Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ meloidogyne spp ở tây nguyên

Các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên nhiều loại cây chủ khác nhau và phân bố rộng trên toàn cầu, làm suy giảm năng suất và sản lượng của các loại cây trồng,

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-LÊ THỊ MAI LINH

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH

GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp Ở TÂY NGUYÊN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2019

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

LÊ THỊ MAI LINH

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH

GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp Ở TÂY NGUYÊN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan :

Luận án „NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY

SẦN RỄ Meloidogyne spp Ở TÂY NGUYÊN‟‟là công trình do bản thân tôi thực

hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Trịnh Quang Pháp và PGS.TS Phan Kế Long Các trích dẫn trong luận án theo các nguồn công bố đầy đủ Số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa công bố hoặc công bố trong các bài báo khoa học mà tôi là tác giả hoặc đồng tác giả

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Lê Thị Mai Linh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS Trịnh Quang Pháp và PGS.TS Phan Kế Long đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn TS Vũ Thị Thanh Tâm, ThS Nguyễn Thị Duyên, ThS Nguyễn Hữu Tiền, TS Nguyễn Thị Ánh Dương đã hỗ trợ tôi trong quá trình hoàn thiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, phòng Tuyến trùng học, Học viện Khoa học và Công nghệ cùng các đồng nghiệp, Thầy Cô trong Viện Sinh thái

và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOTED) trong đề tài mã số:106–NN.03–2013.56; Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR) trong đề tài mã số: IEBR.ĐT/04/17-18, IEBR.ĐT/04/G2-18 đã hỗ trợ kinh phí để tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Lê Thị Mai Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới 5

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 5

1.1.2 Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne 7

1.1.3 Khả năng gây hại trên một số cây trồng 9

1.1.4 Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne 11

1.1.4.1 Phương pháp phân tích hình thái 11

1.1.4.2 Phương pháp phân tích phân tử 13

1.2 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam 16

1.2.1 Tình hình nghiên cứu chung tại Việt Nam 16

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ Meloidogyne tại Tây Nguyên 18

1.2.2.1 Tổng quan Tây Nguyên 19

1.2.2.2 Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên 21

1.3 Biện pháp phòng trừ sinh học tuyến trùng sần rễ Meloidogyne 22

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nội dung, đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 27

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 27

2.1.4 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Khảo sát thực địa và phương pháp thu mẫu 28

2.2.2 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất 29

2.2.3 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ rễ 30

2.2.4 Nhân nuôi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp 30

2.2.5 Phương pháp xử lý làm trong và làm tiêu bản tuyến trùng 31

2.2.6 Nghiên cứu hình thái 33

2.2.7 Nghiên cứu đa dạng di truyền 35

2.2.7.1 Tách chiết DNA 35

2.2.7.2 Phản ứng PCR 36

2.2.7.3 Điện di sản phẩm 37

2.2.7.4 Tinh sạch sản phẩm PCR và đọc trình tự DNA 38

2.2.7.5 Phân tích trình tự DNA 38

2.2.7.6 Thiết lập cây phát sinh chủng loại 38

2.2.8 Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng 38

2.2.8.1 Nấm Paecylomyces javanicus 38

2.2.8.2 Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 39

2.2.8.3 Ảnh hưởng của hợp chất 4-HydroxyphenylaceticAcid (4-HPAA) đến tuyến trùng M incognita 39

2.2.8.4 Phân tích số liệu 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Tần suất xuất hiện, đặc điểm phân bố, khả năng gây hại của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne 41

3.1.1 Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên một số cây trồng ở Tây Nguyên 41

3.1.2 Phân bố, mật độ của các loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu và cây chủ 43

3.2 Đặc điểm hình thái các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên 49

3.2.1 Loài Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949 49

3.2.1.1 Đặc điểm hình thái và hình thái lượng 49

3.2.1.2 Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại 50

3.2.2 Loài Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949 61

3.2.2.1 Đặc điểm hình thái và hình thái lượng 61

3.2.2.2 Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại 68

3.2.3 Loài Meloidogyne arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949 69

3.2.3.1 Đặc điểm hình thái và hình thái lượng 70

3.2.3.2 Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại 70

3.2.4 Loài Meloidogyne enterolobii Yang, Eisenback., 1983 80

3.2.4.1 Đặc điểm hình thái và hình thái lượng 80

3.2.4.2 Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại 87

3.2.5 Loài Meloidogyne graminicola Golden & Birchfield 1965 90

3.2.5.1 Đặc điểm hình thái và hình thái lượng 90

3.2.5.2 Đa dạng hình thái và đặc điểm chẩn loại 91

3.2.6 Loài Meloidogyne daklakensis Trinh, Le, Nguyen, Nguyen, Liebanas & Nguyen,

2018 97

3.2.7 Loài Meloidogyne sp 106

3.3 Đa dạng hình thái, hình thái lượng các loài Meloidogyne 113

3.3.1 Phân tích đa dạng hình thái lượng giữa các loài Meloidogyne 113

3.3.2 So sánh hình thái giữa các loài Meloidogyne spp 118

3.4 Phân tích đa dạng di truyền các loài Meloidogyne spp 127

3.4.1 Phản ứng Multiplex-PCR 127

3.4.2 Phân tích đa dạng di truyền 128

3.4.2.1 Vùng gen ITS 129

3.4.2.2 Vùng gen D2D3 133

3.4.2.3 Vùng gen COI 137

3.4.2.4 Vùng gen COII-16S 141

3.4.2.5 Vùng gen NAD5 146

3.5 Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng 150

3.5.1 Nấm Paecylomyces javanicus 150

3.5.1.1 Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P javanicus đến tỷ lệ nở của trứng của tuyến trùng M incognita 150

3.5.1.2 Ảnh hưởng của dịch bào tử nấm P javanicus đến tỷ lệ chết của ấu trùng M incognita 151

3.5.2 Vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 154

3.5.2.1 Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L antibioticus HS124 đến sự nở trứng của tuyến trùng M incognita 154

3.5.2.2 Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L antibioticus HS124 đến ấu trùng M incognita 155

3.5.3 Ảnh hưởng của 4-HPAA tới tuyến trùng Meloidogyne incognita 158

CHƯƠNG 4 161

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 161

4.1 KẾT LUẬN 161

4.2 KIẾN NGHỊ 162

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 163

TÀI LIỆU THAM KHẢO 164

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Diễn giải

16S-rRNA 16S Ribosomal Axit Ribonucleic

ADF Actin depolymerizing factor

ANOVA One-way analysis of variance (Phân tích phương sai một yếu tố)

CDA Canonical discriminant analysis (Phân tích chỉ số khác biệt)

COI Cytochrome c oxidase subunit 1

COII Cytochrome c oxidase subunit 2

DMSO Dimethyl sulphoxide

DNA Deoxyribonucleic acid (Axit Deoxyribonucleic)

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (Axit ethylenediamine tetraacetic )

ETS E26 transformation-specific

GA Gallic acid (Axit galic)

HPAA Hydroxyphenylacetic acid (Axit hydroxyphenylacetic)

IGS Intergenic spacer

ITS Internal transcribed spacer

MIG Meloidogyne incognita group

NAD5 Nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 5

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông

tin công nghệ sinh học quốc gia)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase)

RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA (Đa hình DNA nhân

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu 37

Bảng 3.1 Tần suất xuất hiện của các loài tuyến trùng Meloidogyne spp trên một số cây trồng ở Tây nguyên 43

Bảng 3.2 Phân bố của các loài Meloidogyne bắt gặp trên các vùng thu mẫu, cây chủ 45

Bảng 3.3 Danh sách mẫu và mật độ các loài tuyến trùng Meloidogyne ghi nhận được 47

Bảng 3.4 Số đo con cái các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước 53

Bảng 3.5 Số đo con đực các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước 54

Bảng 3.6 Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne incognita (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước 57

Bảng 3.7 Số đo con cái các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên cứu trước 62

Bảng 3.8 Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước 63

Bảng 3.9 Số đo con đực quần thể Meloidogyne javanica (số đo theo µm) và nghiên cứu trước 65

Bảng 3.10 Số đo con cái các quần thể tuyến trùng loài Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước 73

Bảng 3.11 Số đo con đực các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước 74

Bảng 3.12 Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne arenaria (số đo theo µm) và nghiên cứu trước 76

Bảng 3.13 Số đo con cái các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước 81

Bảng 3.14 Số đo con đực các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước đó 82

Bảng 3.15 Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne enterolobii (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước đó 84

Bảng 3.16 Số đo con cái các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước 92

Bảng 3.17 Số đo con đực các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước 93

Bảng 3.18 Số đo ấu trùng các quần thể Meloidogyne graminicola (số đo theo µm) và các nghiên cứu trước 94

Bảng 3.19 Số đo các quần thể Meloidogyne daklakensis n sp 102

Bảng 3.20 Số đo các quần thể tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp 110

Bảng 3.21 Bảng chỉ số CDA giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne 114

Bảng 3.22 Đặc điểm so sánh hình thái lượng của các loài tuyến trùng Meloidogyne 119 Bảng 3.23 Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự gen ITS 130

Bảng 3.24 Tỷ lệ % các loại nucleotide trong trình tự vùng gen D2D3 giữa các loài

Meloidogyne incognita 152

Bảng 3.30 Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L antibioticus HS124 đến tỷ lệ nở trứng của tuyến trùng M incognita 155 Bảng 3.31 Ảnh hưởng của dịch bào tử vi khuẩn L antibioticus HS124 đến tỷ lệ chết của

ấu trùng tuổi 2 loài M incognita 156 Bảng 3.32 Ảnh hưởng của hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ nở trứng của M incognita 158

Bảng 3.33 Ảnh hưởng của hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ chết của ấu trùng tuổi 2 tuyến

trùng Meloidogyne incognita 159

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh tuyến trùng sần rễ lần đầu tiên được công bố 6

Hình 1.2 Hình ảnh chi tiết tuyến trùng sần rễ Meloidogyne exigua trên cà phê 6

Hình 1.3 Chu kỳ vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., 7

Hình 1.4 Các đặc điểm chung để xác định các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne 12

Hình 1.5 Hồ tiêu bị bệnh chết nhanh, chết chậm 18

Hình 1.6 Vị trí 5 tỉnh Tây Nguyên trên bản đồ Việt Nam 20

Hình 2.1 Sơ đồ khu vực nghiên cứu (Google map) 28

Hình 2.2 Mẫu đất và rễ sau khi thu mẫu 29

Hình 2.3 Nhân nuôi thuần tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., 30

Hình 2.4 Phương pháp cắt tấm cutin vùng chậu con cái tuyến trùng Meloidogyne spp., 30

Hình 2.5 Hình thái giải phẫu của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., sử dụng cho nghiên cứu hình thái 30

Hình 2.6 Cấu trúc tấm cutin vùng chậu 35

Hình 2.7 Cấu trúc vùng gen trong hệ gen nhân được sử dụng trong nghiên cứu 36

Hình 2.8 Cấu trúc hệ gen ty thể sử dụng trong nghiên cứu 37

Hình 3.1 Đặc điểm rễ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne trên một số cây trồng 42

Hình 3.2 Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne incognita 59

Hình 3.3 Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne incognita 60

Hình 3.4 Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne javanica 66

Hình 3.5 Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne javanica 67

Hình 3.6 Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne arenaria 78

Hình 3.7 Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne arenaria 79

Hình 3.8 Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne enterolobii 86

Hình 3.9 Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne enterolobii 87

Hình 3.10 Ảnh chụp kính hiển vi con cái loài Meloidogyne graminicola 96

Hình 3.11 Ảnh chụp kính hiển vi ấu trùng và con đực loài Meloidogyne graminicola 97

Hình 3.12 Ảnh vẽ loài Meloidogyne daklakensis 97

Hình 3.13 Ảnh chụp kính hiển vi loài Meloidogyne daklakensis 100

Hình 3.14 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (SEM) loài Meloidogyne daklakensis 101

Hình 3.15 Ảnh vẽ loài Meloidogyne sp 107

Hình 3.16 Ảnh chụp kính hiển vi loài Meloidogyne sp 108

Hình 3.17 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (SEM) Meloidogyne sp 109

Hình 3.18 Hình phân tích CDA ấu trùng các quần thể Meloidogyne spp 116

Hình 3.19 Hình phân tích CDA con đực các quần thể Meloidogyne spp 116

Hình 3.20 Hình phân tích CDA con cái các quần thể Meloidogyne spp 117

Hình 3.21 Đặc điểm so sánh tấm cutin vùng chậu con cái các loài Meloidogyne spp 122

Hình 3.22 Đặc điểm so sánh vùng đầu con đực giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., 124

Hình 3.23 Đặc điểm so sánh phần đuôi ấu trùng tuổi 2 giữa các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., 125

Hình 3.24 Hình điện di sản phẩm Multiplex-PCR các mẫu nghiên cứu 140

Hình 3.25 Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen ITS 140 Hình 3.26 Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen D2D3 140

Hình 3.27 Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen COI 140 Hình 3.28 Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen COII-16S 140

Hình 3.29 Cây phát sinh chủng loại các loài Meloidogyne spp., dựa trên vùng gen NAD5 140

Hình 3.30 Nấm Paecylomyces javanicus ký sinh trên trứng loài M incognita 153

Hình 3.31 Nấm Paecylomyces javanicus ký sinh trên ấu trùng M.incognita 153

Hình 3.32 Trứng và ấu trùng M incognita chết do vi khuẩn L antibioticus HS124 156

Hình 3.33 Hợp chất 4-HPAA gây chết trứng và ấu trùng Meloidogyne incognita 160

MỞ ĐẦU

Tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne là nhóm tuyến trùng nội ký sinh

cố định gây sần rễ [1] Sau khi xâm nhập vào rễ, ấu trùng tuổi 2 sẽ di chuyển và cư trú tại mô phân sinh, tấn công vào đỉnh sinh trưởng của chóp rễ, làm phân hóa tế bào đỉnh sinh trưởng, đồng thời tiết ra enzyme làm thay đổi mô rễ và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng Rễ cây bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ bị tổn thương, trên bề mặt có dạng sần sùi hoặc tạo thành các u cục, cây bị còi cọc, vàng lá

và gây chết Các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên nhiều

loại cây chủ khác nhau và phân bố rộng trên toàn cầu, làm suy giảm năng suất và sản lượng của các loại cây trồng, đặc biệt là các vùng Nam, Trung Mỹ, Châu Phi và Châu Á trong đó có Việt Nam [1], [2], [3], [4] Vì vậy, tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne trở thành mối quan tâm trong sản xuất nông nghiệp Tính đến năm

2006, có 111 loài Meloidogyne được mô tả, trong số đó có 18 loài ký sinh trên cây

cà phê, chứng tỏ rằng các loài Meloidogyne có tính đa dạng cao [5]

Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ ghi nhận được 5 loài tuyến trùng sần

rễ Meloidogyne, trong đó Tây Nguyên được biết đến có mặt cả 5 loài này [6] Các

nghiên cứu sau này cho thấy hiện nay tại khu vực Tây Nguyên, sự hiện diện và gây hại của nhóm tuyến trùng này rất lớn đặc biệt trên cà phê và hồ tiêu Sự gây hại của

các loài Meloidogyne spp làm hàng trăm hecta cà phê, hồ tiêu đã phải loại bỏ để

thay thế trồng những cây trồng khác [6], [7], [8], [9]

Biến đổi hình thái của mỗi loài tuyến trùng sần rễ chịu sự ảnh hưởng của cây chủ cũng như phân bố của các quần thể ở sinh thái khác nhau Những tiêu chuẩn chủ yếu trong phân loại bằng hình thái của tuyến trùng sần rễ thường sử dụng tấm cắt cutin vùng chậu (hậu môn-sinh dục) của con cái, ngoài ra các đặc điểm hình thái vùng đầu con đực, vùng đuôi của ấu trùng; các đặc điểm hình thái lượng của con cái, con đực, ấu trùng cũng được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng hình thái giữa

các loài [10], [11], [12], [2] Tuy nhiên, sự chồng lấn các đặc điểm hình thái của các

quần thể trong cùng một loài, giữa các loài gần gũi, hay trên các cây chủ khác nhau hoặc giữa các vùng địa lý khác nhau thường có sự dao động lớn nên gặp nhiều khó khăn trong chẩn loại bằng các đặc điểm hình thái [13], [14] Vì vậy, để hỗ trợ cho phương pháp phân loại dựa trên hình thái, kỹ thuật phân tử đã được sử dụng hiệu

quả trong phân loại các loài Meloidogyne spp Nghiên cứu về di truyền trong phân

tích trình tự các vùng gen trong hệ gen nhân (18S, ITS, và 28S) [15], [16], [17], [18], [19], [20] và các vùng gen trong hệ gen ty thể COI và COII và đoạn không mã

hóa giữa 2 vùng gen COII-16S-rRNA [21], [22], [23], [24] đã hỗ trợ rất nhiều cho

các nghiên cứu phân loại và phát sinh chủng loại của các loài tuyến trùng sần rễ

thuộc giống Meloidogyne được nhanh chóng và chính xác, góp phần phục vụ cho

biện pháp đánh giá tác hại và phòng trừ tuyến trùng sần rễ

Với tác hại và phân bố rộng của tuyến trùng sần rễ trên cây trồng, việc ngăn chặn và phòng trừ nhóm tuyến trùng này luôn được quan tâm và định hướng tới nền nông nghiệp an toàn Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay chủ yếu sử dụng thuốc hóa học với hàm lượng cao đã gây nên hiện tượng kháng thuốc cũng như ảnh hưởng đến môi trường đất, làm suy giảm sự đa dạng của các sinh vật có ích, suy thoái đất, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của con người và vật nuôi [25] Do đó, các biện pháp phòng trừ sinh học hiện được chú trọng hơn khi sử dụng các vi sinh vật để chống lại các loài tuyến trùng ký sinh thực vật, được xem là một trong những biện pháp rất tiềm năng [26], [27] Nhiều loại vi sinh vật có khả năng làm tăng sinh trưởng của cây, tạo ra các chất kháng sinh và độc tố làm ngăn cản sự sinh sản, nở trứng và khả năng sống sót của ấu trùng tuổi 2 tuyến trùng sần rễ do vậy có thể được đưa vào ứng dụng trong phòng trừ tuyến trùng [28], [29]

Xuất phát từ thực tiễn về đa dạng cây trồng và địa hình ở Tây Nguyên, cũng như đa dạng của loài tuyến trùng sần rễ và khả năng gây hại, chúng tôi thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu sự đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp ở

Tây Nguyên’’

Mục tiêu nghiên cứu

 Xác định được các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây hại trên các cây

trồng chính ở khu vực Tây Nguyên

 Đánh giá mức độ đa dạng hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne ở khu vực Tây Nguyên

 Đánh giá khả năng sử dụng một số vi sinh vật trong việc hạn chế sự phát

triển của tuyến trùng sần rễ M incognita trong điều kiện phòng thí nghiệm

Phạm vi nghiên cứu

 Đặc điểm hình thái và phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne ghi nhận trên một số cây trồng ở khu vực Tây Nguyên

 Đánh giá ảnh hưởng của một số vi sinh vật đối kháng lên khả năng nở

trứng và sống sót của ấu trùng Meloidogyne incognita

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

 Bổ sung mới thành phần loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở Tây Nguyên, trong đó ghi nhận thêm nhiều cây ký chủ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne

cũng như sự phân bố của chúng Mô tả và ghi nhận loài mới loài

Meloidogyne daklakensis ký sinh trên cà phê tại tỉnh Đắk Lắk

 Các chỉ tiêu hình thái của các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở các cây

chủ và địa điểm khác nhau được đánh giá, so sánh đưa ra sự biến đổi hình thái trong loài và các loài khác nhau đã xác định được những chỉ tiêu quan trọng ít thay đổi trong phân loại loài như các đặc điểm hình thái, hình thái lượng của vân cutin vùng chậu con cái, vùng đầu con đực và phần đuôi ấu trùng

 Đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể trong một loài và giữa các loài

Meloidogyne ở Tây Nguyên được phân tích đưa ra các đoạn gen bảo thủ và

tiến hóa cũng như phát sinh loài Từ đó góp phần đưa ra chọn lựa tốt nhất

trong phân loại từng nhóm loài Meloidogyne bằng sinh học phân tử Bên

cạnh đó, lần đầu tiên đóng góp cơ sở dữ liệu các vùng gen nhân (ITS, D2D3)

và gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) của các loài Meloidogyne có mặt ở

Việt Nam trên Genbank

 Luận án khẳng định vai trò ký sinh và gây chết của vi sinh vật có lợi trong

điều kiện phòng thí nghiệm của nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn

Lysobacter antibioticus HS124 trong phòng trừ loài Meloidogyne incognita

phổ biến trên nhiều cây trồng

Ý nghĩa thực tiễn

 Xác định thành phần loài, mật độ tuyến trùng sần rễ hại cây trồng là tiêu chuẩn trong phòng trừ hiệu quả Cung cấp số liệu về khả năng ký sinh, ký chủ, gây hại và phân bố của các loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ góp phần ngăn chặn chúng phát tán trong điều kiện tự nhiên bảo vệ cây trồng tránh bị lây nhiễm Từ đó lựa chọn phương thức canh tác phù hợp đối với từng cây trồng nhất là đối với cà phê và hồ tiêu cũng như những cây trồng xen và luân canh

 Luận án cung cấp cơ sở dữ liệu về hình thái và phân tử của các loài

Meloidogyne phục vụ cho tra cứu, tham khảo

 Đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bởi nấm

Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, kháng sinh

4-HPAA làm cơ sở cho việc lựa chọn các tác nhân trong phòng trừ, qua đó góp phần giảm lượng thuốc hóa học trong phòng trừ, giữ được cân bằng sinh

thái để phát triển bền vững các cây trồng chủ lực ở Tây Nguyên

Những đóng góp mới của luận án

 Luận án lần đầu tiên đưa ra dữ liệu đầy đủ về phân bố, cây chủ và đặc trưng hình thái, phân tử của các loài tuyến trùng sần rễ trên cà phê, hồ tiêu và các cây trồng xen ở Tây Nguyên Đã xác định thêm nhiều cây chủ mới nhiễm

tuyến trùng Meloidogyne ở Tây Nguyên cũng như cho Việt Nam Bổ sung

145 trình tự các vùng gen ITS, D2D3, COI, COII-16S, NAD5 của các loài tuyến trùng sần rễ ở Tây Nguyên trên Genbank

 Đã ghi nhận 01 loài tuyến trùng sần rễ mới cho khoa học ký sinh trên cà phê

đã được mô tả, công bố và đặt tên Meloidogyne daklakensis n sp và 01 loài

còn lại đã được gửi công bố

 Lần đâu tiên tại Việt Nam đã đánh giá khả năng ký sinh và gây chết của nấm

Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 và chất

kháng sinh 4-HPAA đối với tuyến trùng sần rễ M incognita trong điều kiện

phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne trên thế giới

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Berkeley (1855) là nhà khoa học đầu tiên công bố sự xuất hiện của tuyến trùng sần rễ trên rễ cây dưa chuột trồng tại khu vườn Nuneham, Vương Quốc Anh với các mô tả triệu chứng như: các nốt sần có màu kem đục, gần như hình cầu, có vảy mờ, có hiện tượng phình to ở rễ (hình 1.1) Jobert (1878) đã ghi nhận sự hiện diện trong rễ cà phê các cá thể hình giun được nở ra từ trứng có trong rễ cây,và ông

đã đưa ra các mô tả cơ bản về tuyến trùng này Sau đó, nhóm tuyến trùng này lần

lượt được đặt tên là Anguillula marioni (Cornu, 1879); Heterodera radicicola (Carl

Muller, 1884), Heterodera javanica Treub (Melchior, 1885) [30] Năm 1887 tên

tuyến trùng sần rễ Meloidogyne (Meloidogyne theo tiếng latin có nghĩa là „con cái

có hình quả táo‟) đã được đề xuất bởi Göldi khi mô tả chi tiết loài M exigua trên rễ

cà phê ở Braxil [1] (hình 1.2) Đến năm 1949, Chitwood thống nhất tách giống

tuyến trùng Meloidogyne Göldi, 1887 dựa trên loài chuẩn M exigua (Goldi, 1887) tách khỏi tuyến trùng bào nang Heterodera Vị trí phân loại của giống Meloidogyne

hiện tại được theo hệ thống Karsen et al (2013) [30]

Giống: Meloidogyne Göldi, 1887

1.1.2 Đặc điểm sinh học, vòng đời của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne

Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát

triển bao gồm: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1); ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm-J2);

ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trưởng thành với con cái và con đực (hình 1.3) [31] Trứng sau khi thụ tinh sẽ hình thành giai đoạn đầu tiên của ấu trùng J1 nằm trong trứng Khi đạt điều kiện thuận lợi trứng chứa J1 sẽ nở ra thành ấu trùng tuổi 2(J2) Ấu trùng tuổi 2 khi chưa xâm nhập vào rễ cây chúng sử dụng dinh dưỡng được dự trữ trong ruột cho đến khi tìm được ký chủ phù hợp [32], khi đó J2 sẽ bắt đầu giai đoạn xâm nhiễm và xâm nhập vào các mô rễ, J2 thường tấn công vào các

mô phần sinh trưởng ở đỉnh rễ; nơi các rễ phụ mọc ra tạo điểm xâm nhập cho các J2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương Khi J2 tiếp xúc với bề mặt của rễ, chúng dùng kim hút châm chích và xâm nhập vào bên trong rễ ở bất kỳ phía nào của rễ

Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ, tách dọc tế bào và định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ bắt đầu quá trình dinh dưỡng Trong quá trình dinh dưỡng, J2 cố định phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm thay đổi quá trình sinh lý sinh hóa của tế bào rễ và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào đa nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc hoặc mô libe Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bào thực vật, được tạo ra và duy trì bằng sự ký sinh của tuyến trùng Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng bị phình to ra và tạo thành các nốt sần rễ (gall hoặc root-knot)

Sự hình thành các tế bào khổng lồ này có liên quan đến sự thay đổi điều tiết

và biểu hiện của gen chẳng hạn như gen ADF mã hóa cho protein ADF2 trong tế bào thực vật chịu trách nhiệm cho sự phát triển các tế bào bình thường [33] Các tác

động từ Meloidogyne sau khi xâm nhiễm sẽ làm kích hoạt các protein ADF2 này

làm cho các tế bào thực vật phát triển mạnh hơn và bất thường hơn Trung bình, kích thước cuối cùng của các tế bào bị nhiễm tuyến trùng sần rễ sẽ lớn gấp 400 lần

so với các tế bào mạch bình thường trong rễ [34], [35]

Các nốt sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi bị tuyến trùng xâm nhập J2 sẽ tăng kích thước, lột xác lên giai đoạn J3, J4 và phát triển

trong thời gian từ 4-6 ngày và cuối cùng là cơ thể trưởng thành đực và cái Con đực

có kích thước dài, hình giun, tuy nhiên chúng không ăn trực tiếp dinh dưỡng từ cây Con cái có dạng hình quả lê và hoàn thành chu trình sống bắt đầu đẻ trứng, mỗi túi trứng được chứa từ 300-500 trứng, có loài lên tới 2000 trứng, trứng này được chứa trong một túi gelatin có thể ở trong hoặc phủ ra ngoài rễ, khi gặp điều kiện nhiệt độ

và độ ẩm thích hợp trứng sẽ được nở [36], [30]

Hình 1.3 Chu kỳ vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.,

Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp có 2 hình thức sinh sản khác nhau, trong đó một vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) như M

carolinensis, M megatyla và M pini [12] và phần lớn các loài còn lại là sinh sản

lưỡng tính (parthenogensis) không cần con đực như M chitwoodi, M exigua và M

fallax Đối với các loài có hình thức sinh sản hữu tính thì con đực cặp đôi với con

cái ngay sau lần lột xác cuối cùng [37], [30] Chiều dài vòng đời tuyến trùng thu được phụ thuộc nhiều yếu tố, quan trọng nhất là nhiệt độ môi trường và loại đất Ở

nhiệt độ 27ºC, một chu kỳ của tuyến trùng Meloidogyne từ 21-25 ngày, trong khi tại

nhiệt độ 19ºC cần ít nhất là 29 ngày để hoàn thành chu kỳ sống Các loài tuyến

trùng ở các vùng ôn đới như M hapla sinh trưởng tốt từ 15-25ºC, trong khi đó các loài ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như M incognita, M javanica, M arenaria

thì thích hợp ở nhiệt độ từ 18-30ºC Chu kỳ sống này cũng sẽ kéo dài hơn nếu cây chủ không phù hợp [38], hay còn tùy thuộc vào môi trường sống, thông thường loại đất cát thích hợp cho tuyến trùng hơn là loại đất sét

1.1.3 Khả năng gây hại trên một số cây trồng

Cho đến nay, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne đã trở thành đối tượng nhận

được sự quan tâm của rất nhiều nhà tuyến trùng học do phân bố địa lý, phổ ký chủ rất rộng và có khả năng làm suy giảm năng suất và sản lượng của nhiều loại cây

trồng Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả năng ký sinh trên hầu hết các loại cây

trồng, lên tới 5500 loại cây khác nhau, bao gồm từ cây một lá mầm đến cây hai lá

mầm [39] Một số loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có phạm vi ký chủ rộng như

M incognita, M arenaria có khả năng ký sinh trên nhiều loại cây so với các loài

tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khác [39], [40] Thiệt hại cho kinh tế của hàng năm

liên quan đến tuyến trùng sần rễ ước tính lên tới hàng trăm tỷ đô la [32], [39], [41],

[42], [43] Tới năm 2006, có 111 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được mô tả

[44], [45] Một số loài mới tiếp tục được ghi nhận trong những năm gần đây như:

M lopezi trên cà phê ở Costa Rica [5], M aberrans trên kiwi ở Trung Quốc [46]

Trên cà phê, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., được xem là một trong

những nguyên nhân chính gây ra các tổn thất làm giảm năng suất và sản lượng, ước

tính tổn thất lên đến 15% [3] Đến năm 2014, có 18 loài tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne ký sinh trên cây cà phê được ghi nhận bao gồm: M exigua, M africana, M arabicida, M arenaria, M coffeicola, M decalineata, M hapla, M incognita, M inornata, M izalcoensis, M javanica, M kikuyensis, M konaensis,

M mayaguensis, M megadora, M oteifae, M paranaensis và M lopezi [4], [5] Ở

khu vực Trung Mỹ, phần lớn cà phê trồng tại đây bị ảnh hưởng bởi các loài tuyến trùng

sần rễ Meloidogyne và có 6 loài đã được ghi nhận, trong đó loài M exigua xuất hiện

phổ biến nhất và được ghi nhận được ở Costa Rica, Nicaragua và Honduras gây thiệt

hại kinh tế khoảng 10% tổng giá trị sản phẩm [47], [48], [49], [50] Hai loài M exigua

và M incognita gây hại mạnh nhất cho cà phê ở khu vực Châu Mỹ La Tinh Tại Braxil tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây thiệt hại kinh tế cho việc sản xuất cà phê lên tới

45% [50] Ngoài ra, một số loài tuyến trùng sần rễ khác cũng được ghi nhận ở khu

vực này như: M arenaria và M incognita đã được ghi nhận ở Cộng hòa Va-Đo và Cộng hòa Gua-Tê-Ma-La, M hapla ở Cộng hòa Gua-Tê-Ma-La [51], [52], M mayaguensis ở Cuba [53]

En-Xan-Trên hồ tiêu, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne làm suy giảm sự sinh trưởng

của cây, gây ra bệnh vàng lá, chết chậm cho cây Điều tra ở Braxil năm 1976 ghi

nhận 91% cây hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng trong đó M incognita là loài được bắt

gặp nhiều nhất [54] Tại Malaysia, M incognita và M javanica được báo cáo là

nguyên nhân làm giảm sinh trưởng và gây triệu chứng vàng lá trên cây tiêu, nhiều cánh đồng trồng tiêu đã bị chết trụi do tuyến trùng sần rễ gây ra [55], [56], hai loài này cũng đã được ghi nhận trên hồ tiêu ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia,

Brunei, Philipin, Braxil và Việt Nam Trong khi đó loài M arenaria chỉ được ghi nhận trên hồ tiêu tại Srilanka [57] Năm 2000, loài M piperi được mô tả là loài mới

trên hồ tiêu tại Ấn Độ [58]

Trên lúa, M graminicola là loài đại diện được tìm thấy trên lúa ở hầu hết ở

các nước châu Á, phổ biến ở Burma, Bangladesh, Ấn Độ, Nepal, Pakistan, Sri Lanka, Lào, Thái lan, Đài loan, Indonesia, Philippine và Việt Nam [57] Loài này gây thiệt hại đến năng suất lúa từ vùng núi cao, vùng đồng bằng cho đến các vườn ươm [59] gây thiệt hại lên tới 70% năng suất lúa ở Philipine [60] Ước tính thiệt hại

do tuyến trùng M graminicola làm suy giảm năng suất lúa dao động từ 20-80%

[61] Ngoài ra, trên cây lúa còn ghi nhận thêm những tuyến trùng sần rễ khác như:

M hainamensis và M lini ở Trung Quốc, M triticoryzae ở Ấn Độ và 4 loài khác

được tìm thấy chủ yếu trên các loài lúa cạn (M incognita, M javanica, M arenaria

và M salasi) [57]

Trên khoai tây, có tới 7 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được ghi nhận

Ở vùng nhiệt đới gây hại mạnh nhất là loài M incognita, tiếp đến là M javanica, M

arenaria Trong khi đó các loài M hapla, M chitwoodi, M fallax và M thamesi

gây hại chủ yếu ở các vùng ôn đới [57] Sự gây hại của tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne còn được ghi nhận ở nhiều nơi khác như Nam Phi, Vương Quốc Bỉ,

Mỹ, Malta, Hà Lan, Ả Rập Xê Út với sự ghi nhận loài M javanica nhiều nhất với tỷ

lệ 7,35% sau đó đến loài M incognita là 5% [62]

Trên các loại rau và hoa màu khác ghi nhận được 5 loài tuyến trùng sần rễ

ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất các loại rau màu bao gồm M incognita (tỷ lệ nhiễm 53%), M javanica (tỷ lệ nhiễm 30%), M arenara (tỷ lệ nhiễm 8%) và M

hapla (tỷ lệ nhiễm 8%) [57]

Tầm quan trọng của nhóm tuyến trùng sần rễ này cũng được thể hiện thông qua một số lượng lớn các nghiên cứu được công bố và sách được xuất bản [2], [38], [40], [63], [64] Một trong những nghiên cứu tập trung nhất về nhóm tuyến trùng

này là dự án “The International Meloidogyne Project” năm (1975-1984) một dự án

nghiên cứu tập trung vào đặc điểm sinh học, phân loại, sinh thái, phòng trừ và

chuyển giao công nghệ trong nông nghiệp [65] Hiện nay, các nghiên cứu về nhóm

tuyến trùng này vẫn được phát triển mạnh và ghi nhận nhiều loài mới cho khoa học

thuộc giống Meloidogyne

1.1.4 Nghiên cứu phân loại các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne

1.1.4.1 Phương pháp phân tích hình thái

Việc phân loại các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne là rất cần thiết chủ

yếu vẫn dựa trên hình thái, tuy nhiên vẫn còn khá nhiều khó khăn vì các đặc điểm hình thái đa dạng giữa các loài và quần thể

Chitwood (1949) đã sử dụng chi tiết các đặc điểm của con cái như: kim hút,

DGO, đặc điểm tấm cutin vùng chậu (perineal pattern) để mô tả các loài M hapla,

M incognita, M arenaira, M exigua, M incognita và M javanica [10] Các đặc

điểm tấm cutin vùng chậu bao gồm các vị trí: điểm đuôi (tail terminus), phasmids, đường bên, khoảng cách vulva-anus (âm hộ-hậu môn), đặc điểm vân bao quanh vulva, anus Tấm cutin vùng chậu này của con cái được xem là đặc điểm quan trọng

khi phân loại các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bởi vì rất nhiều nghiên cứu

chỉ ra rằng các đặc điểm của tấm cắt này khá ổn định và đặc trưng cho từng loài, không thay đổi sau một khoảng thời gian nhân nuôi [31], [66] Jebson (1983) [67]

đã phân tích thêm các đặc điểm vùng đầu con đực, hình thái lượng của kim hút; khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ đổ của tuyến thực quản lưng (DGO) Sau đó ông phân tích thêm các chỉ số chiều dài đuôi, hình dạng đuôi và chiều dài hyaline của ấu

trùng để chia tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ra làm 12 nhóm

Hình 1.4 Các đặc điểm chung để xác định các loài Meloidogyne

A: Đặc điểm hình thái con cái với kiểu cổ; B: Hình thái tấm cutin vùng chậu; C: Phần đầu con đực trưởng thành; D: Đặc điểm kim hút; E: Đặc điểm phần đuôi ấu

trùng

Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) của tuyến trùng đã phân tích được các đặc điểm hình thái chi tiết hơn và hỗ trợ rất nhiều cho các nghiên cứu hình thái thông thường [2], [68] Tuy nhiên, những đặc điểm sai khác của cấu trúc của tấm cutin vùng chậu giữa các cá thể trong cùng một loài [31], [66], [69] và sự tương đồng giữa các loài đồng hình gây ra nhiều khó khăn trong phân loại nếu chỉ sử dụng

riêng rẽ một đặc điểm vùng chậu [2] Ví dụ như, loài M paranaensis, M

konaensis, M izalcoensis và M mayaguensis có cấu trúc vân cutin vùng chậu gần

tương tự với loài M incognita [70] Hơn thế nữa, phân loại các loài dựa trên các đặc

điểm hình thái, hình thái lượng yêu cầu rất nhiều về kỹ năng và thời gian làm việc đặc biệt là nếu số lượng mẫu lớn hoặc các quần thể hiếm gặp lại rất khó căn cứ vào các đặc điểm này [71], [72], [73] Sự khác nhau giữa các loài gần gũi rất khó phân biệt được qua hình thái nhất là đối với nhóm phức hợp loài (species complex) thuộc

giống Meloidogyne [2]; hay như các loài Radopholus gặp ở Việt Nam chỉ phân biệt

được sau khi phân tích biệt thức chuẩn CDA của các chỉ số hình thái lượng và phải dùng các đặc trưng phân tử để chắc chắn loài đã gặp [74]

1.1.4.2 Phương pháp phân tích phân tử

Phân loại tuyến trùng bằng phân tử được bắt đầu bằng phương pháp PCR sử dụng các chỉ thị phân tử và phân tích trình tự gen [75], [76] cho phép việc phân loại các loài này nhanh và chính xác hơn so với phương pháp hình thái truyền thống, từ

đó đưa ra vị trí phân loại của loài và phát sinh chủng loại của các loài tuyến trùng

sần rễ Meloidogyne [77] Phương pháp PCR có thể áp dụng với DNA được tách

chiết từ trứng, ấu trùng, con cái hoặc con đực, có thể phân tích từ 1 cá thể trong mẫu

có lẫn nhiều quần thể với nhau, thời gian bảo quản mẫu có thể lên đến vài năm [75], [78] Cho tới nay kỹ thuật phân tử có thể áp dụng trong định dạng và định lượng các

loài Meloidogyne spp trong mẫu khi có hơn 2 loài bằng phương pháp PCR đa mồi

(Multiplex-PCR) [79]

Phân loại tuyến trùng bằng phân tích trình tự các vùng gen là một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất trong phân loại tuyến trùng sần rễ Các phương pháp hiện nay bao gồm phân tích các vùng gen trong hệ gen nhân (rDNA)

và các vùng gen trong hệ gen ty thể (mtDNA) [17], [80], [81], [82], [83], [84]

Hệ gen nhân

Các vùng gen trong hệ gen nhân được sử dụng trong phân loại một số loài

tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khác nhau, do đây là vùng gen vừa có tính bảo thủ

vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong hệ gen nhân này, một tổ hợp gen quan trọng gọi là tổ hợp DNA ribosome (rDNA) bao gồm vùng giao gen (ITS1 và ITS2) và vùng gen 18S, 26S, 28S và 5.8S Trong đó vùng ITS1 nằm giữa 2 vùng gen 18S và 5,8S; vùng ITS2 nằm giữa 2 vùng gen 5,8S và 28S; hai vùng này có mức độ biến đổi ngoài loài rất cao khó có thể sử dụng để so sánh các loài khác giống nhưng lại phù hợp để phân tích giữa các loài khác nhau trong cùng một giống [81], [85], [86] Vùng gen 18S, 26S, 28S và 5.8S được sắp xếp theo cặp

đối xứng tách biệt với vùng ITS và ETS và liền với vùng IGS [87] Các vùng gen

mã hóa ribosome 18S, 28S, 5.8S thường được sử dụng trong phân tích phát sinh chủng loại của tuyến trùng do chúng bảo thủ hơn so với các vùng không phiên mã

ribosome (ITS, ETS và IGS) và tham gia vào mã hóa gen cấu trúc [77] Landa et al.,

2008 [14] phân loại loài M hispanica phân lập từ Braxil, Bồ Đào Nha và Tây Ban

Nha dựa trên vùng gen 18S, 5.8S, ITS2 và D2D3 Các nghiên cứu sử dụng vùng gen

ITS, ETS và IGS trong đó vùng gen IGS có thể phân biệt sơ bộ một số loài tuyến

trùng sần rễ Meloidogyne [84] Một số phương pháp khác như phân tích RAPD, SCAR có thể sử dụng để phân loại một số loài trong giống Meloidogyne [80], [81],

[82], [84], [88]

Vùng gen 28S-rDNA được ứng dụng thành công trong phân loại tuyến trùng

sần rễ Meloidogyne đặc biệt là phân đoạn mở rộng vùng D trên vùng 28S (vùng gen

D2D3) Các biến đổi của phân đoạn này đã được sử dụng nghiên cứu sự phát sinh

chủng loại của tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne với các giống tuyến trùng thực

vật khác [87], [89], [90], [91] Với tính chất bảo thủ và lặp lại trong cấu trúc gen của

phân đoạn D2D3 nên phân loại các loài Meloidogyne khác nhau dễ dàng hơn, tuy

nhiên lại không thể phân biệt được các loài gần gũi thuộc nhóm nhiệt đới (nhóm

Meloidogyne incognita- MIG) do chúng có mức độ bảo thủ hơn [14]

Phân tích vùng gen nhân đã ghi nhận tiến hóa của các loài Meloidogyne được chia thành ba nhánh chính: Nhánh thứ I gồm M enterolobii và nhóm tuyến trùng sần rễ nhiệt đới (MIG: M incognita, M javanica, M arenaria, M floridensis, M

ethiopica, M inornata, M luci) Nhánh thứ II bao gồm các loài thuộc vùng khí hậu

ôn đới với đại diện là M Hapla Nhánh thứ III lại được chia ra làm 2 nhóm lớn A

và B: nhóm A chứa các loài như M fallax, M chitwoodi và M minor nhóm B chứa các loài như , M naasi, M gramnicola, M oryzae Bên cạnh 3 nhóm chính còn một

số loài (sister) phân tách ra như M mali, M ichinohei, M artiellia, M baetica, M

coffeicola và M camelliae [15] , [19], [24] , [92], [93], [94]

Gen ty thể- mtDNA

Vùng gen ty thể có thể giải quyết được một phần các vấn đề chưa được giải quyết được của hệ gen nhân, do hệ gen ty thể có sự bảo thủ cao giữa các quần thể

trong cùng 1 loài nhưng lại có sự biến đổi cao giữa các loài khác nhau [24], [95]

Hiện nay vùng gen ty thể COI được sử dụng cho phân loại hầu hết các loài trong giới động vật [96] và vùng gen này cũng đã được nghiên cứu nhiều cho tuyến trùng

thực vật thuộc các giống khác nhau như: Bursaphelenchus [97]; Pratylenchus [98];

Aphelenchoides [99]; Scutellonema [100] Vùng gen này cũng đưa kết quả rất tốt

cho phân tích phát sinh chủng loại của giống Meloidogyne [19], [77], [101], [102] Các nghiên cứu và so sánh toàn bộ vùng gen ty thể của một số loài Meloidogyne

spp Kết quả ghi nhận được kích thước vùng gen ty thể của loài M arenaria khoảng 18,8kb; loài M enterolobii khoảng 18,9kb; loài M javanica khoảng 19,6kb; loài M

chiwoodi khoảng 19,7kb; loài M incognita từ 18,6-19,1kb và loài M graminicola

từ 19,6-20,0kb [5], [103], [104] So sánh với kích thước các loài tuyến trùng thực

vật khác thì các loài Meloidogyne spp có kích thước vùng gen ty thể nhỏ hơn, cụ thể như ở loài Pratylenchus vulnus khoảng 21,6kb và Heterodera glycines từ 21- 22kb [105], [106], lớn hơn ở một số loài như Bursaphelenchus spp từ 14,5-14,7kb;

Rotylenchus similis từ 16,8kb Các phân tích chỉ ra ba codon mở đầu (ATT, TTA,

ATA) thường được ghi nhận ở bộ gen ty thể của M arenaria, M enterolobii và M

javanica Riêng bộ ba TTA không ghi nhận ở tuyến trùng thực vật khác mà chỉ ghi

nhận được trong loài M chitwoodi (vùng NAD6, NAD4L, NAD5) và loài M

incognita (COI, NAD6, COII-16S, NAD3 và NAD5) [5], [107]

Đoạn gen ty thể bao gồm vùng gen COII và 16S đã được sử dụng rất hiệu

quả trong phân loại các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., nhất là một số loài

có tính bảo thủ thấp như: M enterolobii và M javanica [78], [108] Tuy nhiên khi

so sánh 6 vùng gen ty thể của các loài Meloidogyne phổ biến bao gồm M arenaria,

M javanica và M incognita có sự biến đổi di truyền rất thấp giữa 3 loài này

Kiewnick et al., (2014) [109] đã mô tả đây là phức hợp loài Meloidogyne nhiệt đới

với sự biến đổi rất thấp ở vùng gen COI và COII, mặc dù các loài này mang các đặc điểm hình thái đặc trưng khác nhau như đặc điểm kim hút, vùng đầu con đực, vùng cutin vùng chậu của con cái [110]

Ngoại trừ loài M enterolobii, nhóm tuyến trùng nhiệt đới bao gồm các loài

có quan hệ chặt chẽ được gọi chung là nhóm loài Meloidogyne incognita (MIG) bao gồm các loài: M incognita, M javanica, M arenaria, M floridensis, M ethiopica,

M inornata, M luci [111], [21], [112], [5] Mối quan hệ chặt chẽ này thể hiện trên

các vùng gen ty thể như vùng gen NAD3 hoàn toàn giống nhau trong nhóm này và gen COI cũng không có sự sai khác [109] Tuy nhiên theo Janssen et al (2016) [113] cho rằng hầu hết các gen ty thể đều thể hiện mức độ đa dạng di truyền trong nhóm này với mức sai khác từ 0-1,5% và sự đa dạng thấp giữa các loài này nhưng vẫn mang tính thông tin di truyền cho từng loài, các phân tích tiếp theo ghi nhận vùng gen NAD5 chứa nhiều vị trí biến đổi và đặc biệt ưu tiên cho nhóm loài MIG

16S [24], vì vậy vùng gen NAD5 có thể được sử dụng trong trong phân loại các loài gần gũi trong nhóm loài nhiệt đới MIG

Với sự hỗ trợ của sinh học phân tử, việc phân loại của tuyến trùng ký sinh thực vật nói chung và tuyến trùng ký sinh sần rễ nói riêng chính xác hơn [1] Tuy

nhiên đối với 3 loài M incognita, M javanica và M arenaria các vùng gen này có

sự biến đổi không đáng kể nên khó tách loài trong nghiên cứu phân tử và phát sinh chủng loại [113] Hugall et al (1999) [114] đã phân tích trình tự ITS của các loài

tuyến trùng sần rễ Meloidogyne và ghi nhận rằng có thể nhầm lẫn khi phân loại 3

loài này nếu chỉ sử dụng vùng gen ITS Mặc dù vậy, khả năng sử dụng trình tự đoạn

gen ITS vẫn có thể được thực hiện đối với nhóm loài khác 3 loài M incognita, M

javanica và M arenaria [1] Tương tự các nghiên cứu về vùng gen D2D3 trên 3

loài M incognita, M javanica và M arenaria cũng gặp khó khăn khi phân loại

của các phương pháp này là chỉ phân loại được 1 loài trong một phản ứng PCR do

vậy tốn thời gian và chi phí cho việc phân loại Để khắc phục những hạn chế của

các phương pháp phân tử trên, phương pháp Multiplex-PCR khuyếch đại đoạn DNA với nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR có thể phân loại nhanh được

3 loài M arenaria, M incognita, M javanica với băng sản phẩm tương ứng 420bp,

300bp và 670bp bằng 3 cặp mồi đặc hiệu Far/Rar; Mi2F4/Mi1R1; Fjav/Rjav [79]

1.2 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu chung tại Việt Nam

Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được biết đến là tác nhân gây hại chính tại

các vùng chuyên trồng rau, cây thuốc và các loại cây trồng khác Trên hồ tiêu nhóm tuyến trùng này là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh “chết chậm” và có tương tác với bệnh “chết nhanh” ở một số vùng trồng chuyên canh Các nghiên cứu công bố đã đề cập đến nhiều khía cạnh khác nhau, trong đó chủ yếu là thành phần loài, phạm vi ký chủ, sự phát triển số lượng quần thể tuyến trùng và các biện pháp phòng trừ Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000) [6] có 5 loài tuyến

trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne được tìm thấy ở Việt Nam bao gồm M

incognita, M javanica, M graminicola, M cynariensis và M arenaria Trong đó

loài M incognita ký sinh gây hại trên rất nhiều loại cây trồng khác nhau như: cà

chua, thuốc lá, nghệ, gừng, tàu bay, cỏ, bí đỏ

Trên lúa, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp được cho là tác nhân gây bệnh

chùn rễ, làm giảm năng suất cây trồng [117] Ngô Thị Xuyên và cs (2000) [118]

ghi nhận 3 loài M incognita, M arenaria và M javanica là những loài gây hại chủ

yếu cho các cây trồng phổ biến ở Hà Nội

Nguyễn Hữu Tiền và cs (2013) [119] đã ghi nhận 3 loài tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne: M incognita, M javanica, M arenaria trên 6 loại cây thuốc tại

Quảng Ninh: Tàu bay (Crassocephalum crepidioides), Râu mèo (Orthosiphon

stamineus), Nghệ vàng (Curcuma longa), Hoài Sơn (Dioscorea persimilis), Kim

Tiền Thảo (Desmodium styracifolium) và Kim Ngân (Lonicera japonica)

Trên cà rốt tại Hải Dương ghi nhận được 2 loài Meloidogyne bao gồm M

arenaria ký sinh trên 5 loại cây rau bao gồm chuối, lạc, bí, dưa chuột, dền cơm Với

tần suất bắt gặp trong đất lên tới 78,8% và trong rễ là 66,7% tổng số mẫu phân tích

Trên hồ tiêu, các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được xác định là

nguyên nhân làm giảm năng suất và có khả năng phá hủy các vườn hồ tiêu ở Việt Nam [122] Trần Thị Thu Hà và cs (2011) [123] nghiên cứu thành phần loài tuyến

trùng trên cây hồ tiêu tại Cam Lộ-Quảng Trị ghi nhận tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne là phổ biến nhất với mật độ cao nhất trong đất và rễ cây vào tháng

2-được xem là thời điểm thích hợp cho tuyến trùng tăng sinh Trịnh Thị Thu Thủy (2012) [124] đã phân tích 123 mẫu hồ tiêu ở Quảng Trị và Thừa Thiên Huế với tỷ lệ

bị nhiễm M incognita lên tới 99% Tại Phú Quốc tỷ lệ hồ tiêu bị nhiễm M

incognita là 98,4% Nghiên cứu về đa dạng quần xã tuyến trùng đất tại khu vực

trồng hồ tiêu tỉnh Đồng Nai tháng 4 năm 2013 chỉ ra rằng tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne là nhóm tuyến trùng chiếm ưu thế và có mặt ở tất cả các điểm thu mẫu

(từ 11,6-60,3%) [125] Đến năm 2016, diện tích bị nhiễm tuyến trùng thực vật là 6.737 ha, diện tích nhiễm tăng 742 ha so với kỳ trước, so với cùng kỳ năm trước

tăng 2.066 ha Trong đó diện tích bị nhiễm tuyến trùng sần rễ Meloidogyne tương

tác gây ra bệnh chết nhanh, chết chậm trên hồ tiêu chiếm diện tích 6.624 ha, diện tích nhiễm tăng 189 ha so kỳ trước, so cùng kỳ năm trước tăng 3.532 ha [126] Năm

2018, tại Phú Yên 125 ha hồ tiêu đang mắc bệnh chết nhanh, chết chậm một phần

do tuyến trùng sần rễ gây nên, trong đó 105 ha tiêu trong giai đoạn thu hoạch bị chết chậm và 20 ha tiêu bị bệnh chết nhanh

Hình 1.5 Hồ tiêu bị bệnh chết nhanh, chết chậm

(A) Triệu chứng chết chậm; (B) chết nhanh trên Hồ tiêu

(Ảnh: Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam) Trên cây cà phê, Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2001) [127] ghi

nhận loài M incognita ở trên cà phê có mặt hầu hết ở các vùng thu mẫu ở Việt

Nam Trinh et al (2009) [9] đã ghi nhận sự có mặt của tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne trên cà phê ở 15 địa điểm của 5/8 tỉnh khảo sát (Nghệ An, Gia Lai,

Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng) với tần suất xuất hiện trong đất là 21% và trong

rễ là 12%

Hiện tại, loài M enterolobii là đối tượng cảnh báo trong kiểm dịch và cũng

đã xuất hiện ở Việt Nam trên vùng trồng cây ăn quả ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu

Long [128] Loài này cũng được biết đến gây hại nghiêm trọng ở các vùng trồng cà phê ở Cu Ba và nhiều cây trồng khác nhưng chưa có những nghiên cứu khẳng định

loài M enterolobii có ký sinh trên các cây trồng khác ở Việt Nam

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ Meloidogyne tại Tây Nguyên

1.2.2.1 Tổng quan Tây Nguyên

Tây Nguyên là khu vực cao nguyên bao gồm 5 tỉnh, xếp theo thứ tự vị trí địa

lý từ bắc xuống nam gồm Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng đây là một trong 3 tiểu vùng của miền Trung Việt Nam Nằm trong vùng nhiệt đới xavan, khí hậu ở Tây Nguyên được chia làm hai mùa: mùa mưa từ tháng 5 đến hết tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau Do ảnh hưởng của độ cao nên ở các cao nguyên có độ cao 400-500m khí hậu tương đối mát và mưa nhiều, cao nguyên có độ cao trên 1000m thì khí hậu lại mát mẻ quanh năm Tây Nguyên có đến 2 triệu hecta đất bazan màu mỡ, tức chiếm đến 60% diện tích đất bazan trên cả nước, đất bazan giàu chất dinh dưỡng, tầng phong hoá sâu, phân bố tập trung thuận lợi cho việc hình thành các vùng chuyên canh qui mô lớn với những cây công nghiệp như cà phê, ca cao, hồ tiêu, nên đây là vùng có diện tích cây công nghiệp lớn nhất cả nước với các cây trồng xuất khẩu chủ lực là cà phê và hồ tiêu Các cây lương thực hàng năm như ngô, sắn, đậu tương… cũng chiếm diện tích lớn so với các vùng khác trong cả nước, qua đó góp phần đa dạng hóa các sản phẩm nông nghiệp giúp phát triển bền vững kinh tế vùng Tây Nguyên [129]

Theo số liệu thống kê của Cục trồng trọt, năm 2014 diện tích cà phê trên cả nước khoảng 653.000 ha, trong đó tỉnh Đắk Lắk là 210.000 ha chiếm 32,1% tổng diện tích của cả nước, tỉnh Đắk Nông 122.278 ha chiếm 18,7% diện tích, tỉnh Gia Lai 78.030 ha chiếm 11,9%, tỉnh Lâm Đồng 153.432 ha chiếm 23,5%, tỉnh Kon Tum 13.381 ha chiếm 2% diện tích Nhờ áp dụng các tiến bộ khoa học-kỹ thuật nên sản lượng cà phê niên vụ 2015-2016 của vùng Tây Nguyên đạt hơn 1.34 triệu tấn; riêng địa bàn tỉnh Đắk Lắk niên vụ 2015-2016 xuất khuẩn cà phê đạt 196.391 tấn, tăng 19.294 tấn so với cùng kỳ năm trước, chiếm 11,26% so với cả nước, kim ngạch xuất khẩu cà phê tại Đắk Lắk đạt 356,479 triệu USD [130]

Hình 1.6 Vị trí 5 tỉnh Tây Nguyên trên bản đồ Việt Nam

Theo số liệu thống kê năm 2014 của Sở NN&PTNT Đắk Nông, tổng diện tích trồng hồ tiêu năm 2014 của tỉnh đạt 14.720 ha với năng suất trung bình 21 tạ/ha Ước lượng tiêu thụ tiêu năm 2015 của Đắk Nông đạt khoảng 19.000 tấn Tại Đắk Lắk năm 2014 khảo sát vùng trồng tiêu chuyên canh tại huyện EaH‟Leo với

diện tích khoảng 4.000 ha, riêng xã EaH‟Leo có 1.600ha (trong đó 100 ha tiêu già trên 10 năm tuổi) với sản lượng thu họach toàn xã đạt 1.700 tấn [131]

1.2.2.2 Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne tại Tây Nguyên

Hiện nay diện tích lớn vườn trồng cà phê và hồ tiêu bị già cỗi và cho năng suất thấp, do đó một lượng lớn diện tích đã được tái canh, trong giai đoạn từ năm 2010-2016, 5 tỉnh Tây Nguyên đã tái canh trên 80.000 ha (tỉnh Lâm Đồng 43.000

ha, tỉnh Đắk Lắk 19.000 ha, tỉnh Đắk Nông 8.400 ha, tỉnh Gia Lai 5.700 ha và tỉnh Kon Tum là 1.500 ha) [130] Tuy với diện tích tái canh lớn nhưng kết quả năng suất không được cao do rất nhiều nguyên nhân như địa phương thiếu các quy hoạch tổng thể hay tình hình sâu bệnh Một trong những nguyên nhân hiện nay đang tàn phá nặng nề các vườn trồng cà phê đó là tuyến trùng ký sinh gây bệnh thực vật, trong đó

có tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne là nguyên nhân chính Đây được

xem là đối tượng gây hại nghiêm trọng trên các vùng trồng cà phê và hồ tiêu ở Tây Nguyên [9]

Viện Bảo vệ Thực vật (2008) [132] đã xác định loài M incognita phổ biến

trong đất và rễ của hồ tiêu, đây là loài gây hại chính và phổ biến trên hồ tiêu ở Đắk Nông, kết hợp với các yếu tố gây hại khác làm cho cây bị rụng đốt và chết Trịnh Thu Thủy (2010) [124] phân tích 240 mẫu thu ở 36 vườn hồ tiêu tại 3 tỉnh Đắk Lắk,

Gia Lai, Kon Tum ghi nhận tỷ lệ 97,1% mẫu hồ tiêu bị nhiễm M incognita, trong

đó tỷ lệ bị nhiễm M incognita cao nhất là ở Gia Lai Lê Đức Khánh và cs (2013)

[7] ghi nhận trên hồ tiêu 3 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne, trong đó 2 loài M

incognita, Meloidogyne sp ghi nhận tại Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và 1 loài M javanica tại tỉnh Đắk Lắk với tần suất xuất hiện Meloidogyne trong đất là 92,5% và

62,5% trong rễ

Trên cà phê, Trinh et al (2009, 2013) [9] [133] đã ghi nhận sự có mặt của 2

loài M exigua và M coffeicola [74] Lê Đức Khánh và cs (2013) [7] đã ghi nhận

loài M incognita trên cà phê tại 4 tỉnh Tây Nguyên (Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông, Lâm Đồng) và loài M exigua tại Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng Vũ Anh Tú và cs

(2014) [8] cũng xác định có 11 giống tuyến trùng thực vật ký sinh trong rễ và đất cà phê tại Easao- Gia Lai trong đó tần suất xuất hiện lớn nhất là tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne, đây được xác định là một trong những nguyên nhân góp phần gây ra

bệnh vàng lá và gây chết trên cà phê

Hàng năm có tới hàng trăm hecta cà phê, hồ tiêu đã phải loại bỏ để trồng những cây trồng khác Tuy nhiên khi cà phê bị nhiễm bệnh thì tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne sẽ tồn tại trong đất nên sẽ gặp khó khăn khi trồng lại cà phê, hồ tiêu vì

bệnh sẽ quay lại nên những vùng đất này thường sẽ bị bỏ hoang hoặc trồng những cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế thấp [74] Qua khảo sát của Trinh et al (2011) [134] tại Tây Nguyên, các loài tuyến trùng này có khả năng tồn tại trong đất không

có cây chủ sau 1 năm loại bỏ cây cà phê bị bệnh Chứng tỏ ngoài phổ ký chủ rộng rãi loài này còn có khả năng tồn tại trong đất rất lâu ngày cả trong điều kiện khắc nghiệt mùa khô tại Tây Nguyên Các nghiên cứu trước đây chủ yếu ghi nhận là loài

M incognita trên cà phê và hồ tiêu và có nhiều loài chưa được xác định Với các

triệu chứng nốt sần ghi nhận rất khác nhau trên cây cà phê và hồ tiêu cho thấy có ít

nhất hơn một loài ký sinh trên cà phê và hồ tiêu [9] Đặc biệt, một số mẫu tuyến

trùng sần rễ Meloidogyne trên cà phê ở Tây Nguyên vẫn chưa được phân loại cần

nghiên cứu tiếp [7], [8]

1.3 Biện pháp phòng trừ sinh học tuyến trùng sần rễ Meloidogyne

Phòng trừ sớm là giải pháp quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng Hiện nay, các biện pháp phòng trừ được sử dụng khi cây đã có biểu hiện triệu chứng thì bệnh do tuyến trùng gây ra đã tương đối nặng nên việc phòng trừ sẽ khó có hiệu quả hoặc có tác dụng chậm trễ Do vậy, cần có các biện pháp phòng bệnh và phát hiện sớm các dấu hiệu gây bệnh trên cây cho kịp thời Đối với những cây bị bệnh nặng thì tốt nhất là đào hết rễ, tiêu hủy, phơi đất, khử trùng đất, khử trùng hố trồng [37]

Có nhiều biện pháp khác nhau đã được đưa ra để phòng trừ tuyến trùng gây hại trên cây bao gồm: (1) các biện pháp chọn giống, chọn những giống tốt, sạch có khả năng kháng bệnh; biện pháp canh tác như vệ sinh đồng ruộng, tưới ủ, phân bón; (2) Biện pháp vật lý dựa trên sự tương thích của tuyến trùng với nhiệt độ và môi trường để tiêu diệt hoặc hạn chế sự phát triển của chúng Tuyến trùng rất mẫn cảm với nhiệt độ, đa số tuyến trùng không chịu được nhiệt độ trên 60oC do đó các biện pháp xử lý nhiệt đa số đều cho hiệu quả cao, nhưng chúng cũng đòi hỏi chi phí cao

và thời gian dài; (3) Biện pháp hóa học đã được sử dụng rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật Mặc dù các biện pháp hoá học có hiệu quả rất lớn tuy nhiên các biện pháp này thường gây ô nhiễm môi trường và độc hại cho người, động vật (4) các biện pháp sinh học là một hướng phòng trừ mang lại hiệu quả kinh tế, có thể lợi dụng được những đặc điểm tự nhiên có ở trong đất để phòng trừ, làm giảm số lượng tuyến trùng gây hại

Biện pháp sinh học hay phòng trừ sinh học là một biện pháp tạo ra các sản phẩm tác động trực tiếp hoặc gián tiếp tới tuyến trùng ký sinh thực vật Đó là một loạt các vi sinh vật sống trong đất có khả năng ăn thịt, phân hủy hoặc ức chế sự sinh trưởng của tuyến trùng Hoặc hợp chất được tạo ra từ các loại thực vật có khả năng hạn chế sự phát triển của tuyến trùng [135]

Đối với hợp chất từ thực vật có thể được lựa chọn thay thế cho các sản phẩm hóa học, bởi vì chúng phân hủy thành các sản phẩm không độc hại, ít tác dụng phụ hơn cho sinh vật và môi trường [136], [137] Trước đây Ấn Độ đã sử dụng dịch

chiết cây Neem (Azadirachta indica) như là một loại thuốc trừ bệnh, các nghiên cứu

sau này từ dịch chiết từ cây Neem có thể ức chế sự sinh trưởng của tuyến trùng sần

rễ Meloidogyne trên cà chua [138] Các nghiên cứu với bánh Neem có thể là độc tố

đối với tuyến trùng ký sinh thực vật nhưng lại không tác dụng đối với vi sinh vật sống tự do trong đất Sản phẩm từ bánh Neem có thể giảm tới 67-90% tuyến trùng

M hapla trong nhà kính [139] Tại Việt Nam, từ những năm 1995 đã sử dụng thuốc

thảo mộc từ hạt và lá cây sầu đâu rừng Brucea javanita làm giảm tuyến trùng trên

hồ tiêu [122] Nguyen et al (2011) [140] đã thử nghiệm các hợp chất được chiết

xuất (CCE) từ cây quế đơn (Cinnamomun cassia) lên rễ và đất của cây dưa chuột bị nhiễm tuyến trùng M incognita, kết quả sau 14 ngày thử nghiệm số lượng ấu trùng

(J2) trong đất và rễ dưa chuột giảm đi đáng kể với liều lượng thử nghiệm 1, 5, 10 mg/ml dịch CCE Sau 28 ngày thử nghiệm số lượng J2 ở 2 nồng độ 5 và 10 mg/ml thấp hơn nhiều so với J2 ở nồng độ 1mg/ml dịch CCE , chứng tỏ các sản phẩm từ dịch chiết cây quế có khả năng phòng trừ tuyến trùng Nguyen et al (2013) [141] đã

sử dụng acid gallic (GA) chiết xuất từ cây chiêu liêu (Terminalia nigrovenulosa) ức chế tới 95,8% trứng Meloidogyne nở ra ở nồng độ 2 mg/ml dịch sau 3 ngày thử nghiệm và gây chết 100% ấu trùng Meloidogyne nồng độ acid GA 1.0mg sau 12 giờ

như: công nghệ sản xuất phức tạp và giá thành cao, nên kết quả ứng dụng thuốc trong thực tế còn rất hạn chế [37]

Đối với các các biện pháp bằng vi sinh vật: Dựa trên đặc tính cấu tạo và sinh dưỡng của tuyến trùng ký sinh thực vật mà tìm kiếm những vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ sinh học, hiện nay chủ yếu dựa vào các vi sinh vật đối kháng có khả năng kháng hoặc giết chết tuyến trùng, Theo Vũ Triệu Mân (2007) [142] tuyến trùng thường bị tấn công bởi nhiều vi sinh vật đối kháng tồn tại trong đất như virus,

vi khuẩn, nấm, côn trùng, tuyến trùng ăn thịt… thường gặp các loại vi sinh vật sau đây:

- Vi khuẩn Pasteuria penetrans: đây là nhóm vi khuẩn gram dương, có khả

năng hình thành bào tử và ký sinh bắt buộc trên tuyến trùng, tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne dễ bị nhiễm vi khuẩn P penetrans khi tiếp xúc với nội bào tử, nội bào

tử sẽ gắn vào biểu bì của ấu trùng, ấu trùng này sau đó xâm nhập vào rễ cây và bắt đầu dinh dưỡng trước khi bào tử được nảy mầm , sau khi nảy mầm bào tử sẽ đâm ra làm rách lớp kitin bên ngoài của ấu trùng làm cản trở sự sinh trưởng của tuyến trùng, P penetrans làm giảm mật độ tuyến trùng lên đến 99% trong 3 tuần Vi

khuẩn P penetrans còn tồn tại lâu dài trong đất mà không bị ảnh hưởng bởi các tác

nhân khác, tuy nhiên vi khuẩn này lại rất khó bắt gặp trong tự nhiên cũng như khó phân lập và nhân nuôi sinh khối lớn nên ít được sử dụng trong phòng trừ [142]

- Các vi sinh vật như nấm có khả năng bẫy tuyến trùng, tạo ra các mạng bẫy dạng lưới để bắt và giết tuyến trùng, sau khi tuyến trùng chết sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng giàu nitơ cho nấm Tuy nhiên hầu hết các loại nấm này có nhược điểm

là không tạo khuẩn lạc nhanh, khả năng cạnh tranh thấp với các tác nhân bên ngoài môi trường và trong đất nên khả năng phòng trừ tuyến trùng không cao [142]

- Các vi sinh vật có khả năng nội ký sinh chúng xâm nhập vào cơ thể tuyến

trùng để gây bệnh cho chúng có thể kể đến một số loại nấm như Nematocomus spp.,

Meria coniospora đã được thử nghiệm cho khả năng ký sinh này Điển hình như

tuyến trùng M hapla gây hại trên khoai tây bị kiểm soát bởi nấm M coniospora

[143]

Một số loại nấm như: Exophiala pisciphila, Scytalidium fulvum, Paraphoma

radicina, Phoma terrestris, Paecilomyces lilacinus; Paecilomyces variotii, có khả

năng ký sinh trên trứng tuyến trùng, bọc trứng bằng các sợi nấm và xâm nhập vào bên trong, phá hủy trứng tuyến trùng [144] Những loại nấm này tương đối dễ nuôi cấy và có thể ký sinh ở tất cả các giai đoạn phát triển của tuyến trùng (trứng, ấu trùng và trưởng thành) Trong số các loài nấm ký sinh trứng và ấu trùng của tuyến

trùng, nấm Paecilomyces spp là loại nấm hoại sinh trong đất, được quan tâm và

nghiên cứu nhiều nhất, do tiềm năng ký sinh và khả năng kiểm soát quần thể tuyến

trùng thực vật tốt, trong đó có P lilacinus là loài có khả năng ký sinh trên tuyến trùng Jones et al (1984) ghi nhận loài P lilacinus là một trong những tác nhân sinh

học rất hiệu quả trong phòng trừ tuyến trùng ký sinh cây trồng [145] Kiewnick và

Sikora (2006) đã thử nghiệm khả năng kiểm soát tuyến trùng sần rễ M incognita ký sinh trên cà chua của nấm Paecilomyces lilacinus strain 251 làm giảm lượng nốt sần

trên rễ 66% và số lượng túi trứng tới 74% và mật độ ấu trùng trong rễ giảm 71% so với mẫu đối chứng [146] Với cơ chế là ký sinh trực tiếp lên trứng, ấu trùng đồng thời sản sinh ra các enzyme như leucinotoxin, chitinase, protease, và acid acetic có khả năng phân hủy lớp kitin bên ngoài của ấu trùng và ức chế nở trứng [147], [148]

Tại Việt Nam, Ngô Thị Xuyên (2000) [118] bước đầu thử nghiệm 2 loài nấm

đối kháng Paecilomyces lilacinus và Gliocladium sp, diệt được ấu trùng tuổi 2 và trứng của M incognita trên một số vùng rau Hà Nội Trần Thị Kiều Lâm (2010) [149] đã khảo sát khả năng đối kháng một số dòng nấm Paecilomyces spp và

Trichoderma spp với tuyến trùng sần rễ trong điệu kiện invitro và nhà lưới, kết quả

ghi nhận dịch trích của bốn dòng nấm P lilacinus, Paecilomyces sp (1),

Paecilomyces sp (2), Paecilomyces sp (TH) có hiệu quả làm chết 99% ấu trùng sau

48 giờ thí nghiệm, đối với nấm Tricoderma sp là 99% ấu trùng sau 72 giờ thí nghiệm, tác giả đã kết luận nấm P lilacinus có khả năng cao nhất trong phòng trừ

tuyến trùng sần rễ

Ngoài ra, một số dòng vi khuẩn cũng có khả năng sản sinh ra các enzyme làm phân hủy lớp kitin bên ngoài của ấu trùng và lớp gelatin bên ngoài túi trứng

được ứng dụng rộng rãi, một trong số đó là vi khuẩn thuộc giống Lysobacter spp

rất phổ biến trong đất, có vai trò như vi khuẩn đối kháng có khả năng phòng trừ nhiều loại tuyến trùng thực vật cũng như nhiều loại nấm gây bệnh cho cây [150]

Chủng vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 có khả năng sản sinh ra các lytic

enzymes và các chất kháng sinh để ức chế tuyến trùng Các lytic enzymes này sẽ

sản sinh ra các chất phân hủy chitinases, glucanases, lipases và proteases và một số hoạt chất có tác dụng tiêu diệt tuyến trùng Một trong số các hoạt chất đó được xác định là là 4- hydroxyphenylacetic acid (4-HPAA), đây được xem như là một chất

kháng sinh từ vi khuẩn L antibioticus HS124 [151] Theo Yoon et al (2012) [29] enzymes và kháng sinh của các vi khuẩn L antibioticus HS124 này có khả năng phân hủy kitin trên tuyến trùng M incognita, đồng thời vi khuẩn này có khả năng

kích thích sinh trưởng trên cây Những nghiên cứu hiện tại cũng xác nhận khả năng

phòng trừ tuyến trùng sần rễ M incognita dựa trên các chất phân hủy kitin và kháng

sinh của các chủng vi khuẩn này, ngoài ra có thể làm gia tăng sinh trưởng của cây

do sau thử nghiệm vi khuẩn L antibioticus HS124 cây thường sinh trưởng mạnh ở thân lá và rễ so với mẫu đối chứng [29] Tại Hàn Quốc, vi khuẩn L antibioticus HS124 đã được đánh giá tốt trong phòng trừ tuyến trùng M incognita và đã phát triển thành thương phẩm GCM, tuy nhiên chưa có thử nghiệm đối với chủng M

incognita tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung, đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu phân bố, tần suất bắt gặp và mật độ của tuyến trùng sần rễ trên một số cây trồng quan trọng: cà phê, hồ tiêu, rau màu và cây trồng xen ở Tây Nguyên

 Nghiên cứu đa dạng loài và hình thái của các loài tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne ở Tây Nguyên

 Nghiên cứu đa dạng di truyền của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne ở khu vực

Tây Nguyên dựa trên phân tích các vùng gen nhân và gen ty thể

 Đánh giá ảnh hưởng của vi sinh vật đối kháng: nấm Paecilomyces javanicus,

vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 tới tuyến trùng M incognita

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu

- Một số cây trồng vùng Tây Nguyên: cà phê, hồ tiêu, rau màu, ổi, lúa

- Nấm Paecilomyces javanicus được cung cấp bởi trường Đại học Khoa học

Tự nhiên- ĐHQGHN, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 từ chế phẩm GCM

của Đại học Quốc gia Chonnam (Hàn Quốc)

- Kháng sinh 4-Hydroxyphenylacetic (4-HPAA) từ hãng Sigma

2.1.4 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Thời gian khảo sát thực địa được tiến hành từ tháng 10 năm 2014 đến tháng

3 năm 2017 tại một số địa điểm thuộc các huyện: CưM„ga (tỉnh Đắk Lắk); Di Linh (tỉnh Lâm Đồng); Kiến Đức (tỉnh Đắk Nông); Chư Sê (tỉnh Gia Lai) và Đắk Hà (tỉnh Kon Tum) (hình 2.1)

- Các nghiên cứu hình thái, nhân nuôi thử nghiệm về hiệu lực phòng trừ của một số vi sinh vật đối kháng được thực hiện tại phòng Tuyến trùng học và các nghiên cứu về đa dạng di truyền được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và

Di truyền bảo tồn-Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật- Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam Quá trình nghiên cứu này được thực hiện từ tháng 10 năm

2014 đến tháng 10 năm 2017

Hình 2.1 Sơ đồ khu vực nghiên cứu (Google map)

A: huyện Đắk Hà (tỉnh Kon Tum); B: huyện Chư Sê (tỉnh Gia Lai); C: huyện

CưM„Ga (tỉnh Đắk Lắk); D: huyện Di Linh (tỉnh Lâm Đồng); E: huyện Kiến Đức (tỉnh

Đắk Nông)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát thực địa và phương pháp thu mẫu

Dụng cụ thực địa: bản đồ, GPS, túi, băng dính giấy, xẻng thu mẫu, dao chặt, dây chun, bút viết, sổ ghi, máy ảnh