Phân lập gen mã hóa enzyme GDP d mannose 3’ 5’ epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin c từ cây quýt miền núi phía bắc việt nam

Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tự trên GenBank .... Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen G

ĐẠ HỌC THÁ NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ KIM CHI

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA

ENZYME

GDP-D-MANNOSE-3’.5’-EPIMERASE

LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C

TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

\

THÁI NGUYÊN - 2018

I I

ĐẠ HỌC THÁ NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ KIM CHI

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA

ENZYME

GDP-D-MANNOSE-3’.5’-EPIMERASE

LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C

TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN - 2018

I I

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sựhướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi

rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực vàchưa từng ai công bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Kim Chi

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm đãtận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành côngtrình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền &Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôitrong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệmTrọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệmcủa đề tài

Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốtthời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn

Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học của

Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm

- Đại học Thái Nguyên

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Kim Chi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC .iii

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây quýt

3 1.1.1 Phân loại thực vật học cây quýt 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây quýt 3

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của quả quýt 4

1.2 Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham gia tổng hợp ascorbic acid ở thực vật

6 1.2.1 Ascorbic acid 6

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vitamin C 7

1.3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền 11

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .

17 2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

17 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 17

2.2.2 Phương pháp xác định trình tự gen 17

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

2.4 Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn 22

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Nhân bản và giải trình tự gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS 23

3.1.1 Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR 23

3.1.2 Kết quả tách dòng gen GDP-D 24

3.1.3 Đặc điểm của trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS 25

3.2 Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D 30

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

1 Kết luận 34

2 Đề nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh

bp base pair

CIAA 24 Chloroform: 1 isoamylalcol

CTAB Cetyl trimetyl amomnium

bromide DEPC Diethyl Pyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleotide acid DNTPs

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D 19 Bảng 2.2 Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen GDP-D 19 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn gen GDP-D vào vector tách dòng pBT

20

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony - PCR 21 Bảng 3.1 Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự nucleotide

của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946 27

Bảng 3.2 Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tự protein suy

diễn của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946 29

Bảng 3.3 Trình tự gen mang mã số trên GenBank được sử dụng phân tích

30

Bảng 3.4 Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của trình tự nucleotide của gen

GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tự trên

GenBank 31

Bảng 3.5 Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của BS-LS và các trình tự

trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen

GDP-D 32

máy xác định trình tự nucleotide tự động 25

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từ

giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D trên GenBank mang

mã số HQ224946 27

Hình 3.5 Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide của

gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tự

gen đã công bố trên GenBank 28

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D

phân lập từ giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số

HQ224946 trên GenBank 29

Hình 3.7 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự đã

công bố trên GenBank dựa trên trình tự nucleotide của gen

GDP-D 31

Hình 3.8 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự

đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn

của gen GDP-D 32

1 Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là giống cây ăn quả được nhiều

người biết đến với vị ngọt thanh, mùi thơm đặc trưng, chứa nhiều vitamin,khoáng chất và dinh dưỡng cần thiết cho con người Quýt được khuyến khích

sử dụng hằng ngày bởi các chuyên gia dinh dưỡng

Quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai tròtích cực trong phát triển kinh tế ở nhiều địa phương.Trồng quýt đem lại thunhập cao cho các hộ làm vườn so với các cây nông nghiệp khác, trung bình từ

80 - 100 triệu đồng/ha/năm

Cây quýt được trồng lâu đời ở miền núi phía Bắc Việt Nam có sự thíchnghi sinh thái ở diện hẹp, do đó đòi hỏi khá kỹ tính về điều kiện canh tác, nônghóa thổ nhưỡng hay tiểu vùng khí hậu Điều này dễ nhận thấy mỗi loại quýt chỉtrồng phù hợp trên một địa bàn đặc hữu với các giống thường gặp như quýt sen(Phú Thọ), quýt hồng (Hà Giang), quýt đường (Lào Cai), quýt QuangThuận (Bắc Kạn), quýt Bắc Hà (Lào Cai), quýt giấy (Tuyên Quang), quýt BắcSơn (Lạng Sơn) [4]

Quả quýt chứa hàm lượng vitamin C cao, khoảng 30mg- 36mg vitamin Ctrong 100gram quả Vitamin C tốt cho tóc, da, tiêu hóa, hệ thống miễn dịch vàcân bằng trọng lượng cơ thể Mỗi giống quýt lại có hàm lượng vitamin C khácnhau, điều này ảnh hưởng đến mùi vị, độ chua ngọt của mỗi giống quýt

Nghiên cứu đặc điểm trình tự các gen tham gia tổng hợp vitamin C, vàtìm hiểu sự đa dạng của trình tự các gen này ở các giống quýt địa phương là

cơ sở đề xuất sử dụng đa dạng hóa trong việc chọn giống cho vùng trồng chuyêncanh

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân lập gen

mã hóa enzyme GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt Nam.”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá được đặc điểm trình tự gen liên quan đến tổng hợp vitamin C ởmẫu quýt khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen liên quan đến tổnghợp vitamin C ở mẫu quýt miền núi phía Bắc

3.2 So sánh trình tự gen, trình tự amino acid suy diễn của enzyme liênquan đến tổng hợp vitamin C ở mẫu quýt nghiên cứu với một số trình tự đãcông bố trên GenBank

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây

quýt

1.1.1 Phân loại thực vật học cây

quýt

Cây quýt có tên khoa học là Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus

suhuiensis Hort ex Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [6], [11] Quýt thuộc

chi Cam chanh (Citrus), họ Cam quýt (Rutaceae), bộ Cam quýt (Rutales).

Tập đoàn quýt trồng khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam được xác định

với nhiều giống quýt (Variele) trong loài Citrus recutilata Blanco với bộ nhiễm sắc thể 2n = 18, quýt mang những đặc tính đặc trưng của chi quả có múi Citrus

ở đặc điểm có các túi chứa tuyến dầu và hoa lưỡng tính, thụ phấn nhờ sâu bọ[11]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây

Lá quýt là đơn mọc cách, không có eo lá, trên lá chứa nhiều túi tiết dầuthơm, dưới dạng điểm, có thể quan sát được bằng mắt thường khi soi qua ánh

sáng cường độ đủ lớn Lá thay nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúcnào cũng xanh lá.

Hoa quýt được hình thành ở nách lá, có cấu tạo là hoa cụm, lưỡng tính,cánh hoa rời nhau, hoa mẫu bốn, trong hoa thường có đĩa mật, một đặcđiểm

thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ Đài hoa gồm các mảnh dính nhau ở phíadưới làm thành đài hợp hình đấu Nhị hoa có số lượng gấp ba đến bốn lần cánhhoa (do sự phân nhánh), chỉ nhị dính thành nhiều bó Bộ nhụy đôi, một đầu vòi

và một đầu nhụy với nhiều lá noãn dính lại thành bầu trên, nhiều ô, mỗi ôtương ứng với số lá noãn đính trụ giữa Kích thước hoa khi nở trung bình từ 0,2

- 0,25 cm Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hằngnăm, phần lớn sinh cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 ra hoa, đợt 3 vàotháng 7 và tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt Trongcác lứa ra hoa thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất

Quả quýt là quả mọng với ba lớp vỏ, lớp vỏ ngoài chứa các túi dầu, lớp

vỏ giữa trắng xốp (cùi), vỏ quả giữa mỏng dai, phía trong có nhiều lông đơnbào chứa nhiều nước mà người ta thường gọi là “tép”

Sự sinh trưởng của quả quýt trải qua các giai đoạn: Giai đoạn ra hoa hìnhthành quả (từ tháng 12 đến giữa tháng 3 năm sau), rụng quả sinh lý đợt một(cuối tháng 4), rụng quả sinh lý đợt hai (đầu tháng 6), quả chắc xanh (cuốitháng 8) và cho thu hoạch (đầu tháng 10 đến tháng 1 năm sau)

Quả quýt có hình dẹt (trừ quýt chum), vỏ màu vàng và mỏng, trọng lượngcủa quả đạt khoảng 35 gam đến 145 gam Vị quả ngọt sắc, chua nhẹ đặc biệt cóhương thơm đậm, đặc trưng rất dễ phân biệt với bất kỳ quả trong nhóm cây ănquả có múi khác Quả trung bình có từ 8 đến 16 múi, số hạt trung bình của quảgiao động từ 10 đến 40 hạt Hạt quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có

2 lớp màng vỏ, màng ngoài cứng do thấm nhiều li gnin, màng trong mỏng.Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10 -30oC, nhiệt độ tối ưu

87,6 gram nước; 1,104 mg carotene - một loại vitamin chống oxy hóa, 30mgvitamin C, 93mg kali, 26 mg canxi, 9mg magnesium, 0,3g chất xơ, 4,5 mgnatri, 7mg Chromium, 20mg phốt pho, 0,32 mg sắt và giá trị năng lượng là 48kcal, protein chiếm 0,6 %, lipid chiếm 0,4 %, đường khoảng 8,6 % Trong đó,

tinh dầu vỏ quýt (có tên thương phẩm là Mandarin oil), là chất lỏng màu vàng

đỏ có huỳnh quang xanh nhẹ Thành phần chính tinh dầu vỏ quýt là limonen(hơn 90 %), methylan - thranilat (1 %)

Trong quýt ngoài vitamin C, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ.Chất xơ khi vào ống tiêu hóa sẽ trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn bãcủa quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài Chất xơ khi vào ruột kết hợp vớiđường và acid tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thụ một số chấtdinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức cầnthiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dư thừadự trữ ở các mô gây béo phì

Quả quýt không chứa chất béo hay cholesterol nhưng chứa nhiều vitamin

C Quả quýt được chứng minh có tác dụng chống viêm, chống khối u, ức chếđông máu và chống oxy hóa mạnh Trên thực tế, hàm lượng vitamin C chỉchiếm 15 - 20% tổng số các chất kháng oxy hóa trong quả, trong khi những hợpchất khác có khả năng chống oxy hóa cao gấp 6 lần vitamin C đó là hesperidin

từ flavanoid có nhiều trong lớp vỏ xơ trắng, màng bao múi của quả và mộtlượng nhỏ trong tép [14]

Ăn cam quýt còn giúp chữa lành các vết thương nhanh hơn bởi vitamin

C đảm nhiệm vai trò quan trọng trong cơ thể để sản xuất collagenprotein chịutrách nhiệm tạo ra các mô liên kết, giúp vết thương, vết cắt hay xước da maulành, thiếu hụt collagen khiến các tế bào trong mạch máu thiếu sự gắn kết, chophép máu rò rỉ trong các mô, cơ quan dễ dẫn đến chảy máu nướu răng và xuấthiện đốm màu đỏ đặc trưng của bệnh Scorbut [28]

Quả quýt có vị chua tính ấm Người bị cao huyết áp, bệnh mạch vành,đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm ăn quýt rất tốt Vỏquýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ dày, long đờm, trị

ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vi Y học đã chứng minh, tinhdầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế vận động của cơ dạdày, phòng xuất huyết Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao huyết áp, nhồi máu cơtim, có tác dụng tốt đối với các chứng bệnh đầy bụng, rối loạn tiêu hóa, kém ăn,buồn nôn, ho nhiều đờm Hạt quýt có vị đắng tính bình, vào hai kinh can vàthận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm Lá quýt vị đắng tính bình,vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng, tan u cục, chữađau mạn sườn, sa nang, u cục ở vú [29]

1.2 Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham gia tổng hợp ascorbic acid ở thực vật

1.2.1 Ascorbic acid

Ascorbic acid (vitamin C) có nhiều trong cây xanh, rau quả, đặc biệttrong chanh, cam, bưởi, quýt, bắp cải và trong thịt, nhất là ở cây hồng gai vàmột số giống ớt đỏ (có thể đạt tới 1% - 2 % khối lượng khô) Lần đầu tiênvitamin C được tách chiết từ chanh, cam vào năm 1920 Đến năm 1933, vitamin

C được điều chế thành công bằng con đường tổng hợp hóa học không cần phảitách chiết từ thực vật Ngày nay, vitamin C được biết tồn tại trong tự nhiêndưới dạng khử (L ascorbic acid) và dạng oxy hoá (dehydroascorbic acid) Tuynhiên, dạng oxy hóa không phổ biến bằng dạng khử Cả hai dạng đều tan trongnước, dễ bị phân huỷ khi tiếp xúc với các chất oxy hoá hoặc bazơ Cả hai dạngkhử và dạng oxy hoá đều có hoạt tính sinh học và đều tồn tại trong các dịch cơthể Hoạt tính của vitamin C chủ yếu là do nhóm endiol của axit ascorbic, vìnhóm này làm nhiệm vụ tham gia vận chuyển hydro [25]

Hình1.1 Các dạng ascorbic acid trong tự nhiên [19]

So với các vitamin khác, vitamin C là chất duy nhất không có ở dạngphức hợp với các nucleotide hoặc coenzym Đặc tính cơ bản của ascorbic acid

là tác dụng khử

Đặc tính này để định lượng vitamin C khi cho nó tác dụng với một chất

có màu, rồi xác định bằng phương pháp so màu

Trong cơ thể người hoàn toàn không tự tổng hợp được vitamin C mà phảilấy từ các nguồn thức ăn bên ngoài vào Vitamin C dễ tìm, có nhiều ở rau quả.Trong cơ thể, vitamin C có nồng độ khác nhau ở mô và thể dịch, nơi nào chuyểnhoá mạnh nhất thì nồng độ vitamin C ở đó cao nhất

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vitamin

C

Nghiên cứu về cơ chế tổng hợp vitamin C ở thực vật gần đây được công

bố năm 1998 bởi Steven Clarke tại phòng thí nghiệm UCLA (University ofCalifornia, Los Angeles, Hoa Kỳ) Theo ông, các nghiên cứu từ năm 1998 đếnnay đã xác minh được phần lớn cơ chế này, mặc dù gen thực hiện bước thứbảy(g) trong sơ đồ hình 1.2 trong tổng số 10 bước chuyển hóa glucose thànhvitamin C được đề xuất vẫn còn là một ẩn số và đang tiếp tục nghiên cứu

Quá trình nghiên cứu bắt đầu từ việc tìm ra vai trò của một gen có trong

loài giun C elegans, một loài giun nhỏ được nhà nghiên cứu Tara Gomez từ

trình lão hóa Trình tự sắp xếp của gen cho thấy nó có mối quan hệ với một

họ gen bị biến đổi trong bệnh ung thư

Sự cộng tác từ nhiều phòng thí nghiệm đã khám phá ra điểm tương đồng

trong gen của loài giun này với sản phẩm là gen GDP-L-galactose

phosphorylase (GGP hay VTC2) của một loài cải dại có tên Arabidopis thaliana, một loại thực vật hoang dại mà bộ gen của chúng đã được biết rõ.

Trước đây, các nhà khoa học đã tìm thấy mối tương quan giữa những đột biếntrong gen của loài thực vật này với hàm lượng vitamin C thấp Chính vì thế,một số nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc xác định cách mà sản phẩm củagen này góp phần vào quá trình

tổng hợp vitamin C [26]

Mạng lưới nội chất hạt, polysacarit và glycoprotein thành tế

bào

Ty thể

Quan điểm hiện tại về Sinh học thực vạt

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid, Nicholas Smirnoff (2000)

[21]

Steven Clarke tái hiện lại bước thứ 7(g) trong hình 1.2, một ẩn số trongsuốt một thời gian dài, trong quá trình tổng hợp vitamin C trong phòng thínghiệm, một phản ứng mà được miêu tả là bước khơi mào Sau đó, so sánh 6bước đầu tiên của quá trình tổng hợp vitamin C với một bản đồ gồm nhiều quátrình chuyển hóa từ đường glucose đến các hợp chất tế bào mà có thể xảy ra.

Tuy nhiên, một khi sản phẩm của bước (f) là một hợp chất có tên

GDP-L-galactose có thể thoát ra ở nơi có mặt gen VTC2 thì các nguyên tử sẽ được hoàn

thiện cấu trúc để hướng đến việc tổng hợp vitamin C, đặc biệt là tạo ra một số

các loại vitamin khác Enzyme VTC2 đã được biểu hiện và tinh chế từ vi khuẩn Tác giả và nhóm nghiên cứu đã chứng minh được rằng gen VTC2 chịu trách

nhiệm ở bước (g), bước mà các nhà nghiên cứu đã tìm kiếm rất lâu trong quátrình tổng hợp vitamin C Bởi vì, các enzyme xúc tác cho các bước thực hiệnkhơi mào trong quá trình tổng hợp cho thấy các vị trí điều hòa sinh học nên cácnhà nghiên cứu hi vọng khám phá này có thể đưa đến những chiến lược mới khimong muốn của con người là tăng hàm lượng vitamin C trong cây trồng thựcvật [21]

Trên cây ăn quả có múi, khi so sánh hàm lượng vitamin C giữa cam và

quýt (Citrus unshiu Marc và Citrus sinensis Osb.) của Trung Quốc, Xiao Y.

Y và cs (2011) đã chỉ ra hàm lượng vitamin C ở cam nhiều hơn so với quýt

Đồng thời tìm ra 4 gen mã hóa cho 4 loại enzyme

(GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase; GDP-L- galactose-pyrophosphatase; L-galactose dehydrogenase và L- galactono - 1,4 - lactone dehydrogenase) liên quan đến con đường hình

thành ascorbic acid trong quả Các tác giả đã giải mã thành công gen mã hóa

GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase (mã số HQ224946) liên quan đến hoạt động

của enzyme ascorbate oxidase và ascorbate peroxidase Khi quả chín, sự có mặt

của

GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase đã góp phần nâng cao hàm lượng vitamin C của cam nhiều hơn

1,5 lần so với quýt [21]

Cũng theo Xiao – Y.Y và cs (2011), gen mã hóa

GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase tìm thấy trên Citrus unshiu (một loài cam ngọt), gen có tổng chiều

dài

1086 bp Gen mã hóa quy định trình tự phân tử protein GDP D mannose

-3’.5’- epimerase với 361 amino acid GDP - D - mannose - -3’.5’- epimerase điều phối vào quá trình hoạt hóa từ enzyme GDP - D – manose thành GDP - L -

galactose, bước chuyển hóa (e) trong hình 1.2 trên con đường sinh tổng hợp

ascorbic acid ở thực vật được công bố trên GenBank với mã số HQ224946[22]

Nghiên cứu của Xiao – Y Y và cs (2011) cũng đã chỉ ra rằng, trên genhình thành 03 vùng để quy định bảo toàn chức năng protein gồm: (1) Vùngđược đặt tên “M1P -guanylylT_B_like_N”, từ vị trí amino acid thứ nhất đến

234, quy định enzyme pyrophosphorylase GDP – mannose một trong số các

enzyme tham gia trực tiếp trong chu trình hình thành ascorbic acid; (2) Vùng cótên “LbetaH - LbH”, từ vị trí amino acid thứ 256 đến 335, mã hóa enzymeacyltransfase liên quan đến sự chuyển hóa ion trong tế bào; và (3) Vùng “other”

từ vị trí amino acid thứ 303 đến 330, vị trí hình thành sự liên kết giữa các chuỗipolypeptide [22], [21]

Cũng theo J un j i e T v à cs (2018) ascorbic acid phổ biến đóng một vai tròquan trọng trong sự phát triển của cây trồng và khả năng chịu stress phi sinhhọc, nhưng nồng độ ascorbic acid rất khác nhau giữa các cây khác nhau

GDP-D- mannose epimerase (GDP-D), xúc tác GDP-D-mannose đến GDP- L galactose hoặc GDP- L -gulose, là một enzyme quan trọng trong con đường

-sinh tổng hợp ascorbic acid thực vật Các chức năng và mô hình biểu hiện

của GDP-D đã được nghiên cứu kỹ trong các công trình trước đó, tuy nhiên, ít

thông tin được biết về các mô hình tiến hóa của gen Trong nghiên cứu này, cấu

trúc gen GDP- D , các mô hình protein được bảo tồn tương ứng và các mối

quan hệ tiến hóa đã được phân tích một cách hệ thống Tổng số 111trình tự gen

rãi trong thực vật xanh Cấu trúc gen GDP-D được bảo thủ ở cây cao hơn, trong

khi

rất đa dạng trong các phân nhóm cơ bản của phylogeny bao gồm lycophytes,

bryophytes và chlorophytes, cho thấy cấu trúc gen GDP-D có thể đã trải qua

sự phân hóa sâu sắc ở thực vật thấp hơn và sau đó dần dần cố định như sự tiến

hóa của thực vật Các trạng thái cơ bản của GDP-D được bảo tồn mạnh mẽ

trong thực vật xanh, cho thấy chức năng bảo tồn của protein Một vài nhánh

và địa điểm được lựa chọn và hầu hết các nhánh nằm trong phân nhómchlorophyte, cho thấy sự lựa chọn đa dạng ở một số nhánh và địa điểm có thể

đóng vai trò trong sự phát triển của GDP-D và đa dạng hóa sự lựa chọn giai

đoạn đầu của thực vật xanh Kết quả này cung cấp thông tin chi tiết mới về bảo

tồn chức năng và sự phát triển của GDP-D[23].

Nghiên cứu của ilbG e r t L và cs (2009) đã sử dụng các dòng cà chua biến

đổi gen đã được RNAi-slienced cho GDP-D, qua đó xác nhận rằng GDP-D thực

sự đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sinh tổng hợp ascorbatetrong thực vật Ngoài ra, các dòng cà chua chuyển gen biểu hiện các khuyết tậttăng trưởng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và sự phát triển tế bào Một tínhnăng đáng chú ý hơn nữa của cây chuyển gen là sự mong manh và mất độsăn chắc của trái cây Phân tích thành phần thành tế bào của lá và phát triển quảcho thấy hàm lượng monosaccharide thành tế bào được thay đổi trong các dòng

chuyển gen, đặc biệt là những liên kết trực tiếp với hoạt động của GDP-D như:

mannose và galactose Khi được xem xét cùng nhau, những phát hiện này chothấy mối liên hệ mật thiết giữa sinh tổng hợp polysaccharide của ascorbate

và tế bào không chứa cellulose trong thực vật, giúp giải thích các yếu tố phổbiến trong các đặc điểm không liên quan như độ cứng trái cây và hàm lượngascorbate[24]

1.3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền

Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền được các nhà nghiên cứu sử dụngbằng nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp các loạithông tin khác nhau Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục

đích của người nghiên cứu Có hai phương pháp sử dụng rộng rãi để nghiêncứu, đánh giá

đa dạng di truyền là: phương pháp xác định đa dạng di truyền dựa trên hình thái(kiểu hình) và thông qua các chỉ thị phân tử (kiểu gen) [8].

Xác định đa dạng di truyền dựa trên kiểu hình là phương pháp cổ điển,hiện nay vẫn được sử dụng phổ biến Phương pháp này giúp các nhà nghiên cứunhận biết và phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường trên thực địa mộtcách nhanh chóng Các đặc điểm chính về hình thái như dạng thân cây, dạng lá,màu sắc lá, hoa được xem là những trạng thái cơ bản để nhận biết giữa cácgiống với nhau Những tính trạng chất lượng thường là nhữ ng cặp tínhtrạng tương phản được duy trì đơn gen, mỗi tính trạng có hai hay nhiềudạng tương phản

Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử sử dụng chủyếu trong nghiên cứu các phân tử protein và DNA

Chỉ thị dựa vào protein là chỉ thị isozyme Isozyme là các dạng khác nhaucủa cùng một enzyme Enzyme có bản chất là protein và là chất đa điện li nêntrong dung dịch nó là trạng thái phân tử Dưới tác động của dòng điện mộtchiều, các phân tử protein khác nhau về khối lượng kích thước, lực tĩnhđiện sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và phân bố ở vị trí khác nhau trêngel, các băng đa hình từ các enzyme đặc hiệu đặc trưng cho sản phẩm protein cóthể cung cấp thông tin di truyền như các chỉ thị đồng trội Khi nghiên cứu đahình protein trên các giống lúa, Mohd A A và cs (2012) chỉ ra được nhượcđiểm của phương pháp này là bị phụ thuộc vào số lượng các loại enzyme có thểphát hiện, vì thế số lượng chỉ thị/genome bị hạn chế Các loại enzyme đượccấu tạo từ nhiều kiểu đơn vị sẽ làm cho việc phân tích trở nên phức tạp [10]

Chỉ thị DNA có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên trìnhtự DNA trong hệ gen Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đốigiữa chúng phản ảnh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài trongquần thể Sinh vật có khả năng nhân bản DNA của chúng với độ chính xác caonhưng có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm biến đổi cấu trúc DNA, đơn giản như