Nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại việt nam (tt)

Tuy nhiên các nghiên cứu về sự lưu hành, đặc điểm dịch tễ học và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số mầm bệnh khác đến nay còn hạn chế và mới chỉ tập trung theo vùng, miền.. Xuất phát từ c

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHẠM HỒNG QUÂN

NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH

TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌC THÚ Y

MÃ SỐ: 9 64 01 08

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Hà Nội, 2019

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ

Người hướng dẫn khoa học 2: PSG.TS Phạm Công Hoạt

Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên

Trường Đại Học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Hữu Nam

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: TS Bùi Nghĩa Vượng

Viện Thú y

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào hồi … giờ … ngày… tháng … năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng đang ngày càng phát triển và chiếm vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta Cùng với các tiến

bộ kỹ thuật về giống, thức ăn, quản lý, thú y kết hợp với các biện pháp khuyến khích chăn nuôi của nhà nước làm cho ngành chăn nuôi lợn phát triển với tốc độ tương đối cao, mang lại hiệu quả kinh tế cho người dân đồng thời góp phần vào nền kinh tế quốc gia

Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn cũng có nhiều thách thức đó là sự gia tăng

và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh, trong đó Hội chứng bệnh do PCV2 được coi là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng Tại Việt Nam, Hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa xuất hiện đầu tiên vào năm 2000 và gây

ra những ảnh hưởng đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn Tuy nhiên các nghiên cứu về sự lưu hành, đặc điểm dịch tễ học và sự đồng nhiễm của PCV2 với một

số mầm bệnh khác đến nay còn hạn chế và mới chỉ tập trung theo vùng, miền Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm làm rõ về sự lưu hành, hoàn thiện bức tranh về đặc điểm dịch tễ học phân

tử và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus trong điều kiện sản xuất thực tế của các cơ sở chăn nuôi lợn xuyên suốt ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam trên cả nước Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới và đề ra các biện pháp phòng chống bệnh do PCV2 có hiệu quả, nhất là công tác lựa chọn chủng virus phù hợp trong sản xuất vắc xin phòng bệnh cho đàn lợn nuôi trong nước

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

- Xác định sự lưu hành và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN, ARN virus ở lợn nuôi tại Việt Nam

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

cho ba miền Bắc – Trung – Nam ở Việt Nam bao gồm: Thái Nguyên, Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Phòng, Hải Dương, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Bình Dương, Tiền Giang và Vĩnh Long Thời gian thực hiện từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 6 năm 2018

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Xác định được tỷ lệ lưu hành và bổ sung đầy đủ thêm bức tranh dịch tễ về virus PCV2 đang lưu hành tại Việt Nam

- Đánh giá được sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus (PPV, TTV, PRRS, PCV3) ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Trong quá trình thực hiện đề tài đã xác định thêm được sự lưu hành của loài virus mới PCV3 ở lợn nuôi tại Việt Nam

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

- Đây là một trong những nghiên cứu có hệ thống về sự lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Đây là nghiên cứu mới về Porcine circovirus 3 (PCV3), một loài virus mới lưu hành của ở đàn lợn nuôi tại Việt Nam

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo về PCV

- Trên cơ sở phát hiện của đề tài về một loài virus mới PCV3, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về đánh giá sự lưu hành, cũng như vai trò gây bệnh và tác động của PCV3 tới sức sản xuất của đàn lợn để đưa ra các giải pháp phòng, chống có hiệu quả

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI LỢN TẠI VIỆT NAM

Ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam chủ yếu là chăn nuôi nhỏ lẻ ở qui mô

hộ gia đình, môi trường chăn nuôi không đảm bảo vệ sinh thú y, phong tục tập quán của người Việt Nam mang nhiều yếu tố nguy cơ làm phát sinh và lây lan dịch bệnh ở lợn như: sử dụng thịt lợn tươi sống là chủ yếu, giết mổ nhỏ lẻ tại hộ gia đình, sử dụng cả thịt lợn mắc bệnh, buôn bán lợn nhỏ lẻ không qua kiểm dịch thú y, chăn nuôi lợn tận dụng nguồn thức ăn thừa từ các nhà hàng, nên nhiều loại dịch bệnh ở lợn, trong đó có Hội chứng bệnh do PCV2 có thể tồn tại, lưu hành trong thời gian dài

2.2 BỆNH DO PCV2 GÂY RA Ở LỢN NUÔI

2.2.1 Giới thiệu về PCV2

2.2.1.1 Phân loại

PCV2 thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae Họ circoviridae gồm 2

giống: Giống Anellovirus, Giống Circovirus

2.2.1.2 Hình thái, cấu trúc

PCV mang bộ gen là ADN virus sợi đơn vòng chứa khoảng 1759 nucleotide (PCV1) và khoảng 1767 - 1768 nucleotide (PCV2)

2.2.1.3 Sức đề kháng

PCV2 có khả năng sống được 15 phút ở nhiệt độ 70oC, bị bất hoạt ở pH= 3

Ở nhiệt độ phòng, khi bị tác động trong 10 phút bởi một số chất sát trùng như chlorhexidine, formaldehyde, iodine, vikon và cồn thì hiệu giá của virus giảm

2.2.2 Dịch tễ học của bệnh do PCV2

2.2.2.1 Loài cảm thụ

Tất cả các giống lợn đều mẫn cảm với bệnh, kể cả lợn nuôi và lợn hoang dã

2.2.2.2 Chất chứa mầm bệnh

Mầm bệnh có trong dịch bài xuất, bài tiết và trong huyết thanh, virus còn

có thể bài thải qua tinh dịch, phân, nước tiểu, sữa non, sữa từ lợn nhiễm bệnh

2.2.2.3 Phương thức truyền lây

Sự lây lan của PCV2 từ lợn sang lợn, từ người sang lợn, từ động vật gặm nhấm sang lợn, từ ký sinh trùng sang lợn, từ môi trường chuồng trại sang lợn Mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường miệng - mũi

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh

PCV2 gây suy giảm miễn dịch dẫn tới tác động đáng kể lên sức sản xuất ở lợn, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh khác xâm nhập và gây bệnh

độ khác nhau, gan, thận, ruột, lách xuất huyết

2.2.5 Một số hội chứng ở lợn có liên quan đến sự nhiễm PCV2

Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa, Hội chứng viêm da và viêm thận, Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn, Hội chứng rối loạn hô hấp ở lợn, Hội chứng viêm ruột ở lợn, Hiện tượng nhiễm PCV2 thể cận lâm sàng

2.2.8 Điều trị

Bệnh do virus nên không có thuốc điều trị đặc hiệu

2.3 HIỆN TƯỢNG ĐỒNG NHIỄM DO PCV2 GÂY RA

Trong thực tế có nhiều giả thuyết được đưa ra nhằm giải thích tại sao có nhiều căn nguyên kết hợp cùng với PCV2 trong hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa Trước hết, có thể một số mầm bệnh có cùng cơ chế sinh bệnh gây ảnh hưởng đến

hệ miễn dịch của cơ thể, khiến cho lợn nhiễm PCV2 có triệu chứng của PMWS

(Darwich et al., 2003) Opriessnig et al (2007) cho biết mặc dù hầu hết lợn trong

đàn có thể bị nhiễm PCV2 nhưng chỉ có khoảng 5 – 30% lợn mẫn cảm biểu hiện triệu chứng Có bốn yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh PCVAD do nhiễm PCV2 là

cấu trúc và độc lực virus, giống lợn, sự đồng nhiễm, trạng thái miễn dịch của cơ thể Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh trong điều kiện thực nghiệm một mình PCV2 không gây bệnh mà kết hợp với một số virus như PRRS, PPV, TTV mới gây bệnh thể lâm sàng Trong hầu hết các trường hợp lợn có triệu chứng lâm sàng rõ khi được gây nhiễm đồng thời với một số mầm bệnh truyền nhiễm hoặc

không truyền nhiễm (Rovira et al., 2002) Do đó PCV2 được coi là điều kiện cần nhưng chưa đủ để gây thành bệnh (Tomás et al., 2008)

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ PCV2 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

PCV2 được phát hiện năm 1991 tại Canada nhưng kết quả nghiên cứu của

Jacobsen et al (2009) khẳng định sự tồn tại của PCV2 ở lợn từ năm 1962 tại miền

triển của PCVAD (Hasslung et al., 2005; Opriessnig et al., 2012)

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Bằng chứng huyết thanh học cho thấy sự xuất hiện của PCV2 vào năm 2000 (Nguyễn Thị Thu Hồng và cs., 2006) Từ đó đến nay, các nghiên cứu về PCV2

được thực hiện đều khẳng định sự hiện diện và nguy cơ ngày càng lan rộng của

PCV2 ở mọi quy mô chăn nuôi lợn Tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ tập trung theo vùng, miền (miền Bắc, miền Trung hoặc miền Nam), chưa có nghiên cứu nào thực hiện để làm rõ sự lưu hành và cập nhật về đặc điểm dịch tễ học phân tử, sự đồng nhiễm của PCV2 xuyên suốt ở cả 3 miền Bắc – Trung - Nam trên cả nước

Đề tài được thực hiện với mục đích làm sáng tỏ về sự lưu hành, hoàn thiện bức tranh về đặc điểm dịch tễ học phân tử và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus

ở lợn nuôi xuyên suốt tại ba miền Bắc – Trung – Nam của Việt Nam Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới và công tác lựa chọn chủng virus phù hợp trong sản xuất vắc xin phòng bệnh cho đàn lợn trong nước

PHẦN 3 NỘI DUNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Mẫu được lấy tại các trại chăn nuôi lợn thuộc 14 tỉnh tại Việt Nam

- Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; cùng với sự giúp đỡ của Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương

- Giải trình tự gen được thực hiện tại Công ty 1st BASE, Singapore

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 3 năm 2019

3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Mẫu nghiên cứu được thu thập ở cả lợn ốm và lợn khỏe bình thường

- Các loại dụng cụ, sinh phẩm và hóa chất dùng: tách chiết ADN/ARN tổng

số, phản ứng PCR/ Realtime PCR và giải trình tự gen

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xác định sự lưu hành của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Xác định đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 lưu hành ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN virus (TTV, PPV, PCV3) và ARN virus (PRRS) ở lợn nuôi tại Việt Nam

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp tính toán dung lượng mẫu

Để phát hiện tỷ lệ lưu hành PCV2 ở lợn nuôi, thiết kế lấy mẫu bệnh phẩm nghiên cứu bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản, nhiều giai đoạn để thu thập mẫu bao gồm các tầng/giai đoạn như sau:

Tính số lượng mẫu ở từng cấp độ, sử dụng công thức sau:

2

2 1

1

e z





Trong đó: n1: Số cơ sở/mẫu cần lấy; P: Là tỷ lệ lưu hành ước tính (dựa vào

số liệu tổng quan các nghiên cứu từ năm 2000 – 2018 đã tổng hợp được tỷ lệ lưu hành ước tính ở từng cấp độ); z = 1.96, tương đương với độ tin cậy 95%; e = Sai

số tuyệt đối giữa giá trị ước tính so với mức độ lưu hành thực tế Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn sai số (e) = 10%

Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu

Số xã cần lấy mẫu

Số cơ sở cần lấy mẫu/1 xã

Số mẫu cần lấy/1

cơ sở

Tổng số mẫu xét nghiệm

Mẫu gộp thí nghiệm

3.5.2 Phương pháp điều tra hồi cứu

Khi giải trình tự gen và phân tích cây phát sinh loài của virus PCV2, điều tra ngược lại các mẫu đã được xét nghiệm trong phòng thí nghiệm

3.5.3 Phương pháp thu thập mẫu

Sử dung phương pháp thu thập mẫu huyết thanh, mẫu dịch hầu họng và mẫu phủ tạng

3.5.4 Phương pháp chiết tách ADN/ARN

Sử dụng bộ kit TacoTM DNA/RNA Extraction Kit, máy chiết tách nucleic acid tự động TacoTM và theo hướng dẫn của nhà sản xuất

3.5.7 Phương pháp giải trình tự và hoàn thiện trình tự gen

Thực hiện tại công ty 1st BASE (Singapore)

3.5.8 Phương pháp phân tích trình tự gen

Sử dụng Chương trình MEGA 6 để dựng cây phát sinh chủng loại

3.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Sử dụng phần mềm MEGA6 để xây dựng cây phả hệ được dựa trên trình tự gen mã hóa capsid protein (gen ORF2)

3.5.10 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian - thời gian

Sử dụng các phần mềm Quantum GIS, phần mềm BEAST, SpreaD3

3.5.11 Phương pháp đo lường tính đa dạng về di truyền

Sử dụng phương pháp Principal Coordinate Analysis (PCoA)

3.5.12 Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý bằng phần mềm MS Excel 2010; so sánh sự sai khác giữa các yếu tố bằng phép thử χ2 (phần mềm Minitab 14.0) và phép thử Fisher Exact Test (phần mềm SAS 9.1)

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 SỰ LƯU HÀNH PCV2 Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM

4.1.1 Kết quả nghiên cứu sự lưu hành PCV2 theo địa phương

Nghiên cứu này đã lấy mẫu để nghiên cứu sự lưu hành PCV2 đồng thời ở

ba miền Bắc - Trung - Nam và trong khoảng thời gian từ 2015-2018 được trình bày ở hình 4.1 và bảng 4.1

D 2018 E 2018 F 2015-2018

Phạm vi lấy mẫu của các nghiên cứu trước đây: (A) Nguyễn Thị Thu Hồng và cs (2006), (B) Huỳnh Thị Mỹ Lệ

và cs (2012), (C) Bùi Trần Anh Đào và cs (2015), (D) (Phạm Hoàng Sơn Hưng và cs (2018), (E) Lê Thị Thu

Phương và cs (2018) Phạm vi lấy mẫu của đề tài này (F)

Hình 4.1 Kết quả so sánh về phạm vi lấy mẫu phát hiện PCV2

Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở lợn nuôi tại 14 tỉnh đại diện cho

ba miền Bắc – Trung – Nam được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.2

Bảng 4.1 Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 từ các địa phương

TT Tỉnh Số mẫu xét nghiệm dương tính Số mẫu Tỷ lệ (%) dương tính (95%CI)

Hình 4.2 Tỷ lệ dương tính với PCV2 tại các địa phương thu mẫu

Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở Việt Nam là 41,14% Kết quả nghiên cứu cũng chỉ

ra PCV2 lưu hành ở tất cả các tỉnh nghiên cứu (14/14) với tỷ lệ không nhỏ dao động từ 16% - 88%, trong đó tỷ lệ mẫu kiểm tra dương tính với PCV2 cao nhất ở Hà Nội là 88%, thấp nhất ở Hải Phòng là 16%

4.1.2 Kết quả xác định sự lưu hành PCV2 theo quy mô chăn nuôi

Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 theo quy mô đàn được trình bày ở bảng 4.2

Bảng 4.2 Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn theo các quy mô chăn nuôi

TT Quy mô đàn (con) Tổng số mẫu kiểm tra dương tính Số mẫu Tỷ lệ (%) dương tính (95%CI)

là 27,42% Ở những trại có mức quy mô đàn phổ biến từ 300 – 500 con và nhỏ hơn 100 con thì tỷ lệ lưu hành PCV2 khá cao, lần lượt trung bình là 43,88% và 41,82% Tuy tỷ lệ dương tính với PCV2 giữa các quy mô đàn có

vẻ khác nhau lớn nhưng kiểm định χ2 cho biết trên phương diện thống kê, các

tỷ lệ này không khác nhau vì trị số p = 0,4085 > 0,05

4.1.3 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn thuộc các lứa tuổi

Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 của lợn ở các lứa tuổi khác nhau được trình bày ở bảng 4.3

Bảng 4.3 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở các lứa tuổi lợn

TT Nguồn gốc mẫu Tổng số mẫu

kiểm tra

Số mẫu dương tính

4.1.4 Kết quả nghiên cứu sự lưu hành của bệnh do PCV2 gây ra

Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của một số lợn nghi mắc PMWS trong quá trình thu mẫu tại các địa phương như còi cọc, chậm lớn, lông thô, triệu chứng hô hấp, tiêu chảy và viêm da được ghi nhận

Trong quá trình thu mẫu, một số lợn nghi mắc PMWS được mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể Kết quả cho thấy nhìn chung hiện tượng sưng to và phân thùy ở các hạch lympho (đặc biệt hạch bẹn nông và hạch màng treo ruột) là phổ biến Ngoài ra, các tổn thương còn biểu hiện ở một số cơ quan như phổi có biểu hiện viêm ở các mức độ khác nhau, gan, thận, ruột, lách xuất huyết

4.2 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PCV2

Đến thời điểm hiện tại, các nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở Việt Nam mới tập trung theo vùng miền nhất định Nhằm có kết luận một cách toàn diện về đặc điểm di truyền cũng như đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 lưu hành trên lãnh thổ Việt Nam, nghiên cứu này đã tiến hành giải trình tự gen của PCV2 tại 3 miền Bắc- Trung- Nam Kết quả nghiên cứu cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng PCV2 trong nghiên cứu vắc