NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG, CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TERPINEN4OL CỦA MÔ SẸO CÂY TRÀM TRÀ (Melaleuca alternifolia Cheel)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM  ĐỖ TIẾN VINH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG, CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TERPINEN-4-OL CỦA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM



ĐỖ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG, CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TERPINEN-4-OL

CỦA MÔ SẸO CÂY TRÀM TRÀ

(Melaleuca alternifolia Cheel)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 12/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM



ĐỖ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG, CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TERPINEN-4-OL

CỦA MÔ SẸO CÂY TRÀM TRÀ

(Melaleuca alternifolia Cheel)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHOÁNG, CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY TERPINEN-4-OL CỦA MÔ SẸO CÂY TRÀM TRÀ

(Melaleuca alternifolia Cheel)

Phân viện Sinh Học Tây Nguyên

4 Phản biện 2: PGS.TS BÙI VĂN LỆ

Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM

5 Ủy viên: TS BÙI MINH TRÍ

Đại học Nông Lâm TP.HCM

Từ tháng 5 đến tháng 8 năm 2009 ôn tập và thi đầu vào cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học tại trường đại học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh

Từ tháng 9 năm 2009 đến hiện tại theo học cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học tại trường đại học Nông Lâm, Thành phố Hồ Chí Minh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đỗ Tiến Vinh

LỜI CẢM ƠN

Trong hai năm học tập và nghiên cứu đề tài tốt nghiệp cao học đã giúp tôi thu nhận rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm cả trong chuyên môn lẫn cuộc sống và đến hôm nay khi đã hoàn thành khóa học tôi xin gửi lời tri ân đến:

Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, thầy trưởng bộ môn cùng các thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Văn Minh Thầy đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp này

PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng, TS Vũ Văn Độ, Cô Bùi Thị Tường Thu, cô

Đỗ Thị Tuyến đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thiết bị, dụng cụ, địa điểm cho tôi thực hiện đề tài

Con xin cảm ơn ba mẹ đã nuôi con khôn lớn và cho con được học tới ngày hôm nay

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Trung Hậu, các anh chị trong phòng Công nghệ Tế bào Thực vật Viện Sinh học Nhiệt đới cùng tất cả các bạn của tôi Những người đã luôn quan tâm, ủng hộ và chia sẻ với tôi những khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Học viên thực hiện

Đỗ Tiến Vinh

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng, chất cảm ứng đến

khả năng sinh trưởng và tích lũy terpinen-4-ol của mô sẹo cây Tràm Trà (Melaleuca

alternifolia Cheel)” được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Trọng Điểm Phía Nam

Về Công nghệ Tế bào Thực vật Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh,

từ tháng 9 năm 2010 đến tháng 9 năm 2011 Mục tiêu của đề tài là xác định các yếu

tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy và khả năng tích tũy terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Kết quả quá trình nghiên cứu cho thấy:

Khảo sát nuôi cấy mô sẹo trên bốn loại môi trường MS - LV - WPM - B5 có

bổ sung đường sucrose (10 - 20 - 30 g/l); BA, NAA, 2,4-D (0,5 - 1,0 - 2,0 - 4,0 mg/l); B1, glycine (5 - 10 - 15 mg/l); nước dừa (5 - 10 - 15%); peptone (0,5 - 1,0 - 2,0 g/l) Đã xác định được lá Tràm Trà là bộ phận tạo mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D (4 mg/l), BA (0,5 mg/l), glycine (10 mg/l), B1 (5 mg/l), đường sucrose (20 g/l) (tỷ lệ tạo mô sẹo là 97,22%) Khi giảm nồng độ 2,4-D xuống (1 mg/l), không có BA và bổ sung thêm nước dừa (15%) vào môi trường sẽ giúp dạng mô sẹo có màu trắng sữa, mềm phát triển tốt nhất (hệ số tăng sinh 19,34 lần) Thời điểm cấy chuyền tốt nhất là 25 ngày sau khi cấy

Số lần cấy chuyền (từ F1 - F5); cường độ chiếu sáng (0 - 500 - 1000 - 2000 -

3000 lux); yeast extract, chitosan, casein hydrolysate (50 - 100 - 150 - 200 mg/l) có ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh và tích lũy hoạt chất của mô sẹo Kết quả cho thấy khả năng tổng hợp terpinen-4-ol của mô sẹo được duy trì khá tốt trong ba lần cấy chuyền đầu tiên, từ lần cấy chuyền thứ tư khả năng tổng hợp hoạt chất sẽ giảm Nhân sinh khối mô sẹo diễn ra trong điều kiện tối là tốt nhất, mô sẹo khi được chiếu sáng với cường độ 2000 lux, 12 giờ/ngày sẽ tổng hợp terpinen-4-ol tốt nhất (0,0218%) Việc bổ sung yeast extract, chitosan, casein hydrolysate có tác dụng làm tăng hàm lượng terpinen-4-ol Trong đó, nồng độ yeast extract 150 mg/l cho kết quả

tốt nhất (0,0256%) Mô sẹo Tràm Trà khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và được lắc với tốc độ 100 vòng/phút sẽ tạo dịch huyền phù tốt nhất với lượng mẫu ban đầu

là 1,5 g trên 50 ml môi trường và có khả năng tổng hợp terpinen-4-ol cao hơn 1,3 lần so với mô sẹo nuôi cấy trên môi trường thạch

ABSTRACT

The thesis “Studying the influences of the minerals, elicitors on cell growth

and terpinen-4-ol accumulation of Melaleuca alternifolia Cheel callus” was carried

out at Southern Key Laboratory for Plant Cell Technology, Institute for Tropical Biology from 9/2010 to 9/2011 The aim of thesis is determination of factors

influencing on growth of callus and terpinen-4-ol accumulation in Melaleuca

alternifolia Cheel callus The experiment was designed in completely randomized

design The results of study showed that:

In examination of callus cultures on four media (MS, LV, WPM, B5) supplemented with sucrose (10 - 20 - 30 g/l); phytohormones (BA, NAA, 2,4-D) with different levels (0,5 - 1,0 - 2,0 - 4,0 mg/l); B1, glycine (5 - 10 - 15 mg/l);

coconut water (5 - 10 - 15%); peptone (0,5 - 1,0 - 2,0 g/l) Melaleuca alternifolia

Cheel leaves was a best explant for callus induction on MS medium supplemented with 2,4-D (4 mg/l), BA (0,5 mg/l), glycine (10 mg/l), B1 (5 mg/l), sucrose (20 g/l) (rate of callus induction is 97,22%) White fragile callus grew best on medium supplemented with decreased 2,4-D concentration (1 mg/l), coconut water (15%) without BA (growth rate: 19,34 times) The best subculture time is day 25 for optimal growth of callus

Cell generation (F1 - F5); light intensity (0 - 500 - 1000 - 2000 - 3000 lux); yeast extract, chitosan, casein hydrolysate (50 - 100 - 150 - 200 mg/l) also influenced on growth and terpinen-4-ol accumulation of callus The results indicated that terpinen-4-ol biosynthesis of callus was stably maintained in thrice of first subcultures and decreased in 4th subculture Proliferation of callus biomass in dark condition was best, callus was lighted with intensity of 2000 lux in 12 h/day enhancing highest terpinen-4-ol content in callus (0,0218%) The supplement of yeast extract, chitosan, casein hydrolysate promoted terpinen-4-ol content in callus and the content of yeast extract (150 mg/l) showed the best result (0,0256%) The

suitable weight of callus for establishment of suspension cultures was 1,5 g per 50

ml liquid medium and shaked with speed 100 round/min for finest suspension The biosynthesis of terpinen-4-ol of cell suspension in liquid medium was 1,3 times higher than that of callus in solid medium

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm ơn iv

Tóm tắt v

Mục lục ix

Danh sách các chữ viết tắt xiii

Danh sách các hình xiv

Danh sách các bảng xv

ĐẶT VẤN ĐỀ 01

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cây Tràm Trà 04

1.1.1 Phân bố sinh thái 05

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 05

1.1.3 Thành phần hóa học 06

1.1.4 Công dụng 08

1.1.5 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Tràm Trà 09

1.1.5.1 Công trình nghiên cứu trong nước 09

1.1.5.2 Công trình nghiên cứu nước ngoài 11

1.2 Terpinen-4-ol 12

1.3 Nuôi cấy mô sẹo 15

1.3.1 Các giai đoạn trong quá trình hình thành mô sẹo 16

1.3.2 Những nhân tố ảnh hưởng tới quá trình phát sinh mô sẹo 17

1.3.3 Các giai đoạn phát triển của mô sẹo 18

1.3.4 Hình thái mô sẹo 18

1.3.5 Màu sắc của mô sẹo 19

1.3.6 Phát sinh cơ quan trong nuôi cấy mô sẹo 20

1.3.7 Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo 21

1.3.8 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào 22

1.3.9 Các phương pháp nâng cao tổng hợp hoạt chât trong nuôi cấy tế bào 22

1.3.9.1 Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy 23

1.3.9.2 Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao 23

1.3.9.3 Bổ sung tiền chất 23

1.3.9.4 Cố định tế bào 23

1.3.9.5 Nhân tố cảm ứng (elicitor) 24

1.4 Phương pháp sắc ký khí 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

2.3 Nội dung và phương pháp thực hiện 27

2.3.1 Tạo cây Tràm Trà in vitro 28

Thí nghiệm 1: Vô mẫu in vitro 28

Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy cây Tràm Trà 28

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân chồi Tràm Trà 29

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA lên khả năng tạo rễ của chồi Tràm Trà 29

2.3.2 Nuôi cấy tạo mô sẹo cây Tràm Trà 30

Thí nghiệm 5: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy tạo mô sẹo cây Tràm Trà 30

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình tạo mô sẹo cây Tràm Trà 30

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của B1 và glycine đến quá trình tạo mô sẹo cây Tràm Trà 31

2.3.3 Nhân sinh khối mô sẹo Tràm Trà 31

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA; NAA; 2,4-D đến quá trình nhân sinh khối mô sẹo Tràm Trà 31

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến quá trình nhân sinh khối mô sẹo cây Tràm Trà 32

2.3.4 Xác định đường cong sinh trưởng mô sẹo Tràm Trà 32

Thí nghiệm 10: Khảo sát đường cong sinh trưởng mô sẹo Tràm Trà 32

2.3.5 Nghiên cứu các yếu tố tác động đến khả năng tổng hợp terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà 33

Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần cấy chuyền đến hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà 33

Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến quá trình nhân sinh khối và hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà 33

Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ trợ đến quá trình nhân sinh khối và hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà 34

Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến khả năng tích lũy hoạt chất trong mô sẹo 34

2.4 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả 35

2.4.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 35

2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng terpinen-4-ol 35

2.4.2.1 Ly trích terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 35

2.4.2.2 Xác định terpinen-4-ol bằng phương pháp sắc ký khí 36

2.4.3 Xử lý số liệu 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo cây Tràm Trà in vitro 37

Thí nghiệm 1: Vô mẫu in vitro 37

Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy cây Tràm Trà 38

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân chồi Tràm Trà 40

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA lên khả năng tạo rễ của cây

Tràm Trà in vitro 43

3.2 Nuôi cấy tạo mô sẹo cây Tràm Trà 45

Thí nghiệm 5: Khảo sát môi trường khoáng cơ bản nuôi cấy tạo mô sẹo cây Tràm Trà 45

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình tạo mô sẹo cây Tràm Trà 50

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của B1 và glycine đến quá trình tạo mô sẹo cây Tràm Trà 53

3.3 Nhân sinh khối mô sẹo Tràm Trà 56

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA; NAA; 2,4-D đến quá trình nhân sinh khối mô sẹo Tràm Trà 56

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến quá trình nhân sinh khối mô sẹo cây Tràm Trà 59

3.4 Xác định đường cong sinh trưởng mô sẹo Tràm Trà 62

Thí nghiệm 10: Khảo sát đường cong sinh trưởng mô sẹo Tràm Trà 62

3.5 Nghiên cứu các yếu tố tác động đến khả năng tổng hợp terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà 64

Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần cấy chuyền đến hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo Tràm Trà 64

Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến nhân sinh khối và hàm lượng terpinen-4-ol của mô sẹo Tràm Trà 67

Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ trợ đến quá trình nhân sinh khối và hàm lượng terpinen-4-ol của mô sẹo Tràm Trà 69

Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến khả năng tích lũy hoạt chất trong mô sẹo 73

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHỤ LỤC 85

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACIAR: australian centre for international agricultural research BA: benzyladenine

B1: vitamin B1 (Thiamin)

B5: môi trường Gamborg 1968

CA: casein hydrolysate

CHI: chitosan

CTV: cộng tác viên

CW: coconut water (nước dừa)

DNA: deoxyribonucleic acic

GA3: gibberellic acid

IBA: indolebutyric acid

ISO: international organization for standardization

LV: môi trường Litvay 1985

MS: môi trường Murashige-Skoog 1962

Môi trường thạch: môi trường có bổ sung agar 8 g/l

NAA: α-Naphthalene acetic acid

NT: nghiệm thức

TN: thí nghiệm

TTO: tea tree oil

WPM: môi trường Loyd & McCown 1980

YE: yeast extract

2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Tràm Trà 04

Hình 1.2 Hoa Tràm Trà 06

Hình 1.3 Con đường tổng hợp terpenoid trong thực vật 12

Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp monoterpenes trong tinh dầu Tràm Trà 13

Hình 1.5 Mối liên hệ sinh hóa giữa các monoterpenes trong tinh dầu Tràm Trà 14 Hình 1.6 Sơ đồ khối máy sắc ký khí khối phổ 25

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quan nội dung thực hiện 27

Hình 3.1 Chồi phát sinh sau khi vô trùng mẫu 25 ngày 38

Hình 3.2 Chồi Tràm Trà sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường MS, LV, WPM, B5 40

Hình 3.3 Chồi Tràm Trà nuôi cấy trên môi trường LV + sucrose 30 (g/l) + BA (0,1 - 0,5 - 1,0 - 2,0 mg/l) 42

Hình 3.4 Chồi Tràm Trà nuôi cấy trên môi trường LV + sucrose 30 (g/l) + NAA (0,1 - 0,5 - 1,0 - 2,0 mg/l); IBA 2,0 mg/l 44

Hình 3.5 Mô sẹo tạo từ lá và thân trên môi trường MS, LV, WPM, B5 48

Hình 3.6 Mô sẹo tạo từ lá khi nuôi cấy trên môi trường MS + BA; MS + BA 0,5 mg/l + 2,4-D 4,0 mg/l 53

Hình 3.7 Mô sẹo tạo từ lá trên môi trường MS + BA 0,5 mg/l + 2,4-D 4,0 mg/l + B1 5 mg/l + glycine 10 mg/l 56

Hình 3.8 Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS + 2,4-D (1 mg/l) + sucrose (20 g/l) + B1 (5 mg/l) + glycine (10 mg/l) 59

Hình 3.9 Mô sẹo Tràm Trà nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D (1mg/l), glycine (5 mg/l), B1 (10 mg/l), cw (15%), sucrose (20 g/l) 62

Hình 3.10 Đường cong sinh trưởng của mô sẹo cây Tràm Trà 63

Hình 3.11 Sắc ký đồ sắc ký khí khối phổ xác định hàm lượng terpinen-4-ol 66

Hình 3.12 Mô sẹo Tràm Trà khi nuôi cấy ngoài sáng 69

Hình 3.13 Dịch huyền phù tế bào Tràm Trà 75

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của dầu Tràm Trà 07

Bảng 3.1 Khảo sát vô trùng mẫu cây Tràm Trà 37

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thành phần khoáng cơ bản nuôi cấy cây Tràm Trà 39

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân cụm chồi Tràm Trà 41

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên khả năng tạo rễ 43

Bảng 3.5a Khảo sát môi trường khoáng thích hợp tạo mô sẹo cây Tràm Trà 45

Bảng 3.5b Thời gian tạo mô sẹo cây Tràm Trà trên bốn loại môi trường khoáng MS, LV, WPM, B5 47

Bảng 3.6a Ảnh hưởng của BA và 2,4-D trong quá trình tạo mô sẹo 50

Bảng 3.6b Ảnh hưởng của BA và 2,4-D đến thời gian tạo mô sẹo 52

Bảng 3.7a Ảnh hưởng của B1 và glycine đến quá trình tạo mô sẹo 54

Bảng 3.7b Ảnh hưởng của B1 và glycine đến thời gian tạo mô sẹo 55

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của BA; NAA và 2,4-D đến nhân sinh khối mô sẹo 58

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến nhân sinh khối mô sẹo 60

Bảng 3.10 Khảo sát ảnh hưởng của số lần cấy chuyền đến hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo 64

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến quá trình nhân sinh khối mô sẹo và hàm lượng terpinen-4-ol trong mô sẹo 67

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ yeast extract, chitosan, casein hydrolysate đến quá trình nhân sinh khối và hàm lượng terpinen-4-ol của mô sẹo 72

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của trọng lượng mẫu ban đầu đến khả năng tạo dịch huyền phù 73

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Tràm Trà (Melaleuca alternifolia Cheel) còn được gọi là Tràm Lá Hẹp là

loại cây chứa tinh dầu có xuất xứ từ nước Úc Trước đây, Tràm Trà được sử dụng

để cải tạo môi trường ở những vùng khí hậu khắc nghiệt, đất gò đồi nghèo dinh dưỡng nhờ khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh Đến năm 1923, cùng với việc các nhà khoa học phát hiện khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Tràm Trà và một số tác dụng dược lý khác (trị viêm họng, viêm da chữa các vết thương bỏng, rắn cắn, cầm máu, trị các chứng bệnh ngoài da như ngứa ngáy, mề đay, gàu, lở loét, mụn trứng cá, rận rệp, đau nhức…) đã giúp cây Tràm Trà trở nên phổ biến với khả năng sản xuất tinh dầu quý Tinh dầu Tràm Trà được sử dụng rộng rãi như một nguồn kháng sinh tự nhiên với nhu cầu ngày càng tăng dẫn đến việc cây Tràm Trà đã được trồng tập trung ở nhiều nơi trên thế giới với mục tiêu sản xuất tinh dầu

Ở Việt Nam, cây Tràm Trà được viện dược liệu di thực về trồng và nhân giống ở các tỉnh phía Bắc vào năm 1986, sau đó được đưa vào trồng ở các tỉnh phía Nam (năm 1995) Từ khi đưa vào trồng ở nước ta cây Tràm Trà cho thấy khả năng thích nghi tốt, không chỉ tham gia phủ xanh đất trống đồi trọc lá Tràm Trà còn tạo

ra các sản phẩm tinh dầu có thể xuất khẩu được Chất lượng tinh dầu Tràm Trà trồng tại Việt Nam phù hợp với tinh dầu Tràm Trà trồng tại Úc với hàm lượng terpinen-4-ol trên 30% (Nguyễn Văn Nghi và ctv, 1997) Giá trị thương phẩm của dầu Tràm Trà phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng terpinen-4-ol, tinh dầu có hàm lượng hoạt chất này cao rất được ưa chuộng và có giá thành cao trên thị trường Tuy nhiên, hàm lượng terpinen-4-ol tích lũy trong cây ngoài tự nhiên phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: mùa, cá thể, các yếu tố ngoại cảnh, thời điểm thu hoạch Vì vậy,

để thu được tinh dầu Tràm Trà với chất lượng tốt gặp rất nhiều khó khăn Bên cạnh

đó, để sản xuất tinh dầu thu hoạt chất terpinen-4-ol đòi hỏi rất nhiều diện tích, thời gian dài, chi phí cao Tổng hợp terpinen-4-ol nhân tạo lại là một quá trình phức tạp

Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã mở ra một hướng mới để giải quyết các vấn đề nêu trên Trong đó, nuôi cấy mô sẹo được xem là kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả, là tiền đề cho các nghiên cứu khác như: tái sinh chồi từ mô sẹo (trong sản xuất giống), nuôi cấy tạo dịch huyền phù tế bào thu nhận các hợp chất thứ cấp Bên cạnh đó, nuôi cấy mô sẹo còn khắc phục được những hạn chế của phương pháp sản xuất truyền thống thu nhận hoạt chất từ nguồn

tự nhiên Với ưu điểm chỉ cần một diện tích nhỏ, chi phí nhân công thấp, có thể tự động hóa ở qui mô công nghiệp và chọn lọc được những dòng tế bào có khả năng sản xuất hoạt chất cao, nuôi cấy mô sẹo cho thấy là một phương pháp hiệu quả để sản xuất terpinen-4-ol trên quy mô công nghiệp Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng, chất cảm ứng đến khả năng sinh

trưởng và tích lũy terpinen-4-ol của mô sẹo cây Tràm Trà (Melaleuca alternifolia

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng

và các chất hữu cơ đến quá trình tạo mô sẹo cây Tràm Trà

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối mô sẹo cây Tràm Trà

- Nghiên cứu sự tác động của điều kiện nuôi cấy và các chất bổ trợ sinh trưởng đến khả năng tích lũy terpinen-4-ol trong mô sẹo cây Tràm Trà

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Đề xuất hướng sản xuất terpinen-4-ol trên quy mô công nghiệp thông qua nuôi cấy mô sẹo Tràm Trà

- Kết quả nghiên cứu của đề tài làm tiền đề cho một số nghiên cứu khác như tái sinh chồi từ mô sẹo tạo nguồn cây giống sạch bệnh với số lượng lớn hay nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Tràm Trà thu nhận các chất có hoạt tính sinh học và hướng tới sản xuất trên quy mô công nghiệp

Chương 1 TỔNG QUAN

Myrtaceae bao gồm hơn 230 loài với

khoảng 219 loài đặc hữu của nước Úc

Trong số đó, một số loài có giá trị sản xuất

tinh dầu thương mại như Melaleuca

alternifolia Cheel, Melaleuca cajuputi,

Melaleuca quinquenervia Blake Tuy nhiên,

Melaleuca alternifolia Cheel hiện là loài

được sử dụng để sản xuất tinh dầu chủ yếu

tại Úc (Baskorowati, 2006)

Tràm Trà là loại cây có tinh dầu

được dùng làm dược liệu, được thuyền

trưởng James Cook (người Anh) phát hiện ở

bờ biển New South Wales của nước Úc vào năm 1770 Cây Tràm Trà mọc trong các đầm lầy, vùng đất thấp trên bờ biển ở phía bắc New South Wales, nơi mà các bộ tộc bản địa sử dụng lá tràm như là một chất khử trùng trong nhiều thế kỷ Sau đó, những người tới định cư bắt đầu sử dụng lá để điều trị một loạt các bệnh về da như

Hình 1.1 Cây Tràm Trà

(Baskorowati, 2006)

vết cắt, vết bỏng, vết côn trùng cắn Từ đó, việc sử dụng dầu cây Tràm Trà lan rộng và bây giờ phổ biến trên toàn thế giới như một chất kháng sinh tự nhiên Các sản phẩm tinh chế từ tinh dầu Tràm Trà chứa hàm lượng terpinene-4-ol cao và hàm lượng 1,8-cineole thấp (dưới 5%) đã phát triển mạnh trên quy mô thương mại Trong giai đoạn những năm 1926, dầu Tràm Trà Úc sản xuất chủ yếu từ nguồn tự nhiên thu trên bờ biển phía bắc của New South Wales với sản lượng 2 - 20 tấn/năm (Baskorowati, 2006) Do nhu cầu dầu Tràm Trà gia tăng từ cuối những năm 1980 Tràm Trà đã được trồng tập chung trên quy mô công nghiệp (chủ yếu ở phía bắc New South Wales và Bắc Queensland) với tổng diện tích 4.000 ha có thể đáp ứng nhu cầu dầu Tràm Trà gần 500 tấn/năm

1.1.1 Phân bố sinh thái

Trong tự nhiên, các loài Melaleuca nói chung được tìm thấy trong các rừng

thưa, rừng gỗ hay vùng đất có cây bụi, cụ thể là dọc theo các dòng suối và rìa các đầm lầy (Riedl, 1997) Ở nước Úc cây Tràm Trà mọc chủ yếu trong các đầm lầy, vùng đất thấp trên bờ biển ở phía bắc New South Wales

Sau khi di thực vào nước ta (tháng 6/1986), cây Tràm Trà được trồng tại các địa phương như: Hà Nội, Hà Tây, Quảng Bình, Phú Yên… Với số lượng cây rất ít Năm 1995, chương trình hợp tác với Úc bác sĩ Nguyễn Hoàng Tâm trồng trên quy

mô 25 ha tại xã Lộc Thành - Lộc Ninh - Bình Phước đã khai thác được tinh dầu cho xuất khẩu với số lượng lớn Việc đánh giá khả năng sinh trưởng, tính thích nghi của cây Tràm Trà trên các vùng sinh thái cùng với các phương pháp nhân giống bằng hạt hay bằng giâm cành có hiệu quả kinh tế, nhằm từng bước phát triển cây tinh dầu mới này trên cả nước đã được thực hiện

1.1.2 Đặc điểm thực vật học

Tràm Trà thuộc loại cây thân gỗ cao từ 2 - 30 m, có lớp vỏ dễ tróc Lá màu xanh, mọc so le, hình trứng hay mũi mác, dài 1 - 25 cm và rộng 0,5 - 7 cm, mép lá nhẵn, màu xanh lục sẫm hay xanh xám Hoa mọc thành cụm dày đặc dọc theo thân Cụm hoa có gai bao gồm 08 - 24 hoa đơn (chiều dài 5 mm, chiều rộng 2 mm) Mỗi bông hoa là một thể hoàn chỉnh với cơ quan sinh sản đực và cái, gồm 4 lá đài, 4

cánh hoa, 5 nhị chứa nhiều bao phấn

được gắn bởi chỉ nhị ngắn và một đầu

nhụy nhỏ ở phần cuối của mỗi nhị

Tất cả các bộ phận của hoa

trước khi nở được bao bọc bởi những

cánh hoa trắng Khi các cánh hoa mở,

các nhị bung ra, phô ra các nhị hoa với

các sợi mịn như lông tơ màu trắng

Phấn hoa của các hoa đơn được tung

ra trước đầu nhụy và được nhụy thu

lấy

Một số lượng lớn hoa được sinh

ra trên một cây trong một khoảng thời gian 2 - 3 tuần thường là từ giữa tháng mười đến cuối tháng mười một Do đó, có rất nhiều cơ hội cho nhụy hoa nhận phấn từ hoa gần đó của cùng một cây làm tăng khả năng tự thụ phấn (Baskorowati, 2006)

1.1.3 Thành phần hóa học

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thới Nhâm và ctv (2002), thành phần hóa học của tinh dầu Tràm Trà trồng tại Việt Nam có chứa hàm lượng terpinen-4-ol cao (46,6%) và chứa ít cineol (5,05%) Thành phần chủ yếu của tinh dầu Tràm Trà Úc

ngược lại với tinh dầu Tràm (Melaleuca cajuputi) chứa khoảng 45 - 60% cinoel,

nhưng chỉ chứa rất ít terpinen-4-ol (1 - 1,5%)

Dầu Tràm Trà được chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước chủ yếu

từ lá của Melaleuca alternifolia Lá Tràm Trà chứa 2% dầu dễ bay hơi màu vàng

nhạt Khoảng một phần ba phần tinh dầu này bao gồm các hydrocarbon terpene như beta-pinen, limonene, aromadendrene, 1-8 cineole và nhiều hợp chất khác Phần còn lại bao gồm các terpen oxy hóa, với 30% terpinen-4-ol (Tyler, 1994) Brophy và ctv (1989) đã thử nghiệm trên 800 mẫu dầu Tràm Trà và xác định được khoảng 100 thành phần có trong dầu Tràm Trà Trong đó, terpinen-4-ol là nhiều nhất cùng với các thành phần khác như terpinolene và 1,8-cineole… (Bảng 1.1) Các thành phần

Hình 1.2 Hoa Tràm Trà

(Baskorowati, 2006)

này có tác dụng tương tự trên các bệnh do vi sinh vật gây ra (Homer và ctv, 2000)

Ngày nay, trong sản xuất thương mại dầu Tràm Trà được gọi là TTO và tổ chức tiêu

chuẩn quốc tế (ISO) đã quy định về tỷ lệ tối thiểu và tối đa cho 14 thành phần trong

dầu, đặc biệt là terpinen-4-ol (trên 30%) và 1,8-cineole (dưới 15%) (ISO 2004)

(Bảng 1.1) Những quy định này được ban hành vì terpinen-4-ol được cho là thành

phần hoạt động và 1,8 cineole đã được báo cáo là một chất kích thích da (Carson và

ctv, 2006) Hiện nay, tiêu chuẩn này vẫn tồn tại vì 1,8-cineole và terpinen-4-ol

thường có tỷ lệ nghịch đảo trong dầu, dầu với nồng độ terpinen-4-ol cao hơn được

xác định là có hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn (Brophy và ctv, 1989)

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của dầu Tràm Trà (Carson và ctv, 2006)

Thành phần Tỷ lệ trung

bình (%)

Tỷ lệ tối thiểu (%)

Tỷ lệ tối

đa (%)

Tiêu chuẩn ISO 4730 (%)

1.1.4 Công dụng

Tinh dầu Tràm Trà có màu vàng chanh nhẹ với mùi thơm dễ chịu, là chất khử trùng không gây hại sức khỏe Tinh dầu Tràm Trà Úc có tác động kháng khuẩn trên cả vi khuẩn gram (-) và gram (+) thử nghiệm và hoạt lực kháng khuẩn tương đương với nhóm kháng sinh cephalosporin thế hệ 2 Tính chất kháng khuẩn này có thể ứng dụng trong các chế phẩm xoa bóp, trị viêm họng, viêm da, trong mỹ phẩm Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu về các chỉ số vật lý, các chỉ số đặc trưng và thành phần hóa học của tinh dầu giúp góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm phân biệt

tinh dầu Melaleuca alternifolia với các tinh dầu khác (Nguyễn Thới Nhâm và ctv,

2002)

Tinh dầu Tràm Trà được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất kem đánh răng, nước súc miệng, dùng để chữa các vết thương bỏng, rắn cắn, để cầm máu, trị các chứng ngoài da như ngứa ngáy, mề đay, gàu, lở loét, mụn trứng cá, rận rệp, đau nhức, nức nẻ, viêm lợi… Hiện nay, nhu cầu tinh dầu Tràm Trà trên thế giới rất lớn, các nước như Mỹ, Nga, Châu Âu… Hàng năm phải nhập với số lượng rất lớn, giá từ

25 - 42 USD/kg tinh dầu (Nguyễn Văn Minh, 2010)

Từ năm 1992, một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy khả năng điều trị tốt của dầu Tràm Trà so với một số phương pháp điều trị thông thường như trong thử nghiệm điều trị bệnh nấm móng tay trên 117 bệnh nhân, các nhiễm trùng được điều trị trong sáu tháng với hai lần trong một ngày, các bệnh nhân trong hai nhóm thử nghiệm được điều trị bằng clotrimazole 1% hoặc 100% dầu Tràm Trà Cuối quá trình điều trị, cả hai nhóm đều cho thấy kết quả tích cực như nhau (Buck và ctv, 1994) Dầu Tràm Trà cũng có hiệu quả loại bỏ chí, các vi sinh vật gây bệnh viêm da tiết bã và gàu (Veal, 1996) Ngoài ra, dầu Tràm Trà còn ức chế sự phát triển của

nhiều loài và chủng nấm khác như thử nghiệm đối với 26 chủng Dermatophytes và

54 chủng nấm men (bao gồm 32 chủng Candida albicans và 22 chủng Malassezia

furfur) đã cho kết quả ức chế sự phát triển của tất cả các chủng nấm này (Nenoff và

ctv, 1996) Trong một nghiên cứu khác, dầu Tràm Trà cho thấy khả năng ức chế đến

90% trên 64 chủng Malassezia furfur, nồng độ ức chế tối thiểu của dầu Tràm Trà là

0,25% Ngoài ra dầu Tràm Trà còn ức chế sự phát triển của Candida albicans,

Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Aspergillus niger và Microsporum gypsum (Conoha và ctv, 1998)

Trong một số nghiên cứu in vitro cho thấy hiệu quả của dầu Tràm Trà trong

ức chế các tác nhân gây bệnh da phổ biến Terpinen-4-ol và các hợp chất khác trong dầu Tràm Trà đã được chứng minh là có hiệu quả trong hoạt động chống lại

Staphylococcus aureus Một số thành phần của dầu Tràm Trà (terpinen-4-ol,

alpha-tecpineol, alpha-pinen và cineole) đã được thử nghiệm khả năng ức chế sự phát

triển của Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis và Propionibacterium

acnes cho kết quả ngoài cineole tất cả các thành phần thử nghiệm đều có khả năng

ức chế cho cả ba vi sinh vật nói trên (Raman và ctv, 1995)

Dầu Tràm Trà cũng được sử dụng trong một số dầu gội vật nuôi để diệt ve,

bọ chét và xua đuổi các loài côn trùng Nó cũng được dùng để điều trị ngứa do côn trùng cắn Nó được cho là hiệu quả trong điều trị viêm xoang, viêm phế quản, viêm họng khi thêm một vài giọt vào nước nóng và hít hơi vào Dầu Tràm Trà cho vào nước ấm được sử dụng như nước súc miệng là một phương thuốc phổ biến để giúp bảo vệ chống lại các bệnh về răng và viêm nướu

Dầu Tràm Trà là một phương thuốc truyền thống của thổ dân Úc trong điều trị vết bầm tím, vết côn trùng cắn và nhiễm trùng da Loại dầu này được xem là không độc, có mùi dễ chịu và nó được sử dụng trong các sản phẩm dành cho da và chăm sóc vết thương Trong thực tế, tính chất lipophilic của dầu cho phép nó thâm nhập da Do đó, nó có thể thích hợp cho việc sử dụng điều trị tại chỗ trong điều trị niêm mạc do nấm và nhiễm trùng da

1.1.5 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Tràm Trà

1.1.5.1 Công trình nghiên cứu trong nước

Từ khi viện dược liệu di thực cây Tràm Trà về trồng và nhân giống ở các tỉnh phía bắc nước ta vào năm 1986, loại cây này đã cho thấy khả năng sẽ mang lại giá trị kinh tế cao Từ đó, một số công trình nghiên cứu đã được thực hiện xung

quanh các vấn đề về xác định thành phần hóa học, phương thức nhân giống, kỹ thuật trồng và chăm sóc… Nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất

Tinh dầu Tràm Trà trồng tại Úc rất được ưa chuộng và xuất khẩu đi nhiều nước trên thế giới Sau khi di thực về nước ta, cây Tràm Trà đã cho thấy khả năng sinh trưởng tốt Tuy nhiên, giá trị dược liệu, thành phần hóa của tinh dầu tràm trồng

ở Việt Nam so với tinh dầu tràm trồng tại Úc vẫn chưa được xác định Qua đề tài nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu Tràm Trà trồng tại Việt Nam, Nguyễn Văn Nghi và ctv (1986) đã xác định và chia thành phần hóa học của dầu tràm thành hai loại chính:

- Loại thương phẩm có thành phần chủ yếu là terpinen-4-ol (thấp nhất 33%, cao nhất 46%), α-terpinen (thấp nhất 3%, cao nhất 13%), γ-terpinen (thấp nhất 10%, cao nhất 25%) Loại này có thành phần phù hợp với tinh dầu tràm thương phẩm Úc

đã được công bố

- Loại có thành phần chủ yếu là terpinolen (thấp nhất 37,65%, cao nhất 60,28%), 1,8-cineol (thấp nhất 16,31%, cao nhất 28,84%) khác hẳn với loại thương phẩm trên

Cây Tràm Trà có thể nhân giống bằng hạt tuy nhiên sau 15 năm được ươm trồng từ hạt ở Việt Nam cây Tràm Trà vẫn chưa cho hạt dẫn đến một số khó khăn trong việc nhân giống loài cây này Từ lý do đó, Nguyễn Văn Nghi và ctv (1986) đã tiến hành nghiên cứu nhân giống loại cây này bằng phương pháp vô tính với hai

hướng là chiết cành và nhân giống in vitro Tuy nhiên, đề tài chỉ dừng lại ở giai đoạn tạo cây giống in vitro thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Sau khi thực hiện đề tài nhân giống vô tính cây Tràm Trà vào năm 1998 Nguyễn Văn Nghi tiếp tục thực hiện đề tài nghiên cứu khả năng sinh trưởng và tích lũy tinh dầu của cây Tràm Trà ở Việt Nam Kết quả cho thấy cây Tràm Trà trồng tại Quảng Bình, Hà Nội và Hà Tây đều thể hiện khả năng sinh trưởng tốt và hàm lượng

tinh dầu thu được trong lá tươi từ 1,7 - 2,2%

1.1.5.2 Công trình nghiên cứu nước ngoài

Ngoài khả năng cải tạo môi trường cây Tràm Trà còn cung cấp nguồn tinh dầu chất lượng cao Tinh dầu tràm có màu vàng chanh nhẹ với mùi thơm dễ chịu là chất khử trùng không gây độc hại được sử dụng rộng rãi trên thị trường thế giới Do tính phổ biến của tinh dầu Tràm Trà nên đã có rất nhiều nghiên cứu về loại cây này Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào thành phần hóa học và công dụng của tinh dầu Một số ít nghiên cứu liên quan đến vấn đề tạo giống, chọn giống, chăm sóc, thu hoạch, giá trị kinh tế… Với các công trình nghiên cứu như:

Thành phần hóa học của TTO bao gồm một hỗn hợp phức tạp của monoterpenoids gồm terpinen-4-ol (thành phần hoạt động chính) và các tecpen khác (Altman, 1988) TTO có khả năng ức chế hoạt động vi khuẩn (Markham, 1999), có thể hoạt động này chủ yếu do tác dụng của terpinen-4-ol (Southwell và ctv, 1993)

và có tính nhạy cảm đối với một loạt các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) (Altman, 1988) TTO đã được sử dụng trong điều trị mụn trứng cá (Basset và ctv, 1990) Cuối cùng, một số nghiên cứu điều tra khả năng chống viêm của TTO và các dữ liệu gần đây đã chứng minh rằng terpinen-4-ol ngăn chặn các tác nhân gây viêm nhiễm

ở người (Hart và ctv, 2000)

Lợi nhuận mang lại từ tinh dầu Tràm Trà đã làm nổi lên phong trào nhân giống và trồng mới loài cây này ở nhiều nơi trên thế giới Tuy nhiên, số lượng và chất lượng tinh dầu thu được lại phù thuộc vào nhiều yếu tố như giống loài, mùa vụ, thổ nhưỡng, thời điểm thu hoạch… Trong đó, chất lượng cây giống được xem là yếu tố quan trọng và có tác động nhiều nhất Với mục đích cải thiện chất lượng cây giống, tạo nguồn cây giống đảm bảo chất lượng cho thị trường nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện Qua chiến lược kiểm soát quá trình sinh sản của cây Tràm Trà, ACIAR đã chọn lọc được những kiểu gen tốt cho năng suất cao, đồng thời đưa ra phương pháp sản xuất và bảo quản hạt giống (Baskorowati, 2006) Không dừng lại ở việc tạo cây giống theo phương pháp truyền thống từ hạt Vào năm 2010,

Yohana và ctv đã tiến hành nghiên cứu nhân giống cây Tràm Trà in vitro trên hai

môi trường MS và WPM kết quả cho thấy cây Tràm Trà phát triển và tạo chồi tốt trên môi trường MS có bổ sung 0,55 μM BA

terpene-4- Con đường tổng hợp terpenoid

 Con đường sinh tổng hợp monoterpenes trong tinh dầu Tràm Trà

Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp monoterpenes trong tinh dầu Tràm Trà

(Shelton và ctv, 2002)

 Mối liên hệ giữa các monoterpenes trong tinh dầu Tràm Trà

 Cơ chế tác động của terpinen-4-ol trong dầu Tràm Trà

Sự phức tạp về tỷ lệ của các thành phần được tìm thấy trong dầu Tràm Trà cho thấy rằng sự kết hợp của một số thành phần có khả năng đóng góp cho hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng Terpinen-4-ol và α-tecpineol chiếm đa số trong những hoạt động kháng khuẩn và chống nấm (Carson và ctv, 2006) Cùng với terpinen-4-ol và

Hình 1.5 Mối liên hệ sinh hóa giữa các monoterpenes trong tinh dầu Tràm Trà 1:

geranyl diphosphate, 2: linalyl carbocation, 3: geranyl carbocation, 4: α-terpinyl carbocation, 5: terpinenyl carbocation, 6: piperitenyl carbocation, 7: phellandryl carbocation, 8: pinyl carbocation, 9: sabinyl carbocation, 10: linalool, 11: myrcene, 12: β- pinene, 13: α-pinene, 14: limonene, 15: α-terpineol, 16: 1,8-cineole, 17: terpinolene, 18: α-terpinene, 19: γ- terpinene, 20: terpinen-4-ol, 21: α-thujene, 22: sabinene, 23: sabinene hydrate, 24: piperitol, 25: α-phellandrene, 26: β- phellandrene, 27: p- cymene (Andras và ctv, 2010)

α-tecpineol, α-pinen đã được chứng minh là có hoạt động chống lại vi khuẩn (Raman và ctv, 1995) Ngoài ra, thành phần linalool và limonene cũng đã cho thấy hoạt tính kháng khuẩn (Cox và ctv, 1998) Terpinen-4-ol, thành phần chính của TTO, đã được công nhận là thành phần kháng khuẩn chính của dầu, vì nó thường hiện diện ở nồng độ cao nhất (Carson và Riley 1995)

Bằng cách sử dụng liposome, tecpen đã thể hiển hoạt động bằng cách tập trung trong lớp màng đôi làm phá vỡ tính toàn vẹn của màng tế bào và phá vỡ hoạt động của proton (Sikkema và ctv, 1995) Các nghiên cứu khác chỉ ra rằng tecpen có thể phá vỡ hoặc đi qua các lớp lipid (Cox và ctv, 1998) Thử nghiệm trên một vài vi khuẩn, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng cơ chế mà TTO tác động đến vi khuẩn tương tự như cơ chế hoạt động của tecpen là phá vỡ cấu trúc và chức năng bình thường của màng (Carson và ctv, 2002)

Theo Reichling và ctv (2009), monoterpen có khả năng kháng khuẩn bằng cách làm gia tăng tính thấm và độ linh động của màng nguyên sinh chất, xáo trộn vị trí của các protein gắn trên màng, ức chế hô hấp và thay đổi quá trình vận chuyển các ion qua màng tế bào Một tính chất quan trọng của tinh dầu và các thành phần của chúng là tính kỵ nước Do đó, các thành phần này có khả năng chia cắt lipid, phá vỡ cấu trúc, làm tăng tính thấm của màng tế bào và ty thể, chúng thấm qua màng làm trương (phồng) tế bào, ức chế các enzyme hô hấp, làm suy giảm gradient

pH và điện thế màng, làm hư hỏng màng nguyên sinh chất Vì vậy, làm thay đổi hình thái tế bào, tác động lên màng tế bào, vách tế bào và ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào

1.3 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức hình thành từ các mô hay cơ quan đã phân hóa thông qua quá trình phản phân hóa Trong những điều kiện nhất định như: sự cân bằng các chất điều hòa sinh trưởng trong thực vật thay đổi, có vết thương… Thì ở các mô hoặc cơ quan sẽ xảy ra một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên, làm cho các tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa)

Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện

thích hợp Ngoài nguyên nhân do sự phản phân hóa sự tạo mô sẹo còn xảy ra do sự

xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan

(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện với những loại cây không có khả năng nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

1.3.1 Các giai đoạn trong quá trình hình thành mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không có lớp nhu mô Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây Mô sẹo hình thành ở hầu hết các

bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt Điều quan trọng được nhận thấy

ở đặc tính mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh

Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy Sự hình thành mô sẹo chia ra

3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa

- Giai đoạn 1: Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy

- Giai đoạn 2: Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối

- Giai đoạn 3: Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào

và sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học

Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo như mô các loại, các tế bào rây… Hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quan tự dưỡng Mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độ ánh sáng Có nhiều yếu tố ảnh hưởng

đến khả năng quang tự dưỡng của những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) như: cường độ ánh sáng mạnh, ánh sáng màu xanh cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzyme, auxin thấp, CO2 cao và tăng hàm lượng phosphate và những tế bào quang tự dưỡng này có khả năng cố định CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon

Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào Sự biến tính này xảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhất là chất điều hòa sinh trưởng

Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, đôi khi dịch chiết Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất điều hòa sinh trưởng thêm vào có khác nhau Chất điều hòa sinh trưởng thường tổ hợp thành

4 nhóm: auxin, cytokinin, auxin kết hợp với cytokinin, dịch chiết (Trần Văn Minh, 2006)

1.3.2 Những nhân tố ảnh hưởng tới quá trình phát sinh mô sẹo

Hầu hết các mô và cơ quan thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo Khả năng này phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, hóa sinh và kiểu gene Sự tăng sinh mô sẹo là

do sự căn bằng giữa trạng thái sinh lý mẫu nuôi cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng

Cơ quan được nuôi cấy: các mô và cơ quan khác nhau của thực vật có thể được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy tạo mô sẹo như lá, thân, rễ, củ, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chưa trưởng thành và trưởng thành…Tuy nhiên, mỗi loại mô hay

cơ quan thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ sử dụng phù hợp với độ nhạy cảm của tế bào trong mô hay cơ quan đó

Sinh lý mẫu nuôi cấy: mẫu cơ quan nuôi cấy trưởng thành thường khó nuôi cấy phát sinh cơ quan hay mô sẹo Ngược lại, với những mẫu nuôi cấy còn non auxin kích thích tạo mô sẹo dễ dàng trên những vết cắt

Vai trò của ánh sáng: tùy loài thực vật hay mẫu nuôi cấy quá trình hình thành

mô sẹo cần ánh sáng hay trong tối

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo

mô sẹo Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra: sự tạo bướu ở các mô và

cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma trong dịch huyền phù tế bào Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ bất định nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo Auxin được sử dụng để tạo mô sẹo với loại

và nồng độ thay đổi tùy thuộc vào vật liệu nuôi cấy Đa số các mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có sự phối hợp giữa auxin và cytokinin Sự tạo mô sẹo từ lá

solanum melongena xảy ra trên môi trường có nhiều loại auxin khác nhau như

NAA; 2,4-D; 2,4,5-T ở các nồng độ thay đổi từ 0,1 - 10 mg/l, còn ở tử diệp cây

mầm Azadirachta indica cần IAA ở nồng độ 0,5 mg/l và BA 1,0 mg/l để có thể tạo

mô sẹo (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

1.3.3 Các giai đoạn phát triển của mô sẹo

Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần khả năng tái sinh càng giảm Sự tăng trưởng của mô sẹo thường theo đường cong sigma và gồm 5 pha: Thời kì đầu tế bào chuẩn bị phân chia (lag phase), thời kì tăng trưởng nhanh tế bào phân chia cực đại (exponential phase), thời kì tăng trưởng tuyến tính tế bào phân chia chậm dần và tăng kích thước (linear stage), thời kì tăng trưởng chậm (decelerating growth), thời

kì cân bằng số lượng tế bào là hằng số (stationary phase) (Dương Công Kiên, 2003)

Auxin có vai trò khá quan trọng trong sự tăng sinh của mô sẹo Mô sẹo sau khi hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì sẽ tăng sinh nhanh, nhưng nếu chuyển sang môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưng không có auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ rất chậm Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phân cũng như nồng độ của auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

1.3.4 Hình thái mô sẹo

Sau khi trưởng thành mô sẹo được cấy chuyền Môi trường cấy chuyền cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất điều hòa sinh trưởng được giảm nồng

độ Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô sẹo có kích thước 5 - 10 mm và có trọng lượng 20 - 100 mg, thời gian giữa

2 lần cấy chuyền là 20 - 30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào:

- Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ, tế bào chất loãng

- Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to, tế bào chất đậm đặc

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy cũng

có tác động khá lớn đến sự phát sinh hình thái của mô sẹo Nếu giữ nguyên nồng độ

và loại auxin trong môi trường nuôi cấy nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái của mô sẹo sẽ thay đổi Trong đa số các trường hợp, sự hiện diện của BA trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và có khả năng sinh phôi Mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở và thường không có khả năng sinh phôi Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

1.3.5 Màu sắc của mô sẹo

Mô sẹo của nhiều loài thực vật khác nhau về cấu tạo (tổ chức), độ xốp và màu sắc Nó có thể có màu vàng úa hay trắng, có màu diệp lục hay màu sắc tố anthocyanin Sắc tố đôi khi đồng dạng hay bị phân bố có những vùng không có cấu trúc sắc tố Cấu trúc sắc tố thường giống như cấu trúc ở mô của mô sẹo và có lẻ mất dần đi qua cấy chuyền nhiều lần Mô sẹo có cấu trúc sắc tố xanh sinh trưởng ngoài sáng tốt hơn trong tối Cấu trúc sắc tố còn chịu ảnh hưởng ở các mức độ khác nhau của hàm lượng đường, sự có mặt của tinh bột hòa tan, thiếu hụt nitrogen, nhiệt độ, ánh sáng và auxin ngoại sinh

Theo Mol và ctv (1996), anthocyanin là tác nhân tạo nên màu xanh, tím, đỏ

và cam ở thực vật bật cao Trong tự nhiên, việc tổng hợp anthocyanin bị tác động bởi các yếu tố như bức xạ ánh sáng, nhiệt độ, chất kích kháng và mức độ dinh dưỡng, hàm lượng đường sucose (Nagira và Ozeki, 2004; Hennayake và ctv, 2006), nồng độ NH4+ (Konczak và ctv, 2001; Piovan và Filippini, 2007) Trong đó, ánh

sáng là một yếu tốt khá quan trong Cụ thể mô sẹo khi được nuôi cấy ngoài sáng có khả năng tổng hợp anthocyanin cao hơn trong tối Kết quả sự tổng hợp anthocyanin của mô thực vật khi được chiếu sáng được quyết định bởi của các gen liên quan đến sinh tổng hợp anthocyanin (Mol và ctv, 1996) Mô sẹo phát triển trong điều kiện được chiếu sáng sẽ có hoạt động trao đổi chất tốt hơn so với mô sẹo nuôi trong tối và một lượng lớn protein được sản xuất, đây là một dấu hiệu của sự tăng biểu hiện gen Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về tác động của ánh sáng đến một số gen tổng hợp anthocyanin chỉ ra rằng sự biểu hiện của gen tổng hợp anthocyanin được kiểm soát chủ yếu bởi các cơ quan thụ cảm UV-B và cơ quan này được điều chỉnh bởi ánh sáng Cơ chế sự truyền tín hiệu liên quan đến vai trò trung gian của ánh

sáng như trong nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo Oxalis reclinata ánh sáng là một tác

nhân kích thích tổng hợp anthocyanin hay trong công trình nghiên cứu của Crouch

và ctv (1993), người đầu tiên báo cáo về sự tích lũy màu đỏ, màu của anthocyanin

trong nuôi cấy mô sẹo Oxalis reclinata

1.3.6 Phát sinh cơ quan trong nuôi cấy mô sẹo

Sự phát sinh cơ quan có thể hình thành trong khối mô sẹo được kiểm soát phát sinh cơ quan tiềm sinh qua vận dụng môi trường dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng Sự tái sinh diễn ra trên môi trường đơn giản hơn là nhu cầu nuôi cấy

mô Thông thường môi trường dinh dưỡng chứa các thành phần vô cơ, hữu cơ, chất điều hòa sinh trưởng… Mỗi loại mô có nhu cầu riêng và đôi khi mô cần các chất hỗ trợ khi sinh trưởng kém Hiện tượng này phụ thuộc vào một số tác nhân như nguồn gốc mô sẹo nuôi cấy, kiểu gen và tuổi sinh lý, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng

và các tác nhân vật lý

Sự phát sinh cơ quan phụ thuộc vào kích thước mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy nhỏ khả năng tái sinh thấp, mẫu nuôi cấy lớn có chứa nhu mô tủy, mô mạch và tượng tầng có khả năng phát sinh chồi mà không phụ thuộc vào nồng độ auxin và cytokinin Tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy cũng là nhân tố ảnh hưởng đến quá trình hình

thành cơ quan Ở Echevaria, lá già phát sinh chồi, lá non phát sinh rễ và lá có độ

tuổi trung bình phát sinh chồi và rễ Chất lượng và cường độ ánh sáng tác động theo

quy luật ảnh hưởng đến hiện tượng phát sinh cơ quan Vùng ánh sáng xanh thúc đẩy hình thành chồi, ánh sáng đỏ thích hợp hình thành rễ Trong tính chất tự nhiên quá trình biệt hóa trong mô có thể bị kiểm soát bởi nhiều bước sóng ánh sáng khác nhau Ánh sáng gia tăng hình thành rễ ở vài mô tách rời và ức chế các mô khác

 Sự hình thành chồi từ mô sẹo

Sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi: các chất sinh trưởng đưa vào môi trường, chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo, các chất có chứa sẵn trong các mẫu nuôi cấy Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy truyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài và sự hình thành tế bào xốp Sự hình thành chồi được điều khiển bằng: tỷ lệ cytokinin/auxin từ 10 - 100, carbohydrate như sucrose và các chất hữu cơ như casein hydrolysate, điều kiện nuôi cấy, dịch chiết Tạo rễ cần auxin, đường, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng, adenin sulfate có tác dụng cản trở auxin GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy hạt tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi Sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môi trường không sinh trưởng, hay có cytokinin + IBA có hiệu quả hơn so với chỉ dùng auxin

Ở hầu hết mô sẹo, sự hình thành chồi thường bị giảm do tuổi sinh lý già và cấy chuyền nhiều lần nhưng khả năng ra rễ có thể tồn tại nhiều năm như ở cây mía Phát sinh chồi đỉnh có thể phát sinh rễ và ngược lại hay chồi phát sinh có thể sinh

trưởng không cần rễ như ở loài Pergularia Mô sẹo có thể duy trì khả năng không

biệt hóa qua sinh trưởng tăng sinh không cần hormone và trao đổi chất Đây là quá trình sinh trưởng mạnh mẽ và mô sẹo thường khó tái sinh (Trần Văn Minh, 2003)

1.3.7 Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo

- Nhân giống in vitro các loài thực vật mà phương pháp nhân giống đỉnh sinh

trưởng ít hiệu quả hay khó thực hiện

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

- Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào

- Thu nhận các sản phẩm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao

- Làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào

1.3.8 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào

Chất điều hòa sinh trưởng: nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến nuôi cấy tế bào cho thấy chất sinh trưởng cần thiết cho quá trình nuôi cấy tế bào, ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào thành cơ quan chồi thân lá rễ, chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các hợp chất thứ cấp và cấu trúc tế bào, chất điều hòa sinh trưởng tác động riêng lẻ hay phối hợp trong cùng nhóm hay cả hai nhóm đến sự sinh trưởng tế bào và tổng hợp các chất thứ cấp Nồng độ chất sinh trưởng sử dụng từ 1 - 10 mg/l

Nguồn đạm: chủ yếu là đạm hòa tan, đạm dạng nitrate hay tổng hợp đạm nitrate và amôn Đôi khi sử dụng casein hydrolysate và các nguồn đạm tự nhiên

Nguồn cacbon: sucrose là nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu được sử dụng đôi khi phụ thuộc vào các loại cây trồng có sử dụng mantose, galactose hay glucose Loại đường và nồng độ đường sử dụng ảnh hưởng đến hàm lượng các chất thứ cấp thu được

Ánh sáng: các chất thứ cấp tạo ra trong quá trình nuôi cấy trong tối hay có

ánh sáng phụ thuộc vào từng loại thực vật và quá trình dinh dưỡng trong nuôi cấy in

vitro

Các chất khác: đôi khi trong quá trình nuôi cấy còn chịu tác động bởi pH môi trường, nồng độ phosphate, loại và nồng độ các loại khí như oxy, cacbonic, ethylen

và được bổ sung yeast extract, nước dừa, chitosan…

1.3.9 Các phương pháp nâng cao tổng hợp hoạt chât trong nuôi cấy tế bào

- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

- Phương pháp cố định tế bào

- Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao

- Cung cấp tiền chất (precursor feeding)

- Chất kích kháng bảo vệ thực vật (chất cảm ứng)

1.3.9.1 Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy

Khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào có thể chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố vật lý (như nhiệt độ, độ thoáng khí, ánh sáng, pH…) và hoá học (như chất điều hoà sinh trưởng thực vật), thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy…Tuỳ từng loại tế bào mà sự đáp ứng với các yếu tố kể trên sẽ khác nhau Khi xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu thì sự sản xuất và tích luỹ các hợp chất thứ

cấp trong tế bào in vitro sẽ cao hơn so với cây trồng ngoài thiên nhiên (Verpoorte và

ctv, 1994)

1.3.9.2 Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao

Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thể tế bào có nhiều kiểu gen khác nhau Do đó, các đặc tính sinh lý của tế bào sẽ khác nhau Phương pháp chọn lọc dòng tế bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp

1.3.9.3 Bổ sung tiền chất

Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng những hợp chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đường sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp nào đó Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn vào môi trường nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả sản xuất của tế bào trong một số trường hợp xác định Phương pháp này sẽ

có giá trị khi giá thành của các tiền chất không quá đắt

1.3.9.4 Cố định tế bào

Trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận các sản phẩm thứ cấp, việc cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử dụng, đặc biệt là trong các hệ thống phản ứng sinh học Mặt khác, những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi trường hơn so với tế bào tự do Tế bào cố định thường là những tế bào có khả năng tiết các sản phẩm thứ cấp ra môi trường ngoài Tế bào ở trạng thái cố định đôi khi tạo ra được các hợp chất thứ cấp có sản lượng cao hơn tế bào ở trạng thái lơ lững tự

do Các chất được sử dụng để cố định tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar, các sợi propylen… Sự cố định tế bào giúp tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp nhưng