Bước đầu nghiên cứu thủy phân rong lục (ulva lactuca) tại vịnh nha trang bằng bacillus subtilis và aspergillus oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất có hoạt tinh sinh học như lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, hợp chất phenolic, alkaloid… trong đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

SUNG VÀO THỨC ĂN CHĂN NUÔI

GVHD: TS Thái Văn Đức SVTH: Trương Văn Đông

MSSV: 56130833

Khánh Hòa, tháng 7/2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

Khoa/viện: Công nghệ thực phẩm

PHIẾU THEO DÕI TIẾN ĐỘ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI / KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

(Dùng cho CBHD và nộp cùng báo cáo ĐA/KLTN của sinh viên)

Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu thủy phân rong lục (ulva lactuca) tại vịnh nha trang bằng Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Giảng viên hướng dẫn:TS Thái Văn Đức

Sinh viên được hướng dẫn: Trương Văn Đông MSSV: 56130833

Kiểm tra giữa tiến độ của Trưởng BM

Ngày kiềm tra: Đánh giá công việc hoàn thành:……%: Ký tên

Đồng ý cho sinh viên: Được bảo vệ: Không được bảo vệ:

Khánh Hòa, ngày…….tháng…….năm………

Cán bộ hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

TS: THÁI VĂN ĐỨC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này, trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được dành cho thầy Thái Văn Đức và cô Nguyễn Thị Thanh Hải đã tận tình hướng dẫn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Xin cám ơn và các cán bộ Phòng Nghiên cứu Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

- Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng em trong quá trình nghiên cứu

Trong quá trình làm đề tài, mặc dù em đã cố gắng hết sức nhưng hạn chế về kiến thức bản thân cũng như về thời gian nên không tránh khỏi có những sai sót

Về phần mình, em xin hứa sẽ hết sức cố gắng mang những kiến thức đã được học để vận dụng vào thực tế góp phần công sức nhỏ bé của mình vào công cuộc xây dựng và đổi mới của ngành công nghệ thực phẩm nước nhà

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 05 tháng 7 năm 2018

Tác giả đồ án

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

DẠNH MỤC SƠ ĐỒ ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Ý nghĩa thực tiễn, mục đích và phạm vi ứng dụng 2

2.1 Ý nghĩa thực tiễn 2

2.2 Mục đích của đề tài 2

2.3 Phạm vi ứng dụng 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu chung về rong lục 4

1.2 Chủng Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae 6

1.2.1 Bacillus subtilis 6

1.2.2 Aspergillus oryzae 8

1.3 Tổng quan về Cellulose 9

1.4 Enzym Cellulase 11

1.4.1 Định nghĩa và phân loại 11

1.4.2 Tính chất 13

1.4.3 Cơ chế thủy phân cellulose 13

1.4.4 Cơ chế tác dụng của cellulase 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1 Rong lục (Ulva lactuca ) 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3 Bố trí thí nghiệm tổng quát 20

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kiểm tra khả năng sinh và hoạt tính cenlulase 35

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả năng thủy phân 36

3.3 Khảo sát thành phần dinh dưỡng cơ bản của rong lục nguyên liệu 37

3.4 Xác định khả năng thủy phân của vsv trên rong lục 38

3.5 Kết quả thăm dò vùng ảnh hưởng các yếu tố chính ảnh hưởng quá trình thủy phân 39

3.5.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 39

3.5.2 Kết quá thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân 41

3.4 Tối ưu hóa quá trình thủy phân 42

Model Terms 44

ANOVA for Quadratic model 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Chemists CMC Carbonyl-methyl cellulose

DNS Dinitrosalicylic axit

K-Na Potassium sodium tartrate tetrahydrate

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

DANH MỤC BẢNG

BẢNG 3 1 KẾT QUẢ ĐO VÒNG PHÂN GIẢI CELLULOSE 36

BẢNG 3 2 THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CƠ BẢN CỦA RONG LỤC ULVA LACTUCA 37

BẢNG 3.3 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM CỦA MÔ HÌNH BOX-BEHNKEN 43

BẢNG 3.4 CÁC ĐIỂM TIÊN ĐOÁN DO PHẦN MỀM DX6 51

BẢNG 3.5 KẾT QUẢ KIỂM TRA THỰC NGHIỆM ĐIỂM TIÊN ĐOÁN 51

DANH MỤC HÌNH

HÌNH 1 1 VI KHUẨN B.SUBTILIS DƯỚI KÍNH HIỂN VI 7

HÌNH 1 2 HÌNH VẼ SỢI NẤM A.ORYZAE 8

HÌNH 1 3 CẤU TRÚC CELLULOSE VÀ MẠNG LƯỚI LIÊN KẾT HYDROGEN 9

HÌNH 1 4 SỰ SẮP XẾP CÁC CHUỖI CELLULOSE TRONG THÀNH TẾ BÀO THỰC VẬT 10

HÌNH 1 5 CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA ENZYM CELLULASE 14

HÌNH 1 6 CƠ CHẾ THỦY PHÂN CELLULOSE 15

HÌNH 2 1 RONG LỤC ULVA LACTUC 16

HÌNH 2 2 KHUẨN LẠC B.SUBTILIS 16

HÌNH 2 3 KHUẨN LẠC CỦA A.ORYZAE 17

HÌNH 2 4 SỰ TẠO PHỨC MÀU CỦA THUỐC THỬ 23

HÌNH 2 5 TỐI ƯU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 29

HÌNH 3 1 KHUẨN LẠC VÀ VÒNG PHÂN GIẢI CELLULOSE CỦA B.SUBTILIS 35

HÌNH 3 2 KHUẨN LẠC VÀ VÒNG PHÂN GIẢI CELLULOSE CỦA A.ORYASE 35

DẠNH MỤC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ 2 1 SƠ ĐỒ TỔNG QUAN THỦY PHÂN RONG LỤC 20

SƠ ĐỒ 2 2 ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE 24

SƠ ĐỒ 2 3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NACL ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA VSV 27

SƠ ĐỒ 2 4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA VSV TRÊN RONG LỤC 29

SƠ ĐỒ 2 5 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG LỤC 30

SƠ ĐỒ 2 6 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TỚI QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG LỤC 31

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ 3 1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG MẬT ĐỘ NACL ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN 36 BIỂU ĐỒ 3 2 KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CỦA VSV TRÊN RONG LỤC 38 BIỂU ĐỒ 3 3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN RONG LỤC 39 BIỂU ĐỒ 3 4 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THỦY PHÂN ĐẾN HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ 41 BIỂU ĐỒ 3 5 KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VSV DÙNG ĐỂ THỦY PHÂN RONG LỤC 42 BIỂU ĐỒ 3 6 BIỂU DIỄN ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THỦY PHÂN ĐẾN HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ 45 BIỂU ĐỒ 3 7 BIỂU ĐỒ ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ THỦY PHÂN ĐẾN HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ 46 BIỂU ĐỒ 3 8 ẢNH HƯỞNG CỦA MẬT ĐỘ VSV ĐẾN HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ 47 BIỂU ĐỒ 3 9 ĐƯỜNG ĐỒNG MỨC HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ 49 BIỂU ĐỒ 3 10 BỀ MẶT ĐÁP ỨNG CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 50

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp như dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm Hàng năm, theo ước tính sản lượng rong biển của thế giới đạt 15 triệu tấn và dự tính khoảng 22 triệu tấn vào năm 2020 Polysaccharide là các polymer sinh học được tìm thấy trong tự nhiên trên cả thực vật và động vật, cả trên cạn và dưới nước, trong đó rong biển được xem là một nguồn cung cấp polysaccharide rất phong phú và đa dạng Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định được khoảng 10.000 loài rong biển, chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là

rong lục (Chlorophyte), rong nâu (Pheophyte) và rong đỏ (Rhodophyte)

Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất có hoạt tinh sinh học như lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, hợp chất phenolic, alkaloid… trong đó polysaccharide được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất do khả năng ứng dụng đa dạng của nó Việt Nam là đất nước có một vùng biển nhiệt đới rộng với bờ biển dài hơn 3000 km, là nguồn cung cấp các loài rong biển phong phú và đa dạng, rong lục với

trữ lượng rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các chi Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha,

Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm 69 loài với hai loài phổ biến nhất là Ulva reticulata

và Ulva lactuca.[38]

Với số lượng phong phú và nguồn nguyên liệu dồi dào nhưng việc khai thác và sử dụng còn quá thô sơ chỉ dừng lại ở việc thu lượm của các ngư dân ven biển, phơi khô bán cho thương lái, hoặc làm thức ăn cho gia súc Với giá thành của thức ăn chăn nuôi hiện nay

là khá cao, thì việc sử dụng rong lục bổ sung vào thành phần thức ăn vật nuôi là một phương

án nên quan tâm Vì giá thành rẻ và nhiều dưỡng chất của rong lục Tuy nhiên với thành tế bào là celulose việc hấp dưỡng chất từ rong đối với gia súc với còn gặp khá nhiều khó khăn Bên cạnh đó, ở các thời điểm trong năm rong lục phát triển mạnh nhất, việc rong lục trôi dạt trên bãi biển là ô nhiễm môi trường

Xuất phát từ các vấn đề thực tế trên, tiến hành nghiên cứu đồ án : “Bước đầu thủy

phân rong lục (ulva lactuca) tại vịnh nha trang bằng Bacillus subtilis và Aspergillus

oryzae bổ sung vào thức ăn chăn nuôi” có ý nghĩa thực tiễn trong việc nâng cao giá trị

kinh tế, đa dạng hóa mặt hàng bổ sung cho thức ăn chăn nuôi, tạo thêm công ăn việc làm cho người lao động, hạn chế ô nhiễm môi trường biển

2 Ý nghĩa thực tiễn, mục đích và phạm vi ứng dụng

2.1 Ý nghĩa thực tiễn

- Đa dạng hóa mục đích sử dụng của rong lục

- Giảm gía thành và tăng chất lượng của thức ăn vật nuôi

- Giúp hạn chế quá trình rong trôi dạt trên bãi biển

- Phân hủy làm ô nhiễm môi trường

- Tăng giá trị kinh tế của rong lục (Ulva lactuca)

2.2 Mục đích của đề tài

Bước đầu khảo sát khả năng thủy phân vách celulose bằng hai chủng vsv là A.ozyae

và B.subtilis và tối ưu hóa quá trình này trên cơ chất rong lục (Ulva Lactuca) qua một số

yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Bên cạnh đó, đề tài sử dụng vsv thủy phân trực tiếp trên cơ chất rong lục thay cho enzyme thông thường, sản phẩm thủy phân không

được xử lý để loại bỏ các vsv Vậy nên đề tài sử dụng hai chủng B.subtilis và A.oryzae được

cho rằng có khả năng phân giải cellulose, nhưng không gây hại cho động vật nuôi mà còn

có lợi cho hệ tiêu hóa động vật nuôi

2.3 Phạm vi ứng dụng

Quy mô phòng thí nghiệm và trong sản xuất thức ăn chăn nuôi Việc sử dụng nguồn nguyên liệu rong lục trong tự nhiên, giải quyết được vấn đề nguồn nguyên liệu dồi dào nếu không xử lý sẽ gây ô nhiễm môi trường Rong lục đưa vào làm thức ăn chăn nuôi còn giải quyết vấn đề giá thành nguyên liệu thức ăn chăn nuôi còn khá cao, trong khi rong lục có giá thành rẻ Việc đa dạng hóa mục đích sử dụng và mở rộng phạm vi ứng dụng sẽ tạo công

ăn việc làm thêm cho các ngư dân vùng biển: đó là thu hoạch rong, công việc ổn định hơn,

có thêm thu nhập Bên cạnh thu hoạch rong tự nhiên, việc ứng dụng rong lục vào thức ăn

chăn nuôi còn có thể mở ra một hướng mới cho ngành rong đó là nuôi trồng rong quy mô lớn hoặc nuôi trồng cùng với một số loại thủy sản khác, tận dụng tối đa diện tích nuôi trồng, tăng tối đa nguồn lợi kinh tế trên một đơn vị diện tích nuôi trồng

Bên cạnh đó, việc sử dụng hai chủng vsv A.ozyae và B.subtilis là hai probiotic[31]

giúp vật nuôi tiêu hóa thức ăn tốt hơn; vừa phân giải cellulose thành đường khử, giải phóng các dưỡng chất được bao bọc bởi thành cellulose của tế bào rong: protein, acid amin, vitamin, khoáng chất… tạo điều kiện cho gia súc hấp thụ dưỡng chất Vật nuôi ăn tốt, phát triển tốt, ít bệnh, giảm chi phí điều trị bệnh cho vật nuôi hơn Chi phí cho vật nuôi bỏ ra ít hơn mà thu lại kinh tế nhiều hơn Cải thiện thành tích chăn nuôi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về rong lục

Rong lục được hình thành từ các nhánh trong, chúng có hình dáng giống lá rau diếp

Là loại cây nhất niên, có vòng đời chỉ 1 năm, loại rong lục này dùng tản hình đĩa để gắn thân mình lên đá, lên các động vật có vỏ và cả trên các loại tảo khác Trong thời gian gần đây, trên thế giới, rong lục là nguồn tài nguyên tự nhiên ngày càng được quan tâm sử dụng trong cuộc sống nhiều hơn phục vụ đời sống con người như làm thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm đặc biệt là trong lĩnh vực y học

Rong lục là một trong ba ngành rong chính đã biết hiện nay, chúng tồn tại trong tự nhiên với số lượng lớn và rất đa dạng về thành phần loài, bao gồm những chi chủ yếu sau:

Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Cladophora, Valonia, Boergessenia, Caulerpa, Bryopsis, Codium Trong đó có nhiều loài thuộc các chi rong lục là Ulva, Enteromorpha, Caulerpa, Codium được sử dụng như là nguồn thức ăn phổ biến cho người và động vật.[26]

Ở nước ta, rong lục là ngành có trữ lượng rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về

các chi rong Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm 69 loài

trong tổng số 100 loài đã được định danh trên thế giới

Đặc điểm tế bào rong Lục [9]:

Tế bào tảo lục có chứa một nhân hay nhiều nhân Đa số các trường hợp tế bào có vách cấu tạo bằng cellulose, và pectin Thể sắc tố của rong Lục có hình dạng rất khác biệt thường có hình cái chuông Thể màu của tảo Lục có cơ cấu gần giống thực vật bậc cao, phía ngoài là một màng đôi, bên trong có một chất đệm (stroma) bằng protein không màu Trong chất đệm có những phiến (lamelle) Chất màu gồm chlorophyll a,b, caroten và rất nhiều xanhthophin khác nhau Chất dự trữ tế bào thường là tinh bột, rất ít khi là dầu Rong Lục được phân biệt với các ngành rong khác ở đặc điểm màu lục, màu của thực vật bậc cao

Do trong cấu tạo tế bào của rong, sắc tố chlorophyll a,b lấn áp các sắc tố màu khác Chlorophyll là sắc tố quang hợp sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời thực hiện quá trình trao đổi chất Sản phẩm của quá trình quang hợp là tinh bột đây là nguồn carbohydrate cung

cấp cho hoạt động sống của tế bào rong Lục Thành và vách tế bào rong Lục đa phần được cấu tạo bằng cellulose Hàm lượng cellulose chiếm tỷ trọng lớn trong tế bào rong Do vậy nguồn cellulose thu nhận từ rong Lục là vô cùng lớn Rong lục là ngành lớn nhất trong các ngành rong, hình dạng của chúng vô cùng phức tạp, có thể là đơn bào, tập đoàn hoặc đa bào Chúng có thể dạng monat, dạng hạt, palmella, dạng sợi dạng phiến,… khích thước biến thiên từ vài micro đến vài ba chục cm hay phiến to cả mét Hình dạng đa dạng để thích nghi cao với mọi điều kiện môi trường nên rong Lục phân bố khắp mọi nơi [9] Do vậy rong Lục là nguồn nguyên liệu dễ tìm, dồi dào và vô cùng phong phú

Rong lục chi Ulva được cho là rất giàu protein, polysaccharide, các vitamin và các

khoáng chất, trong đó, polysaccharide ngày càng được quan tâm nhiều nhất do chúng có những tính chất vật lý và hóa học đáng chú ý và có nhiều tiềm năng ứng dụng trong y sinh học

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, có 4 dạng polysaccharide được tìm thấy từ rong lục

chi Ulva bao gồm: dạng tan trong nước là ulvan, dạng không tan trong nước là cellulose,

dạng tan trong kiềm là xyloglucan mạch thẳng và lượng nhỏ glucuronan Một trong các thành phần chính của chúng là lượng Magiê cao (khoảng 2-3%).[24]Chúng cũng chứa lượng Vitamin cao đáng ngạc nhiên gồm Vitamin A (cao gấp 2 lần bắp cải), Vitamin E chống oxy hóa và Vitamin C (gấp 8-10 lần quả cam, và thúc đẩy việc hấp thu sắt) Chúng còn giàu canxi (gấp 10-20 lần sữa), sắt (gấp 10 lần cải bó xôi) và Magiê (tương đương 20g rau diếp tươi) [37]

1.2 Chủng Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae

1.2.1 Bacillus subtilis

B.subtilis còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ hoặc trực khuẩn cỏ khô, là loại vi khuẩn

Gram dương, thuộc: [24]

Bảng 1 1 Thành phần dinh dưỡng của rong lục Ulva lactuca thu loại trên thế giới

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5

– 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 –

12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 – 300 năm

Bacillus subtilis có thể hình thành bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi như hạn

hán, bức xạ cực cao, môi trường nghèo dinh dưỡng Các tế bào vi khuẩn có thể tự tạo ra các chất kháng sinh hoặc giết chết đồng loại để tìm dinh dưỡng trong điều kiện môi trường sống khắc nghiệt, trước giai đoạn hình thành bào tử

Bởi tính ổn định cao của Bacillus subtilis trong điều kiện khắc nghiệt nên vsv này

trở thành một trong những ứng cử viên hoàn hảo với các ứng dụng chế phẩm sinh học hoặc trong đồ uống , thực phẩm, khử trùng

Bacillus subtilis là lợi khuẩn tự nhiên có ở hệ vi khuẩn đường ruột con người

Bacillus subtilis bền vững ở nhiệt độ cao lên tới 100oC trong vòng 180 phút nên

không bị tác động khi bổ sung vào thực phẩm hàng ngày Có thể bổ sung Bacillus subtilis

Hình 1 1 Vi khuẩn B.subtilis dưới kính hiển vi

tinh khiết cùng những loại thực phẩm nướng, sữa chua, đồ uống có cồn… và không giới hạn các kiểu phối hợp khác

hệ tiêu hóa cũng như có thể chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt, môi trường acid trong hệ tiêu hóa của con người và động vật

Bacillus subtilis có hệ thống enzyme khá hoàn chỉnh, các enzyme cenlulase chuyển

đổi chất xơ thành các loại đường dễ tiêu, enzyme thủy phân lipid, glucid, protid, lecithinase thủy phân các chất béo phức hợp, enzyme phân giải gelatin, enzyme phân giải fibrin và một loại enzyme giống lysozyme có tác dụng trực tiếp dung giải một vài loại vi khuẩn Proteus gây bệnh trong đường ruột.[1, 12]

1.2.2 Aspergillus oryzae

A.oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectasxales, lớp Ascomycetes Cơ thể sinh

trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn, chia sợi thành nhiều tế bào Từ những sợi nằm ngang thành nhiều sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào

tử thường dài 1-2mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia ra nhiều tế bào nhỏ, thuôn dài gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi

là đính bào tử [10, 40]

Hình 1 2 Hình vẽ sợi nấm A.oryzae

Đặc điểm của A.oryzae có khả năng sinh các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào

(amylase, protease, pectinasa…) ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột gạo đã hết nhưng không được rửa sạch… Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương Nấm Aspergillus oryzae là loài mốc chính trong quá trình chế tạo tương, không sinh ra độc tố Aflatoxin và Mycotoxins

Được sử dụng trong các chế phẩm probiotic bởi khả năng tiết nhiều enzyme amylase phân cắt phân tử lớn thành các phân tử nhỏ hơn dể cho động vật dễ hấp thụ; và chúng có khả năng cộng sinh với các lợi khuẩn khác

1.3 Tổng quan về Cellulose

Cellulose là hợp chất hữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất trong tự nhiên, là thành phần cơ bản cấu tạo nên thành tế bào thực vật Năm 1838, Anselin Payen là người đầu tiên tìm ra cellulose trong sợi bông (chiếm 98%), sau đó những nghiên cứu khác cũng cho thấy cellulose có hàm lượng rất cao trong thực vật như ở sợi lanh (80%), gỗ (40-50%) và 50% còn lại là phức hợp polysaccharid [6, 7, 15, 18]

Cellulose là một polymer mạch thẳng không cuộn xoắn, được tạo nên từ các đơn vị là D-glucose thông qua liên kết β-1,4-glucosid Mức độ polymer hóa được đánh giá dựa vào

số phân tử glucose trong chuỗi Đối với cellulose tự nhiên, con số này khoảng 14.000 và trọng lượng phân tử của cả chuỗi là 1,5 x 106 Da, dài 5 mm [17, 21]

Hình 1 3 Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen

Các phân tử glucose trong chuỗi polymer có dạng ghế bành, phân tử này quay 180o

so với phân tử kia Các nhóm β-OH glycoside đều nằm trên mặt phẳng ngang của các phân

tử glucose [28]

Liên kết β-1,4 glucoside giữa các phân tử đường trong chuỗi cellulose đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo nên những đặc tính riêng của cellulose và cả vi sợi Nhờ liên kết này mà chuỗi cellulose trở nên mở rộng, ít linh động hơn so với cấu trúc amylose của tinh bột, điều này cần cho các chuỗi cellulose để chúng có thể kết hợp với nhau và tạo thành cấu trúc dạng sợi Mặt khác sự tương tác qua lại giữa các gốc đường của hai chuỗi cellulose nằm cạnh nhau cho phép tạo nên liên kết hydrogen giữa các chuỗi Thực tế, các nhóm -OH

ở các vị trí C2, C3, C6 và nhóm O-hemiacetal trong phân tử glucose đều có thể tạo liên kết hydro với các gốc đường bên cạnh trong cùng chuỗi cellulose hoặc chuỗi cellulose khác Chính mạng lưới liên kết hydro mở rộng và liên kết β-1,4 glucoside đã làm cho cấu trúc cellulose trở nên bền vững, chặt chẽ có thể tồn tại trong các dung dịch kiềm và acid đậm đặc [27]

Bằng phương pháp phân tích sử dụng tia rơnghen, người ta đã tìm ra cấu trúc của cellulose trong tế bào thực vật có dạng sợi Đơn vị nhỏ nhất của cellulose có đường kính vào khoảng 3 nm Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi hay còn gọi là mixen

Mỗi vi sợi thường có khoảng 60 phân tử cellulose, có đường kính từ 10 – 40 nm, dài 100-40.000 nm [5, 10, 22, 32]

Hình 1 4 Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế

bào thực vật

Cellulose có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng:

- Vùng kết tinh có trật tự cao

- Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ, các mạch tập hợp với nhau nhờ lực Van der Waals, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước, chúng có thể hấp thu nước và trương phồng lên, nhờ vậy enzym cellulase rất dễ tác động Trong khi đó ở vùng kết tinh, các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm –OH thứ nhất của mạch này với nhóm –OH ở C3 của mạch khác nên đã ngăn cản được sự trương này Nhờ đó mà enzym cũng như nhiều phân tử khác khó có thể xâm nhập vào được bên trong phân tử cellulose để phân hủy [2, 4, 14]

Cellulose là một hợp chất có cấu trúc và các đặc tính lý hóa vô cùng phức tạp chỉ bị phân hủy khi đun nóng với kiềm hoặc acid Tuy nhiên nó có thể bị thủy phân dưới tác dụng của cellulase của các vsv ở điều kiện bình thường [4]

13, 22]

Cellulose là một loại phân tử polyme với các tiểu phần là D – glucose Các gốc D – glucose được nối với nhau qua liên kết 1,4- ß-D-glycosid Hệ thống enzym thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3 enzym khác nhau: endoglucanase (1,4-ß-D-glucan-4glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-ß-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và ß-glucosidase (ß-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21) Các enzym này

có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau Đầu tiên, endoglucanase phá vỡ liên kết 1,4-ß-D-glucoside trong phân tử cellulose, sau đó exoglucanase tiếp tục thủy phân

cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng ß-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose [32]

* Phân loại [6, 33]

Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế IUBMB, hệ thống thủy phân cellulose gồm có enzym: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase ký hiệu

EC 3.2.1.91 và ß-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21

• Endoglucanase EC 3.2.1.4, enzym CMCase hay Cx

Tên thường gọi: cellulase

Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-ß-D-glucan-4-glucannohydrolase

Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzym này bằng tên khác: endo-1,4-ß-Dglucanase; ß-1,4-glucanase; cellulase A; endoglucanase; alkali cellulase; cellulase A3; celludetrinase…

Enzym này thường thủy phân các liên kết 1,4-ß-D- glycoside trong cellulose và các ß-D-glucan của ngũ cốc

• Exoglucanase –EC 3.2.1.91,Tên thường gọi: cellulose 1,4-ß-cellobiosidase

Tên hệ thống: 1,4,ß-D-glucan cellobiohydrolase

Các tên khác: exo-cellobiohydrolase; exoglucanase; CBHI; cellulase C1; glucan cellobiohydrolase…

exo-ß-1,4-Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glycosid, giải phóng cellobiose

từ đầu không khử

• ß -glucosidase-EC 3.2.1.21

Tên thường gọi: ß-glucosidase

Tên hệ thống: ß-D-glucosid glucohydrolase

Các tên khác: cellobiase; ß-glucosid glucohydrolase; ß-1,6-glucosidase; salicilinase; arbutinase…

Enzym này thủy phân các gốc ß-D-glucosid.Một số trường hợp cũng thủy phân galactosidase, ß-D-fucoside; ß-D-xyloside; a-L-arabinoside

ßD-1.4.2 Tính chất

* Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu cùa enzym thể hiện ở chỗ mỗi enzym chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glucosid trong phân tử cellulose và các ß- D- glucan của ngũ cốc còn exoglucanase tác động lên các đầu chuỗi mới tạo thành ouyđể sản xuất chủ yếu là cellobiose, ß-glucosidase thủy phân các gốc ß-D-glucose tạo nên phân tử D-glucose … [5, 14, 39]

* Đặc tính vật lý và hóa học

Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulose có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần acid amin giống nhau Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau

- Nhiệt độ tối ưu: 40 – 50oC

- pH tối ưu: thường ở giữa 4 – 5

* Các chất ức chế

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose.Thủy ngân ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ

1.4.3 Cơ chế thủy phân cellulose

Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzym đến nghiên cứu tác động hiệp đồng của cả ba loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzym cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Tuy nhiên, hiện nay trật tự phản ứng của các enzym vẫn chưa có sự thống nhất và có nhiều tác giả đã trình bày cơ chế tác động của cellulase theo nhiều cách khác nhau [5, 6, 19, 21]

* Cơ chế cải tiến của Reese (1980)

Năm 1980, dựa vào quan niệm của Erickson, Reese và các cộng sự của ông đã đưa ra

cơ chế phản ứng mới cho phức hệ enzym cellulase Đầu tiên, C1 tác dụng lên cellulose kết tinh phá vỡ các liên kết đồng hóa trị và tạo ra cellulose biến tính hay cellulose trương nở

Sau đó endoglucanase tác dụng lên đầu chuỗi và giải phóng các cellobiose Tiếp đó dưới tác dụng của ba enzym: endoglucanase, cellobiohydrolase và β-1,4-glucosidase, cellulose

sẽ bị phân giải hoàn toàn và tạo thành glucose.[20, 23, 30, 31]

1.4.4 Cơ chế tác dụng của cellulase

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzym cellulase như endoglucanase (Cx), exoglucanase (C1) và β–glucosidase Một trong ba loại enzym trên không thể tự thủy phân đến cùng phân tử cellulose

Các loài vsv chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzym trong hệ enzym cellulase Hoạt tính enzym này thường mạnh hơn các enzym còn lại Chính vì thế, trong điều kiện tự nhiên, một loài vsv không thể tham gia thủy phân triệt để cellulose được

Từ những nghiên cứu riêng lẽ từng loại enzym đến nghiên cứu tác động tổng hợp của

cả 3 loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzym cellulase

sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều

cách trình bày khác nhau, nhưng cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả [2, 29]

Các loài vsv có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh,

Hình 1 5 Cơ chế tác động của enzym cellulase

có loài lại phát triển yếu Chính vì vậy, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Cơ chế cắt mạch:

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzym, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, mật độ cơ chất, lượng enzym…, một yếu tố quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của hệ enzym cellulase từ nhiều nguồn vsv khác nhau Quá trình thủy phân cellulase chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ 3 loại enzym cellulase trong hệ enzym cellulase Mỗi loài vsv chỉ có khả năng sinh tổng hợp ưu việt một loại enzym Chính vì thế ta phải khai thác enzym cellulase từ nhiều nguồn vsv.[14]

Hình 1 6 Cơ chế thủy phân Cellulose

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Rong lục (Ulva lactuca )

Rong lục thu nhận ở biển Hòn Chồng và Hòn Đỏ thuộc thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Rong thu nhận là rong tươi có chiều dài đồng đều, cọng cứng cáp Rong dạng phiến rộng, mềm mại, mọc xòe, mép nhăn gấp, màu lục thẫm hoặc lục nhạt, dài 10-25cm, rộng 4-10cm Rong sau khi thu nhận phải rửa sạch và ngâm để loại bỏ một số vsv, tạp chất trên bề mặt cọng rong, loại bớt hàm lượng muối Rong sau khi rửa được đưa vào thí nghiệm

hoặc bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh

2.1.2 B.subtilis và A.oryzae

Bacillus subtilis và Aspergillus oryzae: là các chủng giống được phân lập và bảo quản

tại PTN Vi sinh – Trung tâm Thực hành, Trường ĐH Nha Trang

Khuẩn lạc tròn, rìa hơi nhăn, có tâm sẩm màu, màu vàng xám Chủng được cấy trên môi trường thạch và được bảo quản trong môi trường lạnh 4℃ của tủ lạnh

Hình 2 2 Khuẩn lạc B.subtilis Hình 2 1 Rong lục Ulva lactuc

Khuẩn lạc của Aspergillus oryzae mộc lan trên đĩa thạch Có màu xanh lục hoặc có

màu vàng hoa câu khi chúng già Bảo quản chủng ở nhiệt độ 4℃ của tủ lạnh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học của rong

Phân tích độ ẩm, hàm lượng tro, protein thô, carbohydrate theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC [34], theo TCVN và tiêu chuẩn ngành TCN:

a) Hàm lượng tro:

- Nguyên tắc của phương pháp xác định hàm lượng tro: Mẫu được nung ở nhiệt độ 550ºC- 600°C để nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, đem cân phần tro của mẫu sau khi nung và tính

ra phần trăm tro có trong mẫu

- Tiến hành thí nghiệm: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550º – 600°C đến khối lượng không đổi Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 0,0001g Cho vào chén sứ khoảng 5g mẫu Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác như trên, cho tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ từ từ cho đến 550ºC – 600°C Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thường khoảng 6 - 7 giờ Trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại đến tro trắng

Để nguội trong bình hút ẩm và cân đến độ chính xác như trên Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ như trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho đến khối lượng không đổi

Hình 2 3 Khuẩn lạc của A.oryzae

-Tính toán kết quả: Hàm lượng tro theo % được tính theo công thức:

X = ((G2 - G)/(G1 - G)) × 100

Trong đó G: khối lượng chén (g)

G1: khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g)

G2: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)

b) Protein thô:

Lượng nitơ có trong mẫu được xác định bằng phương pháp micro-Kjeldahl, được tiến hành như sau: Cân khoảng 2g mẫu rong khô, cho vào bình cầu 100ml, cho thêm vào 30ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10g K2SO4 và 1g CuSO4.5H2O Hỗn hợp này được đun nhẹ cho đến khi hết sủi bọt thì đun tăng mạnh nhiệt độ lên Khi dung dịch chuyển thành không màu hoặc trong suốt, tiếp tục đun thêm 1 giờ nữa, để nguội, pha loãng với nước cất và chuyển vào bình Kjeldahl 800ml Thêm vào 100ml dung dịch NaOH 40%, lắp bình với hệ thống chưng cất, bình hứng có 25 ml dung dịch H2SO4

0,1N và tiến hành chưng cất Khi hai phần ba lượng chất lỏng đã được cất, kiểm tra xem phản ứng đã xảy ra hoàn toàn chưa Bình hứng được lấy ra chuẩn độ với dung dịch KOH 0,1N Khi đó, lượng protein thô được tính theo công thức sau:

Protein = Nitơ x 6,25

c) Hàm lượng lipid: (TCVN 4331:2001(ISO 6492:1999) )

Cân 20g mẫu kèm 10g natri sunfat khan cho vào cốc lọc Đưa vào trụ triết của bộ Soxhlet, thêm dung môi dietyl ete gần đến vạch chảy tràn, ngâm qua đêm Sau 24h thêm dung môi cho trụ triết,qua mức chảy tràn chảy về lại bình cầu Bình cầu được nung nóng, dung môi bay hơi mà lipid không bay hơi Dung môi bay hơi gặp ống sinh hàn, rớt xuống trụ triết Quá trình triết diễn ra, quá trình diễn ra 5 lần khoản 1 giờ đồng hồ Lượt cuối cùng dừng lại lúc dung môi trong trục triết gần đến mức chảy tràn Lấy bình cầu, làm nút bông để vào tủ sấy ở nhiệt độ 103℃ trong 10 phút Chuyển vào bình hút

ẩm, cân sự thay đổi khối lượng của bình cầu để tìm khối lượng lipid trong 20g rong tươi

d) Phân tích tổng cellulose

Cân chính xác 1-2 gam rong cho vào bình tam giác 200ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp vào ống sinh hàn đun hoàn lưu trong 30 phút kể từ lúc sôi Chú ý đừng để bọt trào lên

Lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng hoặc ly tâm Rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH 0,5% nóng Tiếp tục cho cặn tác dụng với 10ml HCl 10% Thêm vào đó 10ml dung dịch natri hypochlorite từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều Để yên trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng hoặc ly tâm Cho cặn lại tiếp tục tác dụng trở lại với NaOH 0,5% ở nhiệt độ 40℃ Để yên vài phút và ly tâm Làm như thế 1-2 lần nữa để có cellulose thật trắng Sau cùng rửa sạch thật kỹ bằng nước sôi Sấy khô và

cân

𝑿 = 𝒂

𝒎𝒙 𝟏𝟎𝟎 Trong đó: a là trọng lượng cellulose

m là khối lượng mẫu

e) Phân tích hàm lượng nước : Tiêu chuẩn ngành 10TCN 842:2006 về tiêu

chuẩn rau quả

2.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng

Phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp đếm số khuẩn lạc có trên bề mặt thạch dinh dưỡng dùng để nuôi cấy vsv Từ số khuẩn lạc đếm được và hệ số pha loãng,

ta tính số vsv có trong một đơn vị thể tích dịch chứa vsv Đơn vị là CFU/ml với mẫu lỏng và CFU/g với mẫu rắn

2.2.2 Phương pháp cấy chấm điểm

Phương pháp cấy chấm điểm là phương pháp cấy sinh khối vsv thành một chấm điểm trên môi trường thạch dinh dưỡng, vsv sẽ hấp thu dinh dưỡng từ môi trường thạch

để tạo thành các sản phẩm chuyển hóa Vsv sẽ phát triển và ăn lang ra xung quanh điểm cấy và tạo thành các chất chuyển hóa Trong đồ án này, sản phẩm chuyển hóa là đường khử Môi trường dinh dưỡng có chứa cơ chất CMC sẽ bắt mầu thuốc thử Lugol còn

đường khử thì không Qua bề rộng của vòng không bắt màu ta biết được khả năng phân giải cơ chất được bổ sung vào môi trường thạch dinh dương, trong đồ án này cơ chất

bổ sung là cơ chất CMC Ủ ở nhiệt độ và thời gian phù hợp

Rong lục

Khảo sát thành

phần hóa học

Xử lý nguyên liệu

Rong nguyên liệu

Thời gian (giờ)

Nhiệt độ

( )

Mật độ vi sinh

vật (CFU/g)

Sơ đồ 2 1 Sơ đồ tổng quan thủy phân rong lục

Thuyết minh sơ đố:

Chủng vsv B.subtilis và A.oryzae thuần được xác định khả năng cellulase bằng

cách cho phân giải CMC Chủng vsv nếu sinh cellulase thì được mang đi tăng sinh khối

2.3.1 Tăng sinh khối vsv

Cân 13g môi trường dinh dưỡng LB cùng với 1000mL nước cất, hấp vô trùng 1210C, trong vòng 15 phút

*Các bước tiến hành nuôi cấy vsv

Cho 3mL nước muối sinh lý vào ống nghiệm chứa khuẩn lạc của chủng vsv Hút 1mL cho vào bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng lỏng LB đã được hấp vô trùng

Nuôi cấy trong điều kiện lắc 200 vòng/phút với B.subtilis và 120 vòng/phút với

A.oryzae Ở 280C trong 48 giờ để thu sinh khối vi khuẩn

2.3.2 Đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn

Được xác định bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch LBA với B.subtilis và DG18 với A.oryzae Sau hai ngày ủ ở nhiệt độ 35℃ với B.subtilis và ba ngày với A.oryzae

2.3.3 Thu sinh khối vsv

Dịch nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng [3]

- Pha sinh khối vi sinh thu được vật trong 1 lít đệm axetat

- Định lượng mật độ vsv bằng cách đếm đĩa, điều chỉnh mật độ vsv đến 108

CFU/mL

2.3.4 Thí nghiệm xác định hoạt tính cellulase của hai chủng vsv

Kiểm tra khả năng sinh cellulase của vsv bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có

cơ chất CMC

Nguyên tắc của phương pháp là nuôi vi sinh trên môi đặc hiệu có bổ sung cơ chất CMC như sau:

* Môi trường xác định hoạt tính sinh cellulase

- Môi trường khoáng + CMC (g/l):

Môi trường thanh trùng 121℃ trong 15 phút

Dùng phương pháp cấy chấm điểm Ủ ở 350C trong 36 giờ, sau đó tráng dịch Lugol trên đĩa thạch và đo vòng phân giải trong suốt, không bắt màu nhuộm xung quanh điểm cấy

2.3.5 Phương pháp đo đường khử và xây dựng đường khử glucose

a) Nguyên tắc:

Phương pháp xác định hàm lượng đường khử Enzym celluase thủy phân cơ chất CMC tạo thành sản phẩm là các đường có chứa gốc khử Hàm lượng đường khử tạo thành được xác định bằng cách cho phản ứng với dung dịch DNS 3,5- Dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam Màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540nm Dựa theo biểu đồ đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:

* Thiết bị bao gồm: tủ ấm 400C, máy khuấy từ, máy quang phổ

- Cân 0.5g DNS vào 30mL nước cất hòa tan trên bếp khuấy từ 50 độ

-Thêm 0.5mL dung dịch NaOH 4M

- Thêm 15g muối kép tartrat

- Định mức đến 50mL.Bảo quản trong lọ thủy tinh sẩm màu ở 40C

- Chuẩn độ 3mL thuốc thử bằng HCl 0.1M với chất chỉ chị phenolphtalein,hết 5-6 mL HCl là được

Dung dịch đường chuẩn: Pha 0.1g glucose vào nước cất Sau đó thêm nước đến20mL Dung dịch có mật độ 5mg/mL

c) Xây dựng đường chuẩn glucose

Chuẩn bị 20mL dung dịch glucose 1mg/mL rồi pha loãng dung dịch này với độ pha loãng khác nhau từ 0.1 – 0.3 mg/mL Thực hiện các thí nghiệm theo bảng sau:

Hình 2 4 Sự tạo phức màu của thuốc thử

24

Bảng 1 2 Xây dựng đường chuẩn Glucose

Lấy 0.5mL từ mỗi dịch pha loãng glucose ở trên và làm phản ứng xác định hàm lượng đường khử như phương pháp đã được mô tả ở trên

d) Đường chuẩn Glucose

Đường chuẩn Glucose được xây dựng :

Sơ đồ 2 2 Đường chuẩn Glucose

25

e) Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu

Cho 0.5mL dịch của mẫu kiểm tra và 0.5mL dung dịch DNS vào eppendof 1.5mL Đun sôi 5 phút, làm lạnh và ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút Thu 1mL dịch trong và

đo độ hấp phụ tại bước sóng 540nm

* Công thức tính định lượng đường khử

Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y =OD540nm; x=[glucose] (mg/mL) và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel

- Từ phương trình biểu đồ đường cong chuẩn tính được X mg/mL đường khử trong dung dịch đường pha loãng

- Chọn hệ số pha loãng n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn

- Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = (x * n)/m

*Trong đó:

- Với x là kết quả đo được đơn vị là mg/mL

- Với n là số mL dung dịch đệm pha loãng mẫu

- Với m là khối lượng mẫu cân đem đi phân tích

2.3.6 Xác định khả năng của vsv trên cơ chất rong lục

Vsv được cho vào rong để thủy phân Lượng đường khử sinh ra được đo nhằm đánh giá khả năng thủy phân của vsv

2.3.7 Chọn chủng vsv phù hợp

Có ba sự lựa chọn Lựa chọn thứ nhất là chỉ dùng B.sutilis để thủy phân Lựa chọn thứ hai là chỉ dùng A.oryzae để thủy phân Lựa chọn thứ ba là dùng kết hợp hai chủng vsv

là B.sutilis và A.oryzae để cùng thủy phân rong lục

2.3.8 Khảo sát chế độ thủy phân

Nghiên cứu chế độ thủy phân phù hợp với chủng vsv được chọn ở mục 2.3.7 Xác định các vùng ảnh hưởng của các yếu tố như: Nhiệt độ, mật độ vsv, thời gian…

26

2.3.9 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân

Dựa vào các vùng ảnh hướng được xác định ở mục 2.3.8 Tối ưu hóa quá trình thủy phân rong bởi các yếu tố ảnh hưởng: nhiệt độ, mật độ vsv và thời gian thủy phân

2.3.10 Sản phẩm thủy phân rong lục

Sản phẩm thủy phân rong lục có hàm lượng đường khử lớn Phù hợp để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

2.4 Bố trí thí nghiệm

2.4.1 Thí nghiệm kiểm tra khả năng sinh cellulase thủy phân CMC

Môi trường thạch khoáng dinh dưỡng + CMC được đổ vào đĩa petri vô trùng Làm lạnh ở nhiệt độ phòng Khi thạch dinh dưỡng đông lại và ổn định, ta cấy vsv theo phương

pháp cấy điểm lên bề mặt thạch Một đĩa cấy B.sutilis, một đĩa cấy A.oryzae Ủ ở nhiệt độ

35℃ trong vòng 72 giờ Sau 72 giờ, dùng thuốc thử Lugol trải trên bề thạch, idol trong thuốc thử tạo phức với cơ chất CMC nhưng không tạo phức màu với đường khử Ta đo vòng phân giải là vòng không bắt màu thuốc thử Kích thước vòng phân giải được tính như sau:

Vòng phân giả được xác định: 𝑫−𝒅

𝟐Với: D là đường kính vòng thủy phân

d là đường kính giếng khuếch tán

2.4.2 Khảo sát khả năng sinh cellulase của vsv ở các nồng độ muối (NaCl) khác nhau

Đối tượng nghiên cứu là rong lục Ulva lactuca là rong sống ở biển, môi trường sống chứa muối (NaCl) Trong bản thân của Ulva lactuca có hàm lượng muối nhất định

Vì vậy đồ án khảo sát khả năng thủy phân Cellulose trên cơ chất là rong lục của các

vi sinh đối tượng nghiên cứu của đồ án ở các mật độ muối khác nhau Với mục đích đánh giá sự ảnh hưởng của hàm lượng muối lên khả năng sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh cellulase thủy phân cellulase (CMC) Thông số của bố trí thí nghiệm được cố định như

27

sau: 108 CFU B.subtilis+A.oryzae; Nhiệt độ 35℃; Thời gian 72 giờ; Môi trường khoáng + CMC không chứa agar tương tự như mục 2.3.2 với lượng là 200mL Nuôi cấy lắc với 120

vòng/phút

Bố trí thí nghiệm như sau:

Sơ đồ 2 3 Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng

thủy phân của vsv 2.4.2 Khảo sát thành phần hóa học của rong

Dựa vào các phương pháp xác định thành phần hóa học của rong lục ở mục 2.2

để xác định hàm lương chất dinh dưỡng trong rong lục nguyên liêu

2.4.4 Xử lý rong nguyên liệu

Rong lục là loại rong sống ở biển nên mang trong mình hàm lượng muối nhất định

Vì vậy quá trình xử lý rong giúp bên cạnh loại bỏ táp chất cát, sạn….còn loại bỏ một lượng muối nhất định Mật độ muối trong rong thu nhận sử dụng trong đồ án được xác định theo TCVN 4330:1986 Kết quả sau khi đo, hàm lượng muối của rong tại biển hòn Chồng, hòn

Đỏ Nha Trang có mật độ là 1.6 %

Cố định tỉ lệ rong và nước là 100g rong ngâm trong 1L nước sạch Có sử dụng phương pháp khuấy đảo Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian ngâm rong, bước nhảy là 30 phút, thí