NUÔI cấy tếbào ĐỘNG VẬT(ANIMAL CELL CULTURE)

Dulbecco's Modified Eagle Medium D-MEM Institute Media 1640 RPMI-1640 T ỡ acid amin, Glycine, L-Arginine hydrochloride, L-Cystine, Glutamine, Histidine hydrochloride, Isoleucine, Leucine

1 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT (ANIMAL CELL CULTURE)

- T

-T

- T

T

1.1 Một số khái niệm [cell culture] Các t bào có th c l y từ các kh c tách riêng bằng z ọ ngu n g c từ m t dòng t ã c thi t l

à quá trình các t u ki n nhân tạo

y th c p (subculture/ secondary culture)

- p (primary culture) ạn nuôi c y sau khi t bào c tách ra từ u ki n thích h ạt c m l ọ uôi c p (primary culture) T

in vivo, ã

in vitro

T

ọ

Mô

ạ

- th c p (subculture/ secondary culture) c p (subculture/ secondary culture) ằ ạ sau khi c c y chuy n l u (first pasage) Sau l n c y chuy u tiên, qu n th t c coi là m t dòng t bào Có 3 loại dòng t bào: dòng t bào phân chia hạn ch (finite cell line) và dòng t bào b t t

Dòng t bào phân chia hạn ch

ừ ạ

- ừ

ạ ừ

Dòng t bào b t t

ạ

ạ

ừ

T

bào (hình dạng, ngu n g c và bi u hi n c a t t ng v t

trong nuôi c y in vitro n:

- Dạng nguyên bào s ng ỡng c c ho c, dạng thuôn dài, liên k t v i ch t n n

nh 2)

ạ

- Dạng bi u mô, t t v t thành từng

HeLa

- Dạng nguyên bào lympho: hình dạ ng s ng trôi

n ng nuôi c y

bào lympho

ừ T i u ki n nuôi c y

1.2 Đ

u ki n nuôi c

- M ng nhân tạ c nuôi c y, ng nuôi c y có các ch ỡng c n thi t (a.amin, carbonhydates, vitamin, ch t … ng, hocmon - Cá u ki n hóa lý (pH, áp su t thẩm th u, nhi …

- D ng c ch a t …

-

1.2.1 Môi trường nuôi cấy Một ố i ôi trườ ôi ấ t ườ

- ng nuôi c ch a các axit amin, vitamin, mu

ng t t trong mô ng ph c b sung huy

- ng ít huy t thanh: M t s thí nghi m s d ng

ng huy t thanh

Do tác d ng ph không mong mu n

T duy trì s

ng c a t n ph c b sung các ch t ỡng và các nhân t có ngu n g c từ ng v t, do v y sung huy t thanh T

- ng không huy t thanh: loạ ng này s d ng

m t s ch ỡ thay th hoàn toàn huy t thanh Các loại t bào s d ng này bao g m: t bào nuôi c p,

t s n xu t protein tái t h p, m t s dòng t bào lai, t bào côn trùng, m t s dòng t s n xu t virus

Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) Institute) Media 1640 (RPMI-1640)

T ỡ acid amin, Glycine, L-Arginine hydrochloride, L-Cystine, Glutamine, Histidine hydrochloride, Isoleucine, Leucine, Lysine hydrochloride, Methionine, Phenylalanine, Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine disodium salt dihydrate, L-Valine, Choline chloride, D-Calcium pantothenate, Folic Acid, Niacinamide, Pyridoxine hydrochloride, Riboflavin, Thiamine hydrochloride, i-Inositol,

Calcium Chloride (CaCl2), Ferric Nitrate, Magnesium Sulfate, Potassium Chloride, Sodium Bicarbonate, Sodium Chloride, Sodium Phosphate monobasic D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate

1.2.2 Huyết thanh

ọng, là ngu n cung c p các nhân t

ng, bám dính, các hoocmon, lipid, khoáng ch … bào môi

ng nuôi c n u khi n tính th m c a màng t bào và hoạ t mang lipid, enzym, vi ch t ỡng và m t ít nguyên t cho t bào

Tuy n

c chuẩn

c hi ạ n m t s hi u ng không mong mu n

ã ng và/ho c ch a m t vài dòng t bào

ẩ

1.2.3 pH

H u h t các t ng v ng t t tại pH 7,4 M t vài dòng t bào chuy n dạng lạ ng t ng có pH axit nhẹ (7.0 – 4 ; t vài dòng nguyên bào s ng lại phát tri n t t tạ ng ki m nhẹ (7.4 – 7.7) Các dòng t bào côn trùng

ng tại pH 6.2

ừ

ng nuôi c dung d c bicarbonate (HCO3-)

1.2.4 CO2

C n s d ng ngu n CO2 bên ngoài v i n CO2 duy trì trong t

c y là 5-7%

M i loạ ng s thích h p v i n CO2 và bicarbonate

ạ pH chuẩn

1.2.5 Nhiệt độ

Nhi nuôi c y ph thu c vào thân nhi t c a cá th mà t c tách ra và từ ừng t n tại

H u h t t ng v c duy trì 30-37oC

Các t bào từ ng v t máu lạ ng có ph nhi t r ng, từ 15 – 26oC

T

ạ S t s nghiêm trọ nhi u so v i s gi m nhi trong nuôi c y Do v t nhi

th t chút so v i nhi t

1.2.6 Thiết bị và dụng cụ trong nuôi cấy tế bào

 Các thi t b n :

- T hood (hay còn gọi là t c y t bào) dùng trong nuôi c y t bào (laminar flow ho c biosafety cabinet): Cung c p khu v c làm vi c vô trùng

Có ba loại bao g m: loại I, II và III (Class I, II and III) Trong nuôi c y t

ng, s d ng t loại II

- T m CO2 (humid CO2 incubator recommended) cung

c ng thích h p cho s ng c a t bào

- B n nhi t (water bath) ã nhanh

- Máy li tâm (centrifuge)

- T lạnh (4oC và -20oC)

- D ng c m t bào (cell counter or hemacytometer)

- Kính hi c

- B ng

- N i h p kh trùng

- M t s thi t b khác: B , m

 D ng c

- D ng c ch a t bào (chai nuôi c

u gi …

- Pipet các cỡ

- n (Pipet aid)

- B u kim tiêm các loại

- H ng ch t th i thí nghi m

 Hóa ch t:

- ng nuôi c I …

- Huy t thanh (serum)

- Các y u t b sung: L- …

- Trypsin-EDTA

-

- PBS kh trùng

- c kh trùng/kh ion

1.3 Một số ươ á ơ bản trong nuôi cấy tế bào

T ạ

dạng nuôi c y: bám dính và trôi n i

 Nuôi c y bám dính (adherent culture): các t ng tạo m t

l m t nhân tạo

- Nuôi c y bám dính hích h p cho h u h t các dòng t bào bao g m c nuôi c p

- d dàng ki m tra

ằ kính hi c

- c y chuy ng xuyên

- Các t c tách riêng bằng enzym ho c ằ

ọc

-

 Nuôi c y trôi n i (suspension culture): các t bào n i trong dung

d ch nuôi c y

- Thích h p cho các t bào s ng dạng trôi n i ho c m t vài dòng t bào không bám dính

- D dàng c y chuy n

i

ph m t nh tỷ l s ng c a t theo dõi t c

ng c a chúng

- S ng c a t bào b gi i hạn b i m t bào ó

th pha loãng m nuôi c kích thích t bào si ng

- Có th nuôi c y không c n x lý

ạ xoay ạ i khí

1.3.1 Cấy chuyển tế bào

Là quá trình loại b ng và chuy n t bào từ ng nuôi

c y ng nuôi c y m i (bao g i c

c y) Quá trình này nhằm ti p t c kh a dòng t bào

c y chuy n t bào khi:

- M t i v i t ng v t có vú, các t bào bám dính

c c y chuy n khi t bào ạ n m “ ã ”

- M ng cạn ki t ỡ i v i t ng v t có vú, s

gi pH là tín hi u cho th y có s c cho t bào Tỷ l i c a pH ph thu c vào m t bào nuôi c y M càng cao thì s cạn ki ng di n ra càng nhanh và s gi m pH càng

l n

t iệ t iết á bư tiế ấ ể đối i

á tế bào bám dính ư a

 Nguyên li u c n :

- ng t bào nuôi c y

- y m i

- ng nuôi c y hoàn ch ã sung các y u t c n thi t

G … ã m lên 37oC

- T m CO2

- Dung d B … phenol

- Y u t tách t bào: enzym (trypsin, TrypLE Express, collagenase,

… phenol

- Các hóa ch t và d ng c nh tỷ l s ng/ch t c a t bào: Blue trypan, bu m t …



- Loại b

- R a t bào bằng PBS (kho ng 2ml/10cm2 b m t nuôi c ằ

hẹ nhàng th dung d ch vào thành c a chai nuôi c y L c nhẹ chai vài l n B

- Loại b dung d ch r a

- B sung dung d ch tách t bào ( ã c làm

m 3 y L c nhẹ c 2

- Ủ chai nuôi c y tại nhi phòng trong kho ng hút

ừ

c (ki i kính hi c xem t bào ã tách ) Có th gõ nhẹ u qu tách t bào

- 9 % bào ã b sung môi

ng nuôi c y hoàn ch ã c làm m v i th tích g p 2 -3 l n th tích dung d ch tách Tr ng lên b m t l p t bào vài l n

ã

- Chuy n toàn b dung d ch t bào sang ng li tâm và li tâm ian 5 – 10 phút,T thu c vào từng loại t bào)

- Loại b ng nuôi c z u t bào trong môi

ng m i

- L y m t ít d ch t nh tỷ l s ng ch t (xem ptotocol

m t bào)

- Hòa loãng d ch t ạt m t bào c n thi t và hút m t th tích phù h p r i cho vào chai nuôi c vào t m

t iệ t iết á bư tiế ấ ể đối i

á tế bào trôi nổi ư a

 Nguyên li

- Chai nuôi c y ch a t bào c n c y chuy n

- Chai nuôi c y l c

- ng nuôi c y hoàn ch nh, l m m lên 37oC

- T m CO2

- C c khu y từ (n u s d ng chai spinner) ho c t u s

d ng chai tròn- roller bottle) hay máy l c (n y

ng

- Hóa ch t và d ng c nh tỷ l t bào s ng/ch t



- Khi t bào s n sàng cho c y chuy n, l y chai ra kh i t m

ẹ ẹ Dùng pipet hút m ng nh th tích d ch t bào nh tỷ l t bào s ng/ch t - T ng dung d ch c n b hòa loãng n

t n m thích h p - ạ

- Cẩn th n b ng m ã m) v i th tích ã chia nh ng dung d ch t bào vào nhi u chai m ng dung d t quá ½ th tích dung d ch mà chai có th ch a) 1.3.2 Cất l nh tế bào

-

B o qu n t bào c t lạnh tại nhi -

ạ -800 -1700

C T bào

b u b phá h y n u nhi -50oC

C t lạnh t bào tại n nh t và s l n c y chuy n ít nh t có th

C m b 9 % bào s c khi c u ki n c t lạnh có

th khác nhau gi a các dòng t bào

ạ ạ ừ ừ i t 1oC trên m

Luôn luôn s d ng c t lạ é ng này

ng ch a ch t b o qu n lạ O

Luôn luôn s d ng các tube c t t bào chuyên bi t (cryovials) Các tube này có th c c trong nito l ng

m b o gi vô trùng trong mọ u ki n

ng c t lạnh: có th ng nuôi c y hoàn ch nh (ho c huy t thanh) có 10 – 15 % DMSO Ho ẩ Recovery Cell Culture Freezing Medium hay Synth-a-Freeze

Cryopreservation Medium

t iệ t iết á bư tiế ất tế b

 Nguyên li u

- Chai nuôi c y có t bào pha log

- ng nuôi c y hoàn ch nh

- DMSO ho ng c t lạ ẩm khác

- ng li tâm 15 ml và 50 ml

- Hóa ch t và d ng c nh tỷ l t bào s ng/ch t

- Tube c t lạnh t bào vô trùng

- H p c t lạnh t “ ”

- T - ng nito l ng

V i các t bào bám dính c n thêm PBS, Trypsin ho c enzym tách t bào

 C ạ

- Chuẩn b ng c t lạ 2 – 8 n khi s d ng

- i v i t bào bám dính, nhẹ nhàng tách t ã

u t ng nuôi c y hoàn ch nh thích h p

- X nh tỷ l s ng/ch t

- Li tâm d ch t bào tại 100 – 200 x g trong 5 – 10 phút Cẩn th n loại b d ch n i

- u t ng c t lạnh v i m t bào thích

h p cho từng loại t bào

- Chia nh dung d ch t bào trên vào các tube c t lạ

gi t bào phân b u

- t các tube vào h p c t lạ t - 8

- Chuy n các tube t bào vào nito l t bào tạ

t bào lâu trong - 80oC

1.3.3 Ho t hóa tế bào từ cất l nh

ã é

ạ ạ T

ạ ừ ạnh

ạ

- ã bào càng nhanh càng t i 1 phút) tại b n nhi

3 ã

- Nhẹ ã ch t bào bằ ng hoàn ch ã làm m t G m t ạ c s h i ph c t t

- Luôn gi u ki n vô trùng, Luôn s d ng thi t b an toàn khi làm

vi c v i nhi th p, Luôn s d p khi làm vi c v i DMSO

Nguyên liệu i tr t a tế b á bư a

 Nguyên li u

- Tube c t lạnh ch a t bào

- ng nuôi c y hoàn ch ã m tại 37oC

- Ống li tâm các loại

- B n nhi t 37oC

- C n ethanol 70o

- y t bào thích h p

 Q ạ

L y tube c t lạnh ch a t bào từ bình nito l ng và ngay l p t c cho vào b n nhi t 37oC

- ã i 1 phút) bằng cách quay nhẹ tube

c b n nhi n khi ch còn lại m

- Chuy n tube vào t c c khi m n p, kh trùng xung quang bằng c n Et 70o

- Chuy n toàn b t bào từ tube sang ã a s n m t

ng nuôi c y hoàn ch nh, m

- Li tâm tại 200 xg trong 5 -10 phút (t li tâm tùy vào từng loại

t bào)

- Cẩn th n loại b d ch phía trên mà không chạm n kh i t bào

- Nhẹ u t ng hoàn ch nh m i và chuy ; t vào t m CO2 Tùy theo s ng t bào

mà s d ng chai có th tích phù h p