Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất phenolics và khả năng chống oxy hóa từ vỏ quả cacao

TÓM TẮT Mục đích của nghiên cứu này là để tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng nhằm thu được hàm lượng hợp chất phenolics cao nhất và khả năng chống ôxy hóa tốt nhất từ vỏ quả c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY HỖ TRỢ VI SÓNG CHO HỢP CHẤT PHENOLICS VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG

ÔXY HÓA TỪ VỎ QUẢ CACAO

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Tặng

ThS Trần Văn Vương Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Diệu

Mã số sinh viên: 56136200

Khánh Hòa - 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Khoa/viện: Công nghệ Thực phẩm

PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP

(Dùng cho CBHD và nộp cùng báo cáo ĐA/KLTN của sinh viên)

Tên đề tài: Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất

phenolics và khả năng chống ôxy hóa từ vỏ quả cacao

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Tặng

ThS Trần Văn Vương Sinh viên được hướng dẫn: Phạm Thị Diệu MSSV: 56136200

Khóa: 56 Ngành: Công nghệ Thực phẩm

Nhận xét chung (sau khi sinh viên hoàn thành ĐA/KL): ………

……….……

………

………

……….……

………

Điểm hình thức:……/10 Điểm nội dung: /10

Điểm tổng kết:………/10

Đồng ý cho sinh viên: Được bảo vệ: Không được bảo vệ: Khánh Hòa, ngày…….tháng…….năm………

Cán bộ hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) Lần KT Ngày Nội dung Nhận xét của GVHD 1 2 3 4 Kiểm tra giữa tiến độ của Trưởng BM Ngày kiềm tra: ……… ………

Đánh giá công việc hoàn thành:……%:

Được tiếp tục: Không tiếp tục: Ký tên ……

8

9

10

LỜI CAM ĐOAN

Nơi đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Tặng

ThS Trần Văn Vương Tên đồ án tốt nghiệp:

“Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng cho hợp chất phenolics và khả năng chống ôxy hóa từ vỏ quả cacao.”

Nội dung cam đoan:

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của thầy TS Nguyễn Văn Tặng và giúp đỡ của tập thể cán bộ Trung tâm TN-

TH, Trường Đại học Nha Trang Các số liệu và kết quả nêu trong đồ án là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố Các thông tin tham khảo đã được trích dẫn đầy đủ

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Khánh Hòa, ngày 10 tháng 07 năm 2018

Sinh viên

Phạm Thị Diệu

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể cán bộ trong các phòng thí nghiệm - Trung tâm Thực hành Thí nghiệm - Trường Đại học Nha Trang, các bạn, anh chị cùng làm đề tài đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Văn Tặng và thầy ThS Trần Văn Vương đã dành nhiều thời gian, công sức, sự tận tụy, tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để em vượt qua mọi khó khăn trong quá trình để hoàn thành tốt đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Phạm Thị Diệu

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là để tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng nhằm thu được hàm lượng hợp chất phenolics cao nhất và khả năng chống ôxy hóa tốt nhất từ vỏ quả cacao

Trong nghiên cứu này, dung môi phù hợp được đề xuất sử dụng cho việc dịch chiết phenolics từ vỏ quả cacao là nước

Điều kiện tối ưu để chiết phenolics từ vỏ quả cacao gồm: công suất vi sóng X1 = 600W, thời gian bức xạ X2 = 5 s/phút, thời gian trích ly X3= 30 phút, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu X4 = 50 mL/g

Ở điều kiện trên thì hàm lượng phenolics tổng số thu được là 10.97 (mg GAE/g mẫu khô), hiệu suất trích ly phenolics là 76.82%, hàm lượng saponin tổng số là 7.09 (mg EE/g mẫu khô) và khả năng quét gốc tự do DPPH là 121.49 (mg DPPH/g mẫu khô)

MỤC LỤC

Đề mục Trang

LỜI CAM ĐOAN i

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH VẼ vi

DANH SÁCH BẢNG BIỂU viii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cây cacao 3

1.1.1 Đặc điểm và phân bố sinh thái của cây cacao 3

1.1.2 Thành phần hóa học vỏ quả cacao 5

1.2 Giới thiệu về hoạt chất sinh học 6

1.2.1 Hợp chất phenolics 6

1.2.2 Hợp chất saponins 7

1.3 Quá trình ôxy hóa và chống ôxy hóa 7

1.3.1 Quá trình ôxy hóa 7

1.3.2 Chống ôxy hóa 8

1.3.3 Một số phương pháp phân tích đánh giá hoạt tính chống ôxy hóa 9

a Phương pháp xác định trực tiếp hoạt tính chống ôxy hóa 9

b Phương pháp xác định gián tiếp hoạt tính chống ôxy hóa 9

1.4Các phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học 10

1.4.1 Phương pháp truyền thống 10

1.4.2 Phương pháp hiện đại 11

1.5Phương pháp tối ưu hóa bằng bề mặt đáp ứng RSM 11

1.5.1 Nguyên tắc 12

1.5.2 Công dụng của RSM 12

1.5.3 Ưu, nhược điểm của RSM 13

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu 14

2.2 Hóa chất 14

2.3 Thiết kế thí nghiệm tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng 14

2.4 Chuẩn bị dịch chiết 17

2.5 Bố trí thí nghiệm tổng quát 17

2.6 Các phương pháp phân tích 17

2.6.1 Xác định độ ẩm dư 17

2.6.2 Hàm lượng phenolics tổng số (TPC) 18

2.6.3 Hiệu suất trích ly phenolics (PEE) 19

2.6.4 Hàm lượng saponin tổng số (SC) 20

2.6.5 Khả năng quét gốc tự do DPPH 21

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Kết quả 22

3.1.1 Mô hình bề mặt đáp ứng 22

3.2 Hàm lượng phenolics tổng số 26

3.2.1 Mối quan hệ giữa TPC dự đoán và TPC đo được 26

3.2.2 Ảnh hưởng của các yếu tố độc lập đến hàm lượng phenolics tổng số 26

3.3.1 Mối quan hệ giữa PEE dự đoán và PEE đo được 28

3.3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố độc lập đến hiệu suất trích ly phenolics 29

3.4Hàm lượng saponin tổng số (SC) 31

3.4.1 Mối quan hệ giữa SC dự đoán và SC đo được 31

3.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố độc lập đến SC 32

3.5Khả năng quét gốc tự do DPPH 34

3.5.1 Mối quan hệ giữa DPPH dự đoán và DPPH đo được 34

3.5.2 Ảnh hưởng của các yếu tố độc lập lên DPPH 35

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 37

4.2 Đề xuất ý kiến 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC i

PHỤ LỤC 1 i

PHỤ LỤC 2 ii

PHỤ LỤC 3 iii

PHỤ LỤC 4 iii

PHỤ LỤC 5 iv

PHỤ LỤC 6 iv

DANH SÁCH HÌNH VẼ Hình 1.1 Qủa cacao của 3 giống khác nhau 4

Hình 1.2 Thành phần cấu tạo trái cacao 4

Hình 1.3 Phân loại và cấu trúc của các hợp chất phenolic 7

Hình 1.5 Phản ứng giữa DPPH và một chất chống ôxy hóa 10

Hình 2.1 Tổng thể quy trình thử nghiệm của nghiên cứu 17

Hình 3.1 Mô hình dự đoán hàm lượng phenolic tổng số, hiệu suất trích ly phenolic tổng

số, hàm lượng saponin tổng số, khả năng quét gốc tự do của dịch chiết từ vỏ quả cacao theo điều kiện tối ưu 25

Hình 3.2 Mối quan hệ giữa TPC dự đoán và TPC đo được 26

Hình 3.3 Tương tác giữa công suất vi sóng và thời gian bức xạ trên mô hình 3 chiều đối với chỉ tiêu TPC 28

Hình 3.4 Mối quan hệ giữa PEE dự đoán và PEE đo được 29

Hình 3.5 Tương tác giữa công suất vi sóng và thời gian bức xạ trên mô hình 3 chiều đối với chỉ tiêu PEE 31

Hình 3.6 Mối quan hệ giữa SC dự đoán và SC đo được 32

Hình 3.7 Tương tác giữa công suất vi sóng và thời gian bức xạ trên mô hình 3 chiều đối với chỉ tiêu SC 34

Hình 3.8 Mối quan hệ giữa DPPH dự đoán và DPPH đo được 34

Hình 3.9 Tương tác giữa công suất vi sóng và thời gian bức xạ trên mô hình 3 chiều đối với chỉ tiêu DPPH 36

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Tỉ lệ khối lượng của quả cacao 3

Bảng 2.2 Bảng bố trí 27 thí nghiệm theo thiết kế Box-Behnken 15

Bảng 3.1 Các giá trị thống kê hàm lượng phenolics tổng số, hiệu suất trích ly phenolics tổng số, hàm lượng saponin tổng số và khả năng chống ôxy hóa của phenolics trong vỏ quả cacao từ thiết kế Box-Behnken 22

Bảng 3.2 Các giá trị thí nghiệm (Exp.), dự đoán (Pre.) và đo lường (Mea.) cho hàm lượng phenolics tổng số, hiệu suất trích ly TPC tổng số, hàm lượng saponin tổng số và khả năng chống ôxy hóa của phenolics trong vỏ quả cacao từ thiết kế Box-Behnken và theo các thông số MAE tối ưu (n=3) 23

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

TPC: Total polyphenol content

PEE: Phenolic extraction efficiency

SC: Saponin content

DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

RSM: Response surface methodology

MAE: Microwave-assisted extraction

GAE: Gallic acid equivalent

UV-Vis: Ultraviolet-visible spectroscopy

UV: Ultraviolet

từ ngành công nghiệp chế biến cacao bao gồm vỏ cứng, vỏ quả, vỏ nhầy và vỏ hạt, chiếm

khoảng 85% trọng lượng tươi của tổng khối lượng quả cacao [5] Trong đó, hàng năm

trên toàn thế giới lượng vỏ quả cacao ước tính khoảng 55 triệu tấn, bằng 13 lần so với

tổng lượng quả cacao Do đó, vỏ quả cacao cần được khai thác để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng cao và chất thải này được xem như là một nguồn giàu hợp chất phenolics,

rẻ tiền và có thể tái tạo, một hợp chất có giá trị cao, có tác dụng chống ôxy hóa mạnh [6]

Theo nghiên cứu trước đây của Nguyễn [7] xác định hàm lượng phenolic tổng số

và hàm lượng saponin tổng số từ vỏ quả cacao bằng các dung môi khác nhau và chỉ ra rằng hàm lượng phenolic tổng số cao nhất từ vỏ quả cacao được trích ly bằng nước, tiếp theo là bằng ethanol, methanol, ethyl acetate, acetonitrile và hexane (tương ứng là 8.48, 7.32, 6.37, 1.41, 1,07 và 0.61 mg GAE/g mẫu khô)

Mục đích nghiên cứu: Tối ưu hóa điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng để thu được hàm lượng hợp chất phenolics cao nhất và khả năng chống ôxy hóa tốt nhất từ vỏ quả cacao Nội dung nghiên cứu:

1 Chuẩn bị mẫu khô từ vỏ quả cacao và xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu

2 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố chính đến khả năng trích ly hợp chất phenolics

và hoạt tính chống ôxy hóa từ vỏ quả cacao

3 Xác định điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng tối ưu cho hợp chất phenolics từ vỏ quảcacao

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Đề tài tìm ra được điều kiện trích ly hỗ trợ vi sóng tối ưu để thu được hàm lượng phenolics cao nhất từ rễ vỏ quả cacao, nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền, có thể tái tạo, và bền vững bằng cách sử dụng dung môi không độc hại, dễ tiếp cận và rẻ tiền cho các ứng dụng tiềm năng trong ngành dinh dưỡng, y tế và dược phẩm Đồng thời, kết quả của đề tài là dữ liệu khoa học tham khảo cho giảng viên, sinh viên, các nhà nghiên cứu và sản xuất quan tâm đến hợp chất phenolics từ các nguồn tự nhiên

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Từ kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ thu được dịch chiết có hàm lượng phenolics cao nhất từ vỏ quả cacao, từ đó ứng dụng vào trong ngành thực phẩm chức năng, dinh dưỡng,

mỹ phẩm Đồng thời, giải quyết được vấn đề chất thải từ ngành công nghiệp chế biến cacao, hướng đến sự phát triển bền vững

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về cây cacao

1.1.1 Đặc điểm và phân bố sinh thái của cây cacao [a]

Đặc điểm của cây cacao

Cây cacao nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau:

Bộ: Malvales

Họ: Sterculiaceae

Chi: Theobroma

Loài: T Cacao

Danh pháp hai phần: Theobroma cacao

Cây cacao là cây thường xanh tầng trung, cao 4-8m, ưa bóng rợp, có khả năng chịu bóng tốt nên thường được trồng xen dưới tán cây khác như trong các vườn dừa, cao su, vườn rừng,… có sẵn để tăng hiệu quả sử dụng đất

Có 3 giống cacao chủ yếu là: Theobroma cacao Criollo, Theobroma cacao

Phorastero, Theobroma cacao Trinitario.

Bảng 1.1 Tỉ lệ khối lượng của quả cacao [5]

FW: Fresh weight (khối lượng tươi)

Thành phần cấu tạo của trái cacao bao gồm: lớp vỏ cứng (vỏ quả), lớp vỏ nhày (vỏ thịt), lớp vỏ trấu (vỏ hạt), hạt cacao (nhân)

Hình 1.1 Qủa cacao của 3 giống khác nhau [b]

Hình 1.2 Thành phần cấu tạo trái cacao [c]

Cacao cho hạt làm nguyên liệu sử dụng trong ngành công nghệ thực phẩm, có thể

kể đến một số sản phẩm có giá trị kinh tế cao như sôcôla, bột cacao, bơ cacao, Cacao còn là đồ uống thông dụng vì có chất kích thích nhưng lượng caffein thấp hơn cà phê rất nhiều Vỏ trái sau khi lấy hạt có thể phơi khô và xay làm thức ăn cho gia súc hoặc bỏ

Những lợi ích của cacao tiếp tục được các nhà khoa học nghiên cứu, để ứng dụng các hợp chất trong quả cacao vào các ngành như y tế, dinh dưỡng, dược phẩm,…

Phân bố sinh thái [a]

Nguồn gốc của cây cacao là từ Trung Mỹ và Mexico, được những người Aztec và Maya bản xứ khám phá Nhưng ngày nay hầu hết các nước nhiệt đới cũng có thể trồng cây này

Cây thích hợp với những vùng có nhiệt độ trung bình 25-280C, độ ẩm trung bình 85%, lượng mưa hàng năm 1500-2000mm Cây có ưu điểm một năm thu hai vụ, nhu cầu nước không lớn, ít phải tưới, không kén đất nhưng cũng không chịu được các vùng quá khô hạn như đất cát hoàn toàn

1.1.2 Thành phần hóa học vỏ quả cacao

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của vỏ quả cacao [1]

Vỏ quả cacao được xem như một nguồn phong phú và rẻ tiền để thu hồi phenolics

1.2 Giới thiệu về hoạt chất sinh học

1.2.1 Hợp chất phenolics

Các hợp chất phenolic là một trong những nhóm chuyển hóa thứ cấp được phân bố rộng rãi và rộng rãi nhất ở thực vật, với khoảng 10.000 cấu trúc phenolic đã được xác định cho đến nay [8] Hơn nữa, chúng được coi là chất chống ôxy hóa phong phú nhất trong chế độ ăn của con người [9], và đóng góp tới 90% tổng công suất chống ôxy hóa trong hầu hết các loại trái cây và rau quả

Các hợp chất phenolic là các chất có vòng thơm có chứa một hoặc nhiều hơn các gốc hydrôxyl, hoặc tự do hoặc liên quan đến liên kết este hoặc ether [10] Chúng tồn tại chủ yếu ở dạng liên hợp, với một hoặc dư lượng đường nhiều hơn liên quan đến nhóm hydrôxyl bởi các liên kết glycoside Liên kết với các hợp chất, chẳng hạn như axit cacbôxylic, amin, và chất béo cũng rất phổ biến [11]

Các hợp chất phenolic đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe con người Nghiên cứu dịch tễ học có vai trò hỗ trợ mạnh cho các hợp chất phenolic kết hợp với chất chống ôxy hóa trong việc phòng chống viêm mãn tính, chẳng hạn như bệnh tim mạch, ung thư, loãng xương, đái tháo đường, viêm khớp và bệnh thoái hóa thần kinh [12, 13]

Những tác dụng có lợi cho sức khỏe của các hợp chất phenolic là kết quả của các tính chất sinh học của chúng, bao gồm các hoạt động chống ôxy hóa, chống viêm, chống ung thư và kháng khuẩn [13]

Các hợp chất phenolics được chia thành các lớp khác nhau (Hình 1.3) Theo số vòng phenolics mà chúng có và các yếu tố cấu trúc liên kết các vòng này Hợp chất phenolics bao gồm axit phenolic, flavonoid, stilben, tannin và lignans [10]

Hình 1.3 Phân loại và cấu trúc của các hợp chất phenolic [14]

1.2.2 Hợp chất saponins

Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn và được biết đến như một trong những nhóm các sản phẩm tự nhiên đa dạng nhất được tìm thấy trong thực vật và sinh vật biển, là các phân tử cực bao gồm một triterpene hoặc steroid aglycone với một hoặc nhiều chuỗi đường [15] Saponin được chứng minh là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học, chẳng hạn như chất chống ôxy hóa, chống đái tháo đường, chống ăn mòn, chống viêm, chống HIV, kháng viêm gan B và C, chống cholesterol, chống u bướu và chống ung thư [16, 17] Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng saponin có mối tương quan dương với khả năng chống ung thư [18], trong khi các hợp chất phenolics có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh [7, 19] Vì vậy, việc khai thác và ứng dụng saponin trong phòng ngừa và điều trị ung thư là mối quan tâm lớn đối với các nhà nghiên cứu

1.3 Quá trình ôxy hóa và chống ôxy hóa

1.3.1 Quá trình ôxy hóa [d]

Cơ chế quá trình ôxy hóa: sự ôxy hóa chất béo là phản ứng dây chuyền được khởi đầu bằng sự tạo thành các gốc tự do từ các phân tử acid béo

Giai đoạn khởi đầu:

Những phản ứng này xúc tác cho các phản ứng khác Sự tự ôxy hóa lipid được gọi

là phản ứng gốc tự do Khi các gốc tự do phản ứng với nhau, các sản phẩm không gốc tự

do, kìm hãm sự ôxy hóa bằng cách ôxy hóa chính chúng Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống ôxy hóa

Phản ứng của chất chống ôxy hóa với gốc tự do như sau:

R● + AH → RH +A●

Chất chống ôxy hóa trong thực phẩm bao gồm 2 nhóm chính:

+ Chất chống ôxy hóa tự nhiên: Acid ascorbic (vitamin C); tocopherol (vitamin E); carotenoids; flavanone và flavonol; vanilin,…

+ Chất chống ôxy hóa tổng hợp: BHT (butylated hydroxytoluen), BHA (butylated hydroxyanisole), tocopherol tổng hợp, TBHQ (tertbutyl hydroquinone), dodecyl gallate, propul gallate, ascorbyl palmitate,…

1.3.3 Một số phương pháp phân tích đánh giá hoạt tính chống ôxy hóa [e]

a Phương pháp xác định trực tiếp hoạt tính chống ôxy hóa

- Phương pháp TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): hoạt tính chống ôxy hóa so với khả năng chống ôxy hóa của trolox

- Phương pháp DPPH (scavenging ability towards DPPH radicals): khả năng quét gốc tự do DPPH

- Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capcity): khả năng hấp thụ gốc tự

do chứa ôxy hoạt động

- Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): khả năng chống ôxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do

- Phương pháp FRAP (ferric ruducing-antioxidant power): hiệu lực chống ôxy hóa bằng phương pháp khử sắt

b Phương pháp xác định gián tiếp hoạt tính chống ôxy hóa

- Phương pháp cân khối lượng

- Chỉ số peroxide (PV)

- Chỉ số pentadien liên hợp

- Chỉ số para-anisidine

- Chỉ số acid thiobarbituric (TBA)

Trong đồ án này, chúng tôi sử dụng phương pháp DPPH:

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tía và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 515 nm Khi có mặt chất chống ôxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng Đo độ giảm hấp thụ ở bước sóng 515 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống ôxy hóa

Hình 1.5 Phản ứng giữa DPPH và một chất chống ôxy hóa [f]

1.4 Các phương pháp chiết tách hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học

1.4.1 Phương pháp truyền thống [2]

Phương pháp chiết bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và kĩ thuật chiết Một phương pháp chiết thích hợp khi biết rõ thành phần hóa học của nguyên liệu, mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi Vì vậy, không thể có một phương pháp dịch chiết chung cho tất cả các hợp chất

Các phương pháp chiết thông thường như:

• Phương pháp ngâm kiệt

• Phương pháp ngâm dầm

• Phương pháp Soxhlet

• Phương pháp đun hoàn lưu

1.4.2 Phương pháp hiện đại [3]

Để làm tăng hiệu quả của quá trình dịch chiết, các nghiên cứu đã đưa ra để cải thiện phương pháp trích ly bằng dung môi bằng cách áp dụng các biện pháp như hỗ trợ vi sóng (sử dụng vi sóng để làm phá vỡ các tế bào), siêu âm, áp dụng các kĩ thuật trích ly bằng CO2 siêu tới hạn, trích ly pha rắn (SPE-solid phase extraction) hoặc kĩ thuật trích ly bằng cách nén chất lỏng

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng:

Nguyên lý: Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong tế bào thực vật bị nóng lên thật nhanh, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa dịch chiết bị vỡ ra, dịch chiết thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ ngưng tụ

Năng lượng chiếu xạ lớn sẽ làm cho một số cấu phần trong dịch chiết bị phân hủy

1.5 Phương pháp tối ưu hóa bằng bề mặt đáp ứng RSM [20]

Để tìm được điểm tối ưu về hàm lượng phenolics, thì có rất nhiều phương pháp như

sử dụng đường dốc nhất, bề mặt đáp ứng…Trong đó, phương pháp bề mặt đáp ứng

(Response Surface Methodology - RSM) được sử dụng phổ biến do phương pháp này cho kết quả nhanh và tương đối chính xác

Phương pháp bề mặt đáp ứng RSM là một phương pháp thống kê sử dụng các dữ liệu định lượng từ các thí nghiệm để xác định và giải thích nhiều biến phương trình RSM khám phá các mối quan hệ giữa các biến và giải thích một hay nhiều biến phản ứng Phương pháp này đã được giới thiệu bởi GEP Box và KB Wilson vào năm 1951 Ý tưởng chính của RSM là sử dụng một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để có được một phản

ứng tối ưu Để làm điều này, Box và Wilson đã sử dụng một mô hình đa thức bậc hai Mô hình này chỉ là xấp xỉ, nhưng lại tương đối dễ dàng áp dụng

1.5.1 Nguyên tắc của RSM [21]

RSM khám phá các mối quan hệ giữa các biến giải thích và một hay nhiều biến phản ứng Người ta gọilà bề mặt đáp ứng, đại diện hình học hàm mục tiêu của một quá trình vật lý không gian - thời gian ngẫu nhiên cho những biến kích thích Đặc tính đượcnghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự chuyển đổi bằng một chức năng đáp ứng rõ ràng (hay còn gọi là chức năng chuyển đổi) Sự thay đổi giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thayđổi chức năng của hàm mục tiêu Những mô hình thí nghiệm của mặt đáp ứng lưu ý đến sự lựa chọncác biến kích thích, xác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai số Những biến đầu vào Xi (i = 1,…,n) cũng được gọi là những biến cơ sở Chúngđược đặc trưng bởi một loạt các thông tin thống kê µj (j = 1,…, p) (chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan, chuẩn hóa…) Trong trường hợp chung, những biến Xi là những biến thay đổi theo không gian - thời gian Việc điều chỉnh hàm mục tiêu phải dựa trên một cơ sở của những số liệu thínghiệm (thí nghiệm vật lý hay số học) và một hệ cho việc tính toán các sai số, nó cho phép ta suy ra được các thông số Xk Sự biểu diễn hình học của chức năng đáp ứng dưới dạng một đường cong, một mặt phẳng hoặc một mặt phẳng gia tăng đượcgọi là bề mặt đáp ứng

1.5.2 Công dụng của RSM

- Xác định các mức yếu tố làm thỏa mãn đồng thời các thông số kỹ thuật mong muốn

- Kết hợp tối ưu hoá cho các yếu tố để cho ra kết quả mong muốn đạt được và mô tả kết quả tối ưu đó

- Cho ra một kết quả đặc trưng khi nó bị ảnh hưởng bởi những sự thay đổi của các mức yếu tố vượt quá mức đang quan tâm

- Đạt được một sự hiểu biết về định lượng của hệ thống xử lí vượt qua vùng thử nghiệm

- Sản xuất các sản phẩm đặc trưng trong vùng, ngay cả khi kết hợp với các yếu tố không chạy

1.5.3 Ưu, nhược điểm của RSM [20]

- Ưu điểm:

+ Mang tính thực tế vì số liệu được lấy từ thực nghiệm

+ Có thể áp dụng cho bất kì hệ thống nào có biến đầu vào và mục tiêu đầu ra

+ Đánh giá tổng hợp được tác động của các yếu tố ảnh hưởng

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Vỏ quả cacao được mua từ xã Thành Thiệu, huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre vào tháng 12 năm 2017 Vỏ quả cao tươi được tách ra khỏi quả cacao, sau đó cắt thành từng miếng nhỏ, và sấy bằng lò vi sóng ở 450W (50% công suất) đến khối lượng không đổi Mẫu sau khi sấy khô sẽ được xay nhỏ bằng máy nghiền khô Mẫu sau khi xay được đựng trong túi PE, bảo quản ở trong tủ đông ở -200 C cho đến khi sử dụng

2.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích gồm: Chất thử Folin-Ciocalteu, Na2CO3, vanillin, H2SO4, methanol, 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), acid galic, escin

2.3 Thiết kế thí nghiệm tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng [7]

Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm xác định được điều kiện chiết tối ưu vỏ quả cacao để thu được dịch chiết có hàm lượng phenolics cao nhất Tiến hành khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của bốn thông số quan trọng đến khả năng chiết phenolics từ vỏ quả cacao bao gồm: công suất vi sóng, thời gian bức xạ, thời gian trích ly và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu Theo đó, các thí nghiệm sơ bộ về các yếu tố độc lập được thực hiện để lựa chọn phạm vi phù hợp (dữ liệu không trình bày ở đây) Bốn yếu tố chính sau đó đã được lựa chọn cho thiết kế Box-Behnken bao gồm: công suất vi sóng (X1, W), thời gian bức xạ (X2, s/phút), thời gian trích ly (X3, phút) và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (X4, mL/g) sử dụng phần mềm JMP (Phiên bản 11, SAS Campus Drive, Cary, NC, USA)

Hai mươi bảy thử nghiệm đã được thực hiện để tìm ra các giá trị thống kê, thử nghiệm, dự đoán và đo lường: hàm lượng phenolic tổng số, hiệu suất trích ly phenolic tổng số, hàm lượng saponin tổng số và khả năng quét gốc tự do DPPH

Dữ liệu cho các biến được lựa chọn đã được phân tích để phù hợp với mô hình bậc hai như thể hiện trong phương trình đa thức bậc hai sau:

Trong đó Y là biến phụ thuộc; X1, X2, X3, X4 tương ứng là các biến độc lập cho công suất vi sóng, thời gian bức xạ, thời gian trích ly, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu; β0, β1,

β2, β3, β4 và β12, β13, β14, β23, β24, β34, β11, β22, β33, β44 tương ứng là hệ số hồi quy cho hằng

số, tuyến tính, bậc hai và tương tác

Bảng 2.1 Các yếu tố độc lập và mức độ của chúng đối với thiết kế Box-Behnken

Mức độ

Các yếu tố độc lập Công suất vi

sóng (W)

Thời gian trích ly (phút)

Thời gian bức

xạ (s/phút)

Tỉ lệ giữa dung môi/nguyên liệu (ml/g)

Bảng 2.2 Bảng bố trí 27 thí nghiệm theo thiết kế Box-Behnken

2.4 Chuẩn bị dịch chiết

Vỏ quả cacao sau khi được xay nhỏ đến kích thước nhất định Cân 1 g mẫu khô vào bình cầu để trích ly bằng lò vi sóng với dung môi là nước và các thông số như sau: công suất vi sóng 400- 800W, thời gian trích ly 10-30 phút, thời gian bức xạ: 3-5s, tỉ lệ giữa dung môi/nguyên liệu: 20-50 (ml/g)

Qúa trình chiết sử dụng hệ thống trích ly hỗ trợ vi sóng BRN 01 Sau quá trình trích ly, dịch chiết được ly tâm ở tốc độ 7000 vòng/ phút trong vòng 30 phút, sử dụng máy

ly tâm (HERMLE Z323, Hermle, Germany) thu được dịch chiết trong (dịch chiết thô), dịch chiết này được phân tích ngay hoặc bảo quản đông ở -200C cho đến khi phân tích

2.5 Bố trí thí nghiệm tổng quát

Vỏ quả cacao tươi

Chuẩn bị mẫu khô

Công suất vi sóng

bằng hỗ trợ vi sóng Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

Thời gian bức xạ

Đo độ ẩm trong nguyên liệu thí nghiệm nhằm xác định hoạt tính chống ôxy hóa và hàm lượng polyphenol tổng trong các mẫu khô (khô tuyệt đối) từ các mẫu thô ban đầu Khi đó, việc so sánh kết quả giữa các mẫu có ý nghĩa hơn

b Nguyên tắc

Dưới tác dụng của nhiệt độ, nước trong nguyên liệu bay hơi dần cho đến khi đạt độ

ẩm không đổi Dựa vào sự chênh lệch khối lượng của nguyên liệu trước và sau khi tách

ẩm để xác định hàm lượng ẩm trong nguyên liệu

Lượng chất khô = m cốc+mẫu sau khi sấy − m cốc

m mẫu ban đầu * 100 (%)

Độ ẩm dư = 100 – hàm lượng chất khô (%)

2.6.2 Phân tích hàm lượng phenolics tổng số (TPC) [7]

Folin-và acid galic được sử dụng làm chất đối chứng Folin-và chất chuẩn TPC được thể hiện tương đương bằng mg gallic acid/g mẫu khô (mg GAE/g mẫu khô)

Phản ứng của mẫu chuẩn: 0,5 ml dung dịch chuẩn là acid gallic ở các nồng độ: 20,

Từ kết quả đo dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn acid galic y = f(x) với y là mật

độ quang, x là nồng độ chất chuẩn (g acid galic/ml) Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ acid galic trong mẫu đo M (g acid gallic/ml) Hàm lượng phenolics trong nguyên liệu được tính như sau:

Độ ẩ𝑚 𝑑ư.1000TPC: Hàm lượng phenolics tổng trong nguyên liệu (mg GAE/g chất khô)

M: Hàm lượng phenolics trong mẫu đo (g acid galic/ml)

f: Hệ số pha loãng

V: Thể tích dung dịch sau trích ly phenolics (ml)

Độ ẩm dư (%)

2.6.3 Xác định hiệu suất trích ly phenolics (PEE) [7]

Hiệu suất trích ly phenolics được xác định bằng cách: Lấy điều kiện mà mẫu có hàm lượng phenolics tổng số cao nhất trong 27 thí nghiệm Trong điều kiện này, 1 g mẫu khô được trích ly liên tục 5 lần, sau mỗi lần, dùng máy ly tâm để thu dịch chiết và đo tổng thể tích dịch chiết thu được Mẫu này được gọi là mẫu control Tiến hành đo hàm lượng phenolics có trong mẫu control

Hiệu suất trích ly phenolics được tính theo công thức:

𝑇𝑃𝐶 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 100 (%) PEE: Hiệu suất trích ly phenolics (%)

TPC: Hàm lượng phenolics có trong mẫu đo (mg acid galic/g chất khô)

TPCcontrol: Hàm lượng phenolics có trong mẫu control (mg acid galic/g chất khô)

2.6.4 Phân tích hàm lượng saponin tổng số (SC) [7]

a Hóa chất:

Dung dịch vanilin 8% (w/v)

Dung dịch H2SO4 72% (v/v)

b Cách tiến hành

Hàm lượng saponin của dịch chiết từ vỏ quả cacao được xác định như sau:

0,25 ml dịch chiết trộn với 0,25 ml dung dịch vanilin 8% (w/v) Sau đó, thêm vào2,5 ml dung dịch 72% H2SO4 (v/v) Hỗn hợp được ủ ở 700C trong 15 phút, sau đó được làm lạnh nhanh chóng bằng nước đến nhiệt độ phòng Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 560 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS Methanol và escin được sử dụng như là chất đói chứng và chất chuẩn Hàm lượng saponin được thể hiện tương đương bằng

mg escin (EE)/g mẫu khô

Phản ứng của mẫu chuẩn: 0,25 ml dung dịch chuẩn là escin với các nồng độ (50 -

400 g/ml) + 0.25 dung dịch vanilin 8% (w/v) + 2,5 ml dung dịch 72% H2SO4 (v/v) Phản ứng của mẫu trắng: 0,25 ml methanol + 0.25 dung dịch vanilin 8% (w/v) + 2,5

Độ ẩ𝑚 𝑑ư.1000SC: Hàm lượng saponin tổng trong nguyên liệu (mg escin/g chất khô)

M: Hàm lượng saponin trong mẫu đo (g escin/ml)

f: Hệ số pha loãng

V: Thể tích dung dịch sau trích ly saponin (ml)

Độ ẩm dư (%)

2.6.5 Khả năng quét gốc tự do DPPH [7]

- Pha dung dịch gốc (stock): Pha dung dịch gốc DPPH 0,024% trong methanol 100%, bảo quản ở -200C

- Pha dung dịch phản ứng:

Pha loãng 10 ml dung dịch gốc DPPH 0.024% với 45 ml methanol 100% (tỉ lệ 1:4.5)

để đạt độ hấp thụ 1.1 ± 002 ở 515 nm, bảo quản ở -180C

Lấy 0.15 ml dịch chiết đã pha loãng 2 lần trộn với 2,850 ml dung dịch DPPH phản ứng vừa điều chế và tiến hành ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng (21± 10C) trong 3h Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở 515 nm bằng máy do quang phổ UV-Vis

2.7 Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các thí nghiệm đã được thực hiện trong ba lần Dữ liệu được phân tích sử dụng phần mềm SPSS 20 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) và được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n=3) Kiểm định Duncan được thực hiện sau phân tích ANOVA để đánh gía sự khác nhau của các giá trị với mức ý nghĩa P < 0.05 Các hình vẽ

và đồ thị được vẽ trên phần mềm Exell (Office 2010, Microsft, USA)