Nghiên cứu quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm lim xanh (ganoderma lucium (leyss ex fr ) karst) có nguồn gốc tại thanh hóa

Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng sinh trưởng hệ sợi từ quả thể nấm Lim xanh.. DANH MỤC BẢNGBảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến s

HOÀNG VĂN NÂNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ SẢN XUẤT SINH

KHỐI SỢI NẤM LIM XANH (Ganoderma lucium (Leyss Ex

Fr.) Karst) CÓ NGUỒN GỐC TẠI THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái nguyên, năm 2018

HOÀNG VĂN NÂNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN LẬP VÀ SẢN XUẤT SINH KHỐI SỢI NẤM LIM XANH (Ganoderma lucium (Leyss Ex

Fr.) Karst) CÓ NGUỒN GỐC TẠI THANH HÓA

Nghành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: GS.TS Ngô Xuân Bình

Thái nguyên, năm 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tớiGS.TS Ngô Xuân Bình và Ths Nguyễn Thị Tình, Giáo viên hướng dẫn thựchiện luận văn này

Đồng thời, tác giả cũng xin chân thành cảm ơn Khoa Công nghệ Sinhhọc, Khoa Sau Đại học, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tạo mọiđiều kiện thuận lợi cho tác giả trong quá trình học tập và nghiên cứu Cảm ơncác thầy cô và đồng nghiệp đã trao đổi cùng tác giả những kiến thức và kinhnghiệm quý báu để giúp cho luận văn được hoàn thiện hơn

Bên cạnh đó, sự quan tâm của gia đình, bạn bè là nguồn động viênkhông thể thiếu để giúp tác giả hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018

Học viên

Hoàng Văn Nâng

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

1.1 Mục tiêu nghiên cứu: 3

1.1.1 Mục tiêu chung 3

1.1.2 Mục tiêu cụ thể .

4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Phân loại 5

1.2 Nguồn gốc 5

1.3 Tác dụng của nấm Linh chi

6 1.4 Đặc điểm hình thái, phân loại nấm Lim xanh .

14 1.4.1 Nguồn gốc và phân loại nấm Lim xanh 14

1.4.2 Đặc điểm thực vật và phân bố naams Lim xanh 14

1.5 Tổng quan về phân lập 15

1.6 Nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi trong môi trường lỏng

16 1.6.1 Nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng 16

1.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ sợi nấm Linh chi 18

1.7 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong và ngoài nước 19

1.7.1 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi ngoài nước 19

1.7.2 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong nước 19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP .

22 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 23 2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trong môi trường lỏng

28

2.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên giá thể rắn 30

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 32 3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phân lập giống từ mô thịt nấm Lim xanh Thanh Hóa 32 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng sinh trưởng hệ sợi nấm

từ quả thể nấm Lim xanh 34 3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến khả năng sinh trưởng hệ sợi từ quả thể nấm Lim xanh .36 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ quả thể .38 3.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường đến khả năng phát triển hệ sợi

từ nấm Lim xanh 40 3.1.6 Kết quả kiểm tra giống, đánh giá chất lượng giống nấm Lim xanh đã phân lập 41 3.2 Kết quả nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên môi trường lỏng 44 3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng sản xuất sinh khối nấm Lim xanh 44 3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh 46 3.3 Kết quả nghiên cứu thành phần giá thể nhân tạo đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh 49

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn nguyên liệu mùn cưa

gỗ lim đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh 49

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn phụ gia đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh 50

3.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đạm đến năng suất và chất lượng nấm Lim xanh sau 90 ngày nuôi cấy .51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh

trưởng của sợi nấm được phân lập từ quả thể 32Bảng 3 2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến sự sinh trưởng của

hệ sợi nấm Lim xanh 34Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men đến

khả năng sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh 37

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến sự sinh

trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh 39Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường đến sự sinh

trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh 41Bảng 3.6: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng

sản xuất sinh khối nấm Lim xanh 44Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân

sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh 47Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn gỗ lim đến năng

suất và chất lượng của nấm Lim xanh 49Bảng 3.9: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn cám ngô đến năng

suất và chất lượng của nấm Lim xanh sau 90 ngày nuôi cấy 50Bảng 3.10: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn 10% cám ngô và

hàm lượng đạm đến năng suất và chất lượng của nấm Lim xanh sau

90 ngày nuôi cấy 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và nuôi

trồng tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên 15Hình 2.1 : Quy trình phân lập giống nấm Lim xanh 24Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh phân lập

từ quả thể nấm ở các loại môi trường khác nhau 33Hình 3.2: Nấm lim xanh phát triển trên một số môi trường cơ bản trong 13

ngày 33Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các điều

kiện pH khác nhau 35Hình 3.4 Sự sinh trưởng của nấm Lim xanh trên 3 môi trường có pH lần lượt

là 4; 6,5; 8 trong 12 ngày 36Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Lim xanh ở các môi

trường có bổ sung cao nấm men với tỉ lệ khác nhau 37Hình 3.6: Sinh trưởng của hệ sợi nấm trong môi trường A1: 2 g nấm men: A2:

4 g nâm men; A3 6 g nấm men (thí nghiệm quan sát sau6 ngàynuôi

cấy) 38Hình 3.7: Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến

sinh trưởng của hệ sợi nấm 39Hình 3.8 Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên môi trường: A1: 2g pepton/lít

mô trường, A2: 4g pepton/lít môi trường, A3: 6g pepton/lít môi

trường 40

Hình 3.9 Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trên các môi trường có bổ sung các

loại đường khác nhau 41Hình 3.10: Sơ đồ quy trình kiểm tra giống nấm Lim xanh đã phân lập 42

Hình 3.11: Kết quả kiểm tra hình thái quả thể nấm Lim xanh được thu thập từ

Thanh Hóa và nấm Lim xanh được nuôi trồng tại trường ĐH NôngLâm Thái Nguyên 43Hình 3.12: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng môi trường lỏng đến khả năng sản

xuất sinh khối nấm Lim xanh 45Hình 3.13 Sự sinh trưởng của sinh khối nấm Lim xanh trên các môi trường

CD và PD trong 6 ngày 46Hình 3.14: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng nhân

sinh khối của hệ sợi nấm Lim xanh 48

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một trong 16 quốc gia được đánh giá có sự đa dạng tàinguyên sinh học đứng đầu trên thế giới Theo kết quả điều tra, Việt Nam có12.000 loài thực vật, hàng ngàn loài động vật và nấm lớn Trong đó đã ghinhận được 5000 loài thực vật và nấm lớn, 52 loài tảo biển, 408 loài động vật

và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc

Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trườngsống khác nhau, đa phần sống ở trên cạn, nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ởmôi trường trong nước Dựa theo tỷ lệ giữa số loài nấm với số loài thực vật ởcùng một môi trường, người ta ước tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài.Hiện nay có khoảng 80.000 loài nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện

và định danh Giới nấm ngày càng có ý nghĩa to lớn trong nền kinh tế quốcdân, trong khoa học cũng như trong vòng tuần hoàn vật chất Nấm đã được sửdụng trong dân gian từ hàng ngàn năm nay và một số có ý nghĩa rất quantrọng trong đời sống con người

Thanh Hóa là tỉnh có diện tích rừng lớn, có khu bảo tồn Pù Hu, QuanHóa, Mường Lát, Thanh Hóa, Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, Khu bảotồn thiên nhiên rừng sến, đây là tỉnh được đánh giá là có tính đa dạng sinhhọc rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi lớn giá trị kinh tế và giá trị trongnghiên cứu khoa học từ các loài động thực vật Trong đó có nguồn lợi lớn vềnấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệpthực phẩm, dược phẩm

Từ xưa loài người đã biết sử dụng nấm lớn để làm thuốc đặc biệt là Linhchi Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ củaTrung Quốc cách đây 4.000 năm Từ những kinh nghiệm lưu truyền trongnhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi với nhiều cách khác nhau Đếnnay khoa học phát triển loài người đã chứng minh được các tác dụng hữu ích

trong điều trị ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gansiêu virus, suy nhược thần kinh.

Nấm Lim xanh (tên khoa học là Ganoderma Lucidum) là một dược liệu

quý với nhiều tác dụng tốt như chữa suy nhược thần kinh, các bệnh tim mạch,điều hòa huyết áp, giảm lượng đường và cholesterol trong máu, tác dụngchống oxy hóa, bảo vệ gan, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể [1]

Nấm Lim xanh thuộc họ nấm gỗ mọc trên thân hoặc gỗ mục đã đượckhẳng định là loại dược liệu có ích cho sức khỏe con người Nấm Lim xanh làmột loại dược liệu mà con người từ thời xa xưa đã biết dùng làm thuốc SáchThần nông bản thảo xếp nấm Lim xanh vào loại siêu thượng phẩm hơn cảnhân sâm và bản thảo cương mục coi nấm Lim xanh là loại thuốc quý, có tácdụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm,lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày)

Điều làm lên giá trị dược liệu (nấm Lim xanh) là cấu trúc đặc biệt cóchứa 119 khoáng tố vi lượng trong đó có một số khoáng tố như germanium,vanadium, crom, polysaccharides và triterpenoids Các thành phần khoángchất này đã được khẳng định là nhân tố quan trọng trong các phản ứng chốngung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch Trong các thành phầntrên polysaccharide và germanium là hai thành phần quan trọng của nấm lim.Trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về polysaccharide vàgermanium trong nấm Lim xanh [7]

Polysaccharide trong nấm là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa

dạng và phức tạp Hàm lượng, cấu trúc và thành phần hóa học củapolysaccharide phụ thuộc vào loại nấm, điều kiện sinh thái

Germanium hữu cơ trong nấm là các polymer thiên nhiên có tăng cường

khả năng vận chuyển oxy của máu, ức chế khối u phát triển và ngăn chặn cáckhối u không cho chúng lây lan sang các tế bào lành bệnh xung quanh [7]

Với phương pháp nhân invitro bằng hệ thống nuôi cấy lỏng đã được

khẳng định có hiệu quả cao trong việc nhân nhanh số lượng tế bào trong thờigian ngắn Không chỉ trên thế giới đã được ứng dụng kỹ thuật này vào sảnxuất nhân sinh khối để sản xuất các hoạt chất sinh học như: Hàn Quốc nhânsinh khối rễ sâm, ở Việt Nam đã sử dụng hệ thống nuôi cấy lỏng nhân sinhkhối một số loài thực vật có hoạt tính sinh học như nhân sinh khối cây Thông

đỏ, sinh khối cây Lô Hội, Viện Sâm nhân sinh khối rễ sâm Hiện tại việcnghiên cứu nhân sinh khối bằng hệ thống nuôi cấy lỏng đang được nghiên cứu

áp dụng đối với một số loài như tam thất hoang, hoàng tinh…[10]

Để phát triển các sản phẩm nấm của Việt Nam thành các sản phẩm chứcnăng có giá trị và được thực hiện ở quy mô lớn thì ngoài việc nuôi trồng theophương pháp truyền thống việc nhân nhanh sinh khối để tách các hoạt chất cógiá trị là cần thiết Việc thu hoạt chất có giá trị từ sinh khối là công nghệ mới

đã được ứng dụng ở các nước có trình độ sản xuất nấm tiên tiến như: Nhật,Hàn Quốc, Đài Loan,…tuy nhiên công nghệ này chưa được nghiên cứu ở ViệtNam Bằng các nghiên cứu chúng tôi thấy phương pháp này có nhiều tính ưuviệt như: Có khả năng kiểm soát được chất lượng, hàm lượng, thành phầnhoạt chất do kiểm soát chặt chẽ được các điều kiện dinh dưỡng và môi trường

nuôi cấy vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình

phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim xanh (Ganoderma lucium (Leyss Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh Hóa”.

1.1 Mục tiêu nghiên cứu:

1.1.1 Mục tiêu chung

Nghiên cứu được quy trình phân lập và sản xuất sinh khối sợi nấm Lim

xanh (Ganoderma lucium (Leyss Ex Fr.) Karst) có nguồn gốc tại Thanh Hóa.

1.1 Phân loại

Nấm Linh Chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay:

Tên khoa học: Ganoderma lucidum

Linh chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có

hàng trăm các loài khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là: Cổ Linh chi và Linhchi [12]

Linh chi rất phong phú về chủng loại, ước tính trên toàn thế giới có 200loài Linh chi Riêng Trung Quốc có 84 loài, trong đó có 12 loài được dùnglàm thuốc như Xích Linh chi, Tử Linh chi, Hắc Linh chi [14],[16]

Theo sách bản thảo cương mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh ycủa Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành 6 loại:

Thanh chi hay Long chi: màu xanh, vị chua, tính bình, không độc

Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi: màu đỏ vị đắng, tính bình, không độc.Hoàng chi hay Kim chi: màu vàng, vị ngọt, tính bình, không độc

Bạch chi hay Ngọc chi: màu trắng, vị cay, tính bình, không độc

Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh chi đầu tiên đượctiến hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏláng của nấm và đã phát hiện các chất như: esgosterol, các enzymephenoloxidase và peroxidase

Theo phân tích của G Bing Lin thì thành phần hoá học của Ganoderma lucidum gồm các chất: Nước (12 - 13%), cellulose (54 - 56%), lignin (13 -

14%), monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%),sterol (0,14 - 0,16%), các nguyên tố vô cơ như: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg,

Mn, Zn, Bi…[12]

Hiện nay người ta đã tìm được các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chinhư: Hoạt chất Beta–D-glucan, D-6, polysaccharide, ganoderic acid, oleic acid,lucidenol và triterpenoid [12]

1.3 Tác dụng của nấm Linh chi

Vai trò dược lý của nấm Linh chi rất lớn nhờ sự có mặt của các hoạt chấtsinh học Nấm Linh chi được sử dụng như một dược liệu quý, kết quả nghiêncứu dược lý học hiện đại cho thấy, nấm Lich chi có tác dụng trên hệ tuần hoàn[19],[21],[22] Tác dụng trên hệ miễn dịch và chống ung thư [25] Chế phẩmnấm Lim xanh làm gia tăng quá trình sản xuất Interleukin-1 & 2, có tác dụnghạn chế sự phát triển của nhiều loại mô có hại [22] Tác dụng phòng, chốngbệnh tiểu đường [21], cholesterol và đường trong máu [19] Làm giảm đườnghuyết và điều chỉnh rối loạn lipid máu Nấm Linh chi có chất Polysaccharideslàm khôi phục tế bào tiểu đảo tuyến tụy và từ đó thúc đẩy quá trình tiết insulin[12], Tác dụng ngăn chặn quá trình lão hóa, giúp cơ thể tráng kiện Trongthành phần nấm Linh chi có chứa Acid ganoderic (dẫn chất triterpenoid) có

tổng hợp DNA, RNA và protein [26] Nhóm steroid trong nấm Linh chi có tácdụng giải độc gan, bảo vệ gan ngưng tổng hợp cholesterol, ức chế nhiều loại

vi khuẩn gây bệnh nên có hiệu quả tốt đối với bệnh về gan, mật như: Viêmgan mãn tính, viêm gan cấp tính, xơ gan, gan nhiễm mỡ [12] Nấm Linh Chigiúp bài tiết các độc tố trong cơ thể, có tác dụng loại bỏ các sắc tố lạ trên da,làm cho da dẻ đẹp, hồng hào, chống lại các bệnh ngoài da như dị ứng, trứngcá [23]

Về giá trị sử dụng làm thuốc của nấm Linh chi

Trong các nghiên cứu lâm sàng cho rằng nấm Linh chi cần được nghiêncứu và xem xét trong việc (1) phòng ngừa và điều trị bệnh ung thư ở nhữngngười có nguy cơ ung thư cao (2) sử dụng chất bổ trợ trong công tác phòngchống di căn hoặc tái phát ung thư (3) thuốc giảm đau của bệnh ung thư và (4)

sử dụng bổ trợ với hóa trị liệu đồng thời giảm thiểu tác dụng phụ, (5) có khảnăng ngăn chặn quá trình hình thành khối u, (6) điều hòa huyết áp, (7) ngănngừa các bệnh về tim mạch, (8) các bệnh về mạch máu não, (9) điều chỉnhlượng đường trong máu, (10) sản sinh chất chống oxy hóa và chất chống lãohóa hiệu quả[21][22][20]

Về thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Cấu trúc đặc biệt của Nấm Linh chi gồm 119 khoáng tố vi lượng trong

đó có một số khoáng tố như polysaccharides, germanium, Vanadium, crom,

và Triterpenoids đã được nghiên cứu Các thành phần khoáng chất này đãđược khẳng định là nhân tố quan trọng trong các phản ứng chống ung thư, dịứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch [17]

Polysaccgaride là một hợp chất hữu cơ có chứa trong thực vật: quả, củ hoặcthân cây Trong thực vật, polysaccharide tồn tại dưới hai dạng: dạng khôngtan và dạng hòa tan Polysaacharide có trong thành phần một số thực vật điển

phân tử [2].

Polysacharide là những polime được tạo ra từ thiên nhiên hoặc nó có

thể là sản phẩm của phản ứng trùng ngưng các andozo hoặc xentozo

Polysacharide tồn tại ở các loại mạch như mạch hở, mạch không nhánhhoặc có nhánh, mạch vòng hay uốn khúc

Polysacharide thường được phân loại thành hai loại là omopolysacchride

Thành phần polysaccharide hoạt tính sinh học chủ yếu thuộc nhóm Glucan Các chất này trong nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc

β-từ tự nhiên, là loại chất có khả năng điều chỉnh đáp ứng sinh học Là tác nhânđiều hòa hệ thống bảo vệ miễn dịch tự nhiên quan trọng nhất, β - Gluccan từnấm không giống với các loại sản phẩm từ tự nhiên khác mà β- Gluccan từnấm được tinh khiết duy trì tác dụng sinh học cho phép chúng có hiệu quả ởmức độ phân tử và tế bào [20]

Năm 1980, tại Nhật Bản β- Gluccan trong nấm Linh chi đã chứng minhđược khả năng kích thích máu tương tự chủ yếu tố kích thích các bạch cầu hạtđơn nhân Các thí nghiệm đều cho thấy rằng, hiệu quả tác dụng vào tế bàoung thư rất tốt, có thể làm giảm 70-95% trọng lượng khối u so với chúng Tuy

khối u biến mất Qua đó, β- Gluccan có thể làm giảm sự phát triển của khối u,ngăn chặn khối u di căn Trái ngược với vi sinh vật, tế bào khối u cũng nhưcác tế bào vật chủ khác, β- Gluccan là một thành phần không thể thiếu là mộtthành phần bề mặt để kích hoạt thụ thể bổ sung bắt đầu gây độc tế bào và giếtchết tế bào khối u Điều này chỉ xảy ra khi có mặt β- Gluccan [20],[28].

Các hoạt tính của Polysaccharide có tác dụng kháng virus và điều hòamiễn dịch là do có ligmin, các chất kháng sinh; Lentinan là mộtpolysaccharide có tác dụng phục hồi tế bào Lympho T, tăng sản xuấtinterferol [8]

Hoạt tính tăng khả năng miễn dịch

Hoạt chất Polysaccharide còn được nghiên cứu trong nấm hương, kếtquả nghiên cứu cho thấy có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào thúc đẩy quátrình sinh trưởng và phát triển tế bào Lympho T, Lympho B từ đó góp phầntăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân bị bệnh gan, giúp bệnh gan nhiễm mỡmáu chóng hồi phục các tế bào bị tổn thương nhanh chóng hơn [20]

Polysaccharide JSL-18 có trong nấm hương là tăng hoạt tính đại thựcbào, tăng tiết IL-6 (Interleakin-6) Bên cạnh đó, trong nấm hương cònchứa các chất như Lentinacin, dezoxy lentinacin, 5’ –GMP, 5’ –AMP cótác dụng chống đông máu Ngoài ra, còn có chất eritadenine có hiệu quảlàm giảm hàm lượng cholesterol trong máu [5]

Với nhiều tác dụng như vậy việc tách chiết Polysaccharide được quantâm và nghiên cứu ở nhiều loài nấm trong đó có nấm Linh chi Các nghiêncứu cho thấy Polysaccharides trong nấm tồn tại như một thành phần cấu trúccủa vách tế bào nấm và việc lựa chọn phương pháp trích ly phụ thuộc về cấutrúc tế bào Một số phương pháp trích ly thu polysaccharides thông thường

như: Chiết bằng dung môi, bằng sử dụng nước nóng, giải pháp kiềm vàphlyethylene glycol; và các phương pháp sử dụng sóng siêu âm Ngoài raPolysaccharide còn chiết bằng nước, kết tủa bằng etanol với quy trình nhưsau: Quả thể nấm T microcaspus tươi (1kg) rửa sạch bằng nước Sau đó đunsôi nấm quả thế trong 250ml nước cất trong 12 giờ Hỗn hợp dịch chiết được

để qua đêm tại 4 độ C và được lọc qua vải lọc Sau đó, ly tâm ở 8000 rpmtrong 45 phút tại 6 độ C để thu nhận dịch chiết sạch tạp chất Thu nhận lấyphần dịch nổi (200ml) và kết tủa trong ethanol theo tỉ lệ (1:5, v/v) ở nhiệt độphòng Để kết tủa qua đêm tại 4 độ C, sau đó ly tâm ở 6 độ C trong 1 giờ.Phần kết tủa thu được rửa sạch với nước cất và thẩm tách qua ống thẩm táchtrong 6 giờ để loại bỏ các vật liệu có trọng lượng phân tử thấp Phần còn lạiđem sấy khô [2]

Germanium đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các chất

khoáng (489 µ g/g) có trong nấm Linh chi Chất này tồn tại rất ít ở cácloại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhânsâm, lô hội và tỏi [18] Mặc dù germanium không phải là thành phần thiếtyếu, nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khảnăng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến [19].Germanium có tác dụng chống lại các vi khuẩn nhất định Tồn tại dưới dạnghữu cơ, nó đang được đánh giá cao, và đưa vào nghiên cứu điều trị ung thư.Germanium có khả năng cải thiện và tăng cường hệ miễn dịch, tăng cườngquá trình cung cấp oxy cho cơ thể, tiêu diệt các gốc tự do gây hại Nó cũng

có tác dụng bảo vệ cơ thể, chống lại các tia bức xạ từ môi trường.Germanium không trực tiếp tấn công vào các tế bào khối u, mà kích thích hệthông miễn dịch của cơ thể, tự sản sinh ra các chất, và có khả năng ức chế sựhình thành và phát triển của khối u và các bệnh thoái hóa khác Hàm lượngGermanium hữu cơ có trong

nấm Linh chi được đánh giá là cao hơn những loại thảo dược khác Vượt trên

cả Germanium có chứa trong nhân sâm từ 5 – 8 lần [18]

Germanium hữu cơ có tăng cường khả năng vận chuyển oxy của máu,

ức chế khối u phát triển và ngăn chặn các khối u không cho chúng lây lan sangcác tế bào lành bệnh xung quanh [9]

Polysaccharide trong nấm Linh chi tăng cường hệ thống miễn dịch, kìm

hãm và ức chế sự phát triển và di căn của khối u, điều hòa huyết áp, ngănngừa các bệnh về tim mạch và các bệnh về mạch máu não, kích hoạt sản sinhinsulin, điều chỉnh lượng đường trong máu, cũng như sản sinh chất chống oxyhóa và chất chống lão hóa hiệu quả Chiết xuất Polysaccharide được sử dụnglàm thành phần trong một số loại thuốc chống ung thư, chống tiểu đường haythuốc trợ tim, tốt cho tim mạch, vv…[18]

Triterpene có tác dụng làm giảm các tác hại do rượu, bia hay thuốc lá

gây ra cho gan, phổi nên do đó bảo vệ gan, phổi; giết chết tế bào ung thư; làmgiảm đau; giảm viêm; làm giảm cholesterol; ngăn ngừa đông cứng mạch máu;tăng cường chức năng gan và tiêu hóa Ngành sản xuất dược phẩm Nhật Bản,Hàn Quốc, Việt Nam và một số nước tại khu vực Châu Âu đã sử dụng thànhphần Triterpene này vào sản xuất các loại thuốc giảm đau, thuốc ngùa timmạch, thuốc bổ gan, [19]

Yếu tố vi lượng selenium Ngăn ngừa ung thư và làm giảm đau cho bệnh

nhân ung thư Ngoài ra selenium còn có tác dụng chống lão hóa, làm quá trìnhlão hóa xảy ra chậm, giúp cho làn da sáng mịn, giảm tàn nhang và các đốmthâm rám trên da cũng như hạn chế sự xuất hiện của nếp nhăn Hiện một sốcông ty mỹ phẩm cũng đang nghiên cứu và đưa vào sản xuất thành công cácloại mỹ phẩm, các loại sản phẩm chăm sóc sắc đẹp như kem dưỡng da, sữarửa mặt, kem làm trắng da, sữa dưỡng thể, … có thành phần là selenium chiết

xuất từ nấm Linh chi [9].

1.4 Tổng quan về sản xuất sinh khối ở nấm linh chi

Hiện nay các công trình nghiên cứu tách chiết các hợp chất mới đượcthực hiện ở nấm Linh chi Năm 1976 Polysaccharide đã được tách chiết ởNhật và được bằng sáng chế dùng để điều trị ung thư Năm 1982 công tyTeikoko Chemical Industry tách chiết gốc glucoprotein có trong nấm Linh chilàm chất ức chế neoplasm và được nhận bằng sáng chế của mỹ do có khảnăng chống ung thư [19]

Linh chi sinh khối được chứng minh có chứa các thành phần hoạt chấtquý cao gấp nhiều lần so với Linh chi sản xuất bằng phương thức truyềnthống Thành phần chống khối u của nấm Linh chi của công trình đạt 18%, cótrường hợp đạt 20-36%, trong khi nấm Linh chi từ các nơi khác, tức sản phẩmnấm dưới dạng quả thể to như cái đĩa, chỉ đạt 5-6% Đó là các enzym, khángsinh, protein, 17 loại acid min, polysacharid (1-3 beta-D-glucan) [10].Không những thế, Linh chi sinh khối còn hơn hẳn công nghệ sản xuất nấmquả thể như thời gian thu hoạch ngắn Đặc biệt, giá bán của linh chi sinh khốicao gấp đôi quả thể, 600.000 đồng/kg so với 300.000 đồng/kg Khi sử dụng,không cần loại bỏ bã như nấm quả thể Trong số tám sản phẩm của công trình,đáng chú ý có sản phẩm mang tên Sinh linh và Bào tử nấm Linh chi Bào tửnấm Linh chi lâu nay bị nhiều người cho là không tốt nên thậm chí cho rửatrôi bào tử Các nhà khoa học trong nhóm đề tài làm ngược lại Họ cho thu hồi

và sử dụng chúng như một trong những sản phẩm chính Điều thú vị là chínhnhững bào tử này chứa hoạt chất germanium có tác dụng làm giảm đau chobệnh nhân ung thư Đặc biệt, khả năng bảo vệ tế bào khi đột biến gene (khi tếbào lành chuyển sang tế bào ác tính, tế bào ung thư) của Linh chi sinh khốicao hơn linh chi ở dạng quả thể Trong khuôn khổ hợp tác với Hàn Quốc theonghị định thư cấp chính phủ thuộc Trường đại học Khoa học Tự nhiên, sản

phẩm sinh khối vừa được cấp cho 30 bệnh nhân ung thư gan tại BV Ung thưTrung ương dùng thử trong ba tháng để đánh giá tác dụng hỗ trợ chữa ung thưcủa sản phẩm độc đáo này Ưu điểm nổi bật về công nghệ của Linh chi sinhkhối mà nhóm đề tài thực hiện chính là ở chỗ công nghệ đơn giản trong khisản phẩm có hoạt chất sinh học cao như nêu qua ở trên Không cần máy mócđắt tiền, các nhà khoa học có thể giúp bà con sản xuất sinh khối quanh năm vàkhông phải theo thời vụ Các nước phát triển cũng đã và đang sản xuất Linhchi sinh khối và đúng là họ đi trước ta từ lâu Song công nghệ của họ phứctạp, đắt và vì thế, không phù hợp với hoàn cảnh hiện tại ở Việt Nam.

Trung Quốc được coi là cái nôi phát hiện nấm Linh Chi Ngay từ đầu thế

kỷ 17 (1621), nấm Linh chi đã được biết đến, nuôi trồng và sử dụng nhưnguồn dược liệu quý Nấm Linh chi hay gặp ở nơi có khí hậu lạnh như TứXuyên, Phúc Kiến, Quảng Đông Quốc gia này được coi là trung tâm lớnnhất thế giới về nuôi trồng và sản xuất nấm Linh chi Hàng năm, trên thế giớisản xuất 4300 tấn nấm Linh chi, riêng Trung Quốc chiếm 3000 tấn, còn lại làHàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Mỹ, Malaysia, Việt Nam,Indonesia và Srilanka Đến nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về giá trịdược liệu của nấm Linh chi Trước những lợi ích to lớn từ Linh chi, nhiều cơ

sở nuôi trồng nấm Linh chi đã được xây dựng đặc biệt là Linh chi đã đượcnuôi trồng trên quy mô công nghiệp ở Mỹ Ngoài ra tại Mỹ, Viện nghiên cứunấm Linh chi quốc tế đã được thành lập ở New York [21]

Nấm Linh chi, từ nhiều ngàn năm nay đã được trọng dụng ở Á Đông,hiện nay Linh chi là một trong những đề tài nghiên cứu và ứng dụng đangđược quan tâm của ngành y dược Âu Mỹ [8] Nấm Linh chi được xếp vàonhóm thuốc bổ có khả năng giúp tăng lực, đây là một thực tế không thể chốicãi, sau khi sử dụng nấm Linh chi Điều này không chỉ căn cứ vào cảm giác

chủ quan của người dùng, mà dựa trên các tiêu chuẩn khoa học khách quan vàtheo kết quả của hàng trăm công trình nghiên cứu từ châu Á sang châu Âu [9].Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạtchất sinh học trong nấm Linh chi Theo công trình nghiên cứu gần đây, thànhphần chủ yếu của các loại Linh chi có: Acid amin, protid, steroid,polysaccharide, germanium (cao hơn lượng germanium trong Nhân sâm 5 - 8lần), acid ganodenic [16].

1.4 Đặc điểm hình thái, phân loại nấm Lim xanh

1.4.1 Nguồn gốc và phân loại nấm Lim xanh

Trong đó nấm Lim xanh thuộc nhóm Hồng chi có tên khoa học là

Ganoderma lucium (Leyss Ex Fr.) Karst, Hồng chi có loài mọc trên giá thể

gỗ Keo, Bồ Đề, Phượng Vĩ,… có cả những loài mọc trên thân gỗ lim đãmục, người ta gọi là nấm Lim xanh

1.4.2 Đặc điểm thực vật và phân bố naams Lim xanh

- Nấm Lim xanh là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thường ký sinhtrên các cây gỗ lâu năm, một số loài cây chết mục, thường gặp chúng trên câyLim Nấm thường có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong tự nhiên, nấmthường chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [12]

- Lim xanh có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm Cuống nấm biến

dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cmhoặc rất dài 20-25cm Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do quátrình lên tán mà thành

- Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hoặc ít nhiều dịdạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàngnâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng như lángvecni Kích thước tán biến động từ 2 - 30cm, dày 0,8 - 2,5cm

- Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt Nấm mềm, daikhi tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, đầu tận cùng của sợi phình hìnhchuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ vàbao quanh

cuống [14]

từ Thanh Hóa Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Hình 1.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và

nuôi trồng tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

1.5 Tổng quan về phân lập

Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thu Hằng và Lê Xuân Thámtrong phân lập nấm Vân chi, có nhiều cách để phân lập tạo giống gốc nhưnghiệu quả nhất là phân lập từ quả thể Vì đây là phương pháp nhân giống vôtính, trong khi tách hệ sợi nấm thì không rõ có đúng là nấm cần phân lập haynấm mốc, nấm dại khác Còn dùng bào tử nấm cũng không đơn giản vì đây làgiai đoạn sinh sản hữu tính, nên nấm hình thành có thể thay đổi đặc tính.Ngoài ra phương pháp phân lập từ quả thể hạn chế được hiện tượng bị lẫn haynhiễm tạp các loại vi sinh vật khác do sử dụng trực tiếp các mô thịt nấm.Nguyên tắc của phương pháp này là chọn tai nấm điển hình ở giai đoạn

Môi trường phân lập là môi trường dinh dưỡng bao gồm ba thành phần

cơ bản: Đường: 2 – 3 %, thạch: 2% và chất bổ sung: Nước chiết (lấy từ cácnguồn tự nhiên như khoai tây, nước giá, cà rốt…) và hóa chất (chủ yếu làcác chất khoáng N, P, K…) [11]

Khi có được giống thuần, cấy sợi nấm từ môi trường phân lập vào ốngnghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để giữ giống Môi trường giữ giống

có thể giống với môi trường phân lập Khi giữ giống, bảo quản ống nghiệmtrong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 đến 10 độ C và mỗi tháng cấy lại một lần [3],[15]

1.6 Nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi trong môi trường lỏng

1.6.1 Nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng

Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật

Khái niệm: Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng cósục khí để bổ sung thêm oxy hoặc nuôi tĩnh Giống vi sinh vật sau khi cấy vàomôi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồichuyển sang phát triển qua pha lũy thừa (pha log) Trong pha lũy thừa, vi sinhvật phát triển nhanh chóng và đạt cực đại, lượng vi sinh vật ngày càng tănglên nhưng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy nếu không được bổ sungthêm vào đó ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh,nhu cầu oxy tăng, nhiệt độ tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường có thể trào

ra khỏi bình men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạkhông mong muốn

Vi sinh vật trong quá trình lên men phát triển theo 4 pha: pha tiềm phát(pha lag) pha lũy thừa (pha log), pha ổn định, pha suy vong

Pha tiềm phát: Khi cấy các tế bào sinh vật từ môi trường này sang môitrường khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi Trong giai đoạn

Pha log: Cuối pha tiềm phát các tế bào đã thích nghi với điều kiện sốngmới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ, quần thể vi sinh vật chuyển sang lũy thừa,pha phát triển số lượng vi sinh vật mạnh nhất.

Pha ổn định: Sau khi đồng hóa các chất dinh dưỡng hay sau khi tích lũycác sản phẩm trao đổi chất, sinh trưởng của vi sinh vật giảm xuống hay hoàntoàn ngừng lại Trong pha ổn định này sinh khối có thể còn tăng chậm hoặckhông đổi

Pha suy tàn: Đặc trưng của pha này là các chất dinh dưỡng đã bị cạn kiệt.Lượng chất dinh dưỡng trong môi trường bị suy giảm, có thể thiếu một số chấtdinh dưỡng, trong khi chất thải từ vi sinh vật thải ra ngày càng tăng mà khôngđược bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy, do đó các tế bào

vi sinh vật chết dần

Lên men bổ sung ứng dụng cho các trường hợp sau: Nồng độ cơ chất kháthấp nhưng lại cần ổn định, nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi, cần bổsung chất dinh dưỡng liên tục

Môi trường nuôi cấy hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng

Môi trường dinh dưỡng cần cho nấm Linh chi và hệ sợi nấm Linh chiphát triển cần một số nguồn dinh dưỡng thiết yếu như sau:

Về nguồn Cacbon: Nấm Linh chi có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồncacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đường đa [4]

Về nguồn nitơ, nấm Linh chi có thể sử dụng ni tơ hữu cơ như protein,peptide, acid amin hay ure hoặc đạm vô cơ như các muối amon [4]

Tỷ lệ C : N trong môi trường ở giai đoan nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1.Nhưng tỷ lệ C : N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1 Theo

Về nhu cầu yếu tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm Linh chi còn cần một

số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấynên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn [16]

Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồncacbon, nito, chất khoáng…đáp ứng cho sự phát triển của hệ sợi nấm [16]

1.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát t riển của hệ sợi nấm Linh chi

Nấm Linh chi thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trongquá trình nuôi hệ sợi nấm Linh chi nên bổ sung oxy bằng thiết bị lắc,khuấy hay sục khí Bào tử nấm sau khi được cấy vào môi trường lên menthì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) khoảng 24 giờ, rồichuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log) Cuối pha lag các bào

tử nấm đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh

mẽ Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhucầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạothành bọt và lớp bọt tăng Nên phải cấp khí oxy bằng cách lắc ở quy môphòng thí nghiệm và dùng thiết bị sục khí như khuấy, sục khí ở quy môsản xuất để tăng hiệu suất lên men cao tạo sinh khối sợi nấm Linh chi.Bào tử nấm Linh chi nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 22oC-26oC Trong điềukiện khô hạn ở 70oC bào tử đảm của nấm sẽ bị chết sau 5 giờ Nếu ở 80oC thì

sẽ chết chỉ sau 10 phút Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợinấm Linh chi [1]

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về trích ly và ứng dụng các hoạtchất sinh học trong nấm Linh Chi Theo công trình nghiên cứu, thành phần chủyếu của các loại Linh Chi có: Acid amin, protid, steroid, polysaccharide,germanium, acid ganodenic [27].

Gần đây, các nghiên cứu tiếp tục thử nghiệm các kỹ thuật nuôi cấy chìm

để nuôi cấy sợi nấm và thu hàm lượng polysaccharide Linh chi Kết quả chothấy, sinh khối nấm Linh chi cho kết quả tốt nhất ở nuôi cấy chìm, đã thu được12,4 g/L sinh khối nấm khô sau 48 ngày [28]

Theo tác giả Hyun Mi Kim (2006) đã nghiên cứu điều kiện tối ưu hóa

môi trường nuôi cấy chìm Ganoderma resinaceum để tăng cường sản xuất

sinh khối và exopolysaccharide (EPS) Sự tăng trưởng sợi nấm tối đa và sảnxuất EPS trong môi trường có chứa 10g/l glucose, pepton 8g/l đậu nành vàMnCl2 tại pH ban đầu 6,0 và nhiệt độ 31oC Năm loại EPS khác nhau với trọnglượng phân tử khác nhau, từ 53.000 đến 5.257.000 g/mol thu được ở mộttrong hai giai đoạn tủa với ethanol Nồng độ tối đa của sợi nấm sinh khối(42,2 g/l) và EPS (4,6 g/l) thu được vào ngày thứ 6 với hàm lượng đường bổsung vào môi trường là 50g/l [24]

1.7.2 Tình hình nghiên cứu nấm Linh chi trong nước

Từ thập niên 80, nấm Linh chi mới thực sự nuôi trồng nhiều ở Việt Nam.Ngoài ra, còn thấy 15 loài nấm Linh chi mọc hoang dại ở rừng Bắc Kạn, TháiNguyên, Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Đồng Nai, BìnhPhước, Gia Lai, Đăk Lắc Tại hội nghị kết quả công tác chuyển giao côngnghệ nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu, theo tài liệu đã được công bố tớinay có 32/61 tỉnh thành có cơ sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001).Hiện nay có rất nhiều Viện, Trung tâm nghiên cứu về nấm Linh Chi ở cả Bắc

và Nam nhằm lựa chọn những chủng có năng suất cao, phẩm chất tốt, phùhợp với khí hậu và đặc biệt có thể phổ biến đại trà cho các cơ sơ nuôi trồng ởmột số nơi để tận dụng nguồn nguyên liệu cellulose có sẵn, tăng thu nhập chongười lao động Nhưng sản lượng nấm và sản phẩm nấm đã qua chế biếnkhông đáp ứng đủ nhu cầu do Việt Nam mới chỉ tập trung vào điều tra, sưutập, nêu đặc điểm phân loại, điều kiện sinh thái, các hoạt chất chính có trongnấm và chưa quan tâm nhiều đến kỹ thuật nuôi trồng, trích ly các hoạt chấtsinh học có giá trị trong nấm Linh chi và ứng dụng sản xuất thực phẩm chứcnăng [11], [13].

Hiện nay, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, các Trung tâm, việnnghiên cứu, doanh nghiệp sản xuất nấm đã đi sâu vào nuôi trồng, sản xuấtthực phẩm chức năng từ nấm Linh chi như: Bộ Nông nghiệp và phát triểnNông thôn đã đưa chương trình nấm quốc gia với mạng lưới lan rộng trong cảnước và kinh phí đầu tư xấp xỉ 70 tỷ đồng từ ngân sách nhà nước để hoànthiện bộ giống nấm quốc gia và các quy trình sản xuất, chế biến nấm [11].Viện Di truyền là một trung tâm nghiên cứu nấm mạnh nhất cả nước,hiện tại viện đã phân lập và tạo ra nhiều giống nấm có giá trị cũng như làmchủ nhiều quy trình nuôi trồng Các giống nấm của viện đã được thương mạihóa trên toàn quốc

Hiện nay trong nước cũng rất quan tâm và có khá nhiều nghiên cứu vềtrích ly và ứng dụng các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Nhóm nghiên cứu Viện Công nghệ thực phẩm của T.S Trương Thị Hòa

trong nghiên cứu “Trích ly hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi” đã đã xác

định được phương pháp trích ly các hoạt chất sinh học sử dụng cho công nghệsản xuất rượu bổ Phương pháp trích ly bằng ethanol với tỷ lệ dung môi /nguyên liệu là 1/10 đạt hiệu suất cao (8,8%) khi chiết lần 1 bằng ethanol 960,lần 2 bằng ethanol 700, lần 3 bằng ethanol 450 Ngoài ra còn sử dụng enzyme

Novozyme 342 (hỗn hợp của enzyme cellulase và hemicellulase) đạt hiệu suấtcao nhất (10,2%) ở điều kiên nhiệt độ 600C, nồng độ enzyme 0,21% trong 120phút Ưu điểm của phương pháp trích lý bằng enzyme là cho hiệu suất trích lycao, thời gian trích ly ngắn, nhiệt độ trích ly thấp, không ảnh hưởng tới một sốhoạt chất sinh học mẫn cảm với nhiệt độ cao [9].

Theo kết quả của Nguyễn Thị Minh Tú trong nghiên cứu “Quy trình tách chiết các hoạt chất sinh học từ nấm Linh Chi ” với dung môi là nước quá

trình chiết đạt tối ưu ở nhiệt độ 800C, thời gian chiết 7h, tỷ lệ nguyênliệu/dung môi là 1/20 thì hàm lượng chất chiết thu hồi đạt 6,91% [12]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Linh chi (Lim xanh) thu thập từ tỉnh Thanh hóa

Vật liệu nghiên cứu là: Cuống nấm, mô thịt nấm Lim xanh thu nhập

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại

học Nông Lâm Thái Nguyên

- Nội dung 2: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trong môi

trường lỏng

- Nội dung 3: Nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Lim xanh trên giá

thể rắn

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập giống nấm Lim xanh Thanh Hóa tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Thu nhận quả thể tươi, cho vào hộp đựng mẫu đã được chuẩn bị sẵn để

di chuyển về phòng thí nghiệm, xử lý quả thể với cồn 70o Bảo quản quả thểnấm ở nhiệt độ 5oC

* Phương pháp phân lập giống gốc

+ Dùng cồn 70 độ xử lý quả thể, nhằm mục đích loại bỏ một số vi sinhvật và nấm mốc Cắt quả thể thành những mảnh có kích thước từ 0.5 – 1cm đểcấy vào môi trường nghiên cứu [25]

+ Nuôi trong điều kiện không có ánh sáng, nhiệt độ 22 – 28oC, độ ẩm60-70% theo dõi sau 3 ngày sau cấy mẫu [25]

Mô thịt, cuống nấm Đổ môi trường ra đĩa petri vô

Kiểm tra chất lượng giống sau 2 ngày cấy,định kỳ kiểm tra 2 – 3 ngày 1 lần, thời gian 12 -15 ngày

Giống gốc đạt tiêu chuẩn

Hình 2.1 : Quy trình phân lập giống nấm Lim xanh.

*Thí nghiệm 1 : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát sinh hệ sợi nấm từ mô thịt nấm.

Môi trường khoai tây (PDA)

- Bước 1: Cân lấy 200g khoai tây đã được rửa sạch, gọt vỏ rồi cắt nhỏthành hình khối khoảng 1cm.

- Bước 2: Cho khoai vào nồi rồi thêm khoảng 800ml nước cất, đun sôikhoảng 10 - 15 phút

- Bước 3: lọc bỏ cặn

- Bước 4: Bổ sung đường, Agar, Pepton, rồi chuẩn lên 1 lít

- Bước 5: Chuẩn pH = 6.5

- Bước 6: Cho vào bình tam giác rồi hấp khử trùng (121oC trong 30 phút)

Môi trường ngô (CDA):

Môi trường PDA + nước dừa

Thành phần nguyên liệu: Nước dừa trưởng thành, khoai tây

1 Nước dừa già: 100 ml

* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng phát triển hệ sợi từ nấm từ mô thịt trên môi trường PDA.

pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng vàphát triển của các loài nấm Mỗi loài nấm có thể sinh trưởng trong khoảng pHthích hợp khác nhau Vì vậy, việc nghiên cứu pH thích hợp cho nấm Limxanh là cần thiết Thí nghiệm sau sẽ được tiến hành với các thang pH khácnhau như sau:

Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đến khả năng phát triển hệ sợi nấm S

Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Pepton đến khả năng phát triển hệ sợi nấm từ mô thịt

H à m

L ạ

Phương pháp này như sau :

Hệ sợi nấm sau khi phân lập được (giống cấp 1 được đưa vào nuôi cấy trongmôi trường hạt có chứa 200gam thóc bổ sung 0,5 gam cao nấm men, 0,5 gampepton, 100mg vitamine B 1, sau đó cấy giống cấp 1, để 10 – 20 ngày khi hệ