Nghiên cứu thu nhận và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ ốc nón đỏ tectus conus

Do đó, để tồn tại trong môi trường biển với mật độ vi sinh vật cao lên đến 106 tế bào vi khuẩn/ml-1 và 109 virus/ml-1 nước biển, đa số là các loài gây bệnh, các loài nhuyễn thể phải phát

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ

MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ ỐC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ

MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ ỐC

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ kỹ thuật hóa học - Khoa Công nghệ Thực phẩm, trường đại học Nha Trang đã truyền đạt, trang

bị cho tôi những kiến thức cần thiết và quý báu trong thời gian học tập tại trường

Và cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 11 tháng 07 năm 2018

Sinh viên

Huỳnh Lê Thanh Thúy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn và sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng công nghệ sinh học biển – Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Khánh Hòa, ngày 11 tháng 07 năm 2018

Sinh viên

Huỳnh Lê Thanh Thúy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH ẢNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về động vật thân mềm biển (Mollusca) 3

1.2 Tổng quan về ốc nón Tectus conus 3

1.3 Tổng quan về lectin 4

1.3.1 Định nghĩa 4

1.3.2 Sự phân bố lectin trong sinh giới 5

1.3.3 Vai trò sinh học của lectin 6

1.3.4 Cấu tạo của phân tử lectin 6

1.3.4.1 Cấu trúc và phân loại 6

1.3.4.2 Cấu tạo phân tử 7

1.3.4.3 Trung tâm hoạt động của lectin 7

1.3.4.4 Khối lượng phân tử của lectin 8

1.3.5 Một số tính chất hóa lí và sinh học của lectin 9

1.3.5.1 Tính tan và kết tủa 9

1.3.5.2 Khả năng tương tác với đường của lectin 9

1.3.5.3 Khả năng gây ngưng kết tế bào 10

1.3.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới hoạt độ của lectin 10

1.3.6.1 Ảnh hưởng của pH 10

1.3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường 11

1.3.6.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố khác 11

1.3.7 Một số ứng dụng của lectin 12

1.4 Lectin từ động vật thân mềm biển 12

1.4.1 Một số dạng lectin ở động vật thân mềm biển 12

1.4.2 Tình hình nghiên cứu lectin từ động vật thân mềm biển 13

1.5 Phương pháp thu nhận lectin 15

1.5.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin 15

1.5.2 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính 16

1.5.3 Kết tủa phân đoạn bằng dung môi 16

1.5.4 Thẩm tách 16

1.5.5 Các kỹ thuật tinh sạch bằng sắc ký 16

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Quy trình nghiên cứu tổng quát lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 20

2.3.2 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp Ngưng kết hồng cầu 21

2.3.3 Xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Lowry 22

2.3.4 Phương pháp khảo sát các yếu tố cho quá trình chiết lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 23

2.3.4.1 Khảo sát dung môi chiết 24

2.3.4.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 24

2.3.4.3 Khảo sát thời gian chiết 24

2.3.4.4 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa lectin 24

2.3.5 Tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 25

2.3.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin 26

2.3.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 26

2.3.6.2 Ảnh hưởng của pH 26

2.3.7 Phương pháp khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate của lectin 26

2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ ốc nón đỏ T.conus 30

3.1.1 Ảnh hưởng của dung môi chiết 30

3.1.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi chiết 31

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết 32

3.2 Tinh sạch lectin 33

3.2.1 Khảo sát nồng độ ammonium sunfate (NH4)2SO4 để kết tủa lectin 33

3.2.2 Kết quả tinh sạch bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion trên nhựa DEAE-Sepharose 34

3.2.3 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch sơ bộ lectin từ ốc nón đỏ T.conus 35

3.3 Kết quả khảo sát một số đặc tính hóa lý và sinh học của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 38

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 38

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus40 3.3.3 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BSA : Albumin huyết thanh bò

TBS : Dung dịch đệm Tris (hydroxymethyl) aminomethane – HCl chứa muối

natri clorua PBS : Dung dịch đệm phosphate chứa muối natri clorua

C : nồng độ của đường và glycoprotein

Cmin : nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein ( g/ml) mà tại đó

hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị ức chế hoàn toàn

DC : dịch chiết

HĐR : hoạt độ riêng

HĐTS : hoạt độ tổng số

NKHC : ngưng kết hồng cầu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Các loại đường và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết đường của lectin 27

Bảng 3.1 Kết quả tinh sạch lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 35

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Ốc nón đỏ Tectus conus 4

Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry 23 Hình 2.3 Ảnh hưởng của các gốc đường đến khả năng liên kết giữa lectin với các tế bào hồng cầu 27

Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 30

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) đến hoạt độ tổng số và hoạt

độ riêng của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 31

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt độ tổng số và hoạt độ riêng của

lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 32

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ tủa ammonium sulfate đến hoạt độ tổng số và hoạt

độ riêng của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus 33

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ (λ=280nm)và hoạt độ ngưng kết hồng cầu của quá trình sắc ký trao đổi ion DEAE - Sepharose 35

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình thu nhận và tinh sạch sơ bộ lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus37 Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ ốc nón đỏ Tectus

conus 39

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ NKHC của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus40

Trong số các sinh vật biển, nhuyễn thể là một trong những ngành có số lượng loài lớn nhất với hơn 85000 loài đã được xác định [63] Cũng như các sinh vật biển khác, nhuyễn thể không có hệ miễn dịch đáp ứng Do đó, để tồn tại trong môi trường biển với mật độ vi sinh vật cao lên đến 106 tế bào vi khuẩn/ml-1 và 109 virus/ml-1 nước biển, đa số là các loài gây bệnh, các loài nhuyễn thể phải phát triển hệ thống bảo vệ cơ thể bằng các cơ chế sinh học nhằm phát hiện và xử lý các kháng nguyên hiện diện trên

bề mặt tế bào vi sinh vật gây bệnh như Lipopolysaccharides (LPS), lipoteichoic acid, lipoproteins, peptidoglycan bằng cách sản sinh ra các hợp chất hóa học, các enzymes, các peptides, proteins… Nhiều hợp chất trong số này đã được chứng minh có các hoạt tính sinh học như kháng vi sinh vật, kháng ung thư, kháng viêm có tiềm năng sử dụng

để phát triển thành các loại thuốc mới [25] Trong đó phải kể đến lectin

Lectin từ các sinh vật biển nói chung, và từ nhuyễn thể nói riêng là tiềm năng để phát triển thành các loại thuốc mới kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng u và điều biến miễn dịch… Các cấu trúc proteoglycan, glycoprotein và glycolipid liên quan đến một

số loại tế bào nhất định, cũng như các chức năng sinh lý và bệnh lý của chúng bao gồm khả năng tương tác với tế bào chủ, mối liên hệ giữa tế bào – tế bào, là điều kiện ban đầu để gây nên nhiều bệnh lý Lectin có thể nhận biết các dạng carbohydrate khác

nhau trong cấu trúc proteoglycan, glycoprotein và glycolipid, kết quả là chúng có thể điều chỉnh các tế bào thông qua sự hình thành glyco liên hợp, do đó ngăn chặn sự tương tác giữa các tác nhân gây bệnh với vật chủ qua liên kết với các oligosaccharide trên bề mặt của tác nhân gây bệnh [49]

Lectin từ nhuyễn thể đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới Ở Việt nam cũng có một số nghiên cứu của Nguyễn Quốc Khang và Cao Đăng Nguyên Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu này còn rất hạn chế và chưa tương xứng với số lượng các loài nhuyễn thể tại vùng biển Việt Nam (có hơn 903 loài thuộc lớp chân bụng và 228 loài thuộc lớp 2 mảnh vỏ) Do đó, cần đẩy mạnh các nghiên cứu về lectin từ nhóm đối tượng này Cũng theo kết quả sàng lọc sơ bộ trên hơn 20 loài thuộc lớp chân bụng và 2 mảnh vỏ thu nhận tại vùng biển Nha Trang của tác giả Trần Thị Ngọc Kiều (2016) đã

cho thấy lectin hiện diện ở khá nhiều loài Trong đó, lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus

là một trong những lectin thể hiện hoạt tính NKHC tương đối tốt Do đó, trong phạm

vi đồ án tốt nghiệp, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài ―Nghiên cứu thu nhận và đánh

giá một số đặc tính hóa học của lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus‖ nhằm:

Xây dựng quy trình tách chiết và thu nhận lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus thu

nhận tại Nha Trang, Khánh Hòa

Đánh giá sơ bộ một số tính chất hóa lý và sinh học của lectin từ ốc nón đỏ Tectus

conus

Ý nghĩa đề tài

Kết quả đề tài là cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu về lectin từ động vật biển,

bổ sung vào nguồn tư liệu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển tại vùng biển Việt Nam

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về động vật thân mềm biển (Mollusca)

Ngành thân mềm (Mollusca, còn gọi là nhuyễn thể hay thân nhuyễn) là một ngành trong phân loại sinh học có các đặc điểm như cơ thể mềm, có thể có vỏ đá vôi che chỡ và nâng đỡ, tùy lối sống mà vỏ và cấu tạo cơ thể có thể thay đổi

Việt Nam là nước nằm trong vùng nhiệt đới Phía Đông và Nam đều giáp biển,

có nhiều vũng, vịnh, cửa sông đổ ra biển, nền đáy đa dạng tạo nên khu hệ động vật phong phú về thành phần loài Động vật thân mềm là một trong các loài đem lại lợi ích kinh tế cao Do đó việc nghiên cứu động vật Thân mềm được tiến hành sâu rộng từ thế

kỉ XX, nhất là sau khi viện Hải Dương học Nha Trang được thành lập (năm 1922) Năm 1996, Nguyễn Chính nghiên cứu, tổng kết và giới thiệu 88 loài Thân mềm có giá trị kinh tế ở biển Việt Nam [12]

1.2 Tổng quan về ốc nón Tectus conus

Ốc nón đỏ T.conus (Gmelin, 1791) [21]

T.conus, là một loài ốc biển, là động vật thân mềm chân bụng sống ở biển trong

họ Tegulidae, thuộc ngành thân mềm Ốc nón đỏ sống ở các rạn san hô, từ vùng triều thấp đến độ sâu 5m, phân bố rộng ở vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương, xuất hiện ở Biển

Đỏ, ngoài khơi Philippines, Indonesia-Malaysia và từ phía bắc đến phía nam Nhật

Bản Tại Việt Nam, ốc nón đỏ Tectus conus được tìm thấy ở nhiều vùng biển như

Khánh Hòa, Bình Thuận, Phú Quốc…

Ốc nón đỏ T.conus còn có tên gọi khác Trochus conus (Gmelin, 1791) Chiều cao

của vỏ ốc thay đổi từ 45 mm đến 70 mm, đường kính từ 45 mm đến 60 mm Lớp vỏ dày, chắc chắn có hình dạng hình chóp

Hình 1.1 Ốc nón đỏ Tectus conus Phân loại khoa học [64]

Thuật ngữ ―Lectin‖ (Lectin bắt nguồn từ chữ ―Lectus‖, dạng quá khứ của động từ

―Legre‖, trong tiếng Latin có nghĩa là ―lựa chọn‖) - được Boyr và Shapleigh bắt đầu sử dụng vào năm 1954 để chỉ nhóm các chất từ thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu nhóm máu, đây có thể được coi là khái niệm đầu tiên về lectin [20]

Sau đó, có thêm nhiều định nghĩa khác về lectin Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đã đưa ra định nghĩa ―Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu‖ Khái niệm này đồng nhất với định nghĩa về lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm 1982: ―Lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu‖ Năm 1995, Peuman

và Van Dame đã đưa ra một khái niệm mới về cấu trúc liên quan đến tính chất của

lectin: ―Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường‖ [31],[50]

Và một trong những định nghĩa khá đầy đủ về lectin như sau: ―Lectin là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau‖[40]

1.3.2 Sự phân bố lectin trong sinh giới

Lectin được phát hiện ở gần như tất cả các sinh vật ở mọi cấp bậc phân loại

từ virus đến vi khuẩn, thực vật và động vật

Ở thực vật: Lectin phân bố khá rộng ở các loài thực vật từ bậc thấp đến bậc cao,

từ trên cạn xuống dưới nước Hơn 1000 loài được phát hiện có sự có mặt của lectin, tuy nhiên mới chỉ biết rõ 4-5% lectin ở những họ thực vật có hoa Đa số các lectin được nghiên cứu chi tiết nhất đều thuộc họ đậu, chiếm 60% các lectin được nhiều người biết đến Lectin được phát hiện ở hầu hết các mô thực vật, nhưng sự phân bố của chúng trong các mô thay đổi theo các họ đã được nghiên cứu Chúng có nhiều ở hạt (họ đậu, họ đại kích, hòa thảo), quả và củ (họ cà, họ hành), rễ (họ bầu bí, họ đậu),

ở chồi và lá (họ xương rồng và họ lan) [18] Không chỉ ở thực vật bậc cao, lectin còn được tìm thấy ở nhiều loài thực vật bậc thấp như ở một số loài nấm, địa y và rong Vẫn còn nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu, tuy nhiên, những dẫn chứng khoa học được công bố đã cho thấy được sự phân bố khá rộng của lectin ở các loài thực vật [5]

Ở động vật: lectin cũng đã được nghiên cứu ở một số đối tượng và chúng được

phát hiện ở hầu hết các sinh vật có xương sống lẫn không xương sống Lectin ở sinh vật không xương sống có chủ yếu ở dịch hoặc dịch tiết, như huyết thanh cá, nọc rắn, tinh dịch, huyết tương Lectin ở động vật có xương sống tồn tại ở dạng tự do hoặc protein cấu trúc màng ở dịch phôi, các cơ quan và mô ở cơ thể trưởng thành [59]

Ở vi sinh vật: Lectin có nguồn gốc từ vi sinh vật được Alfred Gottschalk phát

hiện lần đầu tiên trên virus cúm vào đầu những năm 1950 và được Don Wiley cùng cộng sự kết tinh cũng như xác định cấu trúc vào năm 1981 Sau đó, một lượng lớn các

hemagglutinin từ virus đã được phát hiện và kết tinh Sự có mặt hemagglutinin trên virus cúm đã mở ra một cái nhìn mới về sự hiện diện của hợp chất này trên vi khuẩn

và động vật nguyên sinh [62] Trên đối tượng vi khuẩn, các nghiên cứu về lectin bắt

đầu vào những năm 1950 bởi nhóm nghiên cứu của Duguid ở Anh và Brinton ở Mỹ Theo đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu được thể hiện ở nhiều loài vi khuẩn, phần lớn

thuộc họ Enterobacteriacae Lectin ở vi khuẩn liên quan đến các fimbrae (hay còn gọi

là pili) trên bề mặt tế bào vi khuẩn Lectin giữ vai trò quan trọng trong cơ chế bám

dính của vi khuẩn vào tế bào chủ - tạo điều kiện tiên quyết cho quá trình gây bệnh của

vi khuẩn [53]

1.3.3 Vai trò sinh học của lectin

Ở động vật: lectin phục vụ nhiều chức năng sinh học quan trọng như quyết định

độ bám dính của tế bào; tham gia vào quá trình tổng hợp glycoprotein; điều chỉnh lượng protein trong máu Lectin có thể liên kết được với các glycoprotein nội và ngoại bào Một số lectin liên kết đặc hiệu với đường galactose cũng được tìm thấy trên bề mặt tế bào gan của động vật có vú Những lectin này đóng vai trò như những thụ thể

bề mặt tế bào và có khả năng loại bỏ một số glycoprotein nhất định trong hệ tuần hoàn Thêm vào đó, lectin cũng giữ một vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch của động vật

Ở thực vật có hai giả thuyết về vai trò của lectin Một giả thuyết cho rằng giúp

thực vật chống lại vi khuẩn gây bệnh và các sinh vật gây hại Giả thuyết này được đưa

ra dựa trên quan sát ở Rehovot cho thấy lectin ức chế quá trình tạo bào tử nấm Ngoài

ra, một quan sát của Lierner về sự chết của ấu trùng bọ cánh cứng khi ăn thức ăn có lectin đậu đen cũng góp phần làm rõ thêm cho giả thuyết này [37] Giả thuyết thứ hai

là sự kết hợp đặc hiệu của một giống đậu nào đó với một số vi khuẩn cố định đạm nhất định Thành phần đường của các polysaccharide hoặc lipopolysaccharide trên màng tế bào các loài vi khuẩn là khác nhau, và khả năng liên kết của lectin của các họ đậu khác nhau với các gốc đường này cũng có sự khác biệt [55]

Lectin cũng đóng vai trò quan trọng đối với quá trình gắn virus vào tế bào vật chủ, mở đầu cho quá trình tấn công tế bào vật chủ của virus

1.3.4 Cấu tạo của phân tử lectin

1.3.4.1 Cấu trúc và phân loại

Năm 1988, khi Drickamer xem xét những gì đã được biết đến trong cấu trúc chính của lectin ở động vật, có thể kết luận rằng hầu hết lectin thuộc về một trong 2 nhóm chính: C-type (phụ thuộc Ca2+) và S-type (phụ thuộc lưu huỳnh hoặc liên kết beta - galactoside) Cả 2 loại đều có một miền bảo tồn khoảng 120 amino acid, mặc dù C-type

và S-type hoàn toàn không liên quan đến nhau Các trường hợp ngoại lệ được biết đến vào thời điểm đó là một nhóm không đồng nhất được gọi là ―N-type‖

Lectin động vật hiện nay ít nhất có 25 loại khác nhau về nếp gấp bao gồm type, I-type (nếp gấp Ig), P-type, β-sandwich (thạch cuộn, có mặt trong gallectins), calnexin/calreticulin, ERGIC-53 (endoplasmatic reticulum-Golgi intermediate compartment-53—L-type), G-domain thuộc họ LNS (laminin, agrin), β-trefoil, domain giàu cysteine thuộc thụ thể mannose đại thực bào C-type, fibrinogen-like domain (ficolins), intelectins và tachylectin-5 [60],[50]

C-1.3.4.2 Cấu tạo phân tử

Lectin có bản chất là protein hoặc glycoprotein, điển hình là ConA

(Concanavalin A) chiết từ Canavalia ensiformis và lectin mầm lúa mì WGA (wheat

germ agglutinin)

Thành phần carbohydrate của lectin bao gồm các đường mannose, glucose, galactose Ngoài ra, còn có axit sialic (là dẫn xuất N-acyl của axit neuraminic) thường nằm ở phần cuối oligosaccaride của các glycoprotein hoà tan

Lectin của mỗi loài chứa thành phần axit amin khác nhau, nhưng phổ biến nhất

là axit aspartic, serin, arginin và threonin Các axit amin này chiếm tới 30% thành phần phân tử lectin Trong khi đó, các axit amin chứa lưu huỳnh như cystein, methionin chỉ chiếm tỉ lệ thấp, hoặc hầu như không có trong thành phần lectin

1.3.4.3 Trung tâm hoạt động của lectin

Bất cứ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc 1 hay cấu trúc không gian phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động Đó là trung tâm liên kết carbohydrate Chính trung tâm này quyết định hoạt tính của lectin Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của chúng là các gốc acid amin hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin, trung tâm hoạt động của chúng là do một số acid amin như tyrosin, serin, threonin,

tryptophan…có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên [26] Các dạng lectin khác nhau thì có thành phần acid amin trong trung tâm hoạt động là khác nhau Cho đến nay, vấn đề về trung tâm hoạt động của lectin vẫn còn rất phức tạp

Về cơ chế hoạt động của lectin, các nhà khoa học đều thống nhất như sau: Các trung tâm hoạt động của các phân tử lectin đều có khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt màng tế bào Các liên kết sẽ được hình thành giữa các receptor trên bề mặt màng tế bào với các trung tâm hoạt động của lectin Nhờ các liên kết này mà lectin đã kết dính các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết tế bào Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các receptor trên

bề mặt tế bào cũng khác nhau Giống như enzyme, trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi nó nằm trong một cấu trúc hoàn chỉnh của phân tử Bất kì một tác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân tử lectin đều sẽ làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của trung tâm này Chính vì vậy, hoạt độ của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một số tác nhân lý hóa của môi trường [26]

1.3.4.4 Khối lƣợng phân tử của lectin

Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu li tâm và phương pháp quang phổ khối ion hóa phun điện tử (electronsprayionization–massspectrometry) khối lượng phân tử của khá nhiều dạng lectin đã được xác định Có thể kết luận khối lượng phân tử của các loại lectin có nguồn gốc khác nhau thì khối lượng có thể giống hoặc khác nhau và dao

động trên một dải rất rộng từ vài nghìn Dalton (lectin của rễ cây tầm ma Urtica

dioica: 8500 Da) cho tới vài trăm nghìn Dalton (lectin của sam biển châu Á: Tachypleus tridentatus 700.000Da) [35]

Do phân tử lectin có thể được cấu tạo từ nhiều tiểu đơn vị, nên khối lượng phân

tử của chúng phụ thuộc rất nhiều vào cấu trúc không gian Các yếu tố này làm thay đổi cấu trúc không gian của lectin như: pH, dung dịch urê nồng độ cao, guanidinclorit đều có thể ảnh hưởng đến khối lượng phân tử lectin

Cho đến nay, khoa học không tìm thấy mối liên quan nào giữa khối lượng phân

tử và hoạt tính của letin Khối lượng phân tử của lectin không mang tính đặc trưng và không phụ thuộc vào mức độ tiến hoá của loài hay cá thể

1.3.5 Một số tính chất hóa lí và sinh học của lectin

1.3.5.1 Tính tan và kết tủa

Lectin có khả năng hoà tan trong nước, đặc biệt lectin rất dễ tan trong dung môi

là muối loãng, vì vậy trong quy trình tinh chế, các nhà khoa học thường sử dụng các dung dich đệm chứa muối ở nồng độ sinh lý làm dung môi chiết xuất Do bản chất là protein nên lectin dễ kết tủa với: aceton, alcohol ở nhiệt độ thấp một số muối trung tính nồng độ cao (đặc biệt là ammonium sulfate) và muối kim loại nặng

1.3.5.2 Khả năng tương tác với đường của lectin

Khả năng tương tác với đường của lectin là một trong những tính chất điển hình của lectin Lectin có thể liên kết với cả phân tử đường đơn lẫn cả gốc đường nằm trên

bề mặt tế bào Các loại đường như là: glucose và glucosamin, galactose và galactosamin, fucose, manose tương tác với nhiều loại lectin

Có rất nhiều giả thuyết về bản chất sự tương tác giữa lectin với gốc đường, tuy nhiên các nhà khoa học đều thống nhất là: sự bền vững của phức hợp lectin - đường được duy trì nhờ các liên kết phân cực (liên kết hidro giữa các nhóm -OH của đường với các đầu phân cực của các gốc axit amin trên phân tử lectin) và liên kết không phân cực hay liên kết không gian (liên kết bằng lực Van der -Walls)

Phương pháp xác định sự tương tác giữa đường và lectin đang được sử dụng hiện nay là xác định hoạt độ NKHC của lectin khi có mặt một loại đường nào đó Trường hợp hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn chứng tỏ đường đã kìm hãm hoạt tính của lectin Ngược lại, hoạt độ lectin vẫn ổn định chứng tỏ đường không ức chế

Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác giữa đường và lectin còn khá phức tạp Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu sử dụng lectin Với các loại lectin tương tác đặc hiệu với một glycoprotein nào đó thì có thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó Một

số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu Gần đây, dựa vào các loại đường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế nhiều loại lectin bằng sắc kí ái lực, hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực letin để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học[32]

1.3.5.3 Khả năng gây ngưng kết tế bào

Ngưng kết tế bào là đặc tính sinh học điển hình của lectin, các nhà khoa học dùng đặc tính này để phát hiện sự có mặt của lectin ở các đối tượng nghiên cứu.Đặc tính này còn giúp phân biệt lectin với những hợp chất sinh học khác cũng có khả năng tương tác với đường như là glycosidase, glycotranferase

Để có thể gây ngưng kết tế bào, lectin phải tạo ra nhiều cầu nối giữa các tế bào

bị gắn kết Tuy nhiên khả năng ngưng kết không chỉ phụ thuộc đơn thuần vào số lượng lectin, mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính phân tử của lectin, đặc ktính màng (số trung tâm liên kết đường, kích thước phân tử, số lượng thụ thể, tính chất và tình trạng trao đổi chất của màng)… Ngoài ra, một số yếu tố như nồng độ tế bào, các yếu tố môi trường như: pH, nhiệt độ, chất kích thích, chất kìm hãm, ion kim loại cũng là những nhân tố tác động lên khả năng ngưng kết tế bào của lectin

Số lượng lectin có khả năng gây NKHC duy nhất một nhóm máu rất ít vì chúng đồng thời có thể gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, gà, cừu, dê hay ngựa… Theo nghiên cứu, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loại lectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loại lectin không đặc hiệu nhóm máu [14],[38] Các lectin đặc hiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng

Theo Sharon (2003), lectin không chỉ gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi [54]…

1.3.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới hoạt độ của lectin

1.3.6.1 Ảnh hưởng của pH

Các nghiên cứu về điểm đẳng điện của lectin cho thấy: tại điểm đẳng điện (pHi) thì hoạt độ của lectin là bé nhất Tại đó, lectin dễ bị kết tủa pH ngoài điểm đẳng điện, lectin ở trạng thái phân li tích điện, dễ hòa tan và có hoạt độ Mỗi dạng lectin thường

có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà ở đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định Ở pH vùng acid và kiềm mạnh, hoạt độ lectingiảm hoặc mất hoàn toàn Thường thì lectin từ thực vật bậc cao, lectin từ động vật có khoảng pH hẹp Đối với lectin từ thực vật bậc thấp có khoảng pH thích hợp rất rộng,

ví dụ như lectin từ tỏi Allium sativum có khoảng pH thích hợp từ 3 đến 10, lectin từ rong biển hầu hết có khoảng pH từ 3 đến 9, đặc biệt có ở một số loại rong như Boodlea

composite, Dictyosphaeria versluysii hay Valonia fastigiata và một số loài rong biển

Việt Nam đã được công bố như: Kappaphycusalvarezii, Kappaphycus striatum và

Eucheuma [9],[10],[48]

1.3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Do bản chất là protein, lectin cũng chịu ảnh hưởng của nhiệt độ tác động lên cấu trúc không gian bậc bốn, làm ảnh hưởng đến ái lực liên kết với đường của các trung tâm hoạt động và làm thay đổi hoạt tính của lectin

Đa số lectin bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao, do tác dụng của nhiệt độ làm đứt gãy liên kết hoá trị của phân tử lectin khiến cấu trúc không gian của chúng không thể phục hồi lại (bị biến tính không thuận nghịch), ở nhiệt độ thấp hoạt tính lectin giảm, khi tăng dần nhiệt độ thì hoạt tính lectin cũng cũng tăng dần đến một giá trị cực đại ở nhiệt

độ tối thích Khoảng nhiệt độ tối thích còn tùy thuộc vào từng loại lectin

1.3.6.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố khác

Ảnh hưởng của enzyme

Enzyme có khả năng làm biến đổi tính chất của màng tế bào và làm thay đổi khả năng ngưng kết tế bào của lectin Một số enzyme như trypsin, papain có tác dụng làm tăng hoạt tính của lectin Khi hồng cầu được xử lý bằng các enzyme này, một số protein trên bề mặt hồng cầu sẽ bị thuỷ phân làm bộc lộ rõ các thụ thể có bản chất là glycoprotein giúp cho lectin gắn vào màng tế bào hồng cầu dễ dàng hơn, do vậy sẽ làm tăng hoạt tính ngưng kết tế bào hồng cầu của lectin Ngược lại một số enzyme lại làm giảm hoặc mất hoạt tính của lectin, khi tiến hành xử lý hồng cầu bằng galactose oxidase hoặc một số enzyme glycosidase các enzyme này sẽ phân huỷ các gốc đường đặc hiệu với lectin, do đó làm giảm hoạt tính ngưng kết

Ảnh hưởng của các ion kim loại

Một vài ion kim loại cũng ảnh hưởng đến tính chất của lectin Trong nhiều thí nghiệm, một số loại ion kim loại sẽ làm giảm hoặc tăng hoạt tính của lectin Tác động của chúng khá là phức tạp không tuân theo quy luật nào [51]

1.3.7 Một số ứng dụng của lectin

Lectin chủ yếu được ứng dụng trong một số lĩnh vực sau:

 Phát hiện, cô lập và nghiên cứu cấu trúc của glycoprotein

 Nghiên cứu carbohydrate trên bề mặt tế bào và các bào quan, hóa mô học và hóa tế bào học

 Kích thích phân bào đối với bạch cầu (trong nghiên cứu lâm sàng)

 Nghiên cứu sự sinh tổng hợp glycoprotein…

1.4 Lectin từ động vật thân mềm biển

Ở động vật, các nghiên cứu về lectin chỉ mới được tiến hành ở một số ngành

Số lượng các lectin đã được phân lập từ động vật là tương đối nhỏ hơn so với từ thực vật và chủ yếu là từ nhuyễn thể và động vật giáp xác

1.4.1 Một số dạng lectin ở động vật thân mềm biển

Dựa vào sự tương đồng về cấu trúc của vùng nhận diện đường (CRD: carbohydrate recognition domain) lectin được chia thành nhiều dạng khác nhau Ở động vật nói chung từ trên cạn xuống dưới nước bao gồm một số dạng lectin như lectin dạng C, lectin dạng S (galectins), lectin dạng I (họ lectin này còn được gọi là siglecs), lectin dạng P, [17],[30]…

Lectin dạng C: đây là loại lectin phổ biến nhất, có mặt ở cả thực vật, động vật

và vi khuẩn Hoạt tính của lectin dạng C phụ thuộc vào Ca2+, hay nói cách khác, hoạt tính của lectin dạng C chỉ được thể hiện khi có sự hiện diện của ion Ca2+ trong môi trường Khi có mặt Ca2+

, lectin dạng C thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như sự bám dính, nhập nội bào (endocytocyte) và trung hòa mầm bệnh (pathogen neutralization)

Lectin dạng S (galectins): Galectin có khả năng liên kết đặc hiệu với đường

β-galactoside và hoạt tính không phụ thuộc vào ion Ca2+ Dựa vào cách xây dựng cấu trúc, galectin được chia ra 3 họ nhỏ là proto- (vùng liên kết đường ở dạng monomer hoặc homodimer), chimera- (vùng liên kết đường và một chuỗi không có khả năng liên kết đường ở đầu N nằm trên cùng một chuỗi) và tandem-repeated (hai vùng liên kết đường riêng biệt nằm cùng trên một chuỗi) Galectin có khả năng tạo thành các phân

tử lớn phức tạp khi có mặt của ion Ca2+ nhưng ion Ca2+ không quyết định khả năng

liên kết giữa galectin và đường Galectins được cho là tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý khác nhau như sự phát triển, hình thái học, miễn dịch [24]

Lectin dạng I: là một thuật ngữ được đề xuất vào năm 1995 để mô tả một trong

IgSF có khả năng liên kết với các oligosaccharides (immunoglobulin superfamily: bao gồm những protein của bề mặt tế bào và những protein hòa tan có liên quan đến sự nhận diện, gắn kết, hoặc quá trình bám dính của tế bào) Hiện nay, thuật ngữ lectin dạng I được mô tả là những lectin có khả năng nhận diện và liên kết đặc hiệu với acid

sialic [23]

Lectin dạng P: được phân biệt với các lectin dạng khác nhờ khả năng nhận

diện các gốc đường mannose được phosphoryl hóa [61]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu lectin từ động vật thân mềm biển

Trên thế giới

Các nghiên cứu về lectin từ động vật thân mềm biển nói chung bao gồm cả các loài nhuyễn thể đã được tiến hành ở nhiều quốc gia trên thế giới Kết quả một số nghiên cứu cho thấy lectin hiện diện ở khá nhiều loài Như trong nghiên cứu đánh giá

sự hiện diện của lectin 90 loài động vật không xương sống biển thu nhận tại vùng biển Philippines của Elmer-Rico E Mojica và cộng sự cho thấy: lectin hiện diện ở 59/90 loài động vật thân mềm biển sử dụng trong nghiên cứu, trong đó nhiều lectin có khả năng gây ngưng kết cùng lúc nhiều loại tế bào hồng cầu Những lectin có hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu cao có nguồn gốc từ các loài ốc nón[44]

Các nghiên cứu cũng đã đi vào xác định cấu tạo và mô tả một số đặc điểm của các lectin thu nhận được Như trong kết quả nghiên cứu của mình, Linsheng Song và cộng sự đã công bố trình tự các amino acids của lectin AiCTL-7 thu nhận từ loài sò

điệp Argopecten irradians Trọng lượng phân tử của lectin này cũng đã được xác định

trong khoảng 35 kDa, bao gồm một trung tâm CRD Cũng trong nghiên cứu này, thành phần các amino acid cấu tạo nên vùng CRD, hay vị trí các ion Ca2+ cũng được chỉ rõ

[39] Trong một nghiên cứu khác, lectin CGL từ loài vẹm Crenomytilus grayanus đã

được thu nhận bằng các kỹ thuật tách chiết và sắc ký cột, trọng lượng phân tử của lectin này cũng đã được xác định vào khoảng 18 kDa, lectin này ở dạng glycoprotein với hàm lượng carbohydrate tổng chiếm 1,3%, lectin bao gồm 115 amino acid với

thành phần và tỉ lệ các amino acid cũng được xác định [19] Bằng việc phối hợp các kỹ thuật tách chiết, tinh chế, các phương pháp phân tích, lectin từ nhiều loài động vật thân mềm biển khác cũng đã được thu nhận và mô tả như lectin PPL ở loài 2 mảnh vỏ

Pteria penguin [47] lectin AGL-IA, AGL-IB, AGL-III và AGL-IV từ loài Anadara

granosa [15], lectin MCL-4 từ loài nghêu Ruditapes philippinarum [58].

Hoạt tính sinh học của nhiều loại lectin từ động vật thân mềm biển cũng đã được chứng minh như hoạt tính kháng một số chủng vi khuẩn gây bệnh (lectin PPL, lectin

CGL…), hoạt tính kháng ung thư (lectin từ loài Crenomytilus grayanus [41] Một

trong những nghiên cứu gần đây nhất về hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư

máu của lectin từ loài M galloprovincialis (MytiLec) một lần nữa cho thấy tiềm năng

của lectin từ sinh vật biển trong lĩnh vực y dược [29]

Ở Việt Nam

Các nghiên cứu về lectin ở động vật thân mềm biển tại Việt Nam bắt đầu từ những năm 1980 trong các nghiên cứu hợp tác quốc tế giữa trường Đại học Tổng hợp Paris IV (Cộng hoà Pháp) và trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội (ĐHQGHN) Một trong những nghiên cứu đi đầu có thể kể đến là nghiên cứu của Cao Phương Dung

và cộng sự (1991) khi tiến hành điều tra sự hiện diện của lectin ở các loài nhuyễn thể tại vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa [11] Tiếp sau đó, nhiều nghiên cứu khác cũng

đã được tiến hành như nghiên cứu Nguyễn Diệu Thuý và cộng sự (1995) đã chỉ ra có khoảng 31% loài nhuyễn thể Việt Nam có hoạt tính lectin [1], hay 75% loài nhuyễn thể thu nhận tại vùng biển Thừa Thiên Huế cũng thể hiện sự hiện diện của lectin trong kết quả nghiên cứu của Cao Đăng Nguyên và Nguyễn Quốc Khang (1998) [28]

Tuy nhiên, các nghiên cứu về lectin từ động vật thân mềm biển tại Việt Nam chủ yếu là sàng lọc đánh giá sự hiện diện của lectin Trong khi đó, số lượng các nghiên cứu về các lectin cụ thể còn rất hạn chế, chỉ tập trung ở một số nghiên cứu của tác giả

Cao Phương Dung và cộng sự về lectin từ loài trai tượng Tridacna squamosa [3], tai nghé (Tridacna crocea), trai tai tượng (Tridacna elongata) và điệp ngọc (Pinctada

margaritifera [4], hay nghiên cứu của Nguyễn Quốc Khang và cộng sự về lectin từ

sam biển Tachypleus tridentatu, lectin từ Trìa mỡ (Meretrix Meretrix Linne) [2],[13]

Một vài nghiên cứu khác về lectin

Hướng nghiên cứu ứng dụng của các loại lectin đang được các nhà khoa học Việt Nam chú ý trong những năm gần đây, chủ yếu tập trung vào các lectin ứng dụng trong y học, hỗ trợ điều trị các căn bệnh khác nhau và cũng đã có một số kết quả đáng quan tâm Các nghiên cứu về lectin tại Việt Nam cũng đã đi vào đánh giá khả năng ứng dụng lectin vào các lĩnh vực, chủ yếu là y sinh Chẳng hạn như năm 1989, Nguyễn Quốc Khang sử dụng lectin trong chẩn đoán thai sớm, 7 năm sau được ứng dụng rộng rãi [6] Đỗ Ngọc Liên và Nguyễn Lệ Phi (1992) sử dụng lectin từ mít tố nữ

(Artocarpus champeden) để tinh chế IgAi trong huyết thanh của người [7] Năm 1994,

Đỗ Ngọc liên sử dụng lectin hạt Chay để chẩn đoán miễn dịch ký sinh trùng

Schistosoma mamsoni [8] Năm 1999, Cao Đăng Nguyên và Bùi Thái Hằng khi nghiên

cứu lectin Trìa mỡ (Meretrix meretrix) thấy rằng lectin này phản ứng với nhiều protein

có nguồn gốc khác nhau, đặc biệt với các protein có ý nghĩa trong y học như: foetoprotein, a-interferon và IgG[2].Năm 2003, các tác giả Đỗ ngọc Liên và Trần Thị Phương Liên đã nghiên cứu đáp ứng miễn dịch kháng thể IgA1và IgG trong huyết thanh bệnh nhân ưng thư gan và bệnh bạch cầu cấp (ung thư máu) bằng phương pháp ELISA-LECTIN [8].Năm 2006, tác giả Nguyễn Hạnh Phúc cho thấy vai trò của lectin

α-từ sam biển Tachypteus tridentatus sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học Năm

2008, tác giả Trần Thị Phương Liên đã sử dụng lectin để xác định kháng thể và kháng nguyên của một số bệnh ung thư thường gặp

Tại Nha Trang từ năm 2008 đến nay cũng đã có các công trình nghiên cứu về lectin từ rong biển được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Các nghiên cứu đã khảo sát trên hơn 80 loài rong biển khác nhau, thuộc 3 dòng: rong đỏ, rong nâu và rong xanh Kết quả cho thấy, lectin hiện diện ở hầu hết các loài rong biển và có khả năng gây ngưng kết với ít nhất một trong số 4 loại hồng cầu động vật sử dụng trong các nghiên cứu là thỏ, cừu, gà, ngựa và 3 nhóm máu người A, B, O Những lectin có hoạt tính cao từ rong biển cũng đã và đang được nghiên cứu sâu về trình tự acid amin, các đặc điểm hóa lý và các hoạt tính sinh học

1.5 Phương pháp thu nhận lectin

1.5.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin

Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết

xuất lectin ra khỏi mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,85%, dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl, ethanol…

1.5.2 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị 1, anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2O4, Na2SO4… Các protein khác nhau được kết tủa ở những nồng độ bão hòa khác nhau của các muối trung tính Người ta sử dụng kỹ thuật này trong các quy trình nghiên cứu protein với mục đích cô đặc dung dịch

protein cần thu nhận

1.5.3 Kết tủa phân đoạn bằng dung môi

Một số dung môi hữu cơ có thể dễ dàng hòa tan trong nước như : acetone, polyethylene glycol, ethanol…làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể kết tủa nhanh chóng Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất dễ gây biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp

1.5.4 Thẩm tách

Phương pháp thẩm tách được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn hơn kích thước màng bán thấm Trong phương pháp này, màng bán thấm ở dạng túi chứa chất cần thẩm tách đặt trong môi trường có pH nhất định, các phân tử nhỏ trong túi sẽ khuếch tán ra môi trường ngoài nhờ tác động của máy khuấy từ Thẩm tách thường dùng để loại muối và những chất có phân tử nhỏ ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tách

1.5.5 Các kỹ thuật tinh sạch bằng sắc ký

Sắc kí lọc gel

Hệ thống sắc ký lọc gel gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng lưới (rây) & lỗ rây Kích thước của các lỗ rây này là khác nhau tùy theo loại gel sử dụng, còn pha chuyển động là đệm hay một loại dung môi thích hợp Các chất khi đi qua hệ thống lọc gel sẽ được phân tách theo nguyên tắc: các phân tử có kích thước to hơn lỗ rỗng (lỗ rây) không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng sẽ đi len qua phần kẻ hở giữa các hạt gel và nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột Các phân

tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng, sẽ toàn phần hoặc bán phần lọt vào lỗ rỗng, cuối cùng theo dòng chảy đi ra khỏi cột

Các gel hay dùng trong sắc ký lọc gel là các dẫn xuất dextran (sephadex), agarose (sepharose, superose) hay polyacrylamide (bio-gel) hay dạng kết hợp giữa dextran và polyacrylamide (sephacryl, bio-gel)

Sắc kí trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích Tùy thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm Lợi dụng tính chất này người

ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh sạch lectin Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi anion Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi cation Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh sạch lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu: lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus

 Địa điểm thu mẫu: vùng biển Khánh Hòa

 Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Sinh học Biển, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, số 02 - Hùng Vương, thành phố Nha Trang, tỉnh

Khánh Hòa

 Thời gian nghiên cứu: Tháng 2/2018 đến tháng 6/2018

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

Vật liệu

Hồng cầu thỏ được lấy từ Viện vaccine và sinh phẩm y tế Nha Trang

Hóa chất

 TRIS: Tris (hydroxymethyl) aminomethane electrophoresis (Sigma –Đức)

 BSA (Bovine serium albumin), Enzyme Trypsin (Sigma – USA), Enzyme Papain (Sigma –USA)

 Nhựa sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala – Thụy Điển)

 Nhựa sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala – Thụy Điển)

 Các loại đường và glycoprotein : Glucose, Mannose, D-Galactose, Xylose, Nitrophenyl-galactopyranoside, Nitrophenyl-glucopyranoside, Nitrophenyl-manopyranoside, NANA (N-acetylneuraminic acid hay Sialic acid), transferrin, fetuin, thymoglobulin, procine stomach mucin; Yeast mannan… (Merck-Đức)

 Thuốc thử Folin (Merck – Đức)

 Hóa chất phân tích các loại: NaCl, CuSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, (NH4)2SO4, NaOH, Na2CO3…

Thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

TT Thiết bị Model máy Xuất xứ

1 Máy đo quang phổ UV-Vis Spectro UV-2505/24 RS Labomed – Mỹ

2 Máy li tâm EBA 20 Hettich – Đức

3 Máy li tâm eppendorf Mikro 200 Hettich – Đức

4 Máy đo pH PHS-550 Đài Loan

5 Bể ổn nhiệt Việt Nam

6 Bể rửa siêu âm UC-20 Jeiotech – Hàn Quốc

7 Thiết bị thu phân đoạn tự

động Frac-920 GE Healthcare – Mỹ

8 Tủ ấm ON-11E Gallenkamp

9 Máy khuấy từ hình đĩa CB 162 Stuart – Anh

10 Cân phân tích CP224S Satorius – Đức

11 Bộ siêu lọc Toya-Roshi,UHP43 Nhật

12 Cột sắc ký ion 1,6 x 20 (cm) GE Healthcare,

Thụy Điển

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Quy trình nghiên cứu tổng quát lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ ốc nón đỏ Tectus conus

Giải thích quy trình

Điều kiện chiết

 Dung môi chiết

 Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

 Thời gian chiết

Muối ammonium sunfate

Lọc, ly tâm thu dịch chiết

Kết tủa dịch chiết

Ly tâm, thu tủa

Hòa tan tủa, thẩm tách

Ly tâm, thu dịch trong

Sắc ký trao đổi ion

Thu các phân đoạn có lectin,

Mẫu ốc nón đỏ T.conus được giã nhuyễn bằng chày và cối chuyên dụng trước khi

tiến hành chiết (hoặc được xay nhỏ bằng cối inox có bổ sung Nitơ lỏng)

Quá trình chiết lectin được bố trí với các yếu tố thích hợp bao gồm dung môi chiết; tỉ lệ nguyên liệu:dung môi; thời gian chiết Dịch chiết được lọc thô bằng rây, sau

đó tiếp tục ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ hoàn toàn bã, kết thúc quá trình chiết

Bổ sung muối ammonium sunfate với nồng độ bão hòa thích hợp vào dịch chiết

để kết tủa lectin Dịch tủa sau đó được ly tâm ở tốc độ 7000 vòng/phút trong 30 phút thu tủa có chứa lectin Loại bỏ dịch trong Sử dụng đệm với lượng ít nhất để hòa tan hết tủa thu được Dịch tủa sau đó được thẩm tách bằng túi thẩm tách có kích thước 10 kDa ở 4 °

C

Dịch tủa sau thẩm tách được li tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút trước khi tiến hành sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose Các phân đoạn có hoạt tính NKHC sau khi tiến hành sắc ký trao đổi ion được thu nhận, cô đặc bằng màng siêu lọc kích thước 10 kDa, thẩm tách loại muối

Lectin thu nhận được sau sắc ký trao đổi ion được mang đi khảo sát một số tính chất như đặc tính liên kết carbohydrate, hoạt tính kháng khuẩn và đánh giá ảnh hưởng một số yếu tố lên hoạt tính NKHC của lectin như pH, nhiệt độ

2.3.2 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp Ngưng kết hồng cầu

Hoạt độ lectin được xác định dựa trên phương pháp Ngưng kết hồng cầu của Hori và cộng sự [32]

Tiến hành

 Cho 25 l NaCl 0,85% vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V

 Thêm 25 l mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngưng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha loãng là 1/2n

(n: số lần pha loãng)

 Tiếp tục cho 25 l hồng cầu vào tất cả các giếng

 Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 1 giờ

Đánh giá kết quả: