Tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase ở cây chè

Sự sai khác một số trình tự nucleotide gen CsLAR1 của chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố trên Genbank .... Sự sai khác trình tự amino acid của gen mã hóa LAR ở giống chè Trun

TẠO DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sốliệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõnguồn gốc Mọi sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể đều được ghi nhậntrong lời cảm ơn

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên

Tác giả

Phạm Thị Hằng

hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ Khoa Công nghệ Sinhhọc, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên vàcác cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Huỳnh Thị Thu Huệ và Cử nhânPhạm Thị Hằng - Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen,Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình chỉ dẫn và giúp

đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS DươngTrung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đãgiúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè vàđồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Phạm Thị Hằng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại của cây chè 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học chung của cây chè 4

1.1.3 Thành phần hóa học của chè 9

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 12

1.2.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới 12

1.2.2 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam 13

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới 14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam 15

1.4 CATECHINS VÀ LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE Ở CHÈ

16 1.4.1 Catechins và công dụng của Catechins 16

1.4.2 Cơ chế sinh tổng hợp catechins ở chè 17

1.4.3 Leucoanthocyanidin reductase (LAR) 19

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 VẬT LIỆU 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Phương pháp thu mẫu lá chè 22

2.2.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ lá chè 22

2.2.9 Biểu hiện gen CsLAR1 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 KHUẾCH ĐẠI GEN CsLAR1 TỪ MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU 32

3.2 TẠO DÒNG GEN, XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA LEUCOANTHOCYANIDIN REDUCTASE 33

3.2.1 Tạo dòng gen CsLAR1 33

3.2.2 Xác định và phân tích trình tự gen CsLAR1 34

3.3 BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CsLAR1 TỪ CHÈ TRUNG DU XANH TRONG VI KHUẨN E COLI 41

3.3.1 Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen CsLAR1 vào vi khuẩn E coli DH10B 41

3.3.2 Biểu hiện gen CsLAR1 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

KẾT LUẬN 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các dạng tán chè 5

Hình 1.2 Mầm chè cắt dọc 5

Hình 1.3 Búp chè 6

Hình 1.4 Sơ đồ đợt sinh trưởng 6

Hình 1.5 Các loại lá trên cành chè 7

Hình 1.6 Rễ chè 8

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp catechins ở chè 18

Hình 2.1 Sơ đồ vector tách dòng pJET 1.2 26

Hình 2.2 Sơ đồ vector biểu hiện pET32a(+) 30

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 31

Hình 3.1 Hình ảnh điện di kết quả PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ chè Trung Du xanh 32

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm tách dòng gen CsLAR1 từ mẫu chè Trung du xanh trong vector pJET1.2 33

Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra sự có mặt của sản phẩm PCR trong plasmid pJET 1.2 34

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự gen CsLAR1 phân lập từ mẫu chè Trung du xanh với một số trình tự trên Genbank 36

Hình 3.5 So sánh trình tự amino acid suy diễn của CsLAR1 từ giống chè Trung Du xanh với các trình tự đã công bố 38

Hình 3.6 Kết quả kiểm tra plasmid 41

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid gắn gen CsLAR1 vào vector pET32a(+) 42

Hình 3.8 Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET32a(+)_CsLAR1 bằng BamHI và XhoI và PCR khuếch đại gen CsLAR1 từ plamid 43

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm protein tổng số từ chủng Rosetta tạo CsLAR1 tái tổ hợp 44

chính trên thế giới năm 2016 12

Bảng 1.4 Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam trong những năm gần đây 14

Bảng 2.1 Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 24

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA 24

Bảng 2.4 Trình tự các đoạn mồi sử dụng nhân gen CsLAR1 25

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR nhân gen CsLAR1 25

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng tạo đầu bằng sản phẩm PCR 26

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ghép nối giữa đoạn gen CsLAR1 và vector pJET 1.2 27

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt plasmid 29

Bảng 3.1 Sự sai khác một số trình tự nucleotide gen CsLAR1 của chè Trung du xanh với các trình tự đã công bố trên Genbank 37

Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự amino acid của gen mã hóa LAR ở giống chè Trung du xanh với trình tự đã công bố trên Genbank 39

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Chè (Camellia sinensis (L) O Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm,

có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới, là cây trồng xuất hiện từ lâu,được trồng khá phổ biến trên thế giới

Chè là nước uống thông dụng và được mọi người ưa thích không chỉbởi hương vị độc đáo của nó, mà còn do nước chè rất có lợi cho sức khỏe.Nước chè có tác dụng giải khát, khắc phục được sự mệt mỏi của cơ bắp và hệthần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảngkhoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về trí óc vàchân tay, ngăn chặn sự phát triển và tiến triển của bệnh Alzheimer [22] Hơnnữa, uống chè còn kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì; chống viêm; chốngsâu răng, hôi miệng và ung thư vòm họng; phòng ngừa ung thư [18], [36];phòng ngừa bệnh tăng huyết áp [41]; tiểu đường [20] và ngăn ngừacholesteron tăng cao [17] Ngoài ra, chè còn có khả năng bảo vệ da khỏi táchại của tia cực tím [21] Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe được liệt kê

ở trên đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol có trong chè

Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giảiquyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, cảithiện đời sống nhân dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóanông thôn [11] Theo đánh giá của Unal (2011) có khoảng 2,5 triệu tấn chèkhô được sản xuất mỗi năm, trong đó chè đen chiếm khoảng 78%, chè xanhchiếm 20% và chè Olong chiếm 2% [26] Thành phần hóa học, đặc biệt hàmlượng polyphenol, chất hòa tan sẽ quyết định đến chất lượng sản phẩm chè[3] Trong đó, catechins chiếm khoảng 30% thành phần polyphenol ở chè.Catechins được chia thành 2 nhóm: catechins được epimer hóa còn gọi làepicatechin (EGCG, ECG, EGC và EC) và catechins không được epimer hóa(GC và C) [27], [30] Hiện nay, hoạt tính sinh học và cơ chế tổng hợp

hàm lượng polyphenol, thành phần catechins còn ít được quan tâm, cập nhật.Trong khi các thành phần này thay đổi rất lớn theo giống và chất lượngnguyên liệu Bên cạnh đó, sự hiểu biết ở mức độ phân tử của các gen mã hóaenzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp polyphenol nói riêng,catechins nói chung hầu như chưa được nghiên cứu cấu trúc và chức năng.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tạo dòng

và phân tích trình tự gen mã leucoanthocyanidin reductase ở cây chè”.

2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Nghiên cứu cấu trúc gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase từ câychè trồng tại Thái Nguyên

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

+ Khuếch đại gen CsLAR1 mã hóa leucoanthocyanidin reductase từ

cây chè

+ Tạo dòng, xác định và phân tích trình tự gen CsLAR1 thu được.

+ Thiết kế vector biểu hiện và tạo leucoanthocyanidin reductase tái

tổ hợp

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CHÈ

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại của cây chè

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L) O Kumtze và thuộc

hệ thống phân loại như sau:

Ngành: Hạt kín (Angiospermae)

Lớp: Song tử diệp (Dicotyledonae)

Bộ: Chè (Theaseae)

Họ: Chè (Theaceae)

Chi: Chè (Camelia hoặc Thea)

Loài: Camellia sinensis

Cây chè là một loại cây công nghiệp lâu năm, cho hiệu quả kinh tế cao,được trồng ở hơn 58 quốc gia Ngày nay, ở Việt Nam hầu hết các tỉnh có điềukiện thuận lợi đều trồng chè, song ba vùng trồng nhiều nhất là [33]:

• Vùng chè thượng du (Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái)chiếm khoảng 25% sản lượng chè miền Bắc

• Vùng trung du (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên) Đây làvùng chè chủ yếu chiếm đến 75% sản lượng chè miền Bắc với nhiều nhà máysản xuất lớn

• Vùng chè Tây Nguyên (Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng, Đắc Lắc) chủyếu trồng giống chè Ấn Độ và chè shan, chè Ô long

Những công trình nghiên cứu của Đjêmukhatze (1961 - 1976) về phứccatechins của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần cácchất catechins giữa các loại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu lênluận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè và trên cơ sở đó xác minhnguồn gốc cây chè Đjêmukhatze kết luận rằng: những cây chè mọc hoang

biến đổi sinh hóa này của lá các cây chè mọc hoang dại và cây chè được trồngtrọt chăm sóc, cho phép đi tới một kết luận mới “Nguồn gốc của cây chèchính là ở Việt Nam” [45].

Hiện nay chè được phân bố khá rộng trong những điều kiện tự nhiên rấtkhác nhau từ 30 độ vĩ nam (Natan - Nam Phi) đến 45 độ vĩ bắc (Gruzia - LiênXô) là những nơi có điều kiện tự nhiên khác rất xa vùng nguyên sản

1.1.2 Đặc điểm sinh học chung của cây chè

Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại thân gỗ hoặcthân bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến vàmang một số đặc điểm sinh học sau đây [10]:

Hình thái

Thân và cành: Cây chè sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên là đơn trục,

nghĩa là chỉ có một thân chính, thân thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thànhmột hệ thống cành và chồi Sự phân cành của thân bụi khác nhau nên tạo chocây chè có các dạng tán: tán đứng thăng, tán trung gian và tán ngang [42]

Hình 1.1 Các dạng tán chè [45]

1 Đứng thẳng 2 Trung gian 3 Nằm ngang

Cành chè do mầm dinh dưỡng phát triển thành, trên cành chia làmnhiều đốt Từ thân chính, cành chè được phân ra nhiều cấp: cành cấp 1, cấp 2,cấp 3

Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh

dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả

Mầm dinh dưỡng gồm có: Mầm đỉnh, mầm nách, mầm ngủ, mầm bấtđịnh (mầm ở cổ rễ)

Hình 1.3 Búp chè [45]

a Búp bình thường b Búp mù

Búp chè gồm có hai loại: búp bình thường và búp mù Có thể tóm tắthoạt động sinh trưởng búp theo tuần tự như sau:

Hình 1.4 Sơ đồ đợt sinh trưởng [45]

Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, mọc cách trên cành, mỗi đốt có

một lá Lá chè có gân rất rõ, những gân chính của lá chè thường không pháttriển ra đến tận rìa lá Trên một cành chè thường có các loại lá như sau:

Hình 1.5 Các loại lá trên cành chè [45]

Hoa: Cây chè 2, 3 tuổi đã có thể ra hoa, kết quả lần đầu, hoa chè mọc

ra từ mầm sinh thực ở nách lá chè Hoa chè là hoa lưỡng tính, trong đó có 5-8cánh màu trắng, có khi phớt hồng

Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1-4 hạt Quả chè có dạng hình

tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt Khi còn non quả chè có màu xanh, khichín chuyển sang màu xanh đậm hoặc nâu Khi vỏ chín vỏ quả nứt ra

Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu

nâu, cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng Kích thước hạt chè to nhỏ phụ thuộc vào

kỹ thuật chăm sóc Hạt chè có khối lượng từ 0,6-2 gam, thường là từ 1-1,6gam

Hệ rễ: Hệ rễ chè gồm có: rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu

nâu hay nâu đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà

Hình 1.6 Rễ chè [45]

Sự phân bố của rễ chè trong đất phụ thuộc vào giống, tuổi của cây, điềukiện đất đai và chế độ canh tác Lượng dinh dưỡng trong đất có ảnh hưởnglớn đến sự phát triển của bộ rễ, nhất là lượng đạm

Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè

Chè là một cây mọc trong những điều kiện ẩm ướt, râm mát của vùngkhí hậu cận nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á Về nhu cầu ánh sáng, cây chè làcây trung tính trong giai đoạn cây con, lớn lên ưa sáng hoàn toàn Dưới bóngrâm, là chè xanh đậm, lóng dài, búp non lâu, hàm lượng nước cao nhưng búpthưa, sản lượng thấp vì quang hợp yếu Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự

khô xém nắng lá non Độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80-85% [46]

Sinh trưởng và phát triển của cây chè

Thời vụ của cây chè:

– Vụ Xuân (tháng 3-4): Hái chừa 2 lá và lá cá, tạo tán bằng những búpcao hơn mặt tán thì hái sát lá cá.

– Vụ Hè Thu (tháng 5-10): Hái chừa 1 lá và lá cá, tạo tán bằng nhữngbúp cao hơn mặt tán thì hái sát lá cá

– Vụ Thu Đông (Tháng 11): hái chừa lá cá, tháng 12 hái cả lá cá

Với các giống chè có dạng thân bụi, sinh trưởng đỉnh đều có thể háikéo hay hái bằng máy để nâng cao năng suất lao động

Chu kỳ sinh trưởng và phát triển:

Chu kỳ của một cây chè bao gồm ba giai đoạn và phát triển lặp lạinhiều lần trong một năm: Giai đoạn đầu tiên là giai đoạn cây non hay giaiđoạn thiết kế cơ bản Sau đó là giai đoạn cây lớn là giai đoạn chè lớn kéo dài20-30 năm, tuỳ giống, điều kiện đất đai, dinh dưỡng và khai thác Đây là giaiđoạn chè cho năng suất cao nhất Giai đoạn chè già cỗi, cây chè suy yếu dần,

lá nhỏ, búp ít, chóng mù xoè, hoa quả nhiều, cành tăm hương nhiều, chồi gốcmọc nhiều

1.1.3 Thành phần hóa học của chè

Chất lượng sản phẩm chè được đánh giá chủ yếu dựa trên cơ sở nghiêncứu thành phần hóa học có trong chè [2] Thành phần hóa học của chè đượcxác định thường phụ thuộc loại chè và cách pha chế Trong đó, các polyphenol

có vai trò rất quan trọng, quyết định đến màu sắc và hượng vị của chè [42]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của chè tươi [2]

Nước là thành phần quan trọng và chủ yếu trong búp chè, chiếm

75-82% khối lượng lá chè [45], hàm lượng nước phụ thuộc vào giống chè, thời

vụ và độ non già của lá chè Lượng mưa trung bình năm thích hợp cho sinhtrưởng cây chè trên thế giới là 1.500-2.000mm Độ ẩm tương đối không khí từ80-85% có lợi cho sinh trưởng của chè Loại đất thích hợp cho trồng chè dày60-100cm; mực nước ngầm dưới 100cm; độ chua pH: 4,5-5,5; ty lệ mùn 3-4% Xét thành phần khối lượng, nước là thành phần chủ yếu của lá chè Theo

số liệu của Phòng nghiên cứu chè và các cây trồng á nhiệt đới Liên bang vềhàm lượng nước trong búp chè gồm một tôm ba lá trong các tháng bằng %được thể hiện ở bảng 1.2:

Bảng 1.2 Thành phần độ ẩm thay đổi theo tháng trong năm [44]

7,5

7,5

8,5

7,8

7,2

5

6

3,5

0,3Hiện nay, xác định được độ ẩm của chè tăng lên trong thời gian bảoquản là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến làm giảm chất lượng của chè Như vậymuốn giữ được chất lượng chè khô ít biến đổi trong thời gian bảo quản phảiquan tâm đến độ ẩm của chè lúc bao gói, đóng thùng [47]

Chất khô: Chiếm 25-30% khối lượng lá chè, gồm có các polyphenol,

pectin, chất xơ (xenlulo), protein, amino acid, các alcoloit (cafein, theofilin,theobromin), các enzyme (enzyme oxi hóa và enzyme thủy phân) và chất tro

Hợp chất polyphenol (tannin): Thành phần hóa học chính trong chất rắn

chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, thường chiếm 20-30% chất khô trongchè Tanin của cây chè là một phức hợp của nhiều hợp chất hữu cơ tự nhiên cóbản chất phenol Hợp chất phenol giữ vai trò chủ yếu trong quá trình tạo màusắc, hương vị của chè đặc biệt là chè đen Tanin có đặc tính dễ bị oxi hóa dướitác dụng của enzym và được cung cấp oxi đầy đủ Flavanoids là thành phầnquan trọng của tanin, trong đó catechins và flavanoids chiếm ty lệ lớn

Hợp chất Caffeine: Ankaloid chính của chè là caffeine Caffeine là dẫn

xuất của purine có tên gọi theo cấu tạo là 1,3,5- trimethylxanthine, chiếmkhoảng 3-4% tổng lượng chất khô trong lá chè tươi Và điều đặc biệt là hàmlượng caffeine trong lá chè cao hơn trong cà phê từ 2-3 lần Caffeine có khảnăng liên kết với tanin và các sản phẩm oxy hóa của tanin để tạo nên các muốitanat caffeine Các muối này tan trong nước nóng, không tan trong nước lạnh

và tạo nên hương thơm và sắc nước chè xanh và nâng cao chất lượng chèthành phẩm

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHÈ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1 Tình hình sản xuất chè trên thế giới

Theo Đỗ Ngọc Quỹ [9], quốc gia đầu tiên trên thế giới phát triển sảnxuất chè là Trung Quốc, sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào những năm

805 sau Công nguyên Đến nay, chè đã được trồng ở 58 quốc gia với quy môkhác nhau, phân bố ở khắp 5 Châu như sau:

- Châu Á: Chấu Á có 20 nước trồng chè bao gồm: Trung Quốc, Ấn Độ,Indonexia, Nhật Bản, Thổ Nhĩ Kỳ, Lào, Thái Lan, Việt Nam, Nepan, TriềuTiên, Iran, Myama…

- Châu Phi có 21 nước bao gồm: Kenia, Malavi, Uganda, Tanzania, AiCập, Công Gô, Nam Phi, Maroc…

- Châu Mĩ có 12 nước bao gồm: Argentina, Braxin, Peru, Colombia,Ecuador, Guatemala, Paraguay, Jamaica, Mexico, Bolivia, Guyana và Mĩ

- Châu Đại Dương có 3 nước sản xuất chè đó là các nước: PapuaTanghine, Fiji và Australia

- Châu Âu chỉ có ở Liên Xô cũ (Grudia) và Bồ Đào Nha

Bảng 1.3 Diễn biến diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trồng chè

chính trên thế giới năm 2016 N

Số liệu thống kê (Bảng 1.3) cho thấy: Trung Quốc là quốc gia đứng đầu

về diện tích đạt 2,240 triệu ha, chiếm 54,66% diện tích chè thế giới, sản lượngchè của Trung Quốc cũng đứng đầu thế giới với 2,414 triệu tấn Tuy nhiên,năng suất chè của Trung Quốc không cao, chỉ đạt 10,778 tạ/ha Sau Trung là

Ấn Độ với diện tích 585,9 nghìn ha, năng suất đạt 21,372 tạ/ha và là nước cósản lượng chè thứ 2 thế giới, đạt 1,2 triệu tấn Trong khi đó, Iran là nước cónăng suất chè cao nhất, đạt 36,759 tạ/ha; sản lượng 119,38 nghìn tấn, đứngthứ 10 thế giới về sản lượng Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích, thứ 6 về năngsuất và sản lượng

1.2.2 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam

Việt Nam có diện tích trồng chè dao động khoảng 126.000 – 133.000ha

và thu hút khoảng 2 triệu lao động Cả nước có khoảng 300 cơ sở chế biếnchè có công suất 900 nghìn tấn búp tươi/năm, trong đó có khoảng 31 nhà máy

có quy mô sản xuất lớn 30 tấn búp tươi/ngày chiếm 47% công suất chế biến;

103 nhà máy có quy mô vừa công suất chế biến 10 đến 28 tấn búp tươi/ngàychiếm 43%; còn lại là cơ sở chế biến nhỏ công suất từ 3 đến 5 hoặc 6 tấn búp

120.000ha, tổng sản phẩm chế biến hàng năm trên 120 nghìn tấn Trong đókhoảng 70% là chè đen, còn lại 30% là chè xanh và các loại chè khác.

Bảng 1.4 Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam trong

tính [9].

Theo Đỗ Ngọc Quỹ (2000) Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Srilanca,Liên Xô cũ đã sử dụng Công nghệ Sinh học trong chọn giống chè tốt, dùngphôi non bồi dưỡng thành cây chè hoàn chỉnh Sử dụng phương pháp lai, sửdụng ưu thế lai để tạo giống chất lượng cao phục vụ cho sản xuất

1.3.2 Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam

Theo Đỗ Ngọc Quỹ thống kê (1991) đến năm 1923 Việt Nam đã trồngđược 10.368ha chè đầu tiên với các giống chè thuộc giống chè Trung Quốc lá

to, chè Shan và chè Ấn Độ, đã thu thập gồm: 43 giống chè trong đó chủ yếu làgiống chè Trung Quốc lá to [10]

Ở Việt Nam qua nhiều năm nghiên cứu, Viện nghiên cứu chè đã ứngdụng thống kê sinh học qua phân tích tương quan dựa vào các đặc trưng hìnhthái để lựa chọn nhanh các loại hình chè có triển vọng khi cây chè 2-3 tuổi.Ngoài ra các chỉ tiêu cần kết hợp xem xét các đặc điểm phát triển bộ rễ, màusắc lá Các nghiên cứu về các quá trình sinh học ở chè và genome chè vẫnchưa được nghiên cứu nhiều Năm 2004, nhóm tác giả Nguyễn Minh Hùng,Đinh Thị Phòng đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu tính đa hình củamột số dòng chè đột biến [4] Năm 2010, Nguyễn Thị Thu Hương và đtg đã

sử dụng kỹ thuật này để phân tích sự đa dạng trình tự genome ở các dòng chèShan [7] Một số giống chè trồng ở xã Tân Cương - vùng chè đặc sản chè nổitiếng của tỉnh Thái Nguyên cũng được phân tích bằng kỹ thuật RAPD bởiHoàng Thị Thu Yến và đtg [5] Năm 2014, Hoàng Thị Thu Yến và đtg đã sửdụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đánh giá một số giống / dòng chè trồng tạiThái Nguyên [15] Các nghiên cứu về cấu trúc phân tử và sự biểu hiện củagen liên quan đến sự sinh trưởng, phát triển, quá trình trao đổi chất, sự tổnghợp polyphenol…ở chè chưa được nghiên cứu nhiều

hóa được biết đến và đang được nghiên cứu như các tác nhân có thể làm giảmyếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh ung thư và bệnh tim Có rất nhiều các hợpchất polyphenol được tìm thấy ở chè Ở chè xanh chứa cả polyphenol đơngiản và phức tạp Hàm lượng catechins (30%) và flavonoid (0,2-5%) là cáchợp chất chủ yếu của polyphenol Hàm lượng polyphenol quyết định đến màusắc, độ chát của nước chè và góp phần tạo hương vị của chè Hầu hết các đặctính có lợi cho sức khỏe của chè đã được chứng minh là do các hợp chấtpolyphenol [8].

Catechins là một hợp chất không màu, tan trong nước, có vị đắng chát

ở mức độ khác nhau và có khả năng chống oxi hóa Thành phần của catechinstrong lá chè xanh bao gồm Epicatechin (EC), ECG (Epicatechin-3-O-gallate),EGC (Epigallocatechin), EGCG (Epigallocatechin-3-O-gallate), C (catechin)

EGC, ECG, EGCG chiếm khoảng 90% catechins tổng số trong lá chè và đãđược chứng minh là có nhiều hoạt tính dược lý bao gồm hoạt tính chống oxy

phần catechins ngày càng trở nên quan trọng trong các chương trình nhângiống cây chè

Công dụng của C:

Trong chè xanh chứa polyphenol và catechins là các chất dinh dưỡng tựnhiên, có khả năng chống oxy hóa Catechins có hoạt tính của vitamin P,nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và giảm tính thấm, củng cố tính bềnthành mạch máu Catechins thường dùng phối hợp với vitamin E trong dự

phòng điều trị chảy máu cấp và còn có tác động đến các biểu hiện lâm sàngkhác của bệnh nhân như giảm sốt, giảm nhiễm độc, giảm rối loạn hoạt động

hệ tim mạch [26] Catechins trong chè có tác dụng chống oxy hóa, tức làchống quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động [24],[32] Do đó, catechins trong chè là chất kìm hãm sự phát triển của khối u,chống phóng xạ và một số bệnh ung thư rất tốt

1.4.2 Cơ chế sinh tổng hợp catechins ở chè

Catechins được tổng hợp thông qua con đường flavonoid (Hình 1.7).Trong đó, enzyme PAL (phenylalanine ammonialyase) xúc tác sự khử amincủa L - phenyllalanine tạo thành axit cinamic và NH4+(amoni), đây là bướcđầu tiên trong sinh tổng hợp phenylpropanoid mà cuối cùng là tạo catechins.Chalcone synthase (CHS) là enzyme quan trọng trong con đường flavonoid ởthực vật, xúc tác các phản ứng tạo chalcone Chalcone isomerase (CHI) xúctác các đồng phân của chalcone để tạo flavanone Chất này sau đó sẽ chuyểnđổi thành đồng vị dihydroflavonol nhờ flavanone 3 - hydroxylase (F3H),flavonoid 3’-hydroxylase (F3’H), flavonoid 3’5’- hydroxylase (F3’5’H).Dihydroflavonol tiếp đó chuyển đổi thành leucoanthocyanidin nhờdihydroflavonol 4 - reductase (DFR)

Từ đây sự chuyển hóa chia thành từng nhánh: Leucoanthocyanidin reductase (LAR) xúc tác leucoanthocyanidin để sản xuất các catechin: {GC,C} và một phần leucoanthocyanidin được chuyển đổi thành EGC và EC bởihoạt tính của synthase anthocyanidin (ANS) và reductase anthocyanidin(ANR)

4-Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp catechins ở chè [23]

ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin synthase);

4CL (4-coumarate: CoA ligase); C4H (cinnamate 4-hydroxylase);

CHI (chalcone isomerase); CHS (chalcone synthase);

DFR (dihydroflavonol reductase); F3H (flavanone 3 β-hydroxylase);

F3′H (flavonoid 3′-hydroxylase); LAR (leuacoanthocyanidin

reductase); PAL (phenylalanine ammonialyase); FGS (flavan-3-ol gallate

synthase); F3′5′H (flavonoid 3′5′-hydroxylase.

Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng cả thành phần và sự tích lũycatechins có tương quan cao với mức độ biểu hiện của các gen liên quan.Catechins của chè được tổng hợp theo nhánh khác biệt của con đườngFlavnoid Leucoanthocyanidin reductase đóng vai trò chìa khóa xác địnhthành phần catechins không được epimer hóa (GC và C) [29] LAR xúc tácchuyển hóa leucocyanidin, leucoanthocyanin thành C và GC

1.4.3 Leucoanthocyanidin reductase (LAR)

Leucoanthocyanidin reductase (LAR) là chất không màu, dễ dàng bịoxy hóa và ngưng tụ hình thành sắc tố trong quá trình lên men chè Cácprotein LAR thuộc siêu họ reductase-epimerase-dehydrogenase (RED)[38] Hơn nữa, nghiên cứu của Pang và đtg chỉ ra rằng sự biểu hiện gen

CsLAR1 ở thuốc lá cho kết quả tích lũy epicatechin cao hơn catechins, điều

này cho thấy CsLAR1 có thể liên quan đến sự tổng hợp epicatechin [28] Bằng phương pháp tiếp cận di truyền ngược đã chỉ ra LAR ở chè (CsLAR) có ba locus gen được đặt tên tương ứng là CsLAR1,CsLAR2,CsLAR3 và đăng kí trên

Genbank với mã số tương ứng KY615698, KY615700, KY615699 cDNA

đầy đủ của ba CsLAR1, CsLAR2 và CsLAR3 là 1518, 1401 và 1595bp với

khung đọc (ORFs) tương ứng1029, 984 và 1197bp Trọng lượng protein suydiễn của chúng tương ứng là 37, 36 và 43kDa Kết quả so sánh cho thấy rằng

CsLAR1, CsLAR2 và CsLAR3 có sự tương đồng trình tự amino acid tương

ứng là 99, 82, và 74% so với gen CsLAR được công bố trên GenBank với mã

số GU992401 Như vậy, CsLAR trong nghiên cứu chính là CsLAR1 Phân tích trình tự amino acid cho thấy rằng các CsLAR có một vùng liên kết với NADP

giàu glycine nằm trong đầu N [25] và ba motif amino acid bảo thủ RFLP,

ICCN và THD [19] CsLAR được biểu hiện trong Escherichia coli (E coli) có

hoạt tính chuyển hóa leucocyanidin thành C

Amino acid của CsLARs được so sánh với các protein LAR ở các loàikhác sử dụng chương trình DNAMAN (Lynnon Corporation, San Ramon,

CA, USA) Kết quả cho thấy cho thấy các CsLAR có một vùng gắn kếtNADP giàu glycine thuộc đầu N (N-terminal), vùng xác định sự đặc hiệu cơchất [24] và 3 motif amino aicd bảo thủ RFLP, ICCN và THD [18] Phân tíchcây phát sinh loài dựa trên trình tự amino acid CsLAR cho thấy LAR thực vật

có thể được nhóm lại thành hai nhóm chính Một nhóm bao gồm CsLAR củathực vật 2 lá mầm (dicotyledon), nhóm còn lại bao gồm nhóm thực vật hạt

rằng họ LAR thực vật có thể đã trải qua một đột biến trong ICCN được bảotồn, đột biến này có thể có tầm quan trọng đối với hoạt động của các LARthực vật [24].

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu chè từ giống chè Trung Du xanh được trồng tại Thái Nguyên do

TS Dương Trung Dũng - Khoa Nông học - Trường Đại học Nông lâm TháiNguyên chọn lọc và cung cấp

● Hóa chất điện di RNA tổng số: 5X MOPS (MOPS pH 7,0 0,2M;

50%; EDTA 1mM; Bromophenol Blue: 0,4%).

● Hóa chất PCR (hỗn hợp PCR Master mix; cặp mồi LAR F342, LARR342…) và các hóa chất thông dụng khác

● Hóa chất sử dụng trong việc chọn dòng: Clone JET for cloning PCR

Kit (Thermo Scientific); tế bào vi khuẩn E coli chủng DH10B; LB; agar; dung dịch Sol I; Sol II; Sol III; Ampicillin; enzyme giới hạn BglII, BamHI và

XhoI.

● Kit tổng hợp cDNA: First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real –Time PCR của hãng Affymetrix