NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 9 GIỐNG MÈ (Sesamum indicum L.) SỬ DỤNG ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ RAPD

ANOVA: analysis of variance Phân tích biến lượng bp: base pair cặp bazơ CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Chất hoạt hóa dương dNTP: Deoxyribonucleotide Triphosphate EB: extraction b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH H

CAO MINH THỦY NGUYÊN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 9 GIỐNG

MÈ (Sesamum indicum L.) SỬ DỤNG ĐẶC ĐIỂM

HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ RAPD

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thàn ph Hồ ChíMinThán 03/201

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH H

**********************

CAO MINH THỦY NGUYÊN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 9 GIỐNG

MÈ (Sesamum indicum L.) SỬ DỤNG ĐẶC ĐIỂM

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 9 GIỐNG

MÈ (Sesamum indicum L.) SỬ DỤNG ĐẶC ĐIỂM

HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ RAPD

CAO MINH THỦY NGUYÊN

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: GS.TS Nguyễn Thị Lang

Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

2 Phản biện 1: TS Nguyễn Hữu Hổ

Viện Sinh Học Nhiệt đới

3 Phản biện 2: TS Võ Thái Dân

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

4 Thư ký: TS Phạm Đức Toàn

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

5 Ủy viên: TS Bùi Minh Trí

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Cao Minh Thủy Nguyên, sinh ngày 29 tháng 11 năm 1981, tại quận Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh, con của ông Cao Minh Dũng và bà Lê Thị Thu Thủy

Tốt nghiệp Tú tài tại Trường Trung học Phổ thông Võ Thị Sáu, Quận Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh

Tốt nghiệp Đại học ngành Nông học, hệ tại chức tại Đại học Nông Lâm, TP

Hồ Chí Minh Sau đó làm việc tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo tồn Tài nguyên Thiên nhiên, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP Hồ Chí Minh

Tháng 9 năm 2008 theo học Cao học ngành Trồng trọt tại Trường Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của tôi Các số liệu, kết quả được nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được bất cứ ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Người cam đoan

Cao Minh Thủy Nguyên

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh;

Các Thầy Cô trong Khoa Nông học cùng các Thầy Cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt 2 năm Cao học vừa qua, cám ơn các Thầy Cô đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng gửi lời biết ơn đến:

TS Bùi Minh Trí đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như tạo điều kiện tốt nhất cho việc thực hiện và hoàn tất đề tài tốt nghiệp

ThS Võ Thị Thúy Huệ đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Các anh chị trong Trung tâm Phân tích Hóa sinh đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Chương trình hợp tác nghiên cứu Việt Nam – Thụy Điển (SIDA/SAREC) đã

hỗ trợ tài chính thực hiện đề tài này

Gia đình, các bạn lớp Cao học 2008 đã chia sẻ, góp ý và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 9 giống mè (Sesamum

indicum L.) sử dụng đặc điểm hình thái và chỉ thị RAPD” đã được tiến hành tại

phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm TP HCM, từ tháng 03/2010 đến tháng 10/2010

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên một yếu tố với 9 nghiệm thức, 3 lần lặp lại Theo dõi và ghi nhận các số liệu về đặc điểm hình thái,

sử dụng phần mềm Microsoft Excel, Statgraphics 7.0 phân tích số liệu và phần mềm Ntsyspc 2.1 xây dựng cây phân nhóm di truyền dựa trên các đặc điểm hình thái Phân tích đa dạng di truyền của 9 giống mè thí nghiệm với 8 mồi RAPD, sử dụng phần mềm Ntsyspc 2.1, Winboot và Popgene 1.32 để đánh giá đa dạng di truyền của các giống mè

Kết quả thu được như sau:

Các tính trạng hình thái phân tích đều thể hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học (p<0,05)

Kết quả xây dựng cây phân nhóm di truyền dựa vào các đặc điểm hình thái

đã phân 9 mẫu giống mè thí nghiệm làm 3 nhóm: Nhóm 1 chỉ có giống VDM 08-2 Nhóm 3 gồm giống VDM 08-1 và VDM 08-9 Nhóm 2 bao gồm các giống mè còn lại

Tám primer cho tính đa hình cao với các giống mè khảo sát Tổng cộng có

46 sản phẩm khuếch đại đa hình trong tổng số 74 sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 300 đến 2700 bp, trong đó primer OPL-07 và OPM-20 cho số sản phẩm khuếch đại đa hình cao nhất Cây phân nhóm di truyền dựa vào chỉ thị RAPD chia 9 giống mè làm 2 nhóm, với mức tương đồng gen khá cao từ 0,650 đến 0,847

Phân tích phần mềm Popgene 1.32 cho kết quả hệ số khoảng cách di truyền dao động từ 0,097 đến 0,713

SUMMARY

The study "Study of genetic diversity of nine sesame accessions (Sesamum

indicum L.) using morphology and RAPD marker " was conducted at Department

of Plant Biotechnology Research of Biotechnology and Environment - Nong Lam University, Ho Chi Minh City Experiments were carried out from March 2010 to October 2010

The field layout was designed in a Completely Random Block Design with three replications The data were calculated using Microsoft Excel, Statgraphics 7.0 and NTSYSpc 2.1 sofware while phylogenetic relationship between accessions were estimated using group average cluster analysis

Eight RAPD markers were used to estimat genetic diversity of the nine accessions Genetic variation and genetic structure were computed with the Popgene sofware 1.32 UPGMA dendrogram was built by using Ntsyspc 2.1 sofware

Results indicated that:

Nine sesame accessions were significantly differences between the accessions for almost characters (p< 0.05)

Cluster analysis for phylogenetic relationship between accessions showed that sesame accessions grouped into three main clusters: the first group consisted VDM 08-2, the third group consisted VDM 08-1 and VDM 08-9, while the second group included all of the remained accessions

High genetic polymorphism was found by using eight RAPD primers A total

of 76 bands were recorded, 46 of which were polymorphic with sizes ranged from

300 to 2700 basepairs Primer OPL 7 and OPM 20 showed the highest polymorphic bands

Plant genetic subgroups based on eight RAPD primers divided into two main groups with coeffecient similarity from 0.650 to 0.847

Analyse with Popgene 1.32 showed that Nei’s genetic distance ranged from 0.097 to 0.713

MỤC LỤC

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cảm tạ iv

Tóm tắt v

Mục lục vii

Danh sách các chữ viết tắt xi

Danh sách các bảng xiii

Danh sách các hình xiv

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu chung về cây mè 3

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây mè 3

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật học cây mè 4

2.1.3.1 Rễ 4

2.1.3.2 Thân 4

2.1.3.3 Lá 5

2.1.3.4 Cành 5

2.1.3.5 Hoa 5

2.1.3.6 Quả 5

2.1.3.7 Hạt 6

2.1.4 Công dụng của hạt mè và dầu mè 6

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây mè 7

2.1.6 Tình hình sản xuất mè trên thế giới và Việt Nam 8

2.1.7 Các nghiên cứu về giống mè ở Việt Nam 10

2.2 Khái niệm và tầm quan trọng của đa dạng sinh học 11

2.2.1 Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity) 12

2.2.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền 12

2.3 Các kỹ thuật sử dụng để nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền 13

2.3.1 Chỉ thị hình thái 13

2.3.2 Chỉ thị phân tử 14

2.3.2.1 Kỹ thuật phân tử dựa vào protein 14

2.3.2.2 Kỹ thuật phân tử dựa DNA 14

a PCR 15

b RFLP 17

c AFLP 18

d SSR 18

e RAPD 19

2.4 Nguyên tắc trong ly trích, định tính và định lượng sản phẩm DNA 21

2.4.1 Nguyên tắc ly trích DNA 21

2.4.2 Định lượng DNA 21

2.4.3 Định tính DNA 21

2.5 Một số nghiên cứu về đa dạng di truyền trên cây mè 22

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm 26

3.2 Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm hình thái 26

3.2.1 Vật liệu 26

3.2.2 Bố trí thí nghiệm 26

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.2.3.1 Ghi nhận các đặc điểm hình thái 27

3.2.3.2 Phân tích số liệu 29

3.3 Nội dung 2: Khảo sát đa dạng di truyền 9 giống mè 29

3.3.1 Vật liệu 29

3.3.2 Hóa chất và thiết bị dụng cụ 29

3.3.2.1 Hóa chất 29

3.3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 30

3.3.2.3 Danh sách các mồi RAPD 31

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu 31

3.3.3.1 Quy trình ly trích DNA 31

3.3.3.2 Định tính sản phẩm bằng kỹ thuật điện di 32

3.3.3.3 Định lượng sản phẩm sử dụng máy quang phổ kế 32

3.3.3.4 Đánh giá đa dạng di truyền của 9 giống mè 33

3.3.3.5 Xử lý số liệu 34

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm hình thái của 9 giống mè 35

4.1.1 Chiều cao cây và độ dài lóng 35

4.1.2 Sự phân nhánh và tổng số lá 36

4.1.3 Sự hình thành quả 37

4.1.4 Một số chỉ tiêu hình thái và năng suất các giống mè 39

4.1.5 Khảo sát chỉ tiêu sinh trưởng các giống mè trong thí nghiệm 41

4.1.6 Xây dựng cây phân nhóm hình thái 44

4.2 Nội dung 2: Khảo sát đa dạng di truyền các giống mè thí nghiệm bằng kỹ thuật RAPD 47

4.2.1 Kết quả ly trích DNA 47

4.2.2 Kết quả phân tích RAPD 47

4.2.3 Phân tích quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 51

4.2.4 Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm Popgene 1.32 56

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Đề nghị 60

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình về chiều dài các đoạn DNA được nhân bản)

ANOVA: analysis of variance (Phân tích biến lượng)

bp: base pair (cặp bazơ)

CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (Chất hoạt hóa dương)

dNTP: Deoxyribonucleotide Triphosphate

EB: extraction buffer (dịch trích)

EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông Lương Thế giới)

GCS: Gene diversity attributable to differentiation among subpopulations (hệ số phân biệt giống trong quần thể)

HE: Expected heterozygosity (Hệ số dị hợp tử mong đợi)

HO: Observed Heterozygosity (Hệ số dị hợp tử quan sát)

Ht: Diversity in Overall Collections (đa dạng hay biến động tổng số)

Hc: Gene Diversities within Subpopulations (biến động hay đa dạng trung bình trong các dòng trong quần thể)

Nm(Gcs): estimate of gene flow from Gcs (ước lượng dòng chảy gen từ hệ số phân biệt giống)

NTSYS: Numerial Taxonomy System

OD: Optical Density (Mật độ quang)

PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng nhân bản DNA in vitro)

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình DNA các đoạn DNA được

nhân bản ngẫu nhiên)

RCBD: Randomized Complete Block Design (Kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên)

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt giới hạn)

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

SSCP: Single Strand Conformation Polymophism (Đa hình mạch đơn của DNA) SSRs: Simple Sequence Repeats (Trình tự lặp lại đơn giản)

Ta: Annealing temperature (Nhiệt độ bắt cặp)

Taq-polymerase: Thermus aquaticus polymerase

TBE: Tris – borate – EDTA

TE: Tris – EDTA

Tm: Melting temperature (Nhiệt độ nóng chảy)

UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic (Phương pháp tính

khoảng cách trung bình với giá trị số đại số)

WWF: World Wildlife Fund (Quỹ quốc tế bảo vệ sinh vật hoang dã)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 2.1 Diện tích, sản lượng và năng suất mè 9

Bảng 3.1 Các chỉ tiêu theo dõi 28

Bảng 3.2 Danh sách các mồi RAPD dùng trong phản ứng PCR 30

Bảng 3.3 Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR với primer RAPD 33

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của kỹ thuật RAPD 33

Bảng 4.1 Kết quả thống kê về chiều cao cây, độ dài lóng 35

Bảng 4.2 Kết quả thống kê về ngày ra hoa, ra quả 37

Bảng 4.3 Kết quả ghi nhận các chỉ tiêu hình thái của 9 giống mè thí nghiệm 39

Bảng 4.4 Các chỉ tiêu cấu thành năng suất của 9 giống mè thí nghiệm 40

Bảng 4.5 Tỉ số đo OD 47

Bảng 4.6 Sản phẩm khuếch đại với 8 primer thí nghiệm 48

Bảng 4.7 Hệ số đồng dạng di truyền các giống mè 52

Bảng 4.8 Kết quả phân tích đa dạng di truyền theo các tham số của Nei 57

Bảng 4.9Khoảng cách di truyền và đồng dạng di truyền các giống mè 58

…

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Nguyên lý phản ứng PCR 17

Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 20

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 27

Hình 4.1 Mức phân nhánh chính của 9 giống mè thí nghiệm 36

Hình 4.2 Số quả trên nách lá ở một số giống mè thí nghiệm 38

Hình 4.3 Tăng trưởng chiều cao cây các giống mè 42

Hình 4.4 Tăng trưởng số lá các giống mè 42

Hình 4.5 Tăng trưởng độ dài lóng các giống mè 43

Hình 4.6 Tăng trưởng số quả các giống mè 44

Hình 4.7 Cây phân nhóm thể hiện sự tương đồng hình thái 45

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR chạy primer OPA02 và OPU05 48

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR chạy primer OPA09 và OPA 18 49

Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR chạy primer OPL 07 và M06 50

Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR chạy primer OPU-18 và OPM20 51

Hình 4.12 Cây phân nhóm di truyền 9 giống mè 53

Hình 4.13 Phân nhóm di truyền 9 giống mè theo phương pháp PGMA 55

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây mè (Sesamum indicum L.), thuộc họ Pedaliaceae, là một loại cây trồng

có dầu quan trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Hạt mè có giá trị dinh dưỡng cao (50% dầu và 25% protein), thích hợp dùng trong thực phẩm, chất lượng dầu tốt Trong dầu mè có chứa nhiều chất chống oxy hóa đồng thời cũng có thể là nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel

Cây mè chịu hạn rất tốt, có thể trồng và sinh trưởng trên các loại đất khác nhau, có tiềm năng xuất khẩu, đem lại lợi nhuận cho người canh tác Ngoài ra, mè còn được ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm và kỹ nghệ Vì vậy việc gia tăng diện tích canh tác cũng như nâng cao kỹ thuật trồng mè ngày càng được phát triển ở Việt Nam Theo thống kê của FAO năm (2009) thì diện tích cây mè ở Việt Nam khoảng 46.000 ha với tổng sản lượng là 26.000 tấn

Tuy nhiên do việc phát triển diện tích tự phát, thiếu chiến lược trong chọn tạo giống hợp lý, nên năng suất mè còn thấp và không ổn định Bên cạnh đó thông tin về đa dạng di truyền ở cây mè còn giới hạn, chỉ có một vài nghiên cứu về đa dạng kiểu hình Vì thế việc xác định đa dạng di truyền ở các giống mè sẽ đóng góp lớn cho sự thành công các chương trình giống đồng thời xác định được biến động di truyền góp phần mang lại hiệu quả trong việc quản lý và sử dụng nguồn gen

Trên thế giới, kỹ thuật được sử dụng để đánh giá di truyền chủ yếu là các chỉ thị phân tử, nhưng sử dụng phổ biến nhất là các kỹ thuật dựa vào PCR như RFLP, AFLP, RAPD, SSR, trong đó kỹ thuật RAPD được xem là kỹ thuật đơn giản,

cho kết quả nhanh, và đặc biệt là không cần phải biết trước trình tự bộ gen của đối tượng

Với những ưu điểm đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

tính đa dạng di truyền của 9 giống mè (Sesamum indicum L.) sử dụng đặc điểm

hình thái và chỉ thị RAPD”

1.2 Mục tiêu

Đánh giá tính đa dạng di truyền của 9 giống mè sử dụng đặc điểm hình thái

và chỉ thị RAPD nhằm làm tiền đề phục vụ cho công tác chọn tạo giống

1.3 Yêu cầu

Trồng và ghi nhận các đặc điểm hình thái của 9 giống mè

Ly trích thành công DNA và đạt độ tinh sạch để tiến hành chạy RAPD Đánh giá đa dạng di truyền của 9 giống mè bằng kỹ thuật RAPD

Phân tích kết quả kỹ thuật RAPD bằng một số phần mềm thống kê di truyền

1.4 Giới hạn đề tài

Chỉ nghiên cứu giới hạn ở 9 giống mè

Chỉ sử dụng 8 mồi trong quá trình chạy RAPD

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu chung về cây mè

2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây mè

Cây mè có nguồn gốc từ châu Phi, có nhiều ý kiến cho rằng Êtiopi là vùng nguyên sản của giống mè trồng hiện nay và cũng có ý kiến cho rằng vùng Afghan - Persian mới là nguyên sản của các giống mè trồng Mè là loại cây có dầu được trồng khoảng 2000 năm trước công nguyên, sau đó được đưa vào vùng tiểu Á (Babylon) và được di thực về phía Tây - vào châu Âu, phía Đông vào châu Á dần dần được phân bố đến Ấn Độ, một số nước Trung Quốc, Nhật Bản; những nơi này được xem như là trung tâm phân bố của cây mè (Weiss, 1983)

2.1.2 Phân loại

Cây mè thuộc bộ Tubiflorae, họ Pedaliacea, có 16 chi và khoảng 60 loài

Trên thế giới giống Sesamum gồm hơn 20 loài, mè được trồng là Sesamum indicum

L có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 26, ngoài ra còn có S capennsen, S alanum, S

chenkii, S laniniatum có 2n = 46 (Bedigian, 1985)

Mè có nhiều giống và dòng khác nhau về thời gian sinh trưởng, màu sắc của hạt và dạng cây Hiện nay việc phân loại giống mè thường được dựa vào những đặc tính thực vật như sau:

- Thời gian sinh trưởng: phân loại giống có thời gian sinh trưởng dài ngày hoặc giống sinh trưởng ngắn ngày Cách phân loại này quan trọng khi xem xét chọn giống để luân canh với cây trồng khác như lúa, bắp, đậu, khoai

- Số khía trên quả mè: phân loại các giống mè bốn khía, sáu khía, tám khía Cách phân loại này cho phép chọn cỡ hạt

- Quả bị nứt khi thu hoạch hay không bị nứt: cách phân loại này giúp dự trù cho công tác thu hoạch có đồng loạt hay không

- Màu hạt: Đây là cách phân loại phổ biến nhất để phân biệt hai loại mè: mè

đen (Sesamum indicum L.) và mè trắng (Sesamum orientale L.) (Phạm Đức Toàn,

2008)

Ngoài các cách phân loại trên, người ta còn phân loại mè theo thời vụ trồng,

số hoa ở nách lá và sự phân cành trên thân

2.1.3 Đặc điểm thực vật học cây mè

2.1.3.1 Rễ

Rễ mè thuộc loại rễ cọc, rễ chính ăn sâu Đồng thời hệ rễ bên của mè cũng rất phát triển về bề ngang Rễ mè phân bố chủ yếu ở lớp đất từ 0 - 25 cm Nếu mè ở vùng đất cát, vùng khô hạn, rễ cái có thể ăn sâu từ 1,0 - 1,2 m để tìm nguồn nước ngầm nên cây mè chịu hạn tốt và chịu ngập nước kém (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Nhiều thí nghiệm cho thấy tốc độ ra rễ của mè rất chậm, kém hơn đậu phộng, bắp Đây là vấn đề lưu ý khi trồng xen mè với các cây trồng này Trên đất cát rễ mọc tốt hơn trên đất sét và không chịu ngập úng trong thời gian ngắn Do đặc tính

rễ mè phát triển kém nên dễ bị đổ ngã khi có mưa to gió lớn (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.1.3.2 Thân

Thân mè thuộc thân thảo, thân thường có 4 cạnh với tiết diện vuông và những rãnh dọc Tuy nhiên có những dạng thân rất rỗng hình chữ nhật Thân có thể tròn, trên thân có nhiều lóng hoặc ít lóng Đặc tính này cũng để phân biệt giống Màu sắc của thân thay đổi từ màu xanh nhạt đến màu tím, phổ biến nhất là màu xanh đậm Thân cao từ 60 - 120 cm (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Trong điều kiện hạn thân có thể thấp hơn, nhưng cũng có giống đạt đến 3 m

và số lượng cành chủ yếu phụ thuộc vào giống, thường có khoảng 2 - 6 cành Cành mọc từ các nách lá gần gốc, mức độ phân cành là tốc độ sinh trưởng chung của cây,

trực tiếp bị ảnh hưởng của môi trường, mật độ, lượng mưa và độ dài ngày Các dạng thân ngắn, đâm cành ít, thường chín sớm, cây cao thường chín trễ và có khuynh hướng chịu hạn khá hơn Các giống dài ngày thường phát triển chậm ở giai đoạn cây con, nhưng tăng trưởng nhanh ở giai đoạn sau (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

độ lông trên bề mặt cũng là đặc tính để phân biệt các giống (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.1.3.4 Cành

Cành xuất phát từ thân chính, cành có thể mọc cách hay mọc đối nhau, cành

sẽ mang hoa và quả, trên các cành chính còn có cành cấp hai Sự phân cành trên thân chính cũng là một yếu tố để phân biệt các giống mè, thường màu của cành giống thân chính (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

2.1.3.6 Quả

Quả là loại quả nang, tiết diện hình chữ nhật, có rãnh sâu, có đầu nhọn hình tam giác ngắn Hình dạng của quả cũng là một yếu tố để phân biệt các giống, chiều dài quả thay đổi từ 2,5 – 8,0 cm, đường kính quả thay đổi từ 0,5 – 2,0 cm, số vách

ngăn từ 1 – 12, quả thường có lông tơ bao phủ Quả mở ra bằng cách chẻ dọc vách ngăn từ trên xuống Khi thu hoạch quả sẽ có các dạng mở hoặc đóng, tùy theo dạng

sẽ ảnh hưởng đến năng suất khác nhau, trong đó dạng bung và bung mạnh gây thất thoát năng suất cao nhất Chất lượng quả cũng khác nhau tùy vị trí quả, thường quả

ở vị trí thấp có hạt lớn hơn ở vị trí cao (Trần Thị Kim Ba, 2003)

2.1.3.7 Hạt

Hạt mè là hạt song tử diệp Cấu tạo hạt có nội phôi nhũ, hạt mè nhỏ và thường có hình trứng, hơi dẹp, trọng lượng 1000 hạt từ 2 - 4 g Vỏ láng hoặc nhăn màu đen, trắng, vàng, nâu đỏ hay xám, cũng có hạt màu xám nâu, xanh olive và màu nâu đậm Hạt mè tương đối mảnh và chứa rất nhiều dầu (Trần Thị Kim Ba, 2003)

2.1.4 Công dụng của hạt mè và dầu mè

Hạt mè được sử dụng rất phổ biến làm thực phẩm cho người rất tốt như ăn sống, rang, và chế biến thành nhiều dạng thức ăn như: kẹo mè, bánh, chè mè, làm

Cây mè được mệnh danh là “hoàng hậu của cây có dầu” do dầu mè được tiêu thụ nhiều nhất và có chất lượng rất tốt, dầu mè dễ tiêu có thể bao quản trong thời gian dài, khác với các loại dầu khác là không bị oxy hóa nên không chuyển mùi khó chịu, vì trong mè có chứa chất sesamol và sesamin, ngăn cản quá trình oxy hoá (Brar và Ahuja, 1979; Ashri, 1989) Do đó dầu mè được xem là một trong những chất béo khá lý tưởng để làm thực phẩm cho cả người lớn, cho người béo phì hay người thừa cholesterol trong máu

Dầu mè đã được dùng trong một vài ngành công nghiệp, kỹ nghệ như chất kháng nấm, thuốc trừ sâu, mỹ phẩm, chất hòa tan, xà phòng Khô dầu mè có hàm

lượng protein cao có thể dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi rất tốt, làm phân bón cho cây trồng (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây mè

Mè có giá trị dinh dưỡng cao, trong hạt mè chứa: 45 - 55% dầu, 19 - 20% protein, 8 - 11% đường, 5% nước, 4 - 6% chất tro Ngoài các thành phần trên trong hạt mè còn có 2 hợp chất: sesamin và sesamolin thuộc về nhóm chất xơ đặc biệt được gọi là lignan có tác dụng giảm cholesterol ở người, điều trị cao huyết áp, sesamin còn bảo vệ gan không bị oxi hóa

Thành phần acid hữu cơ chủ yếu của dầu mè là hai loại acid béo chưa no sau:

- Acid olecic (C18H34O2): 45,5 – 49,4%

- Acid linoleic (C18H32O2): 37,7 – 41,2%

Ngoài ra còn có palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, sesamol, vitamin

E, lecithin (0,65%), planteose, sesamose, cytochrome C, nicotinic acid (0,48%), folic acid (18,45%), sucrose (0,64%), các loại protein: alpha-glubolin, beta-glubolin, 13s-glubolin, albumin, glutelin, pedaliin, phytosterol, linolenic acid, sinapic acid, sesame lectin và nhiều loại amino acid (Brar và Ahuja, 1979; Ashri, 1989)

Nếu so sánh hàm lượng acid amin có trong bột mè và trong thịt, các acid amin có trong bột mè gần tương đương với acid amin có trong thịt

Bên cạnh đó hạt mè còn có một lượng chất khoáng rất dồi dào, trong 100 g hạt có 1200 mg canxi; 379 mg photpho; 10 mg flo; 0,03 mg carotein; 0,3 mg vitamin B1; 0,15 mg vitamin B2 (Trần Thị Kim Ba, 2003)

Về mặt sản xuất, cây mè có khả năng thích ứng rộng, dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, rất thích hợp trong việc thâm canh tăng vụ, nâng cao thu nhập trên một đơn vị diện tích đất, nhất là trên đất trồng lúa Nhu cầu dầu mè trên thế giới ngày càng tăng cũng tạo điều kiện tốt cho việc mở rộng trồng mè trong thời gian tới (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

2.1.6 Tình hình sản xuất mè trên thế giới và Việt Nam

Trước thế chiến thứ hai, diện tích trồng mè từ 5 triệu ha vào năm 1939, đạt sản lượng 1,5 tấn, trong đó Ấn Độ là quốc gia trồng nhiều nhất với diện tích 2,5 triệu ha, kế đó là Trung Quốc 1,5 triệu ha, Miến Điện 700.000 ha

Hiện nay, tuy với diện tích không nhiều, mè đã được trồng khắp các châu lục trên thế giới Sản lượng mè hàng năm trên thế giới theo FAO (2006) hơn 3 triệu tấn Trong đó chủ yếu là châu Á chiếm gần 60%, còn lại là châu Mỹ, châu Phi Các nước trồng mè nhiều là Ấn Độ, Trung Quốc, Sudan, Mexico, sau đó là Myanmar, Thái Lan, Nigeria, Colombia Năng suất trung bình trên thế giới khoảng 0,3 - 0,4 tấn/ha Ở Mỹ năng suất mè vùng Texas lên tới 2 tấn, Trung Quốc 1 tấn/ha Ở Trung Quốc, Thái Lan mè là cây có giá trị xuất khẩu cao (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007)

Ở Việt Nam mè được trồng ở khắp các vùng sinh thái trong cả nước từ Bắc tới Nam Theo Tổng cục thống kê năm 2004 diện tích trồng mè cả nước khoảng 40.800 ha, trong đó các tỉnh phía Nam 25.600 ha, phía Bắc 15.200 ha, vùng trồng nhiều nhất là Bắc Trung Bộ (13.500 ha) Tổng sản lượng trung bình cả nước gần 21.000 tấn, năng suất trung bình cả nước khoảng 0,5 tấn/ha nhiều nhất ở các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long 0,9 tấn/ha (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007) Tại vùng Châu Phú - An Giang, năng suất đạt từ 400 - 600 kg/ha Nếu áp dụng biện pháp thích hợp, năng suất mè có thể đạt 1 tấn/ha Ở miền Bắc diện tích không mở rộng được vì điều kiện khí hậu và đất đai không thích hợp Các tỉnh đang trồng mè nhiều ở Đồng Bằng Sông Cửu Long là: Cần Thơ (4.700 ha), Đồng Tháp (1.200 ha), An Giang (600 ha), Long An (400 ha) (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

Bảng 2.1 Diện tích, sản lượng và năng suất mè trên thế giới và Việt Nam 2009

2.1.7 Các nghiên cứu về giống mè ở Việt Nam

Các nghiên cứu về cây mè ở nước ta chưa nhiều, vì từ lâu mè chưa được coi

là cây trồng chính Nông dân trồng mè theo hình thức quảng canh, tận dụng đất đai

và lao động là chính, vì vậy năng suất và hiệu quả chưa cao

Các nghiên cứu về giống mè ở nước ta tập trung theo hướng nhập nội và chọn lọc dòng thuần Một số nghiên cứu chọn tạo giống bằng phương pháp xử lý đột biến Nhìn chung giống mè ít được bổ sung mới Ở nhiều vùng các giống địa phương vẫn chiếm ưu thế trong sản xuất

Giống mè địa phương thường có tên gọi ghép giữa màu sắc hạt và địa danh trồng Có nhiều quan điểm cho rằng có thể chỉ từ một số giống ban đầu, mà có nhiều tên gọi khác nhau, ví dụ vàng Châu Phú, vàng Vĩnh Long, vàng Cồn Khương, đen Thốt Nốt, đen Trà Ôn, đen Campuchia Các giống địa phương thường có khả năng thích nghi cao, chịu hạn tốt, hạt chắc, chất lượng dầu cao, phân nhánh và ít đổ ngã Hiện nay, đa số các giống địa phương đã bị thoái hóa, năng suất và chất lượng thấp

Các giống nhập nội thường có ưu thế hơn về năng suất và hàm lượng dầu cao, trong đó vượt trội nhất là giống V6 V6 được chọn lọc từ tập đoàn giống mè của Nhật, do công ty Mitsui đưa vào Nghệ An từ năm 1994 V6 được Viện Cây có dầu chọn lại, là giống duy nhất được công nhận là tiến bộ kỹ thuật năm 2002 V6 có dạng hình cao cây, không phân nhánh, nhiều quả, năng suất khá và hàm lượng dầu cao (50 - 55%) (Tạ Quốc Tuấn và Trần Văn Lợt, 2006)

Một số giống mè nhập nội khác cũng được thuần hóa và giới thiệu trong sản xuất như mè trắng Hàn Quốc, mè trắng Thái Lan, mè đỏ Thái Lan, mè đen SriLanka (Ngô Thị Lam Giang, 2005) Tất cả đều là những giống cho năng suất và hàm lượng dầu cao, tuy nhiên do một số hạn chế mà chúng chưa thích nghi trong sản xuất Trần Đình Long và ctv (2004) đã thu thập được nguồn gen mè trong cả nước, nhập nội, lai tạo, đột biến thực nghiệm để đánh giá, chọn lọc các dòng giống ưu tú

có hàm lượng dầu cao, chất lượng dầu tốt

Nghiên cứu chọn lọc dòng thuần đối với giống V6 và V36 bằng phương pháp chọn lọc cá thể, Ngô Thị Lam Giang và ctv (2005) đã chọn được 7 dòng V6-2, V6-

3, V6-5; V6-6, V6-7; V6-18 và V6-19 và một số dòng triển vọng từ V36 Đây là những dòng cho có năng suất và chất lượng cao Ngoài ra, 2 giống mè đen MĐ.01.1

và MĐ.01.3 cũng được tác giả chọn lọc, đều là giống có năng suất cao, trong đó MĐ.01.1 có hàm lượng dầu cao (>51%)

Chọn tạo giống mè bằng xử lý đột biến bởi tia gamma (Co60), Đoàn Phạm Ngọc Ngà (2008) đã thực hiện từ giống mè Tây Ninh, tạo ra giống mè có năng suất cao hơn từ 6,4 - 10,4% và hàm lượng dầu không thay đổi

Kết quả đề tài KC06 - 21 “Nghiên cứu về các giải pháp kỹ thuật phát triển các cây có dầu ngắn ngày ở các tỉnh phía Nam” đã xác định một số giống mè phù hợp canh tác ở vùng Đông Nam Bộ như VDM1, VDM2, VDM3, VDM5, VDM6 Các giống phù hợp canh tác ở khu vực ĐBSCL là Trắng Ấn Độ, Trắng DT - 04, Đỏ Thái Lan và V6 Tính đến năm 2008, Viện Nghiên cứu Dầu thực vật đã thu thập và

tư liệu hóa được 35 mẫu giống mè, trong đó có 8 mẫu mới thu thập trong năm 2008 (Ngô Thị Lam Giang, 2006)

2.2 Khái niệm và tầm quan trọng của đa dạng sinh học

Định nghĩa do Quỹ bảo tồn sinh vật hoang dại thế giới – World Wildlife Fund (WWF) (1989) đề xuất như sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường” Đa dạng sinh học được xem xét trên mức độ đa dạng hệ sinh thái, đa dạng loài và đa dạng di truyền

Tính đa dạng trong thiên nhiên là nguồn tài nguyên vô tận của nhân loại, là nguồn gốc của sự thịnh vượng, cung cấp cho chúng ta toàn bộ thức ăn, phần lớn các loại nguyên vật liệu, hàng hoá và dịch vụ, cung cấp nguyên liệu di truyền cần thiết cho nông nghiệp, dược học, công nghệ Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con người, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống

chính trị, xã hội đồng thời làm giàu chất lượng cuộc sống của chúng ta Vì vậy, việc duy trì được tính đa dạng sinh học sẽ giúp loài người bảo vệ môi trường sống, hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại do thiên nhiên hay do con người gián tiếp tạo nên như hiệu ứng nhà kính, băng các vùng cực tan, môi trường đất, môi trường nước bị nhiễm độc phóng xạ Chính việc lạm dụng tài nguyên thiên nhiên trong quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa con người đã, đang và sẽ gây ra những tác động lớn đến môi trường làm rối loạn các hệ sinh thái tự nhiên và suy giảm tính đa dạng

về sự sống trên trái đất Trước thực tế như hiện nay, việc nghiên cứu và bảo tồn tính

đa dạng sinh học là một vấn đề cấp bách nhằm bảo đảm cho sự phát triển bền vững (Primack, 1999)

2.2.1 Sự đa dạng di truyền

Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau Trình tự

bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền,

do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là sự

đa dạng di truyền

2.2.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên đồng thời cũng quan trọng đối với con người

Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường Sự

đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con người

2.3 Các kỹ thuật được sử dụng để nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1 Chỉ thị hình thái (morphological marker)

Là phương pháp truyền thống được sử dụng để đánh giá sự biến dị và đến giờ vẫn còn tầm quan trọng to lớn Phương pháp này đơn giản và dễ ghi nhận Sự giống nhau một vài đặc điểm nổi bật về mặt vật lý (hình dạng, cấu trúc, màu sắc) của một sinh vật, một quần thể hoặc các thành phần của nó thường được chấp nhận

là có quan hệ di truyền

Đa số thí nghiệm được thực hiện ở các giai đoạn phát triển của cây trồng Tuy nhiên những kết quả này không hoàn toàn phụ thuộc vào bộ gen mà chịu ảnh hưởng mạnh của yếu tố môi trường, chỉ chịu sự kiểm soát của một vài gen (Wang

và Tanksley, 1989) Do đó những đánh giá đặc trưng về hình thái ở cây trồng lâu năm thì đòi hỏi tốn thời gian và chi phí trong suốt quá trình tăng trưởng của cây Do

đó trong nghiên cứu đa dạng hình thái thực vật người ta chú ý vào 2 điểm:

- Sự tương đồng về mặt di truyền (homogogy): khi cấu trúc của các loài khác biệt có sự tồn tại và phát triển lâu dài và được xem như là một kết quả chung, có thừa hưởng di truyền thì những cấu trúc này được gọi là tương đồng Ví dụ lá của cây cẩm chướng, cây sồi, bắp cải nhìn bề ngoài khác nhau nhưng chúng tương tự nhau về cấu trúc cơ bản và cách sắp xếp các bộ phận nên được cho là tương đồng, tương tự các nhà hình thái học thực vật học tìm thấy gai xương rồng có cấu trúc và

sự phát triển cơ bản giống với lá của các cây trồng khác do đó giữa chúng cũng có

sự tương đồng

- Sự đồng qui hình thái (convergence) khi cấu trúc của các loài khác biệt được biết có sự tồn tại và quá trình phát triển lâu dài thích nghi với sức ép môi trường được xem như là một kết quả chung, thì các cấu trúc này được gọi là hội tụ hay đồng qui hình thái dưới sức ép môi trường Ví dụ hình dạng trưởng thành của xương rồng và đại kích rất giống nhau mặc dù chúng thuộc họ có khoảng cách di truyền rất xa Sự giống nhau là do vấn đề sống trong môi trường nóng, khô hạn

2.3.2 Chỉ thị phân tử (molecular marker)

Chỉ thị phân tử có thể là một gen, trình tự DNA, hoặc protein có thể được sử dụng để xác định một sinh vật, một loài, một giống hoặc kiểu hình có liên quan đến

nó Chỉ thị phân tử đã dần thay thế hoặc bổ sung cho những phương pháp dựa vào kiểu hình truyền thống, từ đó chúng mở ra một triển vọng thật sự không giới hạn Đối tượng nghiên cứu chỉ chịu sự chi phối của bộ gen mà không ảnh hưởng của môi trường và tốn ít thời gian hơn Mỗi một chỉ thị có những tiến bộ và hạn chế của nó

Do đó, ứng dụng kỹ thuật phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền phải lựa chọn kỹ thuật xem có phù hợp với mục đích nghiên cứu hay không (Karp và ctv, 1997) Điều này còn dựa vào mức độ phân loại của vật liệu nghiên cứu (những loài, dưới loài, quần thể, nhiều cây, một cây), sau đó kết luận mối liên hệ giữa những vật liệu nghiên cứu Vì vậy những kỹ thuật phân biệt, chọn lọc cao thì cần thiết hơn Ngoài

ra chọn lựa kỹ thuật còn dựa vào tính hữu hiệu và giá trị hiệu quả của kỹ thuật Chỉ thị phân tử được chia làm 2 loại chính:

- Chỉ thị phân tử dựa vào protein còn được gọi là chỉ thị sinh hóa (biochemical marker)

- Chỉ thị phân tử dựa vào DNA (DNA markers)

2.3.2.1 Chỉ thị phân tử dựa vào protein

Cả những protein là enzyme và không phải là enzyme đều được sử dụng Những protein không phải là enzyme thường được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide một hoặc hai chiều và tạo trên gel những band hoặc những spot biểu thị sự khác nhau của những protein khảo sát (Aga, 2005) Trong trường hợp là những enzyme, nhờ vào hoạt tính chuyên biệt của chúng nên thường được dùng trong những phân tích nhằm phát hiện chúng Gel polyacrylamide thường được sử dụng trong phân tích nên kỹ thuật này còn được gọi là điện di protein

Những enzyme khác nhau biểu hiện cho những loci khác nhau, hay những allel khác nhau trên cùng một locus Thuật ngữ allozyme đã được chấp nhận là một chỉ thị đồng trội phân biệt ở một locus, còn isozyme dùng để phân tích sự khác biệt

ở nhiều locus riêng biệt (Aga, 2005) Sự khác biệt này có lẽ do những thay đổi ở mức độ DNA dẫn đến thay đổi amino acid và thay đổi sự tổng hợp protein và biến đổi quá trình hậu dịch mã, dẫn đến thay đổi trọng lượng phân tử Những chỉ thị dựa vào protein có những tiến bộ là chi phí thấp và không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp, chúng thường cho chỉ thị đồng trội nên hay dùng trong nghiên cứu đồng hợp tử và

dị hợp tử Tuy nhiên có những hạn chế là số lượng các hệ thống enzyme có giới hạn, phải sử dụng phương pháp chuyên biệt cho mỗi enzyme, và chỉ những vùng mã hóa trên bộ gen biểu hiện protein mới phân tích được, nên kết quả đa hình thường thấp (Aga, 2005)

2.3.2.2 Chỉ thị phân tử dựa vào DNA

Những chỉ thị đa hình DNA ở cây trồng là những công cụ ứng dụng mạnh

mẽ trong sự đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di truyền (Powell và ctv, 1996) Những kỹ thuật này có thể dựa vào trình tự của một vùng được biết trên bộ gen hoặc không Chỉ thị dựa vào DNA được phân làm các loại sau dựa vào phương pháp thực hiện:

a Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR là chữ viết tắt của cụm từ “polymerase chain reaction”, là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme chịu nhiệt Polymerase (Mullis và ctv, 1983)

Thực chất, đây là phương pháp tạo dòng in - vitro nhằm mục đích thu nhận một

lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định không cần sự hiện diện của tế bào, dựa trên đặc tính của DNA bị tách thành hai chuỗi đơn khi đun nóng trong

dung dịch Mỗi đoạn mạch đơn sẽ được bổ sung các nucleotides bắt đầu từ những vị trí mà đoạn mồi (primer) phát hiện được những chuỗi bổ sung trong mẫu DNA nhờ

xúc tác của một enzyme chịu nhiệt (Taq polymerase, phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus) Mồi có thể là những chuỗi được tổng hợp một cách ngẫu

nhiên (tiêu biểu là chuỗi 10 bazơ) hoặc là những chuỗi được xác định rõ từ một chuỗi đã biết trước và quyết định tính đặc hiệu của các bản sao được tạo ra Phản ứng PCR cho phép nhân số lượng một đoạn gen mục tiêu từ một vài bản sao ban đầu thành hàng triệu bản sao và được thực hiện bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại liên tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:

- Bước 1 (denaturation): đoạn gen (DNA) đang ở trạng thái mạch kép được đun ở nhiệt độ cao để tách thành mạch đơn Chỉ ở trạng thái mạch đơn đoạn gen mới có chức năng làm khuôn cho phản ứng trùng ngưng

- Bước 2 (annealing): nhiệt độ của phản ứng được hạ thấp để các mồi gắn được vào khuôn

- Bước 3 (extension): nhiệt độ được tăng lên giá trị tối ưu cho hoạt tính của enzyme Trong bước này, phản ứng trùng ngưng xảy ra, một bản sao mới của đoạn gen được tạo ra từ một khuôn ban đầu

Sau 3 bước của một chu kỳ, số lượng bản sao của đoạn gen được tăng lên 2 lần Như vậy, số lượng bản sao được tạo ra trong phản ứng PCR là hàm mũ cơ số hai của số lượng chu kỳ lặp lại trong phản ứng Thời gian thực hiện PCR là vài giờ, với chương trình tự động hóa nên không tốn công sức Các phản ứng PCR được thực hiện trong những ống nghiệm bằng nhựa nhỏ, trong một dung tích rất nhỏ ở mức µl (microlite) Nhiệt độ trong ống được tự động điều chỉnh ứng với từng bước trong mỗi chu kỳ bằng một thiết bị gọi là máy điều chỉnh nhiệt theo chu kỳ (thermocycler) còn gọi là máy PCR.

Hình 2.1 Nguyên lí của phản ứng PCR (Vierstraete, 1999)

b Kỹ thuật đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction fragment length polymorphism)

Kỹ thuật RFLP dựa trên sự sai khác của phổ băng điện di và độ dài các phân đoạn bị cắt bởi enzyme giới hạn, số lượng các đoạn cắt khác nhau được phân biệt trên gel điện di gọi là dấu vân tay (finger printing) đặc trưng cho từng phân tử DNA Khi xử lý các mẫu DNA bằng cùng một cặp enzyme cắt giới hạn thì các genome có cấu trúc khác nhau sẽ tạo nên các đoạn cắt có chiều dài khác nhau Ngược lại các genome có cấu trúc giống nhau sẽ tạo nên các đoạn cắt giống nhau thể hiện trên gel điện di (Powell và ctv, 1996)

c Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản chọn lọc (AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng phản ứng PCR để nhân bản các đoạn DNA đã bị cắt bởi enzyme giới hạn Khâu then chốt của kỹ thuật này là thiết

kế các mồi đặc trưng Để làm được điều này trước hết cần phải cắt mẫu DNA nghiên cứu bằng enzyme giới hạn, sau khi xử lý với các enzyme giới hạn, DNA được cắt thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau nhưng trình tự các nucleotide ở

2 đầu đoạn cắt giống nhau và đã được xác định, dựa vào trình tự này thiết kế các oligonucleotide ngắn gọi là adaptor và gắn chúng vào 2 đầu cắt Dựa vào trình tự adaptor có thể thiết kế mồi PCR gồm 2 phần: phần có trỉnh tự bổ sung với adaptor

và phần có 1 đến 3 nucleotide tùy ý Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có các đoạn DNA có trình tự 2 đầu bắt cặp bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản

Ưu điểm của kỹ thuật AFLP là không cần thông tin trình tự DNA, độ chính xác trong phản ứng PCR sẽ đảm bảo cho khả năng tái tổ hợp sản phẩm cao Mặc dù

là phương pháp rất mạnh, tuy nhiên nó có một số nhược điểm như: phụ thuộc vào marker, đa số các marker nằm trên các vùng riêng biệt trên bộ gen nên rất tốn công, mức độ đa dạng di truyền được giới hạn ở một vài loài cây trồng và đòi hỏi chất lượng DNA phải tốt để đảm bảo cho phản ứng men cắt (Weising và ctv, 2005)

d Kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản (SSR: Simple Sequence Repeats) hay Microsatellites

Microsatellites là các đoạn DNA mang các trình tự ngắn (short DNA sequence motif) được lặp lại nhiều lần Chúng phân bố rộng khắp trong bộ gen của sinh vật nhân chuẩn (eukaryotic) nên rất có giá trị trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt giúp thiết lập các bản đồ di truyền có độ phân giải cao Những chuỗi microsatellites được hình thành từ những sự lặp lại nối tiếp nhau theo những motif

1, 2, 3 hoặc 4 nucleotide Những dạng thường gặp là (A)n, (AT)n, (GT)n, (TAT)n, (GATA)n, giá trị của n đi từ vài đơn vị đến vài chục (Semagn và ctv, 2006) Kỹ thuật SSR dựa trên sự khuếch đại các trình tự microsatellite bằng các mồi đặc hiệu

có khả năng bổ sung vào hai đầu locus microsatellite, các mồi được thiết kế dựa vào trình tự các vùng có chứa các microstaellite

SSR nằm trong số những chỉ thị mạnh nhất để phát hiện sự đa hình Chúng ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền, định danh, kiểm tra phả hệ và lập bản đồ di truyền trên cây trồng và động vật Chúng là chỉ thị di truyền hoàn hảo, chuyên biệt locus và đồng trội (co-dominant), cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử và có khả năng lặp lại (Satoni và ctv, 2000) Tuy nhiên, việc xác định những đoạn mồi bọc chuyên biệt là một công việc khá nặng nề đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ thuật cao Hơn nữa kỹ thuật này đòi hỏi chi phí rất cao và không phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm nhỏ

e Kỹ thuật đa hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên Phương pháp này do Williams (1990), Welsh và McClelland (1990) phát triển từ kỹ thuật PCR Kỹ thuật này sử dụng các mồi tổng hợp đơn, ngắn (thường khoảng 10 nucleotide), trình tự các mồi này được thiết kế một cách ngẫu nhiên nhằm khuếch đại các trình tự DNA chưa biết bằng phản ứng PCR Sau khi bắt cặp tại các vị trí trên sợi DNA, mồi tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn DNA có kích thước khác nhau Các đoạn DNA có kích thước khác nhau này được nhận biết bằng điện di Một mồi có thể tạo ra sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể được dùng như những chỉ thị

Để nghiên cứu đa dạng di truyền bằng marker RAPD, cần tiến hành các bước sau đây:

 Tách chiết DNA tổng số

 Thực hiện phản ứng PCR với primer RAPD

 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarsose hoặc gel polyacrylamide

 Xác định tính đa dạng di truyền bằng cách sử dụng các phần mềm như: Ntsyspc2.1, Popgene 1.32

Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng sinh học, marker RAPD cũng được sử dụng cho những mục đích sau:

 Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó

 Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể

 In dấu vân tay (DNA fingerprinting)

Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng marker RAPD cũng có một số hạn chế sau:

 Có đặc tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị hợp tử

 Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất

 Độ tin cậy chưa cao

Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD (IPGRI and Cornell University, 2003)

2.4 Nguyên tắc trong ly trích, định tính và định lượng sản phẩm DNA

2.4.1 Nguyên tắc ly trích DNA từ tế bào thực vật

Tế bào thực vật ngoài màng tế bào còn có lớp thành cellulose vững chắc, ngoài ra một số vị trí có nhiều hợp chất thứ cấp, polysaccharide nên khi ly trích sẽ gặp nhiều khó khăn tùy theo đối tượng Tuy nhiên nguyên tắc chung nhất là:

Nghiền mô bằng phương pháp cơ học: nghiền mô bằng nitơ lỏng để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần bên trong Sử dụng đệm chiết có chất tẩy như CTAB, SDS, để phá vỡ màng tế bào giải phóng DNA, sử dụng các hóa chất bảo vệ DNA tránh khỏi sự phân hủy bởi các enzyme nuclease nội bào phổ biến là EDTA Sử dụng các hóa chất như phenol, chloroform, isoamyl alcohol để loại bỏ tạp chất (protein, polysaccharide) ra khỏi DNA Thu hồi DNA bằng cách tủa trong cồn 99,5% hoặc trong isopropanol và trữ trong nước cất hoặc TE 1X (Trịnh Đình Đạt, 2007)

2.4.2 Định lượng DNA bằng máy hấp thu quang phổ (spectrophotometry) Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử

ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine Giá trị mật độ quang

ở bước sóng 260 nm (OD260 nm – Optical Density260 nm) cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào sự tương quan là 1 đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 µg/µl dung dịch DNA sợi đôi (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) Bên cạnh đó để đo độ tinh sạch của DNA, thường đo giá trị OD280 là bước sóng

mà các phân tử protein có mức hấp thu cao nhất, đồng thời cũng hấp thu ở bước sóng 260 nm nên gây sự sai lệch khi tính nồng độ của acid nucleic Một dung dịch DNA được coi là tinh sạch khi OD260/OD280 từ 1,8 - 2,2 (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

2.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di (Electrophoresis)

Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic là tích điện âm đồng đều trên bề mặt (tính chất nhóm phosphate), nên khi chịu tác dụng của một điện trường chúng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương và tính linh động sẽ phụ thuộc vào 2 chỉ tiêu, khối lượng phân tử và thành

phần cấu thành gel (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) Phân tử có khối lượng càng lớn thì di chuyển càng chậm vì thế có thể phân loại được các đoạn DNA trên gel và

có thể quan sát được bằng kỹ thuật nhuộm ethidium bromide, chụp ảnh sau khi chiếu dưới tia UV

Sau khi điện di sẽ cho kết quả các band đồng hình hay đa hình Đa hình (polymorphism) là thuật ngữ nhằm mô tả sự có mặt đồng thời của quần thể trong genome biểu hiện sự biến dị có tính chất allelic, có thể quan sát trên alen tạo ra những kiểu hình khác nhau, hoặc sự thay đổi của DNA ảnh hưởng đến đoạn phân cắt hạn chế, tạo thành độ dài phân tử khác nhau trên kết quả điện di

2.5 Một số nghiên cứu về đa dạng di truyền trên cây mè

Ercan và ctv (2004) đã sử dụng kỹ thuật RAPD phân tích đa dạng di truyền

trên 38 giống mè (Sesamum indicum L.) ở 4 vùng địa lý khác nhau thuộc Thổ Nhĩ

Kỳ Kết quả thu được tổng cộng 61 băng, trong đó có 78% là băng đa hình Phân tích biến động quần thể (AMOVA) cho thấy phần trăm biến động giữa các quần thể rất cao (91,9%), đồng thời các chỉ số Shannon's index cho thấy có sự đa dạng di truyền rất cao giữa các giống thuộc vùng Đông Bắc Thổ Nhĩ Kỳ (CV = 7,7; Ho = 0,304) và sự đa dạng thấp hơn giữa các giống ở vùng Tây Nam Thổ Nhĩ kỳ (CV = 2,6; Ho = 0,068)

Ercan và Taskin (2005) tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền trên 52 giống

mè ở Thổ Nhĩ Kỳ sử dụng các tính trạng nông học Kết quả 52 giống được phân làm

4 nhóm chính dựa trên mức độ tương đồng Trong đó, các quần thể thuộc vùng phía Nam, Đông Nam, phía Tây có xu hướng tập trung thành nhóm trên cây tương đồng, riêng quần thể thuộc vùng Đông Bắc phân nhóm không phụ thuộc vào nguồn gốc địa lý Nghiên cứu này giúp các nhà chọn giống hiểu hơn về cấu trúc di truyền của quần thể mè ở Thổ Nhĩ Kỳ, từ đó thuận tiện cho việc lựa chọn cá thể bố mẹ cho công tác lai tạo giống

Dixit và ctv (2005) đã chọn lọc từ ngân hàng gen cây mè (Sesamum indicum

L) 50 trình tự SSR Sau khi khảo sát, Dixit đã chọn sử dụng 10 cặp mồi SSR để xác định đa dạng di truyền giữa 16 giống mè ở Hàn Quốc Kết quả thu được các đoạn

khuếch đại có kích thước 150 – 307 bp, số allele/locus dao động trong khoảng 3 – 6, trung bình 4,6 allele/locus Chỉ số dị hợp tử (HE) và chỉ số đa hình (PIC) lần lượt là 0,43 – 0,85 và 0,34 – 0,80

Laurentin và Karlovski (2006) đã sử dụng kỹ thuật AFLP để thực hiện nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 32 giống mè trong bộ sưu tập giống ở Venezuela Kết quả cho thấy có sự đa dạng di truyền rất lớn trong bộ sưu tập giống này bao gồm 457 chỉ thị AFLP được ghi nhận với tỷ lệ đa hình là 93% Hệ số tương đồng Jaccard giữa các giống từ 0,38 – 0,85, nhánh cây tương đồng UPGMA đã chia

32 giống này thành 25 nhóm, không thấy có sự tương quan giữa kiểu gen và nguồn gốc địa lý do các giống Ấn Độ, Châu Phi, Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản phân bố rải rác trên nhánh cây tương đồng Kết quả phân tích AMOVA về đa dạng

di truyền giữa năm nhóm giống theo nguồn gốc địa lý chỉ đạt 20%, đa dạng trong mỗi nhóm giống là 5%

Bertha và ctv (2006) dùng kỹ thuật RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 2 giống mè thương mại (Fonucla và UCLA-1) và 7 dòng mè (UCLA-249; UCLA-295; UCLA-37-1; UCLA-65; UCLA-83; UCLA-90; UCLA-2) có nguồn gốc từ Venezuela Kết quả có 94 band đa hình khi sử dụng 12 mồi ngẫu nhiên với mức độ

đa hình cao

Arriel và ctv (2007) đã sử dụng 30 tính trạng hình thái và đặc tính nông học

để đánh giá đa dạng di truyền của 108 dòng mè ở Brazil Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự đa hình cao giữa các dòng mè, trong đó, tính trạng số quả/cây và năng suất dòng thể hiện sự khác biệt rõ rệt nhất

Ghulam và ctv (2007) đã sử dụng kỹ thuật AFLP phân tích đa dạng di truyền

96 giống mè thu thập từ các nơi trên thế giới, với 21 cặp mồi thu được tổng cộng

445 sản phẩm khuếch đại, trong đó có 157 sản phẩm là đa hình (chiếm 35%) Đồng thời, sử dụng kỹ thuật phân tích phân nhóm UPGMA dựa trên hệ số tương đồng tác giả đã phân 96 giống mè thí nghiệm thành 2 nhóm: nhóm 1 bao gồm các giống có nguồn gốc Đông Á, nhóm 2 bao gồm các giống có nguồn gốc Nam Á

Phạm Đức Toàn và ctv (2008) đã nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống mè ở Việt Nam và Campuchia bằng kỹ thuật RAPD Kết quả tạo ra 107 sản phẩm khuếch đại trong đó có 88 phân đoạn đa hình (83%) Khoảng cách đa dạng di truyền từ 0,03 – 0,43, với khoảng cách di truyền có ý nghĩa là 0,23 Mức độ

đa hình cũng chỉ ra rằng kỹ thuật RAPD có thể được dùng để lựa chọn các dòng bố

mẹ trong công tác chọn tạo giống cây trồng

Abdellatef và ctv (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 10 giống mè thu thập từ các vùng khác nhau ở Sudan Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự đa hình rất cao giữa các giống thu thập, tổng cộng có 75 băng trong

đó có 64 băng đa hình Số băng/mồi là 4 -13 băng, số băng đa hình/mồi dao động từ

2 - 12 băng, chiếm 66,6% tổng số băng thu được, theo ghi nhận có một băng xuất hiện trên 10 giống ở cả 10 mồi, cây phân nhóm UPGMA chia 10 giống thành 2 nhóm

Furat và Uzun (2010) đã dựa trên 21 tính trạng nông học để đánh giá đa dạng

di truyền của 103 giống mè lấy từ các vùng trồng mè ở Thổ Nhĩ Kỳ Tác giả nhận thấy các tính trạng liên quan đến sự nảy mầm, ra hoa, tạo quả và năng suất hạt là những yếu tố chính xác định sự đa dạng di truyền trong bộ giống nghiên cứu Qua phân tích phân nhóm, 103 giống được chia làm 8 nhóm chính và không thấy có sự tương quan về sự phân nhóm và nguồn gốc địa lý của các giống

Parsaeian và ctv (2010) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền trên 24 giống mè dựa trên tính trạng nông học và chỉ thị phân tử ISSR Kết quả cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giống về những tính trạng nghiên cứu, dựa vào tính trạng hình thái, các giống nghiên cứu được chia làm 5 nhóm Kết quả phân tích ISSR chia các giống nghiên cứu làm 7 nhóm với hệ số tương đồng giữa các giống là 0,09 – 0,55

Phạm Đức Toàn và ctv (2010) đã tiến hành đánh giá các giống mè có nguồn gốc địa lý khác nhau dựa trên 15 đặc điểm hình thái 17 giống mè được thu thập từ

El Salvator, Tanzania, Kenya, Ấn Độ, Campuchia và Việt Nam, thí nghiệm được thực hiện ở vùng đồng bằng châu thổ sông Mekong thuộc Việt Nam Qua kết quả