Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và phân loại cây bảy lá một hoa (paris) thu thập ở lai châu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠMNGÔ THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA PARIS THU THẬP Ở LAI CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU

VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)

THU THẬP Ở LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ THÙY LINH

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU

VÀ PHÂN LOẠI CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (PARIS)

THU THẬP Ở LAI CHÂU

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy

Thái Nguyên, năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sựhướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Các kết quả nghiên cứu là trungthực và chưa được công bố ở bất cứ công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018

Tác giả

Ngô Thùy Linh

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy,khoa Sinh học trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo,hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinhhọc, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn,truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Bangiám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy, cô các phòng banchức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đãluôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em

Luận văn là sản phẩm của đề tài cấp Bộ có mã số B2017-TNA-04-QG doPGS.TS Vũ Thị Thu Thủy bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học làmchủ nhiệm

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018

Tác giả

Ngô Thùy Linh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC .iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa 4

1.1.1 Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa

4 1.1.2 Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa 5

1.2 Các phương pháp định danh thực vật

6 1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu

7 1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 8

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu thực vật 14

2.2 Địa điểm nghiên cứu, hóa chất và thiết bị

14 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 14

2.2.2 Hóa chất, dụng cụ 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 15 2.3.3 Phương pháp phân tích trình tự nucleotide 18

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa 19 3.1.1 Đặc điểm hình thái của mẫu cây Bảy lá một hoa 19

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu của mẫu cây Bảy lá một hoa 20

3.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm mã vạch DNA của mẫu cây Bảy lá một hoa

23 3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 23

3.2.2 Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen matK 23

3.2.3 Kết quả khuếch đại và phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS 29

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

1 Kết luận 34

2 Đề nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CBOL : Consortium for the Barcode of Life

DNA : Deoxyribonucleic acid

ITS : Internal Transcribed Spacer

kb : Kilobase

matK : MaturaseK

NCBI : The National Center for Biotechnology Information

P :

:

:

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Mồi matK sử dụng trong kỹ thuật PCR 17

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 17

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 17

Bảng 2.4 Mồi ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR 18

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 18

Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 18

Bảng 3.1 Một số trình tự đoạn gen matK sử dụng để xác định độ tương đồng và sai khác với mẫu SH 27

Bảng 3.2 Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự gen matK 27

Bảng 3.3 Một số trình tự vùng gen ITS sử dụng để xác định độ tương đồng và sai khác với mẫu SH 32

Bảng 3.4 Độ tương đồng và phân ly dựa trên trình tự vùng gen ITS 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm tổng quát 15

Hình 3.1 Hình thái cơ quan sinh dưỡng của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu 19

Hình 3.2 Cấu tạo giải phẫu cuống lá 20

Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân 21

Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu rễ 22

Hình 3.5 Kết quả tách chiết DNA tổng số của cây Bảy lá một hoa 23

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen matK bằng kỹ thuật PCR

24 Hình 3.7 Kết quả Blast trình tự gen matK 25

Hình 3.8 Trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu 26

Hình 3.9 Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các loài Bảy lá một hoa trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK

28 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại vùng gen ITS bằng kỹ thuật PCR 29

Hình 3.11 Kết quả Blast trình tự vùng gen ITS 30

Hình 3.12 Trình tự nucleotide của vùng gen ITS phân lập từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập ở Sìn Hồ, Lai Châu 31

Hình 3.13 Sơ đồ mô tả mối quan hệ di truyền giữa các mẫu cây Bảy lá một hoa trong chi Paris dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS 33

1 Lý do chọn đề tài

MỞ ĐẦU

Bảy lá một hoa là tên gọi chung của các mẫu cây thuộc chi Paris Cây

Bảy lá một hoa còn gọi là Thất diệp nhất chi mai, Độc cước liên, Thiết đăngđài, Chi hoa đầu, Tảo hưu, Thảo hà xa, Trọng lâu, Thất tử liên, Đăng đài thất,

Cúa dô (H’Mông)… Hiện nay, chi Paris được công bố có 24 loài, mỗi loài gồm nhiều giống khác nhau Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê

cho thấy đã có

8 giống Nhiều giống được mô tả chi tiết về mặt hình thái, đó là căn cứ ban đầu

để nhận dạng và phát hiện sự có mặt của các cây quý hiếm này [30]

Ở Việt Nam, cây Bảy lá một hoa được tạm gọi tên khoa học là Paris polyphylla Sm [12], [30] Đây là những loài thảo mộc có giá trị trong chữa một

số bệnh như cầm ho, giảm cơn hen, cầm máu, ức chế trực khuẩn lị, thươnghàn… Đặc biệt, chữa cả một số bệnh nan y như ung thư, rắn cắn chính vì cónhiều giá trị mà hiện tại cây Bảy lá một hoa đang bị khai thác bừa bãi, có nguy

cơ tuyệt chủng Từ năm 1999, Phạm Hoàng Hộ mô tả đặc điểm hình thái của 5loài [5] Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng sự lập khóa phân loại chitiết cho 8 loài và 2 giống [20] Tuy nhiên, tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ởViệt Nam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm

Có nhiều phương pháp có thể định danh thực vật làm thuốc đảm bảo độchính xác và hiệu quả Các phương pháp thường dùng như nghiên cứu và sosánh các đặc điểm về hình thái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh hướng nghiên cứunày đã thành công trên một số đối tượng cây trồng như cây Ngô đồng đỏ, Rongcâu chỉ, Ráng thư dực [2], [3], [4]… Tuy nhiên, khi cây không còn nguyên vẹn,hay đã được chế biến thì phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả

Sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại trong những năm gần đây

có bổ sung vào hệ thống phân loại sinh vật phương pháp phân loại học phân tử.Đây là phương pháp có độ chính xác cao, đặc biệt rất cần đối với thực vật dùnglàm thuốc muốn xác định ở cấp độ loài, ngay cả khi đã được chế biến Việc xác

định chính xác tên loài là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượngsản phẩm Bên cạnh đó, kết quả nhận diện có vai trò quan trọng trong việc bảotồn các loài có nguy cơ tuyệt chủng.

Mã vạch DNA là một phương tiện nhận biết mới của sinh học phân tử.Một số mã vạch DNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân

loại các cây dược liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó gen matK nằm trong lục lạp mã hóa cho enzyme mature K Nhiều nghiên cứu đã sử dụng gen matK trong việc định loại cây trồng và cũng mang lại những thành tựu nhất định [11], [24],… Vùng gen ITS bao gồm trình tự ITS1-5.8S-ITS2

cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều Hiện nay, số lượng các trình tự

nucleotide của vùng ITS đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới khá

phong phú, thuận lợi cho việc phân tích so sánh Các nghiên cứu phát sinh loài

thực vật dựa trên vùng gen ITS ở cây Đẳng sâm, cây Dâu, Nấm và nhiều thực vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng

[13], [25], [33]

Tỉnh Lai Châu là một tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam được phát hiện có

sự có mặt của cây Bảy lá một hoa [20] Mẫu cây thu được có những đặc điểm gì

và thuộc loài nào là câu hỏi được đặt ra trong nghiên cứu này Xuất phát từ

những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái,

giải phẫu và phân loại mẫu cây Bảy lá một hoa (Paris) thu thập ở Lai Châu”.

2 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng được dữ liệu về đặc điểm hình thái, giải phẫu và đặc điểm của

đoạn gen matK, vùng gen ITS dùng trong phân loại thực vật phục vụ nhận dạng

cây Bảy lá một hoa

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cơ quan sinh dưỡng câyBảy lá một hoa thu thập tại huyện Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu

- Nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của đoạn gen matK.

- Nghiên cứu xác định trình tự nucleotide của vùng gen ITS.

- Nghiên cứu xác định mối quan hệ của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập được dựa trên phân tích trình tự nucleotid của đoạn gen matK và vùng gen ITS

nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Bảy lá một hoa

1.1.1 Đặc điểm, phân loại cây Bảy lá một hoa

Cây Bảy lá một hoa là thực vật thuộc ngành Magnoliophyta (Mộc lan, Hạt kín), lớp Liliopsida (Hành), bộ Dioscoreales (Củ nâu), họ Trilliaceae (Trọng lâu), chi Paris (Bảy lá một hoa).

Chi Paris hiện tại được công bố có 22 loài, trong đó gồm nhiều giống khác nhau [16] Chỉ riêng loài Paris polyphylla kết quả thống kê cho thấy đã

gồm 8 giống Các giống khác nhau về số lượng, hình dạng lá và sự phân bố

[32] 8 giống thuộc loài Paris polyphylla gồm:

Paris polyphylla var Alba Q u ý C h â u , H ồ Bắc, V ân N am

Paris polyphylla var chinensis A n H u y , P hú c K i ế n , Q u ả n g Đôn g , Q u ả n g

T

â y , Q u ý C h â u , H ồ Bắc, Hồ Nam , G i a n g T

ô , G i a n g T â y , T ứ Xu y ê n , Đ ài L o a n , V â n N

a m , L à o , M y a n m ar, T h ái L a n , Vi ệt N am

Thiểm Tây, Sơn Tây

Paris polyphylla var nana T ứ X u y ên

Paris polyphylla var panxiensis T ứ X u y ên

Paris polyphylla var polyphylla T r u n g Q uố c , H i m a l a y a s , phía bắc Đông

Tên khoa học là Paris polyphylla Sm Tên đồng nghĩa Daiswa polyphylla (Smith) Raf Tên khác như Thất diệp nhất chi mai, Độc cước liên, Thiết

đăng đài, Chi hoa đầu, Tảo hưu, Thảo hà xa, Trọng lâu, Thất tử liên, Đăng đàithất, Cúa dô (H’Mông)… cũng được sử dụng để gọi về cây Bảy lá một hoa [12],[30]

Ở Việt Nam, từ năm 1999, Phạm Hoàng Hộ đã mô tả đặc điểm hình thái

của 5 loài Các loài đó là Paris delavayi, Paris polyphylla, Paris fargesii, Paris yunanensis, Paris hainanensis [5] Đến năm 2016, Nguyễn Quỳnh Nga và cộng

sự đã lập khóa phân loại chi tiết cho 8 loài và 2 giống [20] Các nghiên cứu vềcây Bảy lá một hoa đều khẳng định tiềm năng của cây Bảy lá một hoa ở ViệtNam còn khá phong phú và cần thiết được khai thác thêm

Bảy lá một hoa là loại cây một lá mầm, thân thảo, sống lâu năm Từ củnổi lên mặt đất một thân mọc thẳng, cao chừng 0,3-0,8 m, thân thon dài, trơnnhẵn, không có cành, phía gốc có 1 số lá thoái hóa thành vảy bao lấy thân cây.Thân mềm, mọng nước Phần thân trên mặt đất của cây lụi hàng năm vào cuốimùa thu Củ có ngấn, phình to, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màuxám đen Rễ mềm, mọc dày theo củ Giữa thân có 1 tầng lá mọc vòng, thường

từ 4 đến 9 lá Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím Phiến lá hình mác, hình trứng, bầudục,… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm Đầu phiến lá nhọn, mặt trên màu xanh đậm,mặt dưới màu nhạt hơn Hoa mọc trên đỉnh cây, cuống hoa dài 14 cm Lá đàibằng số cánh tràng Nhụy màu tím đỏ, bầu có 3 ngăn Nhị mảnh, có bao phấnmàu vàng nâu, xếp thành 2 vòng, xen kẽ nhau, mỗi vòng có 5 nhị [5], [20]

1.1.2 Phân bố, vai trò của cây Bảy lá một hoa

Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rácdưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều

mùn Paris là một chi nhỏ, hiện chỉ có một số loài phân bố ở vùng cận nhiệt đới

hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu: Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan và Myanma Ở ViệtNam, cây Bảy lá một hoa hầu như chỉ thấy ở các tỉnh miền núi phía bắc nhưNinh Bình, SaPa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Sìn Hồ (Lai Châu),… [12],

Theo dân gian, cây Bảy lá một hoa có rất nhiều công dụng để trị một sốbệnh như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô,… Thân rễBảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, vào kinh can, có tácdụng xổ hạ, lợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc Thân rễ của cây còn chữasốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải độc [12] Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đạicòn cho thấy các thành phần trong cây Bảy lá một hoa có tác dụng: cầm ho,giảm cơn hen Chiết xuất hóa học trong thân và rễ còn có tác dụng cầm máu, ứcchế với mức độ khác nhau đối với trực khuẩn lị, thương hàn, tụ cầu vàng, liêncầu khuẩn đồng thời có tác dụng ức chế Leptospira và virut cúm Ngoài ra chiếtxuất ở cây Bảy lá một hoa có tác dụng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung [35].Tại vùng Quảng Tây (Trung Quốc) có câu “Ốc hữu thất diệp nhất chi hoa / Độc

xà bất tiến gia” nghĩa là trong nhà có cây Bảy lá một hoa thì rắn độc không vàonhà được Ngoài công dụng chữa sốt và rắn độc cắn, vị tảo hưu (thân rễ của câyBảy lá một hoa) còn dùng chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, ho lao, dùng ngoài dathì giã nát đắp lên nơi sưng đau Ở Châu Âu người ta dùng thân, rễ và quả của

loài Paris quadrifolia làm thuốc tẩy nhưng có chất độc Dùng với liều vừa phải,

thân, rễ và quả có tác dụng chống co thắt [30], [35]

1.2 Các phương pháp định danh thực vật

Có rất nhiều phương pháp để định danh thực vật Các phương pháp đềudựa trên nguyên tắc những thực vật có chung nguồn gốc thì có những tính chấtgiống nhau Thực vật càng gần nhau thì mức độ giống nhau càng nhiều Sựgiống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinhhọc, nhưng chủ yếu dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đãthu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết Việc quan sát, sosánh cấu tạo của cây thường được tiến hành trong điều kiện tự nhiên và môitrường thực nghiệm Kỹ thuật PCR thường dùng để xác định mối quan hệ phátsinh giữa các loài và là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinhhọc Việc kết hợp 2 phương pháp này sẽ có hiệu quả trong nhận diện và bảo tồncác loài thực vật

1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu

Hầu hết cấu trúc của các cơ quan đều nghiên cứu ở mức độ hiển vi, vìvậy mà các mẫu khi sử dụng phương pháp giải phẫu đều được cắt thật mỏng,sau đó để giữ được cấu trúc bên trong tế bào, thuận lợi cho việc quan sát người

ta thường dùng phương pháp nhuộm màu Việc nhuộm màu này giúp chúng taphân biệt được các thành phần cấu tạo của các cơ quan, vì mỗi một thành phầnthì bắt một màu nhất định Nguyên tắc của phương pháp nghiên cứu hình thái

và giải phẫu chủ yếu là dựa vào việc quan sát, so sánh và trên cơ sở mẫu vật đãthu thập được để phân tích, tổng hợp đi đến suy diễn giả thiết Phương pháp sosánh hình thái, giải phẫu đã cung cấp nhiều thông tin có giá trị trong định loạithực vật [2], [3], [4], [6], [8]

Nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Ngô đồng đỏ ở Cù Lao Chàm, nhómtác giả Vũ Văn Dũng và Đinh Thị Phương Anh (2016) chỉ ra rằng ở Việt Nam

có 2 loài Ngô đồng đỏ cùng thuộc chi Firmiana khác nhau về nơi sống có sự

khác biệt về nhiều đặc điểm hình thái như thân, lá, cụm hoa, hoa, quả Những

sự khác biệt thu được là tài liệu cung cấp cho việc nhận diện mẫu cây Ngôđồng đỏ và làm căn cứ để sử dụng bền vững và phát triển loài cây ngô đồng đỏ

ở Cù Lao Chàm [2]

Năm 2006, Lê Ngọc Hân và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích

đặc điểm hình thái và so sánh các đại diện họ Ban – Hypericaceae juss ở Việt

Nam, nhóm nghiên cứu đã xác định được tông và chi thuộc họ Ban Kết quảnghiên cứu được sử dụng làm khóa phân loại ở mức độ chi [3]

Nghiên cứu của Lê Như Hậu (2009), khi phân tích hình thái các mẫu tiêubản của 7 loài Rong câu chỉ ở Việt Nam phát hiện thấy có sự thay đổi lớn vềmặt hình thái Tuy nhiên, giữa chúng vẫn có những đặc điểm chung về cấu tạothân, kiểu phân nhánh, hình dạng quả Các đặc điểm hình thái ngoài cho thấy,tuy có sự phân bố rộng khắp và được nuôi trồng dọc theo biển Việt Nam nhưngchúng vẫn xuất phát từ cùng một loài [4]

Ráng thư dực (Thelypteridaceae Ching ex Pic Serm) là một họ lớn với

khoảng 50 chi và hơn 1000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới Tại ViệtNam, nhóm nghiên cứu của Doãn Hoàng Sơn cùng cộng sự (2017) đã sử dụngphương pháp so sánh hình thái để mô tả một số đặc điểm cơ bản của các chitrong họ Ráng thư dực Kết quả nghiên cứu đã cung cấp dữ liệu của 17 chi có ởViệt Nam về đặc điểm hình thái, sinh thái, khu phân bố, kèm theo thông tin về

số lượng loài của các chi đó ở Việt Nam [8]

Chi Mua tuy là chi nhỏ nhưng những đại diện thuộc chi Mua lại có vaitrò quan trọng trong các hệ sinh thái rừng thứ sinh Một số loài thì làm thuốc,loài thì làm thực phẩm, làm cảnh Năm 2017, Khuất Văn Quyết cùng Đỗ ThịXuyến đã tiến hành mô tả đặc điểm hình thái chi Mua ở Việt Nam thông qua

mô tả dạng sống, hình thái lá, hình thái hoa, cụm hoa, quả, hạt của 13 loài Trên

cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái đã lựa chọn được 51 đặc điểm làm cơ sởxây dựng khóa phân loại các loài trong chi Mua ở Việt Nam [6]

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử

Các phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái đã thành côngtrên nhiều loài [2], [3], [4], [6], [8] Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của khoahọc kỹ thuật các phương pháp phân loại có độ chính xác cao hơn cũng đượcchú trọng trong nghiên cứu Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử làmột trong những lựa chọn của nhiều nhà nghiên cứu Theo đó, phân loại dựavào sinh học phân tử có nghĩa là sử dụng các phân tử lớn như DNA, RNA,protein để làm dấu hiệu nhận biết và phân loại sinh vật

DNA barcode là một đoạn trình tự nucleotide ngắn, từ một phần của hệgen và được dùng giống như cách một máy quét nhận diện các loài sinh vật.Trọng tâm nghiên cứu barcode ở thực vật chủ yếu là về đánh giá hiệu quảtương đối của các đoạn gen chỉ thị đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinhloài Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loàithực vật gặp nhiều khó khăn Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên

không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiềuđặc điểm mong muốn Hebert P.D, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ởOntario, Canada từ năm 2003 đã đề xuất mã vạch DNA (DNA barcode, chỉ thịDNA) giống như một cách để xác định loài [18].

Để đảm bảo là một mã vạch DNA điển hình cần 3 yếu tố Thứ nhất phải

có hiệu suất nhân bản cao và trình tự có tính đặc hiệu Thứ hai phải có tính phổbiến Thứ ba có khả năng phân biệt được nhiều loài một cách đồng thời [28]

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử có thể giám định được ngay cảkhi các mẫu không còn nguyên vẹn Việc kết hợp giữa chỉ thị phân tử DNA vàchỉ thị hình thái sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữa sinh vật nàyvới sinh vật khác một cách chính xác [23]

Hiện nay, nhiều loại thảo dược được sử dụng rộng rãi trong việc điều trịcác bệnh, góp phần phát triển ngành công nghiệp dược liệu Những cây dượcliệu luôn phải xác định ở cấp độ loài, vì vậy cần phải định danh chính xác đểđảm bảo được sản phẩm chất lượng và có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiêncứu các đặc tính đa dạng di truyền và bảo vệ các loài quý hiếm Bên cạnh đó,dược liệu còn bị pha trộn nhiều làm giảm đi hiệu quả của thuốc, hay dược liệu

bị thay thế bởi các thành phần chứa độc tính, nên một số trường hợp có thể thểgây nguy hiểm đến tính mạng Vì vậy, xác định chính xác nguồn gốc của cácloại dược liệu là điều cần thiết Nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứuxác định nguyên liệu thảo dược bằng mã vạch DNA He J và cộng sự (2010)cũng sử dụng mã vạch DNA để nghiên cứu xác định một số mẫu cây dược liệu

trong chi Aconitum [18] Chỉ thị DNA thường dùng trong phân loại cây thuốc

là matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL …

Gen rpoC1 mã hóa 1 trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp Gần đây, nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra hiệu quả của việc sử dụng gen rpoC1

vào việc định danh thực vật Nghiên cứu của Vũ Thị Thu Thủy và cộng sự

(2016) đã sử dụng đoạn gen rpoC1 có kích thước 558 bp của mẫu thu thập tại

huyện Bình Gia, tỉnh Lạng Sơn đã xác định được mối quan hệ của mẫu với các

loài trong chi Paris ở mức 96-99 % [10].

Nghiên cứu của Liu và đồng tác giả (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài Bryophytes Tuy nhiên,

CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài của đoạn

gen rpoC1 là thấp nhất (43%) Do vậy cần có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoC1 làm chỉ thị barcode trong các

nghiên cứu giám định loài [24], [28]

Gen matK mã hóa cho enzyme maturase K liên quan đến quá trình loại

bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA Trong số các gen lục lạp,

matK có kích thước khoảng 1550 bp và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã

được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và

phát sinh loài ở thực vật Trình tự gen matK trong các gen lạp thể cũng có khả năng phân biệt loài cao CBOL đã thử nghiệm gen matK trên gần 550 loài thực

vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng

cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng gen matK là một trong

những mã vạch chuẩn cho thực vật [23], [28]

nghiên cứu, nhóm tác giả phát hiện một loài trước đây được cho là lan thực ralại là hai loài tách biệt Loài này sống trên những dốc khác nhau trên núi và cóhoa hình dạng khác nhau để thích nghi với những loài côn trùng thụ phấn khácnhau [31]

Nghiên cứu của Huang và cộng sự (2017) xác định trình tự của gen lục

lạp loài Paris vietnamensis có 158224 bp Trong đó gen matK gồm 1547

nucleotide, nằm từ vị trí 1677 đến 3224, quy định tổng hợp maturase K có 515axit amin (KX784050) [34] Hay như khi phân tích hệ gen lục lạp của loài

Daiswa chinensis, nhóm tác giả này cũng thu được 157847 bp Gen matK nằm

ở vị trí từ 1651 đến 3198 quy định tổng hợp maturase K (KX784048) [34]

Khi sử dụng gen matK để so sánh mối quan hệ của loài có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R tanguticum (Maxim ex Regel) Maxim.

ex Balf, R officinale Baill., và loài gần gũi Rheum palmatum L Kết quả

nghiên cứu cho thấy mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau làkhá cao [11]

Trên cây Bảy lá một hoa, việc sử dụng gen matK trong việc định danh

cũng đã được thực hiện bởi một số các tác giả Nghiên cứu của Vũ Thị Thu

Thủy và cộng sự (2017) phân lập đoạn gen matK từ các mẫu khác nhau về địa

điểm thu thập và số lượng lá Theo đó mẫu thu được ở tỉnh Hà Giang có 6 lá vàmẫu thu ở tỉnh Lào Cai có 7 lá Kết quả cho thấy trình tự nucleotide của đoạn

gen matK mẫu cây 6 lá (Hà Giang) có 808 nucleotide, trình tự nucleotide của đoạn gen matK mẫu cây 7 lá (Lào Cai) có 806 nucleotide Tuy nhiên kết quả so sánh sự khác biệt và tương đồng cho thấy cả 2 mẫu cùng thuộc loài Paris polyphylla var yunnanensis [11].

Trình tự vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một vùng gồm các đoạn ITS1-5,8S-ITS2 Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá

trình tổng hợp rRNA Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA,

phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S Vùng ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa dạng di truyền của các loài như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc tính di truyền

của cả bố và mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp cho việc khuếch đại và

xác định trình tự DNA ribosome Trình tự nucleotide vùng gen ITS đã được

nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới khá phong phú và đa dạng,thuận lợi cho việc phân tích so sánh Các nghiên cứu phát sinh loài thực vật dựa

trên vùng gen ITS đã được tiến hành bởi nhiều nhà nghiên cứu [14], [21], [22].

Trước đây nấm thường được phân loại dựa trên các đặc điểm về hình thái,

cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả

phân loại thường có độ chính xác không cao Berbee và cộng sự (1995) đã

chứng minh Penicillium, Aspergillus, và Paecilomyces thuộc lớp

Trichocomaceae khi sử dụng vùng gen ITS để định loại [13].

Sử dụng trình tự vùng gen ITS và trình tự trnL-F, Zhao Weiguo và cộng

sự (2005) đã làm rõ được mối quan hệ giữa loài dâu thuộc chi Morus Kết quả cho thấy trong chi Morus trình tự ITS có sự đa dạng hơn nhiều so với trình tự

trnL- F [25].

Muthumeenakshi và cộng sự (1994) đã chứng minh có sự đa hình xảy ra

khi nghiên cứu những thay đổi trong vùng gen ITS của các dòng Trichoderma

harzianum dựa trên trình tự rRNA 18S, 5.8S và vùng gen ITS [19].

Đánh giá đa dạng di truyền trong chi Ephedra các nhà khoa học đã tiến hành phân tích trình tự vùng ITS Kết quả nghiên cứu xác định được nguồn gốc lai giữa các loài và phân loại 8 được loài Ephedra [27].

Những năm gần đây, ngoài ý nghĩa phân loại, vùng ITS rất được quan

tâm ở cấp độ phân tử Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng sự (2012) đã tiến hànhnghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam

thuộc chi Đẳng Sâm (Codonopsis sp), kết quả nghiên cứu đã khuếch đại thành công vùng gen ITS và phân tích được sự đa hình trên mỗi vùng gen [33].

Quả của các loài thuộc chi Zanthoxylum trong y học Trung Quốc có công

dụng lớn trong việc chữa đau vùng thượng vị Người ta đã phát hiện ra trong

chi Zanthoxylum có đến 200 loài khác nhau Sun Yan-Lin và cộng sự đã tìm ra trình tự vùng gen ITS của loài Zanthoxylum piperitum đồng thời phân biệt loài Zanthoxylum piperitum với loài Zanthoxylum schinifolium trong chi Zanthoxylum cũng nhờ trình tự vùng gen ITS [29].

Vùng gen ITS được sử dụng như một điểm đánh dấu hiệu quả và mạnh

mẽ, đây cũng là một mã vạch tiềm năng để phân biệt các loài khác nhau trong

họ Fabaceae [17].

Trình tự nucleotide của 22 loài thuộc chi Paris trên GenBank được sử

dụng để làm trình tự tham chiếu khi so sánh với 3 mẫu cây Bảy lá một hoa khác

nhau kí hiệu lần lượt là PR1, PR2, PR3 Sử dụng phần mềm Bioedit NguyễnTiến Dũng cùng cộng sự (2017) cho thấy kết quả so sánh có sự tương đồng rất

cao giữa 3 mẫu nghiên cứu với nhau và với trình tự loài Paris vietnamensis trên GenBank Trong đó vùng gen ITS khả năng phân biệt loài tốt hơn, với độ biến thiên trình tự giữa các loài cao hơn so với vùng gen psbA-trnH [5].

Vũ Thị Thu Thủy cùng cộng sự (2017) đã khuếch đại thành công vùng

gen ITS của mẫu Bảy lá một hoa thu được ở Lào Cai Từ trình tự vùng gen thu được có kích thước 676 bp với hệ số tương đồng là 99% so với loài Paris vietnamensis, mẫu cây Bảy lá một hoa thu được ở huyện SaPa, tỉnh Lào Cai đã được định danh thuộc loài Paris vietnamensis [9].

Có thể thấy việc nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA trong phân tích

đa dạng di truyền các loài đã khẳng định vùng gen ITS và gen matK có thể

giúp nhận diện loài, đồng thời có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếptheo về tiến hóa học phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dượcliệu quý [11], [12]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thực vật

Mẫu của cây Bảy lá một hoa thu thập được tại huyện Sìn Hồ, tỉnh LaiChâu là sản phẩm của đề tài cấp Bộ có mã số B2017-TNA-04-QG do bộ mônSinh học hiện đại và Giáo dục sinh học chủ nhiệm sử dụng làm vật liệu nghiêncứu

2.2 Địa điểm nghiên cứu, hóa chất và thiết bị

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm phân tích hình thái, giải phẫu được thực hiện tại KhoaSinh học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên

Phân lập đoạn gen matK, vùng gen ITS được thực hiện tại Viện Công

nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Luận văn được hoàn thành tại trường Đại học Sư phạm – ĐHTN

2.2.2 Hóa chất, dụng cụ

Đề tài sử dụng hóa chất của các hãng có uy tín và đảm bảo độ tin cậynhư Merck, Bioneer, Sigma, Một số hóa chất chính có sử dụng trong đề tàinhư: xanh methylene, phèn chua, carmin, chloroform, isoamy alcohol,

Cặp mồi nhân gen được thiết kế dùng chung cho phân loại thực vật dophòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử như máy ly tâm (Nhật Bản),máy điện di (Mỹ), pipet (Eppendorf – Đức), máy đo quang phổ (Đức), máyPCR, cùng các trang thiết bị khác thuộc Viện Công nghệ sinh học thuộc ViệnHàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài được thực hiện theo mô hình thí nghiệm tổng quát trình bày ởhình 2.1