Sử dụng các phương pháp khác nhau để xác định khối lượng phân tử của collagen chiết xuất từ da cá basa (pangasius bocourti)

Xác định khối lượng phân tử của collagen bằng phương pháp đo độ nhớt .... Xác định khối lượng phân tử của collagen bằng phương pháp điện di polyacrylamide với SDS .... Do đó, tôi chọ

i

LỜI CẢM ƠN

Cho phép em được gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy Cô Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tháng học tập vừa qua Những kiến thức mà thầy cô truyền đạt trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án tốt nghiệp mà còn

là hành trang quý báu cho con đường sắp thêm phần vững chắc và tự tin

Cảm ơn các Cán bộ quản lý Phòng thí nghiệm khu Công Nghệ Cao, các phòng thí nghiệm Hóa, các Khoa, Phòng Ban chức năng liên quan đã giúp đỡ, tạo điều kiện trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu

Đặc biệt hơn cả, xin cho em gửi những lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ hướng dẫn GV TS Trần Thị Hoàng Quyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ để em có thể hoàn thiện được đề tài trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập và hoàn thiện đề tài

Trong quá trình nghiên cứu cũng như làm luận văn tốt nghiệp, do trình độ lý luận cũng kinh nghiệm còn hạn chế nền không tránh gặp phải những thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý từ các Thầy Cô để giúp đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Lương Nguyễn Công Hào

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

LỜI NÓI ĐẦU 1

A TỔNG QUAN 4

I Tổng quan về collagen 4

1.1 Sơ lược về collagen 4

1.2 Các nguồn thu nhận collagen 4

1.3 Cấu trúc của collagen 6

1.3.1 Cấu trúc phân tử 6

1.3.2 Cấu trúc sợi của collagen 7

1.4 Phân loại collagen 8

1.5 Tính chất của collagen 10

1.5.1 Tính chất vật lý 10

1.5.2 Tính chất hóa học, hóa sinh 10

1.6 Ứng dụng của collagen 11

1.7 Chức năng của collagen 12

1.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất collagen 13

1.9 Tình hình nghiên cứu collagen trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.9.1 Tình hình nghiên cứu collagen trên thế giới 14

1.9.2 Tình hình nghiên cứu collagen ở Việt Nam 16

iii

II Tổng quan về cá basa 17

2.1 Sơ lược về cá basa 17

2.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh lý của cá basa 18

2.3 Các sản phẩm được chế biến từ cá basa 19

2.4 Thành phần hóa học trên da của một số loại cá da trơn 19

B Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 21

I Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 21

1.1 Hóa chất 21

1.2 Dụng cụ 21

1.3 Thiết bị 21

II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Quy trình thu nhận collagen 22

2.2.2 Xác định một số tính chất, đặc tính của collagen 26

2.2.2.1 Xác định hàm lượng ẩm trong collagen xác định theo TCVN 3700-90 27

2.2.2.2 Xác định hàm lượng khoáng trong collagen xác định theo TCVN 3700-90 27

2.2.2.3 Xác định hàm lượng lipid còn lại bằng phương pháp Folch (1957) 28

2.2.2.4 Xác định hàm lượng hydroxyproline bằng phương pháp trắc quang so màu 29

2.2.2.5 Xác định độ tinh khiết của collagen bằng quang phổ UV-Vis 30

iv

2.2.2.6 Xác định nhiệt độ biến tính của collagen bằng phương pháp đo độ

nhớt 30

2.2.3.7 Xác định cấu trúc collagen bằng kính hiển vi điện tử quét 30

2.2.3.8 Xác định thành phần nhóm chức bằng quang phổ chuyển đổi hồng ngoại 31

2.2.3.9 Xác định thành phần amino acid trong collagen bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 31

2.2.3 Xác định khối lượng phân tử của collagen 31

2.2.3.1 Xác định khối lượng phân tử của collagen bằng phương pháp đo độ nhớt 32

2.2.3.2 Xác định khối lượng phân tử collagen bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel 32

2.2.3.3 Xác định khối lượng phân tử của collagen bằng phương pháp điện di polyacrylamide với SDS 33

C KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

I Kết quả phân tích tính chất, đặc tính của collagen 34

1.1 Hàm lượng ẩm trong collagen và da cá nguyên liệu 34

1.2 Hàm lượng khoáng trong collagen và da cá nguyên liệu 34

1.3 Hàm lượng lipid còn lại trong mẫu và trong da cá nguyên liệu bằng phương pháp Folch (1957) 34

1.4 Hàm lượng hydroxyproline trong mẫu da cá nguyên liệu 35

1.5 Quang phổ UV-Vis xác định độ tinh khiết collagen 36

1.6 Nhiệt độ biến tính 37

1.7 Kết quả ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho biết cấu trúc collagen 38

v

1.8 Thành phần nhóm chức hóa học trong cấu trúc của collagen bằng quang phổ

FT-IR 40

1.9 Thành phần amino acid trong collagen thu được từ da cá basa 42

II Khối lượng phân tử của collagen 43

2.1 Khối lượng phân tử của collagen bằng phương pháp đo độ nhớt 43

2.2 Khối lượng phân tử của collagen bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel 45

2.3 Khối lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BSE Bovine Spongiform Encephalopathy

TSE Transmissible Spongiform Encephalopathies FMD Foot & Mouth Disease

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

HPLC High Performance Liquid ChromatographySDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide với SDSSEM Scanning Electron Microscope

ASC Collagen tan trong acid

PSC Collagen tan trong pepsin

ASEC Acid Soluble Enzyme Collagen

Td Nhiệt độ biến tính

FT-IR Quang phổ chuyển đổi hồng ngoại Fourier

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix) 6

Hình 1.2 Hình ảnh cấu trúc xoắn ba của collagen 7

Hình 1.3 Cấu trúc sợi của collagen 8

Hình 1.4 Ảnh cá basa 18

Hình 2.1 Quy trình thu nhận collagen 23

Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn biểu diễn độ hấp thụ theo nồng độ hydroxyproline 35

Hình 3.2 Quang phổ UV-Vis của collagen 36

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc độ nhớt tương đối theo nhiệt độ 37

Hình 3.4 Ảnh SEM của collagen thu được từ da cá basa 38

Hình 3.5 Ảnh SEM của cá biển (Thunnus obesus) 39

Hình 3.6 Ảnh SEM của cá tầm sông Amur 40

Hình 3.7 Phổ FT-IR của collagen chiết xuất từ da cá basa 41

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ nhớt riêng vào nồng độ 44

Hình 3.9 Tín hiệu thu được từ quá trình sắc ký 45

Hình 3.10 Bản điện di SDS-PAGE collagen type I từ da cá basa 46

Hình 3.11 Điện di SDS-PAGE collagen loại I từ rat-tail 47

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân bố của các amino acid trong chuỗi polypeptide [47] 7 Bảng 1.2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người 9 Bảng 3.1 Thành phần ẩm trong collagen thu được và da cá basa nguyên liệu 34 Bảng 3.2 Thành phần khoáng trong collagen thu được và da cá basa nguyên liệu 34 Bảng 3.3 Thành phần lipid còn lại trong mẫu collagen và trong da cá basa nguyên liệu 35

Bảng 3.4 Hàm lượng hydroxyproline trong da cá nguyên liệu (µg/ml) 36

Bảng 3.5 Thành phần amino acid trong collagen thu từ da cá basa 42

cá chủ yếu được xuất khẩu trực tiếp với giá rất rẻ (khoảng 2–3 triệu đồng/tấn cấp đông), còn phế liệu vụn và ruột cá chỉ làm thức ăn gia súc hoặc phân bón

Với mục đích nhằm tận dụng nguồn phế thải da cá từ quá trình phi lê cá basa để thu nhận được hợp chất có giá trị kinh tế cao, cần có một hướng nghiên cứu cụ thể để giải quyết các vấn đề được đặt ra Ngoài ra, đề tài thực hiện còn nhằm mục đích sử dụng những phương pháp mới cũng như trang thiết bị hiện đại để xác định các đặc tính

cụ thể của collagen Do đó, tôi chọn đề tài “Sử dụng các phương pháp khác nhau

xác định khối lượng phân tử collagen chiết xuất từ da cá basa (Pangasius bocourti)” với hàm lượng khoa học và ý nghĩa thực tiễn cao

II Mục tiêu đề tài

- Thu collagen tinh khiết có hiệu suất cao từ da cá basa (hiệu suất > 90 %, khoáng

2

còn lại < 1%, độ ẩm < 10%, lipid còn lại < 1%)

- Xác định được một số tính chất, đặc tính của collagen: độ tinh khiết, nhiệt độ biến tính, cấu trúc bó sợi, thành phần amino acid, thành phần các nhóm chức hóa học

và khối lượng phân tử

- Chỉ ra được ưu/nhược điểm của các phương pháp khác nhau xác định khối lượng phân tử collagen

III Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất collagen từ da cá basa (Pangasius bocourti) sử dụng acetic acid kết

hợp enzyme pepsin làm dung môi chiết và xác định hiệu suất chiết

- Nghiên cứu một số tính chất, đặc tính của collagen thu được (độ ẩm còn lại, hàm lượng khoáng còn lại, lipid còn lại; đặc trưng hấp phụ quang phổ UV-Vis và thành phần các nhóm chức hóa học (độ tinh khiết); nhiệt độ biến tính; cấu trúc bó sợi; thành phần amino acid của collagen thu từ da cá basa

- Sử dụng các phương pháp khác nhau để xác định khối lượng phân tử của collagen (xác định thông qua độ nhớt của dung dịch, sắc ký thẩm thấu gel, điện di SDS-PAGE); từ đó chỉ ra được ưu/ nhược điểm của từng phương pháp

IV Phương pháp nghiên cứu

- Chiết collagen bằng phương pháp chiết ngâm dầm sử dụng acetic acid kết hợp enzyme pepsin làm dung môi chiết

- Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy theo tiêu chuẩn TCVN

3700-90

- Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung theo tiêu chuẩn TCVN 5105:2009

- Xác định hàm lượng lipid

- Xác định hàm lượng hydroxyproline bằng phương pháp trắc quang so màu

- Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp quang phổ UV-Vis

- Xác định thành phần nhóm chức hóa học có trong cấu trúc của collagen bằng phương pháp phổ chuyển đổi hồng ngoại FT-IR

- Xác định thành phần amino acid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

3

cao (HPLC)

- Xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp: dựa vào đo độ nhớt, sắc ký thẩm thấu gel và điện di SDS-PAGE

V Đối tượng nghiên cứu

Cá basa (Pangasius bocourti) được thu mua tại siêu thị Lotte Mart Nha Trang,

phường Phương Sơn, thành phố Nha Trang Lựa chọn những con cá có kích thước gần bằng nhau khoảng 1,82,0 kg Lọc lấy da, cạo hết phần thịt một cách triệt để ra khỏi

da và bảo quản da cá basa ở -20oC Da cá được rã đông tự nhiện trước mỗi lần thí nghiệm

VI Khoa học và thực tiễn của đề tài

+ Chỉ ra được ưu/nhược điểm của các phương pháp xác định khối lượng phân tử của collagen được sử dụng trong nghiên cứu: dựa vào đo độ nhớt, sắc ký thẩm thấu gel

và điện di SDS-PAGE

- Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này chỉ ra được triển vọng chiết xuất collagen tinh sạch từ cá basa

(Pangasius bocourti) nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam Nghiên cứu cho

thấy tiềm năng tạo ra sản phẩm có giá trị kinh tế cao được chiết xuất từ các phế phẩm thủy sản sau quá trình chế biến, cụ thể ở nghiên cứu này là thu nhận collagen từ da cá basa

4

A TỔNG QUAN

I Tổng quan về collagen

1.1 Sơ lược về collagen

Collagen chiếm từ 2530% lượng protein trong toàn bộ cơ thể, đặc biệt là ở các động vật có vú (Muller & Werner, 2003) Nó có thể được tìm thấy trong da, xương, mạch máu, sụn, ngà,…[34] Collagen được hình thành chủ yếu bởi nguyên bào sợi của

mô liên kết và nhiều loại mô khác Trong mô sợi của da, gân hay dây chằng ở dạng sợi dài, chiếm từ 12% và là thành phần quan trọng của endomysium

Collagen cung cấp cho các mô liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc của nó Nó phân bố khắp nơi trong

cơ thể, từ gân nối bắp chân, gót chân cho tới giác mạc (Wolfgang Friess, U.o.E., Erlangen, Germany) [2] Trong gân và dây chằng, collagen có tác dụng truyền lực từ

cơ sang xương và tích trữ năng lượng đàn hồi Sự di chuyển nhịp nhàng, uyển chuyển

sẽ không thể thực hiện nếu thiếu những tính chất này Collagen còn là chất nền hữu cơ

có trong xương và men răng giúp chúng chống lại sự rạn nứt Nó là thành phần chính trong da, mạch máu và các cơ Collagen không chỉ có chức năng cơ học, chẳng hạn như ở giác mạc, trật tự cấu trúc của các sợi collagen tạo nên sự trong suốt Collagen được xem như là một vật liệu mang tính xây dựng Sự linh hoạt của nó là nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụ những chức năng nhất định

1.2 Các nguồn thu nhận collagen

Hiện nay, hầu hết các collagen có nguồn gốc từ da bò và lợn Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này tiềm ẩn các bệnh zoonosis như bệnh bò điên (BSE), bệnh não xốp (TSE) và bệnh lở mồm long móng (FMD),… có khả năng lây truyền từ động vật sang cho con người [30] Ngoài ra, xét về khía cạnh tôn giáo, những tín đồ theo đạo Hồi giáo hay Do Thái không chấp nhận bất kỳ sản phẩm thực phẩm liên quan từ lợn, trong khi người Hindu không tiêu thụ các sản phẩm liên quan đến bò [30] Do đó, các nhà

5

khoa học đang tập trung vào nghiên cứu để tìm ra nguồn collagen thay thế và collagen

có nguồn gốc từ cá được coi là sự thay thế tốt nhất vì tiện lợi cao của nó, không có nguy cơ lây truyền bệnh và không có rào cản tôn giáo [14] Chất thải chế biến cá (da, xương, vảy và vây,…) là nguồn nguyên liệu hứa hẹn cho việc sản xuất collagen Ở Ấn

Độ tạo ra hơn 2 triệu tấn chất thải mỗi năm từ hoạt động chế biến cá Chất thải chế biến từ cá nhiều khoảng 7085% tổng trọng lượng của đánh bắt Chúng thường được

đổ vào đất hoặc thải vào đại dương Xử lý các chất thải cũng đặt ra vấn đề môi trường cho chế biến thủy sản [30]

Việt Nam có các sản phẩm từ cá chiếm một phần lớn trong kim ngạch xuất khẩu Những năm gần đây, việc nuôi cá da trơn (cá tra, cá basa,…) rất phát triển, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long Trong quá trình chế biến cá, bên cạnh những chính phẩm dùng cho việc xuất khẩu là một khối lượng lớn các phụ phẩm như: da, xương, vây, vảy,… Đây là những nguồn giàu collagen, có thể sử dụng thay thế cho những nguồn cung cấp collagen trước kia như da, xương bò, lợn Việc sử dụng những phế phẩm từ

cá basa góp phần làm tăng giá trị kinh tế của các loài cá da trơn ở nước ta

Trong số những nguồn thay thế, cá cung cấp nguồn nguyên liệu tốt nhất vì:

- Dễ tìm, có sẵn trong tự nhiên [30]

- Không liên quan với nguy cơ bệnh bò điên (BSE) bùng phát [14]

- Collagen cá được chấp nhận đối với Hồi giáo và hạn chế tối thiểu cho Do Thái giáo [14]

- Có khả năng thu nhận được collagen với hiệu suất cao [30]

- Giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải từ quá trình chế biến cá

Cho đến nay, hầu hết các loại mỹ phẩm trên nền collagen đều có chứa protein chiết xuất từ gia súc Nhưng do sự bộc phát của các loại bệnh nên collagen từ gia súc đang dần rút khỏi phạm vi sử dụng, thay vào đó là nguồn collagen được trích từ cá, đặc biệt là cá da trơn Nguồn collagen được chiết tách từ nguồn nguyên liệu này có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứng dụng trong thực phẩm, y học và mỹ phẩm Trong

6

công nghiệp sản xuất mỹ phẩm, các loại mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc có tốc

độ hấp thụ rất chậm trên da người Nhưng nguồn collagen trích ly từ cá thì hấp thu hoàn toàn trên da người Vì cá sống trong phạm vi lớn với các điều kiện về nhiệt độ,

độ sâu và áp suất khác nhau Điều này có nghĩa là collagen trích từ da cá có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học [8]

1.3 Cấu trúc của collagen

1.3.1 Cấu trúc phân tử

Phân tử collagen (hay còn gọi là tropocollagen) là một protein trụ, dài khoảng

300 nm, đường kính khoảng 1,5 nm

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix) [46]

Phân tử protein collagen bao gồm 3 chuỗi polypeptide (gọi là chuỗi ∝) cuộn lại với nhau Mỗi chuỗi ∝ cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn Ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ ba xoắn ốc triple helix (Hình 1.1)

Mỗi chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, tạo nên tổng khối lượng phân tử của collagen khoảng 300 kDa Chuỗi ∝ được cấu tạo bởi khoảng

1000 amino acid Các chuỗi ∝ khác nhau (∝1, ∝2 và ∝3) ở thành phần amino acid Sự phân bố của các chuỗi ∝1, ∝2 và ∝3 trong các phân tử collagen khác nhau tùy thuộc vào sự khác nhau về gene

7

Hình 1.2 Hình ảnh cấu trúc xoắn ba của collagen [42]

Collagen không chứa trytophan, giàu thành phần glycine, proline và hydroxyproline, là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine Nó chứa khoảng 33% glycine, 12% proline và 11% hydroxyproline Các amino acid sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Sự phân bố của các amino acid trong chuỗi polypeptide [47]

Gly–X–X Gly–X–I Gly–I–X Gly–I–I

0,44 0,20 0,27 0,09

Trong đó, I là amino acid (proline và hydroxyproline), X là các amino acid khác, glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid và được phân bố một cách đều đặn tại mỗi vị trí mỗi xuyên suốt trong phân tử collagen Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau thành nên một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi Ngoài ra, trong phân

tử collagen có những vùng gồm khoảng 926 amino acid tại các điểm đầu mút amino hay carbonxyl của chuỗi Các vùng này không sáp nhập với cấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide

1.3.2 Cấu trúc sợi của collagen

Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm

8

những sợi mảnh, nhỏ Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với nhau hình thành nên các vi sợi bao gồm từ 48 phân tử collagen và với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi Những sợi này có đường kính từ 10500 nm tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển Các sợi collagen sẽ thiết lập nên các sợi lớn hơn hay cao hơn nữa là các bó sợi [43]

Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh của các phân tử collagen Các

vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn Các sợi lớn hơn sẽ kết hợp với nhau tạo thành những

bó sợi collagen Các sợi collagen được sắp xếp với những cách thức kết hợp và mức

độ tập trung khác nhau để cung cấp đặc tính khác nhau của mô (Hình 1.3) [43]

Hình 1.3 Cấu trúc sợi của collagen [14]

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính chu kì nhất định Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có một khoảng trống 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau [1]

Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, tạo cho các mô có độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng biệt [43]

1.4 Phân loại collagen

Tính đến thời điểm hiện nay, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng, chúng được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành 27 loại collagen Họ collagen được

Bảng 1.2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người

I (∝1(I))2∝2(I), trimer (∝1(I))3 Da, gân, xương, giác mạc, men

răng, sụn, mạch máu

II (∝1(II))3

III (∝1(III))3 Mạch máu, van tim, hạ bì, ruột,

nướu răng, thành tử cung

IV (∝1(IV))2∝2(IV), Màng nhầy

V

∝1(V),∝2(V), ∝3(V)hoặc (∝1(V))2∝2(V),hoặc (∝1(V))3

Giác mạc, xương mạch máu, nướu răng, sụn

VI ∝1(VI), ∝2(VI), ∝3(VI) Da, cơ tim

VII (∝1(VII))3 Da, phổi, sụn, giác mạc, nhau

IX ∝1(IX), ∝2(IX), ∝3(IX) Sụn

10

XI ∝1(XI), ∝2(XI), ∝3(XI) Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch

thủy tinh

Hiện tại, có ít nhất khoảng 13 loại collagen đã được trích chiết Chúng khác nhau

về chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như bản chất và kích cỡ của những phần không xoắn ốc (Wolfgang Friess, U.o.E., Erlangen, Germany) [2]

Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV [16] Những bệnh tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gene ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp, sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sinh sản collagen một cách bình thường

1.5 Tính chất của collagen

1.5.1 Tính chất vật lý

Collagen là một protein không tan trong nước, nhưng có khả năng giãn nở nhẹ

Tỉ lệ giãn nở có giới hạn co giãn khoảng 7% cho sợi ướt và 5% cho sợi khô

Ở 60oC dưới tác động của acid hay kiềm hoặc muối, collagen ẩm đột ngột, phồng lên, co rút khoảng 1/3 hay 1/4 chiều dài của nó Và nếu tiếp tục đun collagen sẽ tiếp tục bị thủy phân thành gelatin

1.5.2 Tính chất hóa học, hóa sinh

Collagen là chất duy nhất có thể chuyển thành gelatin khi đun sôi với nước nóng,

đó là kết quả của sự mở vòng xoắn 3 sợi kèm theo sự phá vỡ liên kết hydro Gelatone

và gelatose là sản phẩm của quá trình phân giải gelatin tiếp sau đó

Collagen là một loại protein, vì vậy, nó mang đầy đủ các tính chất mà một chuỗi polypeptide như tác dụng với acid và kiềm

Collagen bị thủy phân chậm bởi trypsin và pepsin

- Sản xuất collagen vi tinh thể: đây là một dạng của sợi collagen có thể được sản xuất từ nhiều loại khác nhau được gọi chung là collagen vi tinh thể (microcrystalline) Tuy nhiên, vì một số lý do về bản quyền nên thông tin chi tiết về sản phẩm hiện chưa được công bố

- Những ứng dụng của collagen giống như gelatin: Ba lĩnh vực chính mà collagen được sử dụng rộng rãi dưới dạng gelatin là trong công nghệ sản xuất thực phẩm (Gotthoffer, 1945; Idson và Braswell) tạo nên sự bền bọt, tham gia tạo cấu trúc, độ dai của sản phẩm,… trong nhiếp ảnh giúp ổn định giữa thành phần gắn kết và hệ nhũ tương thuốc nhuộm (Cox, 1972; Rose, 1977) Theo Idson và Braswell (1957), 65% tổng sản lượng gelatin hàng năm của Hoa Kỳ (50 triệu lb) được sử dụng cho các sản phẩm ăn được như bánh tráng miệng, kẹo marshmallows, đồ gia vị, kem, và các sản phẩm từ sữa khác, 20% được sử dụng trong nhiếp ảnh, và 10% trong dược phẩm viên nang, thuốc mỡ, mỹ phẩm, chất phủ và nhũ tương khác [12]

12

b) Ứng dụng collagen trong y học và dược phẩm

Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, tác dụng của collagen dựa trên sự kết hợp khả năng tạo màng và tạo gel một cách tự nhiên Collagen được

sử dụng lĩnh vực y dược có mùi và vị trung hòa, không gây dị ứng và được hấp thụ hoàn toàn trong cơ thể con người, có tính tương thích sinh học cũng như khả năng cầm máu nên có thể được chế tạo thành những dạng khác nhau, là một loại vật liệu sinh học lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học Collagen được ứng dụng làm chất cầm máu tạm thời, chất tạo bọt và ổn định trong quá trình sản xuất chất bọt cầm máu, chất ổn định các thành phần nhạy cảm khỏi tác động của sự oxy hóa ánh sáng, sự hấp thụ ẩm, tạo mùi vị trung hòa, là chất ổn định của hệ nhũ tương, huyền phù,…

c) Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm

Collagen có tác dụng chống lão hóa, ngăn ngừa và cải thiện nếp nhăn Khoảng 70% cấu trúc của da là collagen, phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn màng, tươi tắn và trẻ trung Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào Ngoài ra, collagen còn được bổ sung vào một số sản phẩm dưỡng tóc để phục hồi tóc [16]

1.7 Chức năng của collagen

Collagen là giá đỡ cho các mô, các cơ quan và liên kết các cấu trúc này với xương Collagen là một trong những thành phần chính cấu trúc nên da, đặc trưng cho sự khỏe mạnh và độ bền của da, thể hiện qua sự trơn láng, đầy đặn của da khi còn trẻ Cấu trúc độc nhất này đã làm cho collagen có sức căng mạnh hơn cả thép Sự mất cấu trúc 3-D cũng có nghĩa là mất đi sự giúp đỡ của khung sườn của da

Collagen này có nhiều trong các mô liên kết ở da cá Tương tự như sợi collagen trong động vật có vú, các sợi collagen ở các mô của cá cũng tạo nên cấu trúc mạng lưới mỏng với mức độ phức tạp khác nhau Tuy nhiên, collagen ở cá kém bền nhiệt hơn nhiều và ít có các liên kết chéo hơn nhưng nhạy cảm hơn collagen ở động vật máu

13

nóng có xương sống (Phan Thị Thanh Quế, 2005) [3]

Collagen là loại protein phổ biến nhất trong cơ thể (chiếm khoảng ¼ tổng lượng protein), thành phần chính của mô liên kết và là một trong các thành phần chính của

da, cơ vân, sụn, dây chằng, gân, xương và răng; đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các mô trong cơ thể và củng cố thành mạch, tồn tại trong các giác mạc và thủy tinh thể của mắt dưới dạng kết tinh Lớp bì, lớp đệm trong cùng của da chứa rất nhiều collagen, mà chính các sợi collagen này tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm,…

1.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất collagen

a) Ảnh hưởng của pH

Độ tan của collagen thấp nhất ở pH = pI, độ tan của collagen tăng lên khi pH nằm

xa vị trí này, vì khi pH = pI thì phân tử collagen không tích điện nên chúng không có lực đẩy tĩnh điện và dễ bị đông kết Vì thế, khi pH nằm lệch khỏi vị trí này thì các phân tử collagen sẽ tích điện cùng dấu và đẩy nhau cho nên không bị đông kết, do đó

độ tan tăng lên [7]

b) Ảnh hưởng của nồng độ muối

Muối trung tính ở nồng độ thấp làm tăng độ tan của collagen Khi tăng nồng độ muối tới một giới hạn nhất định thì độ tan của collagen giảm xuống và nếu nồng độ muối tiếp tục tăng lên thì collagen có thể đông kết hoàn toàn [4]

c) Ảnh hưởng của dung môi

Khi cho các dung môi như cồn, benzene, acetone, chloroform, vào dung dịch collagen thì độ tan của collagen bị giảm và có thể dẫn đến đông kết do phá vỡ lớp vỏ thủy hóa [2]

d) Ảnh hưởng của không khí

Ở các độ tuổi khác nhau, trong cơ thể sống hay trong quá trình thí nghiệm, không khí đóng một vai trò quan trọng trong sự thay đổi cấu trúc hóa học của collagen (Sobel

14

và Hansen, 1989) [21] Sự oxy hóa sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử của các protein, nguyên nhân là do sự thay đổi về mặt hóa học và các liên kết của vài amino acid đã vượt quá thời gian [5]

e) Ảnh hưởng của nước

Nước ảnh hưởng đến collagen theo những con đường khác Nó giữ vai trò trực tiếp trong các biến đổi hóa học của collagen thông qua sự thủy phân, sự hydrate hóa của các gốc tự do, sự ổn định của các liên kết hydro và tỷ lệ của sự tạo thành gelatin [2]

f) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hướng rất lớn đến cấu trúc của collagen Cấu trúc dạng sợi của collagen tồn tại ổn định ở nhiệt độ thấp và bị chuyển thành gelatin ở nhiệt độ cao Bên cạnh đó, theo một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy collagen tồn tại không ổn định ngay cả khi ở nhiệt độ phòng, protein này cũng có thể bị biến tính ngay cả khi đang bên trong cơ thể sinh vật ở điều kiện sinh lý bình thường [23] Do đó, hàm lượng collagen trong cơ thể sinh vật phụ thuộc khá nhiều vào môi trường sống của sinh vật

đó

1.9 Tình hình nghiên cứu collagen trên thế giới và ở Việt Nam

1.9.1 Tình hình nghiên cứu collagen trên thế giới

Wang L và cộng sự (2007) tách chiết và tính chất của collagen từ da cá đỏ sống

ở vùng biển sâu (Sebastes mentella) Nguyên liệu sau khi được băm nhỏ, đem đi xử lý

với dung dịch NaCl trong 24 giờ để lọai bỏ những thành phần không cần thiết, khuấy liên tục và đồng hóa trong 2 phút Kế đến, da sau khi xử lý được rửa sạch bằng nước cất và đông khô để tách chiết collagen Collagen hòa tan trong acid (ASC) được chiết xuất bằng actetic acid với tỉ lệ 1:100 (w/v) trong 24 giờ, khuấy đảo liên tục Dịch chiết được thu nhận bằng bằng phương pháp ly tâm tại 20000 rpm trong 1 giờ, phần bã được tái chiết xuất trong cùng điều kiện Phần dịch nổi được kết tủa bằng cách thêm NaCl Kết tủa sau đó được thu bằng cách ly tâm dịch tại 2500 rpm trong 0,5 giờ và hòa tan

da cá và các triển vọng ứng dụng thương mại cao được xem như một lựa chọn thay thế tốt cho nguồn nguyên liệu truyền thống từ động vật có vú [36]

Zhang F và cộng sự (2011) bào chế và xác định đặc tính của collagen thu được

từ vảy cá nước ngọt Quá trình chiết tách được tiến hành trong 2 ngày với dung môi được sử dụng là acetic acid Dịch chiết sau đó được thu bằng cách ly tâm với tốc độ

10000 rpm trong 30 phút Phần bã được tái tách chiết với cùng dung môi trong 1 ngày

và thu dịch bằng cách ly tâm với cùng điều kiện Dịch chiết sau đó được bổ sung NaCl Collagen kết tủa được phân lập bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 10000 rpm trong 30 phút và được hòa tan trở lại trong acetic acid và kết tủa bằng NaCl để tiến hành quá trình thẩm tích tinh sạch Quá trình tinh sạch sử dụng dung môi là nước cất, sau khi kết thúc tiến hành đông khô nhằm bảo quản mẫu Quá trình chiết xuất collagen với enzyme hỗ trợ được tiến hành tương tự, dung môi được sử dụng là acetic acid với enzyme pepsin (Sigma p7000) trong 72 giờ với cùng điều kiện Ở nghiên cứu này, phương pháp điện di SDS-PAGE được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của

16

collagen Quá trình điện di SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli

sử dụng gel gom 5% và gel phân tách 7,5% Mẫu được hòa tan trong đệm Tris-HCl 0,6 M (pH = 6,8) chứa glycerin 25% (v/v), SDS 2% (w/v), β-mercaptoethanol 5% (v/v)

và Bromophenol Blue 0,1% (w/v) Sản phẩm thu được có thành phần amino acid cao, nhưng có nhiết độ biến tính thấp hơn collagen thu từ da lợn Từ kết quả chụp X-Ray

và điện di SDS-PAGE cũng cho thấy cấu cúc mạch ba xoắn ốc [40]

1.9.2 Tình hình nghiên cứu collagen ở Việt Nam

Trần Thị Huyền và cộng sự (2011) thu nhận collagen từ da cá tra bằng phương pháp hóa học Nguyên liệu da cá tra được rửa sạch, cắt miếng rồi đem xử lý kiềm để loại béo với nồng độ NaOH 0,2 M; tỷ lệ 1/10 (w/v) trong 20 giờ Sau khi xử lý kiềm phải rửa sạch bằng nước cất để đưa về môi trường trung tính Bước tiếp theo khử khoáng bằng citric acid nồng độ 0,003 M; tỉ lệ 1/8 (w/v) trong 30 phút Da cá sau khi

xử lý citric acid được rửa lại bằng nước thường rồi đem xử lý H2O2 để tẩy màu cho nguyên liệu nhằm mục đích sản phẩm collagen thu được có màu sáng hơn Để chiết collagen sử dụng acetic acid 0,5 M; tỷ lệ 1/10 (w/v) Thu kết tủa sau quá trình chiết với NaCl Tinh sạch collagen, thẩm tích trong dung môi Na2HPO4 0,02 M trong thời gian 36 giờ, thay dung môi 4 giờ một lần Cuối cùng đem sản phẩm sấy khô, bao gói

và bảo quản lạnh đến khi sử dụng Collagen thu được có các thành phần hóa học và một số tính chất đặc trưng phù hợp với các tính chất của collagen thu nhận từ thủy sản Quá trình xác định khối lượng phân tử được tiến hành bằng phương pháp điện di của Weber và Osborn (1969) Kết quả phân tích điện di để xác định khối lượng phân tử của collagen thu được cho thấy trong sản phẩm collagen thu được có 4 loại protein có các khối lượng phân tử lần lượt là 217 kDa, 185 kDa, 156 kDa và 104 kDa Quy trình thu nhận collagen cụ thể, khảo sát đầy đủ các điều kiện để chọn được nồng độ, tỷ lệ

và thời gian tối ưu Tuy nhiên, hiệu suất chiết collagen chỉ sử dụng acetic acid còn thấp, hàm lượng khoáng vẫn còn hơi cao [4]

Le Thi Thu Huong và cộng sự (2014) chiết xuất và tinh sạch collagen từ da cá

basa Da cá nguyên liệu sau khi được rã đông, rửa sạch để ráo nước sẽ được ngâm vào LASNa (Sodium Linear Alkyl Benzene Sulphonate) 0,5% trong 6 giờ Sau đó, toàn bộ

17

nguyên liệu được ngâm trong H2O2 1% và trong NaOH 0,05 N trong 2 giờ để loại bỏ lipid, khoáng, màu và mùi của nguyên liệu đầu vào Tiếp đến, cắt nhỏ nguyên liệu thành miếng nhỏ Quá trình chiết được tiến hành bằng dung dịch acetic acid 0,75 M (w/v = 1/50) trong 24 giờ tại 3oC Thu dịch lọc và thêm NaCl đến nồng độ cuối cùng

là 0,9 M Thẩm tích để tinh sạch collagen thu được Khối lượng phân tử của collagen thành phần được tiến hành bằng phương pháp điện di với hệ đệm là SDS 1%; Tris 0,025 M và glycine 0,192 M Gel phân tách được sử dụng là 7% và gel gom 5% Sau khi quá trình điện di kết thúc, gel sẽ được nhuộm màu bằng Coomassive Blue R-

250 0,05% (w/v) trong methanol 15% (v/v) và acetic acid 5 % (v/v) Cuối cùng, gel được ngâm trong methanol 30% (v/v) và acetic acid 10% (v/v) để tẩy màu Marker so sánh chạy từ 75 kDa đến 250 kDa Kết quả thu được ba chuỗi bao gồm chuỗi β (250 kDa) và hai chuỗi α (α1  130 kDa và α2  140 kDa) Collagen có nguồn gốc từ cá có tác dụng với da tốt hơn so với collagen từ da cầm [19]

Như vậy, có thể nhận thấy rằng hầu hết các nghiên cứu của cả trong và ngoài nước đều xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp điện di Vì thế, nghiên cứu này có ý nghĩa cao khi cung cấp thêm thông tin về phương pháp, kết quả và chỉ ra ưu nhược điểm của ba phương pháp khác nhau (phương pháp dựa vào độ nhớt, phương pháp sắc kí thẩm thấu gel và điện di SDS-PAGE) để xác định khối lượng phân tử collagen từ da cá basa

II Tổng quan về cá basa

2.1 Sơ lược về cá basa

Cá basa, tên khoa học Pangasius bocourti, còn có tên gọi là cá giáo, cá sát bụng,

là loại cá da trơn trong họ Pangasiidae có giá trị kinh tế cao Loài cá này là thực phẩm

quan trọng ở thị trường quốc tế Chúng thường được gắn nhãn ở Bắc Mỹ và Úc với tên

là "cá basa" hay "Pangasius bocourti" Cá basa được nuôi tập trung tại nhiều nước trên

thế giới như khu vực sông Chao Phraya của Thái Lan,… Ở Việt Nam, cá basa được nuôi để xuất khẩu với số lượng lớn chủ yếu ở Đồng bằng sông Cửu Long Trong tự nhiên, cá sống thường sống chủ yếu ở những sông rộng nước chảy mạnh

Có 4046 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 3136 tia vây Răng vòm miệng với dải răng trên xương khẩu cái ở giữa và răng trên xương lá mía ở 2 bên Chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn Mặt lưng có màu nâu, mặt bụng

có màu trắng [41]

2.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh lý của cá basa

Ở cá basa, thời kỳ cá giống cũng lớn khá nhanh, sau 60 ngày cá đạt chiều dài

810,5 cm, sau 78 tháng đạt thể trọng 400550 g, sau 1 năm đạt 7001300 g Nghiên cứu về tăng trưởng cá basa cho thấy trong 2 năm đầu tiên cá tăng trưởng nhanh về chiều dài thân, càng về sau tốc độ này giảm dần Khi đạt đến một kích thước nhất định thì chiều dài thân hầu như ngừng tăng Ngược lại, trong 2 năm đầu tốc độ tăng trưởng

về thể trọng chậm nhưng tăng dần về sau Nuôi trong bè sau 2 năm có thể đạt tới

 Họ : Pangasiidae

 Giống: Pangasiidae

 Loài : P.bocourti

19

2500 g Trong tự nhiên đã gặp cỡ cá có chiều dài thân 0,5 m

Cá basa có tính ăn tạp thiên về thức ăn động vật, nhưng ít háu ăn và ít tranh mồi hơn cá tra Sau khi hết noãn hoàn, giai đoạn này cá ăn phù du động vật là chính Khi

cá ở giai đoạn lớn, cá basa cũng dễ dành thích nghi với các loại thức ăn từ động vật, thực vật, dễ kiếm như: hỗn hợp tấm, cám, rau quả, cá vụn và các phế phẩm nông nghiệp,… do đó rất thuận lợi cho việc nuôi cá trong bè [43]

2.3 Các sản phẩm được chế biến từ cá basa

Nguồn cá basa trong tự nhiên không thể đủ cung cấp cho chế biến công nghiệp

mà chủ yếu được nuôi trong lồng bè Ngoài sử dụng ít trong thực phẩm ăn uống thì cá basa chủ yếu phục vụ cho công nghiệp

Trong công nghiệp, cá basa thường được chế biến dưới dạng phi lê đông lạnh chủ yếu để phục vụ cho thị trường xuất khẩu Hiện nay tình thị trường xuất khẩu cá basa vẫn chưa được ổn định nên cần điều chỉnh lại mục tiêu để ổn định ngành nghề và phát triển nghề nuôi cá này của Việt Nam [43]

Mỗi năm, sản lượng cá tra và cá basa có tổng sản lượng thịt cá xuất khẩu đạt hơn 30.000 tấn/năm, nhưng da cá lại được xuất khẩu trực tiếp với giá rẻ (khoảng 23 triệu đồng/tấn cấp đông), còn phế liệu vụn và ruột cá chỉ làm thức ăn da súc hoặc phân bón [43]

2.4 Thành phần hóa họ c trên da của một số loại cá da trơn

Da cá thông thường chứa hàm lượng collagen đạt từ 14–25%, tượng tự hàm lượng collagen chứa trong da của các loài động vật máu nóng Vì vậy, đây có thể được xem

là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất hợp chất tự nhiên có dược tính cao này, collagen được chiết xuất với các đặc tính bề mặt và đặt tính tạo gel cho thấy triển vọng ứng dụng cao (Gómez-Guillén, 2011) [34]

Độ ẩm trong da cá tra cao hơn rất nhiều so với các loài cá khác cùng chủng loại; lượng khoáng chất trong thành phần lại rất ít (dưới 1%) giúp việc loại bỏ tạp chất không mong muốn đơn giản hơn và an toàn khi sử dụng Hàm lượng protein của cá tra thấp hơn đôi chút so với các loại còn lại (Hình 1.3), tuy nhiên, nhờ vào số lượng nguyên

20

liệu tương đối lớn có thể bù đắp được vấn đề này

Nguồn cung cá tra, cá basa trên thị trường hầu như đều đến từ các ao hồ chăn nuôi, vì thế, thành phần lipid chứa trong da của cá tra, cá basa nói riêng hay một số loại cá da trơn nước ngọt khác nói chung thường cao hơn rất nhiều so với các loại cá cùng bộ sống ở biển

21

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

1.1 Hóa chất

- NaOH (Xilong, Trung Quốc)

- NaCl (Xilong, Trung Quốc)

- Acid citric (Merck, Đức)

- H2O2 (Xilong, Trung Quốc)

- Acetic acid (Xilong, Trung Quốc)

- Pepsin (Sigma Aldrich, Mỹ)

- Hóa chất tạo gel: Acrylamide (FW 71,08) (Sigma Aldrich, Mỹ), acrylamide (FW 154,2) (Sigma Aldrich, Mỹ), Tris-base (Sigma Aldrich, Mỹ), HCl đậm đặc (Xilong, Trung Quốc), SDS (Sigma Aldrich, Mỹ), ammonium persulfate (Xilong, Trung Quốc), glycerol (Xilong, Trung Quốc), dithiothreitol (DTT) (FW 154,2) (Sigma Aldrich, Mỹ), Bromophenol Blue (Sigma Aldrich,

Bis-Mỹ), TEMED (Sigma Aldrich, Mỹ).

- Hóa chất nhuộm gel và rửa gel: Coomassie Brilliant Blue G-250

(Thermofisher, Mỹ), methanol (Xilong, Trung Quốc)

- Thuốc thử Bradford: Coomassive Brilliant Blue G-250 (Thermofisher,

Mỹ), ethanol 96% (Xilong, Trung Quốc), H3PO4 (Xilong, Trung Quốc)

1.2 Dụng cụ

- Bình tam giác (Duran, Đức)

- Pipet 10 ml, 5 ml (Hangzhou Sumer, Trung Quốc)

- Đĩa petri (Boeco, Đức)

- Bình định mức 1000 ml, 500 ml (Hangzhou Sumer, Trung Quốc)

22

- Máy khuấy từ (Velp scientifica, Đức)

- Tủ nung (Nabertherm, Đức)

- Máy ly tâm lạnh (Mikro 220r, Đức)

- Máy đông khô chân không (Labconco, Mỹ)

- Máy đồng hóa (Ika t25 digital ultra, Đức)

- Kính hiển vi điện tử quét (SEM, Hitachi S-4800, Nhật)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, Agilent 1200 Series coupled to

MS detector, micrOTOF-QII Bruker, Mỹ)

- Bộ dụng cụ điện di Mini Protein II (Bio- Rad Laboratories, Inc.,

Richmond, CA, Mỹ)

- Máy đo quang phổ FT-IR (Bruker, Đức)

- Quang phổ kế UV-Vis CARY50 (Varian, Úc)

II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá basa đươc mua ở siêu thị Lotte Mart Nha Trang, phường Phương Sơn, Nha Trang Lựa chọn những con có kích thước gần bằng nhau, khối lượng khoảng 1,8–2,0 kg Lọc lấy da, loại triệt để phần thịt còn sót lại trên da rồi bảo quản da ở -20oC Trước mỗi lần thí nghiệm tiến hành rã đông nguyên liệu tự nhiên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình thu nhận collagen

24

 Thuyết minh quy trình

a) Xử lý nguyên liệu

Da cá sau phi lê được bảo quản đông, trước mỗi lần thực hiện thu collagen được

rã đông tự nhiên và xử lý như sau:

- Cạo bỏ phần thịt và mỡ thừa còn sót lại trên da

- Rửa lại bằng nước sạch nhiều lần để loại bỏ máu và các tạp chất bẩn khác

- Cân 100 g da cá, cắt nhỏ (1x1cm)

b) Quá trình khử béo

Mục đích: nhằm loại mỡ, các tạp chất, máu, một phần mùi tanh, chất nhờn

Ngoài ra, quá trình này cũng giúp cắt đứt các liên kết hydro của collagen Và các mạch này trở nên lỏng lẻo, tạo điều kiện cho quá trình chiết collagen được dễ dàng, hiệu suất thu hồi collagen cao

Tiến hành: Nguyên liệu sau khi xử lý được cho vào ngâm trong dung dịch

NaOH Quá trình khử béo cần kết hợp cùng khuấy từ nhằm để tăng hiệu suất khử Sau khi quá tình ngâm kết thúc thúc tiến hành rửa da cá sau khử béo bằng nước cất nhiều lần để đưa về pH trung tính (pH = 7,0), có thể sử dụng khuấy từ để tăng hiệu suất rửa được nhanh chóng và triệt để hơn

c) Quá trình loại khoáng

Mục đích: loại bỏ khoáng chất không cần thiết và NaOH dư ở quá trình trước

đó nhằm tăng độ tinh khiết của collagen thành phẩm thu được

Tiến hành: Nguyện liệu sau khi đã rửa giải để về pH trung tính được cho vào

dung dịch citric acid trong 30 phút để loại khoáng

d) Quá trình khử màu, khử mùi

Mục đích: làm trắng nguyên liệu, khử mùi và loại bỏ một phần béo

Tiến hành: Sau quá trình khử khoáng, nguyên liệu được cho tiếp tục vào cốc để

tiến hành ngâm trong dụng dịch H2O2 trong 3 giờ Quá trình này không nên tiến hành quá lâu vì khả năng oxy hóa mạnh của H2O2 sẽ làm cắt mạch protein, ảnh hưởng không