phương pháp định lượng captopril trong nguyên liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Thẩm định phương pháp xây dựng theo các tiêu chí của một phương pháp định lượng, từ đó đề ra quy trình định lượng thường quy để định lượng Captopril trong nguyên liệu  Áp dụng phươn

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

Ket-noi.com chia se

NGUYỄN BÌNH NGUYÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Ths TRẦN THỊ LAN HƯƠNG – người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôixin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa Dược, Dược lý đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm việc tại bộ môn

Tôi xin gửi tới các thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành về sự dạy bảo, dìu dắt tận tình trong suốt năm năm tôi học tập tại đây

Và cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới cha mẹ kính yêu và những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn giành cho tôi tình yêu thương, sự quan tâm, động viên trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp

Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013 Sinh Viên

Nguyễn Bình Nguyên

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 5

1.3.2 Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký 5 1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 7 1.3.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn sắc ký 7 1.3.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 11 1.4 Thẩm định phương pháp phân tích 12

1.4.2 Nội dung thẩm định phương pháp 12 Chương II: ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14

2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 16

3.1.2 Chọn pha tĩnh 18

3.1.3 Khảo sát chọn thành phần pha động và tốc độ dòng 19

3.1.4 Khảo sát chọn dung môi hòa tan Captopril 24

3.2 Xây dựng và đánh giá phương pháp định lượng Captopril trong

trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC 25

3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 25

3.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng 27

3.3 Đánh giá phương pháp định lượng 28

3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 28

3.3.2 Đánh giá tính chính xác của phương pháp 30

3.3.3 Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp 33

AF : Hệ số bất đối xứng(Asymmetric)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) MeOH: Methanol

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối(Relative Standard Deviation)

Rs : Hệ số phân giải (Resolution)

TB : Trung bình

3.6 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy hệ

3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ dung dịch

3.1 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC 26 3.2 Cách pha dãy dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính 28

3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Captopril 29

3.4 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 30

3.6 Kết quả định lượng Captopril trong Captopril nguyên liệu của công

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, tăng huyết áp là một bệnh mang tính chất phổ biến Điều đáng ngại chính là có tới 50% người bị tăng huyết áp không biết mình bị tăng huyết áp, khoảng 30% của những người đã biết mình tăng huyết áp nhưng vẫn không có một biện pháp điều trị nào.Tăng huyết áp nếu không được điều trị đúng và đầy đủ dẫn đến nhiều biến chứng nặng nề như suy thận, suy tim, tai biến mạch não… thậm chí

có thể gây tử vong hoặc để lại các di chứng nặng nề ảnh hưởng đến sức khỏe, sức lao động của người bệnh Một trong những thuốc đầu tay bác sỹ hay dùng để điều trị tăng huyết áp trên bệnh nhân đó chính là nhóm ức chế men chuyển trong đó Captopril là một thuốc kinh điển

Muốn kiểm soáttốt các chế phẩm chứa Captopril thì đi từ việc nhỏ nhất đó là đánh giá được nguồn nguyên liệu để sản xuất thuốc Captopril Hiện nay, ở Việt Nam, phương pháp chính để định lượng Captopril trong nguyên liệu là phương pháp oxy hóa khử bằng phép đo Iod Trên thực tế nếu như trong nguyên liệu có các chất khử và các chất oxy hóa thì khi áp dụng phương pháp này dễ dẫn đến các sai

số HPLC là một phương pháp phân tích có tính ổn định,có độ chính xác và độ chọn lọc cao, được sử dụng rộng rãi trong phân tích và dược phẩm

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Captopril trong nguyên liệu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”

Với 3 mục tiêu sau:

 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng captopril trong nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Thẩm định phương pháp xây dựng theo các tiêu chí của một phương pháp định lượng, từ đó đề ra quy trình định lượng thường quy để định lượng Captopril trong nguyên liệu

 Áp dụng phương pháp mới xây dựng để định lượng Captopril trong nguyên liệu

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL

1.1.2 Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định:

1.1.2.1 Dược động học :

Captopril hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có Ftuyệt đối là 60% - 75%, Cmaxtrong huyết tương đạt được khoảng 1 giờ sau khi uống Captopril liên kết với protein khoảng 30% Chủ yếu được bài tiết trong nước tiểu, khoảng 40%-50% đào thải qua thận ở dạng còn nguyên hoạt tính, còn lại chuyển hóa qua gan thành dạng captopril disulfide và captopril-cystein.Captopril có t1/2= 2–3h, Cls=13,33 ml/min/kg.[14]

1.1.2.2 Dược lực học

Captopril có tác dụng ức chế enzym chuyển Angiotensin I→Angiotensin II, giảm tái hấp thu muối nước ở ống thận nên hạ huyết áp, giảm tiết các yếu tố gây phì đại cơ tim và phì đại mạch máu Captopril được chỉ định trong điều trị tăng huyết

áp, điều trị suy tim, đau thắt ngực, bệnh thận do tiểu đường phụ thuộc Insulin có protein niệu > 300mg/24h.[14]

1.1.2.3 Chỉ định và tác dụng không mong muốn

Liều dùng:Điều trị tăng huyết áp : liều đầu 12,5mg /lần x 2 lần /ngày, sự tăng giảm phụthuộc vào huyết áp của bệnh nhân, nếu sử dụng thêm thuốc lợi tiểu thì liều đầu là 6,25 mg/lần x 2 lần /ngày.Điều trị bệnh thận do tiểu đường : 75-100 mg/ngày,với bệnh nhân suy thận cần được hiệu chỉnh liều cho phù hợp với từng đối tượng Một số chế phẩm Captopril đang có trên thị trường đươc trình bày ở bảng1.1

Bảng 1.1 : Một số chế phẩm có chứa Captopril Biệt dược Nồng độ/Hàm lượng Dạng thuốc Hãng sản xuất

Captopril 50 mg

Viên nén

Bristol-myers Ssquibb Ecazide Captopril 50 mg +

Hydroclothiazid 25mg

Bristrol-myers Ssquibb

Captopril

STADA®25

Captopril 25 mg Stadapharm GmnH

DH-CaptoHasan Captopril 25 mg Hasan

1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL

1.2.1 Định lượng Captopril bằng phép đo Iod

Nguyên tắc : Oxy hóa Captopril bằng dung dịch I2 Hòa tan 0,15g chế phẩm trong 30,0 ml nước cất Chuẩn độ bằng dung dịch Iod 0,05 M Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (dùng điện cực Platin).[1]

 Phương pháp định lượng thực hiện đơn giản Tuy vậy, nếutrong nguyên liệu

có các tạp khử hoặc oxy hóa khác có thể dẫn đến sai số.Đồng thời, Captopril có nhiều mứcoxy hóa nênbước nhảy thế có thể diễn ra ở nhiều mức khác nhau, điều này cũng sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng

1.2.2 Định lượng Captopril bằng phương pháp đo quang

Nguyên tắc:Bratton-Marshall đưa ra phương pháp định lượng Captopril bằng phương pháp đo quang sau khi tạo dẫn chất.Captopril tác dụng với một lượng dư acid nitoro(HNO2) tạo sản phẩm S-nitroso tương đối bền vững phá hủy HNO2 dư được phá hủy bằng acid sulfamic Thủy phân S-nitroso giải phóng acid HNO2 Tạo muối diazoni bằng cách cho thêm sulfanilamine Sau đó thêm N-(1-napthyl)ethylenediamine tạo phẩm màu azo có màu đỏ.Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch.[10]

N+N

S

NH2

O O

N+N

N N

Nhận xét :

 Cách tiến hành định lượng phức tạp vì nhiều giai đoan khó thực hiện, sản phẩm đo quang là chất trung gian dễ bị phân hủy,làm giảm sự chính xác của phép định lượng

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích có tính

ổn định, độ chính xác và độ chọn lọc cao được sử dụng rộng rãi trong phân tích và dược phẩm.Vì vậy trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Captopril trong nguyên liệu bằng HPLC

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1 Định nghĩa

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của

sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế : hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt.[5]

1.3.2 Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký

 Thời gian lưu tR :

Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồtính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó

là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi Ngoài ra trong một phép phân tích còn thời gian lưu hiệu chỉnh, được tính bằng công thức sau: tR’ = tR – tM

Với: tM là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh

Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị loãng, thời gian phân tích kéo dài.[2]

 Hệ số phân bố k : là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột

k = Trong đó : CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh

CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động

 Hệ số dung lượng k’ : cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha và được tính theo sức chứa của cột:

 Hệ số đối xứng của pic F :

F = Trong đó :W : chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

a : là khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đếnmép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N :

Hiệu lực cột được đo bằng thống số : Số đĩa lý thuyết N của cột

N = 5,54 x

/

[5]hoặc16 x [5]

Trong đó : W1/2h là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic

W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic

 Độ phân giải Rscủa cột :

WB ; WA : độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2A ; W1/2B : độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic Yêu cầu : RS> 1 ; giá trị tối ưu Rs = 1,5.[5]

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính sau :

 Bơm cao áp :

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất (thường 0– 400 bar)để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký

 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi :

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm)

và đã đuổi khí hòa tan

2 – 5 mm

 Detector :

Là bộ phận phát hiện chất phân tích Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau: Detector hấp thụ UV – VIS, Detector phổ phát xạ nguyên tử, Detector huỳnh quang.[5]

1.3.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.3.4.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại :

 Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực

 Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon.Trong sắc ký hấp phụ pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:

 R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH2

-NH2, alkyl nitril – CH2 – CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận

để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.[15]

 Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bàng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của mạch carbon (C2;C8;C18) hay các gốc carbon vòng phenyl Do các nhóm OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica

đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion.[5]

Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích

Trong môi trường quá acid pH< 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột

Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –Si-C18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi Kết quả giảmđi độ chính xác

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽche chắn đi những nhóm –OH, được trình bày ở hình 1.2

Hình 1.2 : Cấu trúc cột có gốc Isopropyl Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS – Expended Polar Selectivity)[15]

1.3.4.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như : nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của chúng.Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như : độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy pic.Nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng

Yêu cầu của 1 pha động :

 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian

 Hòa tan chất cần phân tích

 Có độ tinh khiết cao

 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

 Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

Có các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả :

 Bản chất của dung môi để pha pha động

 Thành phần các chất trong pha động

 pH của pha động

 Tốc độ dòng của pha động [7]

Chọn đệm – pH :

Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.[7]

Tốc độ dòng của pha động :

Sau khi có pha tĩnh, pha động,pH thích hợp,để tăng hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế.[7]

1.3.4.3 Lựa chọn Detector

Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi Detector chuyển thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ Detector phổ biến nhất là Detector UV-VIS Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau.[15]

1.3.5.2 Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Phương pháp định lượng chất phân tích trong HPLC dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của chất

phân tích Cácphương pháp tính kết quả thường dùng

 Phương pháp chuẩn nội

 Phương pháp chuẩn hóa diện tích

 Phương pháp chuẩn ngoại

Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu thử với mẫu chuẩn được phân tích trong cũng một điều kiện Nồng độ (hàm lượng)của chất chưa biết được tính toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn hóa một điểm:chuẩn bị một mẫu chất chuẩn và một mẫu chất thử Tiến hành song song với nhau.Căn cứ vào diện tích pic của chất chuẩn, chất thử và nồng độ chất chuẩn, tìm được nồng độ của chất thử

Điều kiện áp dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm: trong khoảng nồng độ khảo sát, chứng minh luôn có tương quan hồi quy tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với diện tích pic của chất phân tích.[7]

1.4 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1.4.1 Yêu cầu chung

Thẩm định một phương pháp phân tích trong nguyên liệu là một quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc trưng cơ bản của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát

1.4.2 Các tiêu chí trong thẩm định phương pháp

1.4.2.1 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ đáp ứng của pic (diện tích pic) với nồng

độ chất phân tích trong dung dịch

Tính tuyến tính của phương pháp phân tích là khả năng suy ra các kết quả thử một cách trực tiếp hoặc thông qua phép biến đổi toán học, nó tỷ lệ thuận với nồng độ của chất cần phân tích có trong mẫu thử trong một giới hạn nồng độ đã cho

Khoảng tuyến tính: là khoảng nồng độ từ nồng độ thấp nhất đến nồng độ cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Thông thường đối với nguyên liệu thì khảo sát tínhtuyến tính trong khoảng từ 80% đến 120% nồng độ so với nồng

độ định lượng Đường chuẩn phải có ít nhất là 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong dung dịch và ít nhất 4/5 điểm trong dãy chuẩn có độ đúng và độc chính xác đạt yêu cầu

1.4.2.2 Tính chính xác : bao gồm các tiêu chí về độ lặp lại và độ đúng

 Độ lặp lại

Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ phù hợp với nhau giữa các kết quả riêng rẽ khi áp dụng phương pháp để định lượng lặp đi lặp lại nhiều lần lấy mẫu từ một mẫu đã trộn đồng nhất

Phương pháp là lặp lại nếu độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2,0%

 Tính đúng

Tính đúng của phương pháp là sự gần sát của kết quả định lượng so với giá trị thực Do hàm lượng mẫu thử chưa được xác định chắc chắn ở thời điểm nào, vì vậy tính đúng phải được xác định trong toàn bộ vùng cần xác định Đối với nguyên liệu, tính đúng được xác định trong khoảng 80% đến 120% nồng độ phân tích

Phương pháp là đúng nếu :

 Trung bình tìm lại được từ 98% đến 102%

 Khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1 (không có sai số hệ thống tỷ lệ) Khoảng tin cậy của b (y=ax + b) chứa gốc tọa độ (không có sai số hằng

định)

1.4.2.3 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng xác định chất cần phân tíchmà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác như tạp chất, sản phẩm phân hủy và các thành phần khác

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Captopril nguyên liệu của công ty dược phẩm Traphaco

2.2 THIẾT BỊ, HÓA CHẤT

2.2.1 Dụng cụ, thiết bị

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : DIONEX – detector UV diode aray

- Máy lắc siêu âm – SONOREX

- Máy đo pH : METTLER TOLEDO MP 220

- Máy lọc chân không : SATORIOUS

- Cân phân tích :SATORIOUS

- Máy khuấy từ: HEIDOLPH MR 1000

- Bình định mức 10,25,50,100 ml

- Ống đong 100ml, cốc có mỏ 100, 500, 1000 ml

- Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45µm

2.2.2 Hóa chất

- Captopril nguyên liệu của công ty Traphaco (ngày hết hạn 11/2015)

- Captopril chuẩn đối chiếu của Viện kiểm nghiệm – Bộ Y Tế (hàm ẩm 3%, hàm lượng 95,3%, ngày hết hạn 11/2015)

- Muối KH2PO4, H3PO4 (85%) loại tinh khiết dùng phân tích

- MeOH dùng cho HPLC (hãng Honeywell)

- Nước cất 2 lần dùng cho HPLC

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

- Tham khảo các phương pháp định lượng Captopril đã công bố

- Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất lý hóa học của Captopril cũng như điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu, xây dựng quy trình định lượngCaptopril trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC có tính chính xác, đặc hiệu cao

2.3.2 Nội dung nghiên cứu

2.3.2.1.Nghiên cứu các điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp

 Khảo sát điều kiện sắc ký

Chọn bước sóng phát hiện, chọn cột, chọn pha động, tốc độ dòng thích hợp

để có pic captopril cân đối và thời gian lưu hợp lý

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột Gemini C18 (250mm x 4,6mm, 5µm)

và cột Luna C8 ( 250 mm x 4,6 mm, 5µm ) là những cột thường dùng trong các cơ

sở kiểm nghiệm hiện nay Tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký phù hợp

 Lựa chọn dung môi để hòa tan Captopril hoàn toàn từ nguyên liệu

Dựa vào tính chất của Captopril và qua tham khảo tài liệu, bằng thực nghiệm chọn ra dung môi thích hợp để hòa tan captopril và đảm bảo Captopril không bị thủy phân

2.3.2.2 Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng Captopril trong Captopril nguyên liệu

 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

 Xây dựng phương pháp định lượng

 Đánh giá phương pháp xây dựng bằng các tiêu chí

 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Captopril và diện tích pic trên sắc ký đồ

 Tính chính xác của phương pháp: