức 20 (NT20): Tương tự NT17 nhưng nhưng tiệt trùng mẫu đất (bùn)

3.3.4 Phương pháp đánh giá kết quả

Số liệu được lưu trữ trong phần mềm Excel, xử lý bằng phần mềm Statgraphic 7.0 và phần mềm thống kê Data Analysis

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Đặc điểm mẫu đất, bùn trước khi tiến hành thí nghiệm

4.1.1 Kết quả kiểm tra hàm lượng lindane trước khi tiến hành thí nghiệm

Mẫu bùn và đất được kiểm tra hàm lượng lindane trước khi tiến hành thí

nghiệm, kết quả kiểm tra không phát hiện lindane, ngưỡng để phát hiện lindane của máy sắc ký khí Aglilent 6890 bằng đầu dò ECD là ≥ 1 ppb

Bảng 4.1: Nồng độ lindane trong mẫu đất và bùn trước thí nghiệm

Mẫu Số lượng Nồng độ lindane (ppm)

Mẫu đất và mẫu bùn được lựa chọn làm thí nghiệm dựa vào kết quả khảo sát khả năng tích tụ của dư lượng thuốc trừ sâu hữu cơ gây hại trong bùn và đất ở đồng bằng sông Cửu Long Kết quả khảo sát đợt thứ nhất cho thấy ở một vài nơi khảo sát có

sự hiện diện thuốc trừ sâu hữu cơ gây hại trong đó có lindane, tuy nhiên ở đợt khảo sát thứ hai thì không phát hiện, do đó đề tài đã chọn mẫu 2 và mẫu 9 (bảng 4.2) để tiến hành thí nghiệm vì khả năng ở hai mẫu này có sự hiện diện của vi sinh vật có khả năng phân hủy lindane

Mẫu 2: Mẫu đất lấy ở ruộng của ông Nguyễn Văn Xoan, sâu 80 cm, ấp II, xã

Mỹ Tân, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp

Mẫu 9: Mẫu bùn lấy ở sông Tiền - đầu kênh Đồng Tiến, ấp Phú Thọ, xã An Long, huyện Tam Nông, tỉnh Đồng Tháp

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát dư lượng thuốc trừ sâu

Lindane (ppb)

Aldrin (ppb)

Chlordane (ppb)

DDE (ppb)

DDD (ppb)

o,p'-PCB Mix 1 (ppb)

Lindane (ppb)

Aldrin (ppb)

Chlordane (ppb)

      (Nguồn: Viện Nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường, trường ĐHNL Tp.HCM, 2009)

KPH: Không phát hiện, ngưỡng phát hiện: o,p’-DDE ≥ 1ppb, o,p’-DDD ≥ 1ppb,

lindane ≥ 1ppb, aldrin ≥ 0.5ppb, chlordane ≥10ppb

4.1.2 Kết quả kiểm tra vi sinh trước khi tiến hành thí nghiệm

Hình 4.1 Vi sinh vật hiện diện trong mẫu trước khi thí nghiệm A1, A2, A3: Nấm

men nấm mốc; B1, B2, B3: Vi khuẩn hiếu khí; C1, C2, C3: Vi khuẩn kỵ khí

Bên cạnh việc kiểm tra hàm lượng lindane trong đất, bùn cần phải tiến hành kiểm tra tổng số nấm men nấm mốc, vi khuẩn hiểu khí và vi khuẩn kỵ khí, kết quả cho thấy tổng số vi sinh hiện diện trong bùn và đất tương đối cao (bảng 4.3)

Bảng 4.3 Tổng số nấm men nấm mốc, vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí trước thí nghiệm

Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy tổng số nấm men nấm mốc trong mẫu đất (1,7x103 cfu/g) nhiều hơn trong mẫu bùn (1,1x103 cfu/g) tuy nhiên sự khác nhau về chủng loại nấm men nấm mốc không cao Tổng số vi khuẩn hiếu khí (1,1x105 cfu/g)và tổng số vi khuẩn kỵ khí (1,5x104 cfu/g) trong mẫu bùn nhiều hơn so với mẫu đất (tổng số vi khuẩn hiếu khí 1,5x103 cfu/g, tổng số vi khuẩn kỵ khí 4,6x103 cfu/g) Có thể bùn được lấy ở sông Tiền (mẫu 2) có hàm lượng hữu cơ cao nên phong phú về chủng loại cũng như số lượng Ở điều kiện hiếu khí như mẫu đất nhưng tổng số vi sinh vật hiếu khí lại thấp hơn so với vi sinh vật kỵ khí, trong khi ở điều kiện kỵ khí như mẫu bùn thì tổng

vi khuẩn hiếu khí lại nhiều hơn so với tổng vi khuẩn kỵ khí Điều này cho thấy sự phân

bố của vi sinh vật trong mẫu không chỉ phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng mà còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác

Với mẫu đất và mẫu bùn tiệt trùng ở điều kiện 1210C trong 30 phút, kết quả cho tổng số nấm men nấm mốc, tổng số vi khuẩn hiếu khí và tổng số vi khuẩn kỵ khí đều không hiện diện Như vậy, mẫu bùn và mẫu đất được tiệt trùng là điều kiện phù hợp để làm các nghiệm thức không xử lý cho thí nghiệm vi sinh vật, hóa học kết hợp với vi sinh vật cũng như các nghiệm thức trong thí nghiệm hóa học, đảm bảo rằng khi tiến hành thí nghiệm các yếu tố vi sinh vật có khả năng phân hủy lindane đã bị loại bỏ khỏi thí nghiệm

Mẫu

Tổng số nấm men nấm mốc (cfu/g)

Tổng số vi khuẩn hiếu khí (cfu/g)

Tổng số vi khuẩn kỵ khí (cfu/g)

4.2 Kết quả kiểm tra hàm lượng lindane ở ngày bắt đầu và kết thúc thí nghiệm 4.2.1 Hàm lượng lindane trong mẫu đất ở ngày bắt đầu và kết thúc thí nghiệm

Kết quả kiểm tra hàm lượng lindane trong mẫu đất bằng máy sắc ký khí ở ngày bắt đầu thí nghiệm cho thấy nồng độ lindane dao động từ 2,52 – 3,21 ppm và sau 60 ngày thí nghiệm nồng độ lindane trong đất giảm xuống còn 0,47 – 2,38 ppm Theo Albright và ctv (1974), thời gian bán rã lindane ngoài đồng ruộng có thể lên đến 3 năm nhưng trong thí nghiệm này sau 60 ngày nồng độ lindane ở các phương pháp hóa học,

vi sinh vật, hóa học kết hợp với vi sinh vật đều giảm đi rất nhiều (bảng 4.4), đặc biệt là

ở các nghiệm thức sử dụng Fe0 để phân hủy lindane nồng độ giảm xuống chỉ còn 0,47 – 0,52 ppm

Bảng 4.4 Nồng độ lindane trung bình của các phương pháp xử lý ở mẫu đất

Nồng độ lindane trung bình của 3 LLL (ppm) Phương pháp xử lý Nghiệm

thức Ngày bắt đầu thí

nghiệm (ngày 0)

Ngày kết thúc thí nghiệm

(ngày 60 ) Thí nghiệm loại bỏ lindane bằng phương pháp hóa học