Ứng dụng phương pháp quang phổ phân giải theo thời gian nghiên cứu quá trình truyền năng lượng cộng hưởng

Luận văn được hoàn thành với sự hỗ trợ từ đề tài KHCN cấp Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam thuộc Chương trình phát triển Vật lý tới 2020 cấp: “Ứng dụng phương pháp huỳnh quang

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ QUANG HỌC

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN GIẢI THEO THỜI GIAN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TRUYỀN NĂNG LƯỢNG

CỘNG HƯỞNG

PHẠM THỊ HẰNG LỚP CAO HỌC LÝ K10.B1

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tớiThầy giáo hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thanh Bình Thầy đã giao đề tài và tận tìnhhướng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Vũ Thị Bích và Th.S Nguyễn ĐìnhCông ở Viện Vật Lý Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, PGS TS ChuViệt Hà trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện

để em hoàn thành tốt luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn của mình tới toàn thể Thầy Cô giáo trong khoa Vật lýtrường Đại Học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và giúp đỡ em trongsuốt quá trình học tập tại khoa, và các anh chị, các bạn học viện lớp K10B1 – lớp Caohọc Vật lý đã trao đổi và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè đồngnghiệp của tôi – những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốtthời gian học tập và thực hiện luận văn này

Luận văn được hoàn thành với sự hỗ trợ từ đề tài KHCN cấp Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam thuộc Chương trình phát triển Vật lý tới 2020 cấp:

“Ứng dụng phương pháp huỳnh quang phân giải thời gian và hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng FRET thử nghiệm phát hiện độc tố kháng sinh trong thực phẩm”

Tác giả luận văn

PHẠM THỊ HẰNG

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH .v MỞ ĐẦU 1

Chương 1: Tổng quan 3

1.1.Vật liệu nano và ứng dụng 3

1.2 Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) 5

1.2.1 Khái niệm .5

1.2.2 Lịch sử phát triển FRET [11] .7

1.2.3 Ứng dụng hiệu ứng FRET và chấm lượng tử làm nanosensor 14

Chương 2 Kỹ thuật thực nghiệm 17

2.1 Kỹ thuật đo hấp thụ 17

2.2 Kỹ thuật đo huỳnh quang 19

2.3 Kỹ thuật đo huỳnh quang phân giải thời gian 20

2.3.1 Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang 20

2.3.2 Hệ đo huỳnh quang phân giải thời gian - TCSPC 23

Chương 3: Kết quả và thảo luận 27

3.1 Quá trình truyền năng lượng giữa AuNPs với phân tử Rh6G .27

3.2 Quá trình truyền năng lượng giữa Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS 33

KẾT LUẬN 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Các mẫu nghiên cứu FRET giữa cặp Rh6G (Donor) và AuNPs (Acceptor) 29Bảng 3.2 Kết quả tính thời gian sống từ fitting đường cong suy giảm huỳnh quang theo hàmstretch exponent

33Bảng 3.3 Các mẫu nghiên cứu FRET giữa cặp Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS 34Bảng 3 4 Giá trị của tích phân vùng phổ chồng chồng lên nhau, (J ()), hiệu suất truyềnnăng lượng Förster, (E%), và khoảng cách cặp donor-acceptor (r) 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Mô hình h i ệ u ứng F RE T 6

Hình 1.2: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET 10

Hình 1.3: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và Acceptor 11

Hình 1.4: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng cách cặp donor- acceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất truyền băng 50%

12 Hình 1.5: Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung dịch hỗn hợp của donor và acceptor 13

Hình 1.6: Mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano QDs (a,b) 15

Hình 1.7: Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động 16

Hình 2.1: Máy đo phổ hấp thụ Shimazu UV2600 18

Hình 2.2: Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS-NIR 18

Hình 2 3: S ơ đồ n g u y ê n l ý c ủ a m á y phổ kế h u ỳ nh qu a ng C a r y E c l i pse 20

Hình 2.4: (a) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền thời gian; (b) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền tần số 22

Hình 2.5: Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC: một photon tín hiệu được ghi nhận tại mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian (bin time), dựng lại biểu đồ tín hiệu theo thời gian (histogram) sẽ cho profile cường độ [17] 24

Hình 2.6: Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC 25

Hình 3.1: Ảnh HRTEM của AuNPs 28

Hình 3.2: Phổ hấp thụ của hạt AuNPs trong 28

Hình 3.3: Phổ PL của các mẫu AuNPs/Rh6G, kích thích = 488nm 30

Hình 3.4 Hiệu suất FRET phụ thuộc vào tỉ lệ N giữa Acceptor và Donor (tam giác đỏ), so sánh với lý thuyết Förster tại tỉ lệ R/Ro = 0.92 (Đường màu xanh dương) 30

Hình 3.5: Đường cong suy giảm huỳnh quang của Rh6G 32

Hình 3.6: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của các mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau 34

Hình 3.7: Phổ huỳnh quang phân giải thời gian của các mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ thành phần khác nhau đo tại đỉnh phát xạ 563 nm với bước sóng kích thích 405 nm 35

MỞ ĐẦU

Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang hay truyền năng lượng cộnghưởng Förster được đặt tên của nhà khoa học Theodor Förster - người đã tìm ra hiệuứng truyền năng lượng giữa hai chất màu hữu cơ, chất huỳnh quang [1] Trong một thờigian dài, mục tiêu chính của phương pháp dựa vào FRET là xác định khoảng cách giữacác phân tử tương tác bằng cách xác định sự thay đổi cường độ huỳnh quang của chấtcho (donor) hoặc chất nhận (acceptor), từ đó xác định hàm lượng thành phần củadonor-acceptor [2,5] Sau này với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đặc biệt là kỹthuật đo thời gian sống huỳnh quang, ảnh thời gian sống huỳnh quang, FRET trở thànhcông cụ nghiên cứu cấu trúc, tương tác giữa các phân tử trong tế bào FRET là nguyênnhân gây ra sự dập tắt huỳnh quang của donor nhưng phần lớn năng lượng phát xạ bởiacceptor FRET có các thuộc tính của truyền năng lượng và dập tắt cơ học [4] Khi hiệuứng FRET xảy ra, acceptor với một tập hợp các mức năng lượng quỹ đạo gần hoặcthấp hơn mức kích thích của donor, có nghĩa là phổ phát xạ của donor phải chồng chậplên phổ hấp thụ của acceptor, quá trình truyền năng lượng có thể đo được thông quathời gian sống huỳnh quang Xác định FRET qua thời gian sống huỳnh quang có một

số ưu điểm so với phương pháp xác định cường độ phổ đồng thời tránh được trườnghợp không phải FRET (quá trình tái hấp thụ) Trong nghiên cứu này, chúng tôi trìnhbày kết qủa nghiên cứu truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang là cặp donor-acceptor là: chất màu Rhodamin 6G và hạt nano vàng; Rhodamin 6G và chấm lượng

tử CdSe/ZnS trong môi trường dung môi nước

Luận văn với tiêu đề: “Ứng dụng phương pháp quang phổ phân giải thời gian nghiên cứu quá trình truyền năng lượng cộng hưởng ” Ngoài phần mở đầu, kết luận

được chia làm 3 chương:

Chương 1: Tổng quan tìm hiểu tài liệu về FRET, ứng dụng FRET: trình bày

lich sử phát triển nghiên cứu FRET, lý thuyết FRET và một số ứng dụng củanó

Chương 2: Kỹ thuật thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu đo, các phương pháp thực

nghiệm được sử dụng trong luận văn như đo phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang,thời gian sống huỳnh quang

Chương 3 Trình bày các kết quả truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh

quang của 2 cặp donor-acceptor là: chất màu Rhodamin 6G và hạt nano vàng;Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS trong môi trường dung môi nước

Chương 1

TỔNG QUAN 1.1.Vật liệu nano và ứng dụng

Vật liệu nano là loại vật liệu được đặc biệt chú ý nghiên cứu trên thế giới và tạiViệt Nam trong hơn mười năm trở lại đây Hiện nay công nghệ nano đã và đang dần đivào cuộc sống, nhiều ngành, nhiều lĩnh vực sử dụng công nghệ nano tạo ra ứng dụng

có tính đột biến lớn Công nghệ và Vật liệu nano cũng là hướng nghiêu cứu ưu tiêntrong định hướng phát triển khoa học công nghệ của Đảng và Nhà Nước ta trong thờigian tới Về bản chất vật liệu nano là loại vật liệu làm việc ở cấp độ nguyên tử phân tửnên nó có nhiều tính chất khác biệt so với vật liệu ở dạng khối Vật liệu nano cho thấykhả năng ứng dụng rất phong phú và đa dạng, vật liệu nano có thể thay thế các loại vậtliệu truyền thống hoặc sử dụng tính chất mới của vật liệu nano để tạo ra ứng dụng mới.Với ưu điểm là kích thước rất bé (1-100nm) vật liệu nano có thể dễ dàng xâmnhập vào các tế bào sống Đây chính là chìa khoá để mở ra khả năng ứng dụng to lớntrong lĩnh vực y-sinh học Vật liệu nano có thể kết hợp với các chất hợp sinh để đưavào trong cơ thể, tế bào sống mà không bị đào thải và bám vào tế bào đích Đây chính

là nguyên lý ứng dụng hạt nano đánh dấu nhận biết các tế bào bị bệnh nhằm chẩn đoán

và điều trị, nhằm giảm thiểu các hiệu ứng phụ so với những phương pháp truyềnthống Cũng với tính chất này, vật liệu nano còn được sử dụng để dẫn truyền thuốc tớitận các tế bào bệnh, ức chế hoặc tiêu diệt các tế bào Nhiều phương pháp điều trị bệnhđược xây dựng trên cơ sở sử dụng vật liệu nano như liệu pháp hoá trị (chemotherapy):chế tạo các hệ thống mang thuốc nano hướng đích làm tăng hiệu quả của thuốc vàgiảm các tác dụng phụ; liệu pháp nhiệt trị (thermal therapy): sử dụng nguyên tắc đốtnội với các nguồn nhiệt là các hạt từ, hạt kim loại kích thước bé hơn tế bào để bóc táchhoặc diệt tế bào ung thư; liệu pháp thực khuẩn thể (phage therapy) là phương pháp sửdụng các thực khuẩn thể đặc hiệu gắn với các hạt mang thuốc… Ngoài ra, tính chấtquang của các hạt nano như chấm lượng tử, hạt nano vàng, các hạt nano silica chứatâm màu hữu cơ và các hạt nano đất hiếm được sử dụng để đánh dấu, làm tăng độtương phản ảnh, tăng độ nhạy cũng như độ chính xác của phép chuẩn đoán hình ảnh

Tại Việt Nam nghiên cứu về vật liệu nano đã được thực hiện gần hai chục năm qua,hàng ngàn dự án, đề tài khoa học các cấp đã được thực hiện, chúng ta đã thu đượcnhiều kết quả khoa học đáng khích lệ, nhiều công trình khoa học đã được công bố,nhiều kết quả đã được đưa vào ứng dụng trong thực tế …bên cạnh những tính chất,thông số, đặc trưng vật lý của đơn hạt nano ở trạng thái dừng (steady state) của vật liệunano được tập trung nghiên cứu thời gian gần đây, một tính chất khác của vật liệunano là tính chất động học – tính chất của vật liệu khi có tương tác với môi trường bênngoài ít được chú ý vì ở Việt Nam chúng ta chưa có đầy đủ phương tiện, máy móc đểthực hiện các nghiên cứu này Gần đây tại viện Vật lý Viện Hàn lâm Khoa Học CôngNghệ Việt Nam đã phát triển được một số thiết bị cho phép xác định được một số đặctính động học của vật liệu nano

Vật liệu nano có triển vọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Chẳng hạn, ốngnano cacbon, dây nano silic đóng vai trò quan trọng trong việc chế tạo các linh kiệnđiện tử, cũng như các chuyển mạch quang Các vật liệu gốm trên cơ sở tinh thể nanoSi3N4, SiC có độ cứng siêu cao, ít bị mài mòn, được dùng trong cơ khí để chế tạomũi khoan, dao cắt gọt, các ổ bi Vật liệu TiO2 anatase với kích thước cỡ nano métcho thấy chúng là một chất xúc tác quang điện hóa mạnh, mở ra một khả năng ứngdụng làm vật liệu xúc tác, làm sạch môi trường: kính được phủ hạt tinh thể nano TiO2

sẽ không dính ướt; các loại sơn có pha hạt nano TiO2 sẽ có độ bám dính rất cao, làmcho lớp sơn bền lâu và không bám bụi Các hạt nano từ: Fe2O3, Fe3O4 được sử dụng

để đốt các tế bào ung thư bằng từ trường ngoài mà không ảnh hưởng đến các tế bàobình thường

Các hạt kim loại có cấu trúc nano cũng là một hướng tiếp cận trong các nghiêncứu khoa học–công nghệ nano Ở đây, tính chất hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặtliên quan tới hệ điện tử tự do đặc biệt có ý nghĩa quan trọng Gần đây, hai loại hạtnano kim loại được quan tâm nghiên cứu nhiều là vàng (Au) và bạc (Ag) Vàng kíchthước nano (khoảng một vài chục nm) có plasmon bề mặt cộng hưởng ở khoảng 530

nm Quá trình biến đổi photon–plasmon–photon (vùng phổ cộng hưởng ~530 nm) chophép tiếp cận trực tiếp lĩnh vực nano–photonics, tận dụng được các ưu thế "nhanh" củaquang tử (photonics) và "kích thước nano" của điện tử Plasmon bề mặt trong các hạtvàng còn được sử dụng để truyền năng lượng ánh sáng cho các tế bào, protein được

đánh dấu riêng, nhằm có được sự đốt nóng chọn lọc trong điều trị định vị các mô ungthư Các hạt nano bán dẫn (CdS, CdSe, CuInS2 ) được sử dụng trong đánh dấu sinhhọc, phát hiện các phân tử DNA, phát hiện ung thư, virút hay các ứng dụng trong pinmặt trời, chiếu sáng rắn [6]

1.2 Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET)

1.2.1 Khái niệm.

Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FluorescenceResonance Energy Transfer - FRET ) là một cơ chế truyền năng lượng xảy ra ở cấp độnano thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, đây là một hiện tượng vật lý quantrọng với nhiều lĩnh vực tiềm năng trong lĩnh vực quang điện tử và rất nhiều lĩnh vựckhác FRET được đưa ra từ thập kỷ 50 của thế kỷ trước, hiện nay đang được ứng dụngrộng rãi trên nhiều lĩnh vực đặc biệt trong nghiên cứu y sinh học [7,8] FRET là hiệuứng phụ thuộc vào khoảng cách truyền năng lượng từ một chất cho huỳnh quang(donor) tới một acceptor huỳnh quang (acceptor) phù hợp, là một trong số ít các công

cụ có sẵn để đo khoảng cách nanomet và xác định những thay đổi trong khoảng cách

cả trong in vitro lẫn trong cơ thể Do có độ nhạy với khoảng cách cao, nên hiệu ứngFRET đã được sử dụng để nghiên cứu động học, tương tác nguyên tử [9,10,13]

Cơ chế truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang liên quan đến các chất pháthuỳnh quang mà ở đây là điện tử ở trạng thái kích thích, một phân tử huỳnh quang cóthể truyền năng lượng kích thích của nó cho một acceptor không phát xạ gần đó thôngqua các tương tác lưỡng cực-lưỡng cực tầm xa Lý thuyết truyền năng lượng được dựatrên khái niệm về một chất huỳnh quang kích thích như một dao động lưỡng cực có thểtrải qua sự trao đổi năng lượng với một lưỡng cực thứ hai có tần số cộng hưởng tương

tự Vấn đề này, truyền năng lượng cộng hưởng tương tự như sự dao động cùng tần số.Ngược lại, năng lượng bức xạ yêu cầu phát xạ và tái hấp thụ một photon phụ thuộc vàokích thước vật lý và tính chất quang học của mẫu vật, cũng như hình dạng của bề mặt

và quãng đường truyền sóng Không giống như các cơ chế bức xạ, truyền năng lượngcộng hưởng có thể mang lại một lượng đáng kể thông tin về cấu trúc liên quan đến cácacceptor.[9,10,12]

Một cặp phân tử tương tác với nhau thông qua hiệu ứng FRET được gọi là mộtcặp donor- acceptor Hiện tượng FRET không qua trung gian là quá trình phát xạphoton Ngoài ra, nó thậm chí không yêu cầu chất màu nhận được phát huỳnh quang.Mặc dù trong hầu hết các ứng dụng, các donor và acceptor đều có khả năng pháthuỳnh quang [13,14]

Tóm lại, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET ) hay còn gọi

là hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang Ở đây truyền năng lượngcộng hưởng (RET) còn gọi là truyền năng lượng cộng hưởng điện tử (electronicenergy tranfer – EET)

Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) là cơ chế màtrong đó một hạt nano có thể truyền năng lượng kích thích không bức xạ của nó chomột hạt nano độc lập khác ở một khoảng cách ngắn (khoảng cách nguyên tử)

Phát xạ FRET

Hấp thụ Donor Accrptor

Hình 1.1: Mô hình hiệu ứng FRET

Một cặp nguyên tử tạo ra một điện trường do sự tương tác lưỡng cực Đầu tiên

sự hấp thụ ánh sáng xảy ra ở nguyên tử cho (donor molecule), bắt đầu bị kích thích.Trước khi donor có thể phát huỳnh quang và quay trở lại trạng thái ban đầu, nó đang ởtrạng thái kích thích nên truyền năng lượng cho nguyên tử nhận (acceptor molecule)gần nhất có trạng thái năng lượng kích thích thấp nhất qua sự trao đổi của một photon

ảo Nguyên tử cho (the donor) trở về trạng thái cơ bản còn nguyên tử nhận trở lêntrạng thái kích thích.[9,15,16]

Kết quả cuối cùng là nguyên tử nhận bắt đầu chuyển lên trạng thái kích thíchnhờ vào quá trình gián tiếp nhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất

tự nhiên [12] FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó không phụ thuộcvào sự tiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử

1.2.2 Lịch sử phát triển FRET [11]

Mặc dù các ứng dụng thực tế của FRET chỉ diễn ra sau năm 1950 nhưng quansát hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang được thực hiện từ thựcnghiệm năm 1900 và các nhà khoa học luôn tìm mọi cách để giải thích hiện tượng này.Bắt đầu với lý thuyết về sóng điện từ (EM) và quang phổ, đồng thời với sự ra đời của

cơ học lượng tử (QM) Những lý thuyết này rất cần thiết cho quan sát và giải thíchđúng về việc truyền năng lượng không bức xạ Khái niệm EM đưa ra chỉ vài thập kỷtrước khi quan sát được truyền năng lượng Lý thuyết đầu tiên cố gắng giải thíchFRET là sử dụng lý thuyết EM cổ điển này Lý thuyết cơ học lượng tử đầu tiên củaFRET đã được phát triển đồng thời với lý thuyết mới của Heisenberg, Schrodinger vàDirac (Heisenberg, 1925; Dirac, 1926; Schrodinger, 1926)

Thí nghiệm đầu tiên ghi lại các phép đo truyền năng lượng huỳnh quang cộnghưởng (quan sát phát xạ của nguyên tử donor) được Carlo và Franck thực hiện trênkhoảng cách lớn hơn bán kính va chạm đã được thực hiện vào năm 1922 Carlo quansát phát xạ từ Tali trong một hỗn hợp hơi thủy ngân và Tali, khi hỗn hợp hơi bị kíchthích bởi bước sóng 253,6 nm, Bước sóng này chỉ có thể kích thích các nguyên tử thủyngân nhưng lại thu được huỳnh quang của Tali Huỳnh quang của Tali được gọi là

“huỳnh quang cảm ứng” (sensitized fluorescence) nó quan sát được vì năng lượng từcác nguyên tử thủy ngân bị kích thích đã truyền cho nguyên tử tali

Các thí nghiệm tiếp theo của các tác giả khác thấy huỳnh quang cảm ứng xẩy ravới hơi của các kim loại kiềm như: bạc, cadmium, chì, kẽm và indi với sự có mặt củahơi thủy ngân Tầm quan trọng của sự cộng hưởng giữa năng lượng mức giữa các mứcnăng lượng của nguyên tử nhạy cảm đã được minh chứng rõ ràng bởi các thí nghiệmsau nay của Beuler và Josephi (1927-1929), cường độ huỳnh quang tăng với sự thamgia của hai loại nguyên tử Điều này phù hợp với nguyên lý Franck (1922): năng lượngđiện tử của một nguyên kích thích không thể chuyển trực tiếp thành động năng của hạt

va chạm Nếu năng lượng kích thích đã chuyển thành nội năng dập tắt thì sẽ có nhữngtrạng thái kích thích với năng lượng được tăng cường

Lý thuyết cơ học lượng tử để giải thích sự truyền năng giữa các nguyên tử ởkhoảng cách xa hơn so với bán kính va chạm đã được đề xuất bởi Kallmann và

London (1928) Lý thuyết này giả thiết có sự cộng hưởng giữa các mức năng lượngcủa các nguyên tử tương tác Về cơ bản đây là phép tính nhiễu loạn bậc hai để tínhtoán năng lượng tương tác Họ tìm ra rằng chuyển dời giữa các mức năng lượng là cácchuyển dời dipole, tiết diện hiệu dụng q của 2 nguyên tử tương tác tăng -2/3 ( là sự saikhác mức năng lượng kích thích) khi 0 tiết diện hiệu dụng tiến tới giá trị lớn hơnbán kính tán xạ Đây là cơ sở lý thuyết FRET cơ học lượng tử sau này, tương tự như

mô tả của lực London-van der Waals

Lực London - Van Der Waals) và tương tác Debye-Keesom

Ý tưởng lưỡng cực-lưỡng cực (Dipole-Dipole) tương tác ở khoảng cách giữacác nguyên tử và phân tử đang được London áp dụng giải thích tương tác phân tửVander Waals và truyền năng lượng Trước đó tương tác này cũng đã được Keesom(1912); Debye (1920-1921) sử dụng giải thích các tương tác giữa các phân tử có mốiliên hệ giữa phân tử của London và FRET Sự khác nhau chính ở đây là năng lượngtương tác của lực Vander Waals và tốc độ thay đổi năng lượng của FRET Trongtương tác Vander Waals cả hai phân tử tương tác ở trạng thái cơ bản còn trong FRETmột trong hai phân tử tương tác ở trạng thái kích thích Biểu thức lực London tươngtác giữa hai nguyên tử liên quan đến cường độ dao động UV-Vis của chuyển dờiquang học tương ứng, giống như FRET (Förster, 1951) Biểu thức đầy đủ cho tươngtác London tổng của các chuyển dời quang học của hai nguyên tử tương tác Nếu cảhai nguyên tử đều ở trạng thái cơ bản, lực London luôn là lực hút, hơn nữa, nếu cácnguyên tử tương tác không phải là hình cầu đối xứng có phân cực đẳng hướng, địnhhướng tương đối của chúng sẽ ảnh hưởng đến sự tương tác (giống như sự phụ thuộcđịnh hướng của FRET) Tương tác van der Waals đơn giản (không tính đến thế năngliên quan đến hiệu ứng Casmir theo lý thuyết của London giảm theo R6, trong đó R làkhoảng cách giữa các nguyên tử; điều này cũng giống nhau khoảng cách phụ thuộcnhư FRET giữa hai phân tử huỳnh quang

Lý thuyết của J Perrin và F Perrin

Mô hình J Perrin (1925): Ông giả thuyết rằng việc truyền năng lượng kíchthích có thể nhảy từ một phân tử tới một phân tử khác thông qua tương tác giữa cácdao động lưỡng cực của các phân tử gần nhau Theo lý thuyết cổ điển một phân tử kíchthích sẽ dao động ở tần số tương ứng với cường độ của năng lượng kích thích

lý do sau đây Năng lượng bị mất bởi donor chính xác bằng năng lượng thu được củaacceptor Mỗi phân tử chỉ có một xác suất va chạm nhất định Điều này làm giảm khảnăng cộng hưởng, bởi vì phải có hai lưỡng cực tương tác để có quá trình truyền nănglượng F Perrin đã sử dụng lý thuyết phổ va chạm mở rộng cho truyền năng lượng ởkhoảng cách mới giảm xuống còn khoảng [(/ 2) (t/)]1/6 trong đó t là thời gian giữ hailần va chạm; là thời gian sống huỳnh quang

Lý thuyết của Förster's.

Trên cở sở các công trình của các nhà khoa học tiền bối Theodor Förster đãphát triển lý thuyết truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang xuất bản và công bốqua hàng loạt công bố từ 1946-1951

1.2.3 Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET.[9,12]

Sự kích thích trên một ion có thể lan truyền sang một ion cùng loại khác sang mộttrạng thái cơ bản là một kết quả của sự truyền năng lượng cộng hưởng (FRET) khichúng được định xứ gần nhau Khoảng cách giữa các ion mà tại đó xác suất của quá

trình huỳnh quang và năng lượng trở nên cạnh tranh nhau là cỡ vài Angstrom Sơ đồ của quá trình truyền năng lượnđg cộng hưởng mô tả như hình dưới:

Hình 1.2: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET

Trong quá trình truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang, phân tử huỳnhquang donor hấp thụ năng lượng tưng ánh sáng tới chuyển lên trạng thái kích thích.[9]Năng lượng kích thích này truyền cho phân tử huỳnh quang acceptor lân cận Quátrình truyền năng lượng này tự nó sẽ làm giảm huỳnh quang của donor (dập tắt) vàtăng cường độ huỳnh quang acceptor đồng thời giảm thời gian sống huỳnh quangdonor

D + h → D*+

D* + A → D +A*

A* →A + h’

D: donor; A: acceptor; dấu “*” kí hiệu trạng thái kích thích

Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là:

(i) Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử donor phải chồng lên phổ hấpthụ hoặc kích thích của chất màu nhận Mức độ chồng chập lên nhau được gọi là phổchồng lên nhau tích hợp (J)

(ii) Donor phải có cường độ huỳnh quang mạnh

(iii) Hai chất này (donor và acceptor) phải ở khoảng cách gần nhau (thường 1đến 10 nanomet)

Acceptor Khu vực màu đậm là sự chồng quang phổ gữa quang phổ huỳnh quang củacác donor và phổ hấp thụ của acceptor.[9]

Hiệu suất truyền năng lượng FRET tỉ lệ với nghịch đảo mũ 6 khoảng cáchdonor-acceptor

(1.1)Trong đó R0 là bán kính Förster – là khoảng cách mà ở đó năng lượng truyền được 50%

Trong đó DA là thời gian sống huỳnh quang của donor khi có mặt acceptor; D

là thời gian sống huỳnh quang của donor khi không có mặt acceptor

Tóm lại, tỷ lệ FRET phụ thuộc vào mức độ chồng chập quang phổ giữa các cặp

cho – acceptor (hình 1.3), hiệu suất lượng tử của các chất cho, định hướng tương đối

của các donor– acceptor, những khoảng cách chuyển tiếp lưỡng cực và khoảng cách từcác donor tới acceptor Bất kỳ quá trình nào có ảnh hưởng đến khoảng cách giữa cáccặp chất cho- acceptor cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất của FRET

Phát hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET):

Việc phát hiện và định lượng hiệu ứng FRET có thể được thực hiện trong một

số cách khác nhau Đơn giản chỉ cần hiện tượng này có thể được quan sát bởi một mẫuvật có chứa cả các donor và các phân tử acceptor với ánh sáng phát ra ở các bước sóngtrung tâm gần với phát xạ Bởi vì FRET có thể dẫn đến giảm cường độ huỳnh quangcủa các phân tử donor cũng như tăng cường độ huỳnh quang của acceptor, nên khi xácđịnh tỷ lệ số liệu của hai tín hiệu có thể phát hiện được hiệu ứng FRET có xảy ra haykhông [12]

Ưu điểm của phương pháp này là một thước đo của sự tương tác có thể đượcthực hiện là độc lập với nồng độ tuyệt đối của cảm biến Bởi vì không phải tất cả cácgốc acceptor đều phát huỳnh quang, nên chúng có thể được sử dụng như một phươngtiện để dập tắt huỳnh quang Trong trường hợp này, những tương tác mà kết quả trongmột phân tử các chất huỳnh quang cho đến gần phân tử như vậy sẽ dẫn đến một sự mấtmát tín hiệu

Khoảng cách (Angstorm)

Hình 1.5: Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung dịch

hỗn hợp của donor và acceptor

Trong Hình 1.5, huỳnh quang của acceptor tăng gần sáu lần khi có sự hiện diện

của chất cho Trong trường hợp, như huỳnh quang các donor trở thành 1/3 huỳnhquang các chất cho Sự thay đổi cường độ huỳnh quang là bằng chứng hình ảnh rõràng của FRET Các quang phổ huỳnh quang đã được ghi nhận là sự phát huỳnh quangcủa donorvà nhận Đây là hiệu ứng FRET sử dụng các chất 3-octadecyl-2[3-octadecyl-2(3H)-benzothizolidene) metyl] benzoth) metyl] benzothiazolium perchlorate (chất cho), Octadecyl rhodamine B (acceptor)

1.2.4 Ứng dụng hiệu ứng FRET và chấm lượng tử làm nanosensor

Nanosensor là cảm biến được xây dựng ở cấp độ nano, với mục đích chủ yếu là

để thu thập số liệu về quy mô nguyên tử và chuyển nó thành dữ liệu có thể dễ dàngphân tích Các cảm biến này cũng có thể được định nghĩa là “Một cảm biến hóa học,cảm biến vật lý, cảm biến sinh học sử dụng các thành phần có kích thước nano, thôngthường là từ kích thước micromet tới nanomet” Những cảm biến này có độ nhạy cực

kỳ cao và có thể phát hiện các hạt đơn lẻ hoặc thậm chí nồng độ cực thấp dư lượngmột chất nguy hiểm tiềm tàng còn sót lại Vì hiện nay công nghệ này đã và đang đượcnghiên cứu ở rất nhiều hướng khác nhau nên rất khó để có thể cho một định nghĩa duynhất về những gì chính xác là một nanosensor.[12]

phát huy Bằng phương pháp này, ta có thể kiểm chứng được DNA nhanh và độ chính xác cao[12,13,14] Hình 1.6 là mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano.

Hình 1.6: Mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano QDs (a,b)

và hiệu ứng kiểm tra (c).

Nhìn chung, biosensor nano hiệu ứng FRET dùng chất phát huỳnh quang QDs

có nhiều ưu điểm so với huỳnh quang hữu cơ Vì vậy nhiều loại biosensor để xác địnhảnh invivo được nghiên cứu chế tạo

Sử dụng nanosensor trong nghiên cứu Enzim

Giáo sư Gae Baik Kim và Young-Pil Kim cùng các cộng sự taị đại họcHanyang Hàn Quốc cũng nghiên cứu và phát triển phép phân tích Enzim Proteasebằng nanosensor sử dụng chấm lượng tử có hiệu ứng FRET Nghiên cứu này cho thấyviệc phát triển hoạt động của protease dựa trên sự truyền năng lượng của các chấmlượng tử Bằng cách kết hợp một số loại protease vào thiết kế của dạng QDs có cấutrúc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) và truyền năng lượng cộnghưởng phát quang sinh học (BRET), hoạt động của protease dẫn đến những thay đổitrong hiệu suất truyền năng lượng Đặc biệt là do đặc tính vượt trội của QDs, nó có thể

được xem như là một tác nhân nhận biết protease với độ nhạy cao Người ta dự đoánrằng QDs dựa trên FRET/BRET như một đầu dò sẽ có một tiềm năng lớn trong việcphân tích vai trò cơ bản của protease và có khả năng chế tạo loại thuốc ức chế proteasenhư thuốc điều trị sinh học dạng nano [12,13,14].

FRET là kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng trong các ứng dụng cảm biếnsinh-hóa hiện nay bởi độ nhạy cao, khả năng phục hồi trạng thái tốt, và khả năng quansát trong thời gian thực Phương pháp thông thường để phát hiện để phát hiện hoạtđộng protein được dựa trên phát huỳnh quang với các liên kết peptide hữu cơ Ví dụcho hoạt động protease là đầu dò tự động, đầu dò mang màu kép, và đầu dò dựa trên

các photon hiệu ứng FRET, như mô tả hình 1.7.

Tuy nhiên, việc phát huỳnh quang hữu cơ thường gặp một vài vấn đề chẳng hạnnhư hình ảnh bị tẩy trắng, độ nhạy ảnh hưởng bởi môi trường, khó khăn trong việcphân tích tổ hợp donor và acceptor Như đã nói trên, những vấn đề trong các nghiêncứu về FRET có thể được khắc phục khi có phổ huỳnh quang thích hợp hoặc dập tắt

được sử dụng thích hợp với chấm lượng tử (QDs).(hình 1.7) Từ QDs có dải hấp thụ

rộng và phổ phát xạ hẹp cũng như sự ổn định quang cao, sẽ có thuận lợi trong việctheo dõi lâu dại và cho phép phát hiện, QDs thường được sử dụng như các donor trongkhi các phân tử nhận năng lượng huỳnh quang (chất dập tắt) thường là một peptideđược biến tính thích hợp [12-13-14]

Hình 1.7: Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động

(A) Quá trình FRET thông thường (B) FRET sử dụng QDs D và A là chất cho và

nhận tương ứng

Chương 2

KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1 Kỹ thuật đo hấp thụ

Phổ hấp thụ là một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu sự tương tác của vậtliệu với ánh sáng chiếu vào, qua đó, có thể biết được thông tin về các quá trình hấp thụxảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học từ một số trạng thái cơ bản ni đến một

số trạng thái kích thích nj, từ đó có thể xác định được bước sóng kích thích hiệu quảcho quá trình quang huỳnh quang (j–i) quan tâm Môi trường vật chất hấp thụ ánh sángtuân theo định luật Beer–Lambert:

I (ν) = I 0 (ν)e – α (ν )d (2.1)

trong đó: I 0 (ν) và I(ν) là cường độ ánh sáng tới và cường độ truyền qua mẫu vật chất, d là độ dày của mẫu và α(ν) là hệ số hấp thụ vật liệu đối với photon có năng lượng hν (hay hc/λ, với c là vận tốc ánh sáng).

Muốn xác định hệ số hấp thụ α(ν), người ta lấy in hai vế (2.1), được:

(2.2)

Phổ hấp thụ biểu diễn đồ thị hệ số hấp thụ α (hay độ hấp thụ A) theo bước sóng

hay năng lượng của photon đi qua vật chất Như vậy, hệ số hấp thụ lớn tại một bướcsóng nào đó cho thấy photon có năng lượng tương ứng bị vật chất hấp thụ mạnh, phầnánh sáng truyền qua có cường độ yếu Ý nghĩa của hệ số hấp thụ bằng 1 là khi ánhsáng truyền qua một môi trường có độ dày 1 cm, cường độ sẽ bị suy giảm đi e (~2,7)

lần Hai đại lượng I 0 (ν) và I (ν) đo được bằng thực nghiệm.

Phương pháp đo phổ hấp thụ trong từng vùng phổ đòi hỏi nguồn sáng phát xạ liêntục trong vùng phổ đó, một phổ kế hoặc là máy đơn sắc lựa chọn bước sóng hay tần số,thiết bị thu tín hiệu để đo sự truyền qua của ánh sáng đơn sắc Nguồn sáng thườngđược sử dụng là đèn hydrogen và deuterium đối với vùng tử ngoại và đèn dây tóc(volfram+halogen) cho vùng nhìn thấy và vùng hồng ngoại gần Trong thí nghiệm đophổ hấp thụ, chúng tôi dùng đèn halogen phát xạ trong vùng nhìn thấy Bằng cách ghi

phổ trải trong vùng năng lượng photon rộng, có thể biết được các quá trình hấp thụ xảy

ra tương ứng với các chuyển dời quang học

Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Một chùm ánh sáng được phát ra từ nguồn

sáng, là đèn phát sáng trong vùng tử ngoại UV hoặc phát trong vùng nhìn thấy VIS,được đưa qua hệ máy đơn sắc là hệ lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ, để được tách rathành các bước sóng đơn sắc Mỗi tia sáng đơn sắc này sẽ lần lượt được chia thành haitia để so sánh, có cường độ như nhau nhờ một gương phản xạ bán phần Một trong haitia sáng trên truyền qua một cuvet trong suốt bằng thạch anh chứa dung dịch mẫu cần

nghiên cứu, cường độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu là I Tia sáng còn lại là tia

sáng so sánh truyền qua một cuvet tương tự nhưng chỉ chứa dung môi không chứa

chấm lượng tử, cường độ của nó sau khi truyền qua dung môi là Io Cường độ của các

tia sáng sau đó được các detector ghi lại và so sánh trực tiếp trong cùng điều kiện đo

Hình 2.8: Máy đo phổ hấp thụ Shimazu UV2600

Hình 2.9: Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS-NIR

Nếu mẫu không hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng đã cho thì I = Io Tuy nhiên nếu mẫu hấp thụ ánh sáng thì I < Io Các phổ có thể được vẽ dưới dạng phổ truyền

qua :

T(ν) = I(ν)/Io(ν) (2.3)

hoặc phổ hấp thụ:

A(ν) = log 10 [Io(ν)/I(ν)] (2.4)

2.2 Kỹ thuật đo huỳnh quang

Hệ đo phổ huỳnh quang Cary Eclipse phân giải cao được đặt tại Viện Vật Lý,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nguyên tắc hoạt động của phổ kế

Cary Eclipse được cho trên hình 2.2.

Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn

Xenon flash có thể phát bước sóng từ 200 đến 1000nm, nguồn sáng từ đèn xenon điqua một máy đơn sắc để chọn bước sóng đơn sắc kích thích Ánh sáng đơn sắc nàyđược đưa vào buồng mẫu và hội tụ lên mẫu đo Tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫuđược hội tụ lên lối vào của máy đơn sắc thứ hai và thu nhận ở lối ra bằng đầu thuquang điện Một phần của ánh sáng kích thích được trích ra đưa vào đầu thu quangđiện thứ hai để đồng bộ với tín hiệu thu Xeno flash hoạt động ở chế độ xung nên CaryEclipse còn có thể đo thời gian sống huỳnh quang của mẫu có thời gian sống dài (lânquang)